肝癌标志物单克隆抗体的制备及其应用的制作方法
本发明涉及针对人肝癌标志物的抗体或其片段(特别是单链抗体)，用于制备它们的方法，包含它们的检测试剂和试剂盒，及其应用。
背景技术：
原发性肝癌(plc,简称肝癌)是临床上最常见的恶性肿瘤之一，起病隐匿，侵袭生长迅速，治疗后易复发，预后极差，被称为“癌中之王”。全世界半数左右的肝癌患者集中在中国，每年我国约有11万人死于肝癌，居恶性肿瘤死亡率的第二位。目前，手术切除及肝移植是肝癌最有效的治疗方法，但绝大多数肝癌患者就诊时已到中晚期，无法手术，手术切除率仅为10-30％。对于不能手术的病例，传统的放、化疗效果不佳，患者生存期一般不超过半年。由此可见肝癌早期诊断至关重要，是临床诊疗和预后的关键。
早期肝癌检出率低的现状反映出目前肝癌的诊断方法还有很大局限性。当前肝癌的诊断主要依靠血清学检查和影像学诊断。血清学检查主要检测血清中的肿瘤标志物，目前主要是依靠afp的检测，但afp在小肝癌中的敏感度仅为40％左右。由此可见，单独使用一种肿瘤标志物无法准确诊断肿瘤的发生和发展，联合检测多种肿瘤标志物才能提高检出的准确率，避免或减少漏诊和假阳性。应用新的检测技术、选择更有诊断价值的标志物组合，提高现有肿瘤标志物检测的灵敏度和特异性对肝癌早期诊断极为重要。目前，常用的肝癌标志物主要包括：甲胎蛋白(afp)、谷氨酰转移酶同工酶ⅱ(ggtⅱ)、α-l-岩藻糖甘酶(afu)、肝细胞生长因子(hgf)、硫酸肝素蛋白多糖3(gpc3)、癌胚抗原(cea)等。
单克隆抗体能识别各种生物活性物质如蛋白、多糖、脂蛋白、神经肽、核酸等的单一抗原决定簇并与其特异性结合，又由于单克隆抗体的均质性极易大量生产，使得单克隆抗体在生命科学研宄领域中得到极为广泛的应用。单链抗体(scfv)是抗体分子中保留抗原结合部分的最小功能片段，分子量约为完整抗体的1/6，是用基因工程方法将抗体重链和轻链可变区通过一段连接肽连接而成的重组蛋白。单链抗体优越性在于可通过包含体大量表达，尤其易于构建抗体融合蛋白，具有分子小、免疫原性低、无fc端、不易与具有fc受体的靶细胞结合、对肿瘤组织的穿透力强等特点。利用单克隆抗体和单链抗体，用于早期肝癌的检测，具有无可比拟的优势。
技术实现要素：
本发明包括特异性结合于人肝癌标志物的抗体或其片段，所述人肝癌标志物选自由以下组成的组：甲胎蛋白(afp)、谷氨酰转移酶同工酶ii(ggtii)、α-l-岩藻糖甘酶(afu)、肝细胞生长因子(hgf)和硫酸肝素蛋白多糖3(gpc3)。
优选所述抗体为单克隆抗体，其特征在于包含轻链可变结构域和重链可变结构域，其中
a)对于针对afp的抗体，所述轻链可变结构域包含seqidno:21的cdr1区,seqidno:22的cdr2区和seqidno:23的cdr3区,并且所述重链可变结构域包含seqidno:24的cdr1区,seqidno:25的cdr2区和seqidno:26的cdr3区；
b)对于针对afu的抗体，所述轻链可变结构域包含seqidno:27的cdr1区,seqidno:28的cdr2区和seqidno:29的cdr3区,并且所述重链可变结构域包含seqidno:30的cdr1区,seqidno:31的cdr2区和seqidno:32的cdr3区；
c)对于针对ggtii的抗体，所述轻链可变结构域包含seqidno:33的cdr1区,seqidno:34的cdr2区和seqidno:35的cdr3区,并且所述重链可变结构域包含seqidno:36的cdr1区,seqidno:37的cdr2区和seqidno:38的cdr3区；
d)对于针对hgf的抗体，所述轻链可变结构域包含seqidno:39的cdr1区,seqidno:40的cdr2区和seqidno:41的cdr3区,并且所述重链可变结构域包含seqidno:42的cdr1区,seqidno:43的cdr2区和seqidno:44的cdr3区；和
e)对于针对gpc3的抗体，所述轻链可变结构域包含seqidno:45的cdr1区,seqidno:46的cdr2区和seqidno:47的cdr3区,并且所述重链可变结构域包含seqidno:48的cdr1区,seqidno:49的cdr2区和seqidno:50的cdr3区。
优选地，所述抗体或其片段其特征在于包含：
a)seqidno：1的轻链可变结构域和seqidno：2的重链可变结构域；
b)seqidno：3的轻链可变结构域和seqidno：4的重链可变结构域；
c)seqidno：5的轻链可变结构域和seqidno：6的重链可变结构域；
d)seqidno：7的轻链可变结构域和seqidno：8的重链可变结构域；或
e)seqidno：9的轻链可变结构域和seqidno：10的重链可变结构域。
优选地，所述抗体或其片段其特征在于所述抗体是人igg2亚类、人igg1亚类或人igm亚类的。
优选地，所述片段是单链抗体(scfv)。
本发明的另一个实施方案是包含本发明所述的抗体或其片段的测定或诊断用试剂盒或试剂。
优选地，所述试剂盒或试剂用于elisa测定、westernblotting测定、免疫组织化学测定或免疫荧光测定，特别是用于诊断肝癌。
本发明的另一个实施方案是本发明所述的抗体或其片段在制备测定或诊断用试剂盒或试剂中的应用，优选所述试剂盒或试剂用于elisa测定、westernblotting测定、免疫组织化学测定或免疫荧光测定，特别是用于诊断肝癌。
本发明的另一个实施方案是编码本发明所述的抗体或其片段的核酸。
本发明的另一个实施方案是包含本发明所述的核酸的表达载体，优选所述载体用于在原核宿主细胞或真核宿主细胞中表达特异性结合于人肝癌标志物的抗体或其片段，所述人肝癌标志物选自由以下组成的组：甲胎蛋白(afp)、谷氨酰转移酶同工酶ii(ggtii)、α-l-岩藻糖甘酶(afu)、肝细胞生长因子(hgf)和硫酸肝素蛋白多糖3(gpc3)。
本发明的另一个实施方案是包含本发明所述的载体的原核宿主细胞或真核宿主细胞。
本发明还包括用于产生根据本发明所述的重组人或人源化的抗体的方法，其特征在于在原核或真核宿主细胞中表达根据本发明所述的核酸，并且从所述细胞或细胞培养上清液中回收所述抗体。本发明还包括可通过所述重组方法获得的抗体。
根据本发明所述的抗体或其片段特别用于elisa测定、westernblotting测定、免疫组织化学测定或免疫荧光测定，特别是用于诊断肝癌。
发明详述
本发明公开了针对五种肝癌标志物的单克隆抗体和单链抗体，及其制备方法和科研医疗用途，属于细胞工程技术领域。它们以市售afp和本实验室制备的hgf、afu、ggtⅱ、gpc3融合蛋白为抗原，免疫balb/c小鼠得到分泌抗体的b细胞，与骨髓瘤细胞融合后筛选具有分泌单克隆抗体的融合细胞；所制备单克隆抗体能很好应用于elisa、westernblotting、免疫组织化学、免疫荧光等对相应抗原的检测；此外，本发明还利用基因工程方法分别制备了只含有每种抗体重链可变区和轻链可变区的单链抗体(scfv)，所构建的单链抗体具有分子小、免疫原性低、无fc端、对肿瘤组织的穿透力强等特点。将这些抗体联用，有望开发出应用于肝癌患者早期血清学诊断的有效试剂盒。
具体地，本发明提供以下各项：
1、五种单克隆抗体，hgf、afp、afu、ggtⅱ、gpc3单克隆抗体，其特征在于它们是以市售afp和自行制备的hgf、afu、ggtⅱ、gpc3融合蛋白为抗原，免疫balb/c小鼠得到分泌抗体的b细胞，与骨髓瘤细胞融合后筛选具有分泌单克隆抗体的融合细胞，注射到小鼠腹腔得到含有抗体的腹水，纯化后即得到单克隆抗体，hgf抗体为igg2b和igg2a，afp抗体为igg2a，afu抗体为igm，gpc3抗体为igg2b，ggtⅱ抗体为igg2b和igg1。
2、根据以上1所述的单克隆抗体，其特征在于其制备方法包括的步骤：
1)用hgf、afp、afu、ggtⅱ、gpc3抗原蛋白分别免疫balb/c小鼠，elisa法测效价后，取小鼠脾脏从而得到能分泌相应抗体的b细胞；
2)用细胞融合技术将小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞系sp2/0融合，利用无限稀释法、有限稀释法结合elisa法筛选得到具有分泌单克隆抗体功能的杂交瘤细胞；
3)将杂交瘤细胞注射入提前注射过pristine的balb/c小鼠腹腔内，得到小鼠腹水，经盐析法和透析袋透析后，应用hitrapproteinghp柱纯化单克隆抗体；
4)利用akta蛋白分离纯化仪洗脱结合好的纯化柱，得到单克隆抗体。
3、根据以上1所述的单克隆抗体，其特征在于所制备的hgf单克隆抗体能很好应用于酶联免疫吸附法(elisa)和westernblotting对hgf的检测；所制备的afp单克隆抗体能很好应用于elisa、westernblotting和免疫组织化学(ihc)对afp的检测；所制备的afu单克隆抗体能够很好地应用于westernblotting对afu的检测；所制备的ggtⅱ单克隆抗体能很好应用于elisa、westernblotting和免疫荧光(if)对ggtⅱ的检测；所制备的gpc3单克隆抗体能很好地应用于elisa、westernblotting和if对gpc3的检测。
4、根据以上3所述的单克隆抗体应用，其特征在于其包括的步骤：
1)elisa法：在酶标板上包被所制备的单克隆抗体，检测hcc患者血清和正常人血清，孵育羊抗鼠二抗后opd显色，检测吸光度；
2)westernblotting法：将不同肝癌细胞蛋白(hepg2、hep3b、7721、7702等)上样电泳转膜后，孵育所制备的单克隆抗体作为一抗，孵育二抗后ecl显色，暗室曝光；
3)免疫组织化学法(ihc)：使用肝癌组织石蜡切片，经脱蜡、抗原修复、灭活内源性过氧化物酶后，孵育所制备的单克隆抗体作为一抗，孵育二抗后dab显色，经复染、脱水步骤后封片拍照；
4)免疫荧光法(if)：将肝癌细胞hepg2铺种于放有盖玻片的十二孔板，经固定及打孔后，孵育所制备的单克隆抗体作为一抗，孵育二抗及dapi染核后封片拍照。
5、五种单链抗体，其特征在于它们分别根据已制备的hgf、afp、afu、ggtⅱ和gpc3单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区序列，经过overlappcr、质粒构建及蛋白表达纯化等步骤制备而成的，具有分子小、免疫原性低、无fc端、对肿瘤组织的穿透力强等特点。
6、根据以上5所述的单链抗体，其特征在于各自的碱基序列，详见专利说明书。
7、根据以上5所述的单链抗体，其特征在于其制备方法所包括的步骤：
1)提取杂交瘤细胞的rna，经逆转录后pcr扩增重链可变区vh、轻链可变区vl片段，与载体连接后转化入感受态dh5α，挑选vh和vl阳性克隆。
2)用pcr法分别扩增出相应单克隆抗体的vh和vl，之后用overlappcr法连接vh、vl片段。
3)用重组技术构建payz-hgf(afp、afu、ggtⅱ、gpc3)scfv质粒，在大肠杆菌16c9中大量表达，应用hitrapff亲和层析柱纯化单链抗体。
根据具体地，本发明提供了针对不同肝癌标志物抗原的五类抗体，分别为afp单克隆抗体及单链抗体，afu单克隆抗体及单链抗体，ggtⅱ单克隆抗体及单链抗体，hgf单克隆抗体及单链抗体，gpc3单克隆抗体及单链抗体。
本发明所述的五种单克隆抗体的抗原afp为市售，纯度大于95％以上，hgf、afu、ggtⅱ和gpc3抗原为本实验室制备，在大肠杆菌中表达，为原核表达的融合蛋白。
本发明所述的五种单克隆抗体的制备所包括的步骤为：
1)用hgf、afp、afu、ggtⅱ、gpc3抗原蛋白分别免疫balb/c小鼠，elisa法测效价后，取小鼠脾脏从而得到能分泌相应抗体的b细胞；
2)用细胞融合技术将小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞系sp2/0融合，利用无限稀释法、有限稀释法结合elisa法筛选得到具有分泌单克隆抗体功能的杂交瘤细胞；
3)将杂交瘤细胞注射入提前注射过pristine的balb/c小鼠腹腔内，得到小鼠腹水，经盐析法和透析袋透析后，应用hitrapproteinghp柱纯化单克隆抗体；
4)利用akta蛋白分离纯化仪洗脱结合好的纯化柱，得到单克隆抗体。
本发明所制备的单克隆抗体应用的步骤为：
1)elisa法：在酶标板上包被所制备的单克隆抗体，检测hcc患者血清和正常人血清，孵育生物素标记单克隆抗体和hrp标记亲和素后opd显色，检测吸光度；
2)westernblotting法：将不同肝癌细胞蛋白(hepg2、hep3b、7721、7702等)上样电泳转膜后，孵育所制备的单克隆抗体作为一抗，孵育二抗后ecl显色，暗室曝光；
3)免疫组织化学法(ihc)：使用肝癌组织石蜡切片，经脱蜡、抗原修复、灭活内源性过氧化物酶后，孵育所制备的单克隆抗体作为一抗，孵育二抗后dab显色，经复染、脱水步骤后封片拍照；
4)免疫荧光法(if)：将肝癌细胞hepg2铺种于放有盖玻片的十二孔板，经固定及打孔后，孵育所制备的单克隆抗体作为一抗，孵育二抗及dapi染核后封片拍照；
本发明筛选出的5种抗体稳定性非常好，杂交瘤细胞株经过多次鉴定都保持了强分泌抗体的特性。抗体制备过程中采用镜下直接吸取细胞株的方法，大大提高了得到单克隆株的概率，有效缩短了分选的时间。本发明所采用的抗原纯度高，免疫原性强，从源头上保证了所制备抗体的质量。
本发明所制备的hgf单克隆抗体能很好应用于elisa和westernblotting对hgf的检测；所制备的afp单克隆抗体能很好应用于elisa、westernblotting和ihc对afp的检测；所制备的afu单克隆抗体能够很好地应用于elisa和westernblotting对afu的检测；所制备的ggtⅱ单克隆抗体能很好应用于elisa、westernblotting和if对ggtⅱ的检测；所制备的gpc3单克隆抗体能很好地应用于elisa、westernblotting和if对gpc3的检测。
单链抗体(scfv)是抗体分子中保留抗原结合部分的最小功能片段，分子量约为完整抗体的1/6，是用基因工程方法将抗体重链和轻链可变区通过一段连接肽连接而成的重组蛋白，具有分子小、免疫原性低、无fc端、对肿瘤组织的穿透力强等特点。为了更好地将肝癌标志物抗体应用于肝癌检测，本发明分别根据已制备的hgf、afp、afu、ggtⅱ和gpc3单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区序列，制备了相应的单链抗体。
本发明所述的五种单链抗体的制备所包括的步骤为：
1)提取杂交瘤细胞的rna，经逆转录后pcr扩增重链可变区vh、轻链可变区vl片段，与载体连接后转化入dh5α，挑选vh和vl阳性克隆。
2)用pcr法分别扩增出相应单抗的vh和vl，之后用overlappcr法连接vh、vl片段。
2)用重组技术构建payz-hgf(afp、afu、ggtⅱ、gpc3)scfv质粒，在大肠杆菌16c9中大量表达，应用hitrapff亲和层析柱纯化单链抗体。
定义
术语“抗体”涵盖抗体结构的多种形式，包括但不限于完整的抗体和抗体片段。根据本发明所述的抗体优选地是人源化的抗体、嵌合抗体或其它遗传改造的抗体，只要根据本发明的特征性质仍旧保留。
抗体的“类别”是指其重链具有的恒定结构域或恒定区的类型。有五个主要类别的抗体：iga，igd，ige，igg和igm，并且这些中的一些可以进一步被划分为亚类(同种型)，例如，igg1，igg2，igg3，igg4，iga1和iga2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别被称为α，δ，ε，γ和μ。
“抗体片段”是指不同于完整抗体的分子，其包含完整抗体的部分，所述部分结合完整抗体结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于fv，fab，fab'，fab’-sh，f(ab')2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scfv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”用于本文中时，指单一氨基酸组成的抗体分子制剂。
“可变结构域”(轻链(vl)的可变结构域，重链(vh)的可变结构域)用于本文中时，表示直接参与抗体与抗原结合的每对轻链和重链结构域。可变轻链和重链的结构域具有相同的一般结构且每个结构域包括4个构架(fr)区，所述构架区的序列普遍保守，其通过3个“高变区”(或互补决定区,cdrs)相连接。构架区采用β-折叠构象且cdr可以形成连接β-折叠结构的环。每条链中的cdr通过构架区以其三维结构保持并与来自另一条链的cdr一起形成抗原结合位点。抗体重链和轻链cdr3区在按照本发明的抗体的结合特异性/亲和力方面发挥特别重要的作用并因此提供本发明的另一个目的。
用于本文时，术语“抗体的抗原结合部分”指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。抗体的抗原结合部分包括来自“互补决定区”或“cdrs”的氨基酸残基。“构架”或“fr”区是除本文中定义的高变区残基之外的那些可变结构域区域。因此，抗体的轻链和重链可变结构域从n端到c端包括结构域fr1,cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3和fr4。特别地，重链的cdr3是最有助于抗原结合的区域并且限定抗体的性质。按照kabat,e.a.,等，免疫目的的蛋白质序列(sequencesofproteinsofimmunologicalinterest)，第5版，公众健康服务，国家健康研究所(publichealthservice，nationalinstitutesofhealth)，bethesda，md.(1991))的标准定义确定cdr和fr区域,和/或来自“高变环”的那些残基。
术语“核酸”或“核酸分子”，用于本文时，意欲包括dna分子和rna分子。核酸分子可以是单链或双链的，但是优选是双链dna。
术语”氨基酸”在本申请中使用时指天然存在的羧基α氨基酸的组，其包括丙氨酸(三字母编码:ala,一字母编码:a),精氨酸(arg,r),天冬酰胺(asn,n),天冬氨酸(asp,d),半胱氨酸(cys,c),谷氨酰胺(gln,q),谷氨酸(glu,e),甘氨酸(gly,g),组氨酸(his,h),异亮氨酸(ile,i),亮氨酸(leu,l),赖氨酸(lys,k),甲硫氨酸(met,m),苯丙氨酸(phe,f),脯氨酸(pro,p),丝氨酸(ser,s),苏氨酸(thr,t),色氨酸(trp,w),酪氨酸(tyr,y),和缬氨酸(val,v)。
用于本文中时，表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可交替使用，且全部这些名称都包括子代。因此，词语“转化体”和“转化的细胞”包括原代受试细胞和由其来源的培养物，而不考虑转移的次数。还理解所有的子代的dna含量可能不精确一致，这归因于有意或无意的突变。包括在最初转化的细胞中筛选的具有相同功能或生物学活性的变异子代。
根据本发明所述的抗体可以由重组方式产生。因此，本发明的一个方面是编码根据本发明所述的抗体的核酸，并且另一个方面是包含编码根据本发明抗体的所述核酸的细胞。用于重组生产的方法是现有技术中广泛已知的并且包含在原核细胞和真核细胞中的蛋白表达，以及随后的抗体分离和通常纯化为药用纯度。对于将前述抗体在宿主细胞中的表达，将编码各个修饰的轻链和重链的核酸通过标准方法插入表达载体中。在适合的原核或真核宿主细胞如cho细胞,ns0细胞,sp2/0细胞,hek293细胞,cos细胞,per.c6细胞,酵母,或大肠杆菌细胞中进行表达，并且将所述抗体从细胞(上清液或裂解后的细胞)中回收。用于重组生产抗体的一般方法是现有技术中公知的，并且例如在makrides,s.c.,proteinexpr.purif.17(1999)183-202；geisse,s.,等,proteinexpr.purif.8(1996)271-282；kaufman,r.j.,分子生物技术(mol.biotechnol.)16(2000)151-161；werner,r.g.,j.drugres(药物研究杂志).48(1998)870-880的综述文章中描述。
根据本发明所述的抗体适当地从培养基中通过常规免疫球蛋白纯化方法分离，所述纯化方法如，例如蛋白a-琼脂糖,羟基磷灰石层析法，凝胶电泳，透析或亲和层析法。编码所述单克隆抗体的dna和rna容易地使用常规方法进行分离和测序。杂交瘤细胞可以充当所述dna和rna的来源。一旦被分离，可以将dna插入表达载体中，所述表达载体接着被转染到不另外产生免疫球蛋白的宿主细胞如hek293细胞,cho细胞,或骨髓瘤细胞中，从而在宿主细胞中获得重组单克隆抗体的合成。
提供下列实施例，序列表和附图来辅助理解本发明，其真实范围在后附的权利要求中提出。需要理解可以在不背离本发明实质的情况下对本发明进行改动。
氨基酸和核苷酸序列描述
seqidno：1抗afp单克隆抗体的轻链可变结构域的氨基酸序列
seqidno：2抗afp单克隆抗体的重链可变结构域的氨基酸序列
seqidno：3抗afu单克隆抗体的轻链可变结构域的氨基酸序列
seqidno：4抗afu单克隆抗体的重链可变结构域的氨基酸序列
seqidno：5抗ggtii单克隆抗体的轻链可变结构域的氨基酸序列
seqidno：6抗ggtii单克隆抗体的重链可变结构域的氨基酸序列
seqidno：7抗hgf单克隆抗体的轻链可变结构域的氨基酸序列
seqidno：8抗hgf单克隆抗体的重链可变结构域的氨基酸序列
seqidno：9抗gpc3单克隆抗体的轻链可变结构域的氨基酸序列
seqidno：10抗gpc3单克隆抗体的重链可变结构域的氨基酸序列
seqidno：11编码抗afp单克隆抗体的轻链可变结构域的核苷酸序列
seqidno：12编码抗afp单克隆抗体的重链可变结构域的核苷酸序列
seqidno：13编码抗afu单克隆抗体的轻链可变结构域的核苷酸序列
seqidno：14编码抗afu单克隆抗体的重链可变结构域的核苷酸序列
seqidno：15编码抗ggtii单克隆抗体的轻链可变结构域的核苷酸序列
seqidno：16编码抗ggtii单克隆抗体的重链可变结构域的核苷酸序列
seqidno：17编码抗hgf单克隆抗体的轻链可变结构域的核苷酸序列
seqidno：18编码抗hgf单克隆抗体的重链可变结构域的核苷酸序列
seqidno：19编码抗gpc3单克隆抗体的轻链可变结构域的核苷酸序列
seqidno：20编码抗gpc3单克隆抗体的重链可变结构域的核苷酸序列
seqidno：21抗afp单克隆抗体的轻链可变结构域的cdr1序列
seqidno：22抗afp单克隆抗体的轻链可变结构域的cdr2序列
seqidno：23抗afp单克隆抗体的轻链可变结构域的cdr3序列
seqidno：24抗afp单克隆抗体的重链可变结构域的cdr1序列
seqidno：25抗afp单克隆抗体的重链可变结构域的cdr2序列
seqidno：26抗afp单克隆抗体的重链可变结构域的cdr3序列
seqidno：27抗afu单克隆抗体的轻链可变结构域的cdr1序列
seqidno：28抗afu单克隆抗体的轻链可变结构域的cdr2序列
seqidno：29抗afu单克隆抗体的轻链可变结构域的cdr3序列
seqidno：30抗afu单克隆抗体的重链可变结构域的cdr1序列
seqidno：31抗afu单克隆抗体的重链可变结构域的cdr2序列
seqidno：32抗afu单克隆抗体的重链可变结构域的cdr3序列
seqidno：33抗ggtii单克隆抗体的轻链可变结构域的cdr1序列
seqidno：34抗ggtii单克隆抗体的轻链可变结构域的cdr2序列
seqidno：35抗ggtii单克隆抗体的轻链可变结构域的cdr3序列
seqidno：36抗ggtii单克隆抗体的重链可变结构域的cdr1序列
seqidno：37抗ggtii单克隆抗体的重链可变结构域的cdr2序列
seqidno：38抗ggtii单克隆抗体的重链可变结构域的cdr3序列
seqidno：39抗hgf单克隆抗体的轻链可变结构域的cdr1序列
seqidno：40抗hgf单克隆抗体的轻链可变结构域的cdr2序列
seqidno：41抗hgf单克隆抗体的轻链可变结构域的cdr3序列
seqidno：42抗hgf单克隆抗体的重链可变结构域的cdr1序列
seqidno：43抗hgf单克隆抗体的重链可变结构域的cdr2序列
seqidno：44抗hgf单克隆抗体的重链可变结构域的cdr3序列
seqidno：45抗gpc3单克隆抗体的轻链可变结构域的cdr1序列
seqidno：46抗gpc3单克隆抗体的轻链可变结构域的cdr2序列
seqidno：47抗gpc3单克隆抗体的轻链可变结构域的cdr3序列
seqidno：48抗gpc3单克隆抗体的重链可变结构域的cdr1序列
seqidno：49抗gpc3单克隆抗体的重链可变结构域的cdr2序列
seqidno：50抗gpc3单克隆抗体的重链可变结构域的cdr3序列
附图说明
图1.实施例3中hgf单克隆抗体纯化图谱；
图2.实施例3中afp单克隆抗体纯化图谱；
图3.实施例3中ggtⅱ单克隆抗体纯化图谱；
图4.实施例7中hgfh1及h2单克隆抗体(h1为igg2a类型，h2为igg2b类型，对第一种进行了测序)对不同细胞系中hgf表达的检测；
图5.实施例7中afp单克隆抗体对不同细胞系中afp表达的检测；
图6.实施例7中ggtⅱ单克隆抗体对不同细胞系中ggtⅱ表达的检测；
图7.实施例7中gpc3单克隆抗体对不同细胞系中gpc3表达的检测；
图8.实施例6中elisa法对人血清hgf含量的检测；
图9.实施例8中afp单克隆抗体免疫组织化学法检测肝癌组织afp的表达；
图10.实施例9中ggtⅱ单克隆抗体免疫荧光法检测肝癌细胞ggtⅱ的表达；
图11.实施例9中gpc3单克隆抗体免疫荧光法检测肝癌细胞gpc3的表达；
图12.实施例5中hgf单链抗体sds-page图；
图13.实施例4中overlappcr连接afpvh和afpvl片段电泳图；
图14.实施例8中hgf单克隆抗体免疫组织化学法检测肝癌组织afp的表达(结论：抗体可以应用于人肝细胞肝癌免疫组化)；
图15.实施例8中afu单克隆抗体免疫组织化学法检测肝癌组织afp的表达(结论：抗体可以应用于人肝细胞肝癌免疫组化)；
图16.实施例1中各免疫原蛋白的氨基酸序列(注：所用afp抗原为市售蛋白)；
图17.实施例10afp、afu、hgf、gpc3和ggt2在四组受试者血清中含量统计图；
图18.实施例10在全人群筛查肝癌时afp、afu、hgf、gpc3和ggt2单独检测全期肝癌患者血清的roc曲线图；
图19.实施例10在全人群筛查肝癌时hgf单指标纳入受试者年龄和性别检测全期肝癌和早期肝癌患者血清的roc曲线图；
图20.实施例10在全人群筛查肝癌时，双指标纳入受试者性别检测全期肝癌和早期肝癌患者血清的roc曲线图；
图21.实施例10在全人群筛查肝癌时，双指标纳入受试者年龄检测全期肝癌和早期肝癌患者血清的roc曲线图；
图22.实施例10在全人群筛查肝癌时，三指标检测全期肝癌和早期肝癌患者血清的roc曲线图；
图23.实施例10在全人群筛查肝癌时，四指标检测全期肝癌和早期肝癌患者血清的roc曲线图；
图24.实施例10在全人群筛查肝癌时，五指标联合检测全期及早期肝癌患者血清的roc曲线图；
图25.实施例10在肝炎患者中筛查肝癌时，hgf单指标及hgf纳入受试者年龄性别检测全期肝癌和早期肝癌的roc曲线图；
图26.实施例10在肝炎患者中筛查肝癌时，双指标纳入受试者性别检测全期肝癌和早期肝癌患者血清的roc曲线图；
图27.实施例10在肝炎患者中筛查肝癌时，双指标纳入受试者年龄检测全期肝癌和早期肝癌患者血清的roc曲线图；
图28.实施例10在肝炎患者中筛查肝癌时，三指标检测全期肝癌和早期肝癌患者血清的roc曲线图；
图29.实施例10在肝炎患者中筛查肝癌时，四指标检测全期肝癌和早期肝癌患者血清的roc曲线图；
图30.实施例10在肝炎患者中筛查肝癌时，五指标检测全期肝癌和早期肝癌患者血清的roc曲线图；
图31.实施例10在肝硬化患者中筛查肝癌时，hgf单指标及hgf纳入受试者年龄性别检测全期肝癌和早期肝癌的roc曲线图；
图32.实施例10在肝硬化患者中筛查肝癌时，双指标纳入受试者性别或年龄检测全期肝癌和早期肝癌患者血清的roc曲线图；
图33.实施例10在肝硬化患者中筛查肝癌时，三指标检测全期肝癌和早期肝癌患者血清的roc曲线图；
图34.实施例10在肝硬化患者中筛查肝癌时，四指标检测全期肝癌和早期肝癌患者血清的roc曲线图；
图35.实施例10在肝硬化患者中筛查肝癌时，五指标检测全期肝癌和早期肝癌患者血清的roc曲线图；和
图36.实施例10中afp、afu、hgf、gpc3和ggt2在肝癌病人血清，乙肝病人血清，肝硬化病人血清及正常人血清中检测值模型验证。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体描述，它们只用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据上述本发明的内容做出一些非本质的改进和调整，均属本发明保护范围。
实施例1：制备hgf抗体动物免疫及免疫效价测定(以hgf为例，其余抗体步骤相同或类似)
1)7周大小雌性balb/c小鼠3只，首次免疫采用100μghgf融合蛋白(任选地例如带有标签蛋白如his的hgf蛋白)/每只鼠，加等体积福氏完全佐剂，通过三通来乳化混勾形成油包水的乳糜状，皮下多点注射。
2)间隔三周后抗原剂量减半，加福氏不完全佐剂及生理盐水混匀，腹腔注射。同法免疫四次后釆取静脉血测效价。
3)包被hgf蛋白，4ng/ml。4℃过夜；
4)pbs清洗一遍后，0.2％bsa室温封闭1h；
5)血清分别稀释成1:200、1:400、1:800、1:2000、1:4000、1:8000、1:20000。pbs为空白对照，未免疫过的小鼠血清作为阴性对照。37℃孵育2h；
6)pbs清洗三遍后，羊抗鼠二抗1:5000，37℃孵育1h；
7)pbs清洗五遍后，opd显色5-l0min；
8)终止液终止，492nm波长下检测吸光度。
实施例2：细胞融合及融合细胞的筛选
1)处死7周大小balb/c小鼠2只，取巨噬细胞作为饲养细胞铺在6块96孔板内；
2)取静脉冲击三天后的小鼠处死后取脾脏，与骨髓瘤细胞sp2/0融合后无限稀释法铺成6个96孔板。培养条件为含20％fbs的1×hat的dmem/f12培养液；
3)10天后观察克隆生长，期间补充两次含血清的1×hat的dmem/f12培养液；
4)显微镜下观察杂交瘤细胞，又圆又亮葡萄串生长的即可以开始检测特异性。用elisa法筛选出能与抗原特异性结合的阳性孔进行亚克隆化；
5)有限稀释法亚克隆：取巨嗟细胞作为词养细胞铺在6块96孔板内。调整阳性孔细胞数为1×103/ml左右，加入含血清的1×ht的rpmi1640培养液使每孔细胞分别为2个/孔，1个/孔，0.5个/孔；
6)4-5天后观察，用elisa法对上清进行抗体检测，再得到阳性孔扩大培养再进行克隆化，直到得到单克隆抗体细胞；
7)筛选出的阳性单克隆株扩大化培养，冻存至液氮罐，定期复苏检查细胞活性和分泌抗体的稳定性。本发明筛选出的5种抗体稳定性非常好，杂交瘤细胞株经过多次鉴定都保持了强分泌抗体的特性。
实施例3：腹水的制备与纯化
1)准备10周大左右的雌性balb/c小鼠5只，腹腔注射500μlpristine/只，待7-21天后每只鼠腹腔注射2×106个处于对数生长期的杂交瘤细胞，10天后密切观察小鼠，待腹水尽可能多时处死小鼠取出腹水。3000rpm，15min离心去杂质，去油脂。
2)盐析法沉淀免疫球蛋白：用pbs将腹水稀释一倍，加入饱和硫酸铵使终浓度为33％。边滴加边摇晃。4℃放置4小时以上。12000rpm，离心15min后弃去上清。沉淀用适量pbs溶解，放入透析袋，4℃透析过夜。
3)取出透析液，使用泳动泵将液体上柱，免疫球蛋白会特异性与proteing结合，将留出的液体再上柱一遍使结合更加完全，用pbbuffer不断过柱，将杂蛋白洗脱下来；
4)将结合好的柱子装在akta蛋白分离纯化仪上，pbbuffer平衡后，将流动相换成0.1m甘氨酸洗脱液，观察uv吸收峰。洗脱液管保存冰上，以免蛋白降解；
5)将洗脱液转移到50ml浓缩管(100kd)，2000rpm，4℃离心4小时。不断加入pbbuffer置换，直到剩下1ml左右蛋白溶液，吸出至ep管，检测od值，测定浓度；
6)将单克隆抗体稀释到1mg/ml，加入甘油，分装，-20℃保存。
实施例4：hgf单链抗体载体的构建(以hgf为例，其余抗体步骤相同或类似)
1)选取处于对数生长期，能持续分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞2×107个，使用trizol裂解液提取rna。
2)将rna用depc水稀释到300ng/μl，使用逆转录试剂盒进行rna逆转录，得到的cdna用于进行pcr扩增。
3)pcr扩增hgfvh、hgfvl片段：以逆转录合成的hgfcdna为模板，分别以p1，p2和p3，p4为引物扩增重轻链可变区片段，反应体系为50μl。
扩增重链轻链可变区的简并性引物：
p1：重链上游5’-saggtgmagctkcassartcwgg
p2：重链下游5’-tggggstgtygttttggctgmrgagacrgtga
p3:κ上游5’-gacattgtkmtsacmcagymkycm
p4:κ下游5’-ggatacagttggtgcagcatcatcagcccgttt
4)反应产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳分离，采用切胶回收试剂盒纯化回收。
5)将切胶回收的hgfvhdna、hgfvldna分别与pmd19tvector连接，连接产物分别转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，使用蓝白筛选挑选阳性克隆，测序正确后提取质粒。
6)以测序阳性的克隆为模板，pcr法分别扩增hgfvh和hgfvl，通过overlappcr将hgfvh和hgfvl通过glyglyglyglyser(g4s)基因片段连接。
7)利用限制性内切酶mlui，sphi酶切hgfvh-vl基因片段，与用同样酶切的payzvector进行连接。连接产物转化16c9感受态细菌，通过菌落pcr挑选阳性克隆，测序正确后用于融合蛋白的表达。
本发明获得的单克隆抗体的轻链和重链可变结构域的氨基酸序列及其编码核苷酸序列如以下和序列表中所示。
本发明所述的五个单链抗体的碱基序列为：
1)hgfscfv(igg2b)
gagctcgatattcagatgatacagtctccatcctccgtggaggcagctgtgggaggcacagtcaccatcaagtgccaggccagtgaggatattagtagtaatttagcctggtgtcagcagaaaccaggacagcctcccaagctcctgatctatggtgcatccactctggcatctggggtcccatcgcggttcaaaggcagtggatctgggacacagtatactctcaccatcagcgacgtgcagtgtgacgatgctgccacttactactgtgcaggcggttatagtcgtggtagtgatacttttgctttcggcgtggggaccaagctggaaataaaaggtggttcctctagatcttccctcgaggtgaagctgatggaatctggggctgagctggtgaggcctggggcttcagtgacgctgtcctgcaaggcttcgggctacacatttactgactatgaaatgcactgggtgaagcagacacctgtgcatggcctggaatggattggagctattgatcctgaaactggtggtactgcctacagtcagaagttcaagggcaaggccacactgactgcagacaaatcttccagcacagcctacatggagctccgcagcctgacatctgaggactctgccgtctattactgtacgctaaggattgcttactggggccaagggactctggtcactgtctctgcagagagtcagtccttcccaaatgtcactagtggaggtggaggtaaaggaggtggaggtggccaggccggccagcaccatcaccatcaccatggcgcatacccgtacgacgttccggactacgcttcttag
2)afpscfv(igg2a)
gcgc
3)afuscfv(igm)
gagctcgatattaagataacccagtctccatcttatcttgctgcatctcctggagaaaccattactattaattgcagggcaagtaagagcattagcaaatatttagcctggtatcaagagaaacctgggaaaactaataagcttcttatctactctggatccactttgcaatctggaattccatcaaggttcagtggcagtggatctggtacagatttcactctcaccatcagtagcctggagcctgaagattttgcaatgtattactgtcaacagcataatgaatacccgtacacgttcggaggggggaccaagctggagctgaaaggtggttcctctagatcttccctcgaggtgaagcttgaggagtctggggctgagctggtgaggcctggagtctcagtgaagatttcctgcaagggttctggctacacgctcactgattatgctatgcactgggtgaggcagagtcctgcaaagagtctagagtggattggagttattagtacatactatggtgatgctaactacaaccagaagttcaagggcaaggccacaatgactgttgacagaccctccagcacagcctatatggaacttgccagactgacatctgaggattctgccatctattactgtgcaagagatggttacgacgtcttctatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagagagtcagtccttcccaaatgtcactagtggaggtggaggtaaaggaggtggaggtggccaggccggccagcaccatcaccatcaccatggcgcatacccgtacgacgttccggactacgcttcttag
4)ggtⅱscfv(igg2b)
gagctcgacattttgatgactcagactccactctccctgtctgtcagtcttggagatcaagcctccatctcttgcagatctaatcggagccttgtacacagtaatggaaacacctatttacattggtacctgcagaagccaggccagtctccaaagctcctgatctacaaagtttccaaccgattttctggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcacactcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttatttctgctctcaaagtacacatgttccgtacacgttcggaggggggaccaagctggagctgaaaggtggttcctctagatcttccctcgaggtgcagctgcagcagtctggggctgagctggtgaggcctggagtctcagtgaagatttcctgcaagggttctggctacacgttcactgattatgctatgcactgggtgaggcagagtcctgcaaagagtctagagtggattggagttattagtacatactatggtgatgctaactacaaccagaagttcaagggcaaggccacaatgactgttgacagatcctccagcacagcctatatggaacttgccagactgacatctgaggattctgccatctattactgtgcaagagatggttacgacgtcttctatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagccaaaacaacagccccatctgtcactagtggaggtggaggtaaaggaggtggaggtggccaggccggccagcaccatcaccatcaccatggcgcatacccgtacgacgttccggactacgcttcttag
5)gpc3scfv(igg2b)
gagctcgacattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctgtgtctcctggggaaacagccaccctctcctgctgggccagtcagagtattggcacctacttagcctggtaccaacagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctacggtgcattcaccagggccgctggtgtcccagacaggttcactggcagtggctctgggacactcttcactctcaccatcagcagcctgcagtctgaagattttgcaatttattattgtcagcagtttaataactggcctcggacgttcggccgggggaccaagctggaaatcaaaggtggttcctctagatcttccctcgaggtgcagctgaaggagtcgggacctggcctggtgaaaccttctcagtctctgtccctcacctgcactgtcactggctactcaatcaccagtgattatggctggaactggatccggcagtttccaggaaacaaactggagtggatgggctacataagctacagtggtggcactagctacaacccatctctcaaaagtcgaatctctatcactcgagacacatccaagaaccagttcttcctgcagttgaattctgtgactactgaggacacagccacatatttctgtgcaagagatcctggggaatattactatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctccccagccaaaacgacacccccatctgtcactagtggaggtggaggtaaaggaggtggaggtggccaggccggccagcaccatcaccatcaccatggcgcatacccgtacgacgttccggactacgcttcttag
afp的重链、轻链可变区氨基酸序列及其编码核苷酸序列，其中加粗、加下划线部分为cdr区序列：轻链：
ggatacagttggtgcagcatcagcccgtttgatttccagcttggtgcctccaccgaacgtccacggagtaccccaaaaatgttgacagtaataaattccaaaatcttcagactgcaggctgttgatcttgagggaatattgtgtgcctgatccactgccactgaaccttgatggcacaccatctgctaagtttcttgcaacatagaccaggagctgaggagattttccctgtttctgctgataccatgttaattcactgtaaatattctcacttgctcgacatgtgatggtgacagtttctcccacagatacagatagggaggcgggcgactgggtgagcacaatgtc
氨基酸序列：
divltqspaslsvsvgetvtitcraseniyseltwyqqkqgkspqllvyvarnladgvpsrfsgsgsgtqyslkinslqsedfgiyycqhfwgtpwtfgggtkleikradaaptvs
重链：
gaggtgcagctgcagcagtcaggggctgaactggtgaagcctggggcttcagtgaagttgtcctgcaaggcttctggctacaccttcaccaactactatatgtactgggtgaagcagaggcctggacaaggccttgagtggattggagagattaatcctagcaatggtgatactaacttcaatgagaagttcaagagcaaggccacactgactgtagacaaatcctccagcacagcatacatgcaactcagcagcctgacatctgaggactctgcggtctattactgtacaagatggagggcaactcggactatagggtttgcttactggggccaagggactctggtcactgtctctgcagccaaaacgacagcccca
氨基酸序列：
evqlqqsgaelvkpgasvklsckasgytftnyymywvkqrpgqglewigeinpsngdtnfnekfkskatltvdkssstaymqlssltsedsavyyctrwratrtigfaywgqgtlvtvsaakttap
afu的重链、轻链可变区氨基酸序列及其编码核苷酸序列：
轻链
gagctcgatattaagataacccagtctccatcttatcttgctgcatctcctggagaaaccattactattaattgcagggcaagtaagagcattagcaaatatttagcctggtatcaagagaaacctgggaaaactaataagcttcttatctactctggatccactttgcaatctggaattccatcaaggttcagtggcagtggatctggtacagatttcactctcaccatcagtagcctggagcctgaagattttgcaatgtattactgtcaacagcataatgaatacccgtacacgttcggaggggggaccaagctggagctgaaa
氨基酸序列：
eldikitqspsylaaspgetitincrasksiskylawyqekpgktnklliysgstlqsgipsrfsgsgsgtdftltisslepedfamyycqqhneypytfgggtklelk
重链
ctcgaggtgaagcttgaggagtctggggctgagctggtgaggcctggagtctcagtgaagatttcctgcaagggttctggctacacgctcactgattatgctatgcactgggtgaggcagagtcctgcaaagagtctagagtggattggagttattagtacatactatggtgatgctaactacaaccagaagttcaagggcaaggccacaatgactgttgacagaccctccagcacagcctatatggaacttgccagactgacatctgaggattctgccatctattactgtgcaagagatggttacgacgtcttctatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagagagtcagtccttcccaaatgtcactagtggaggtggaggtaaaggaggtggaggt
氨基酸序列：
levkleesgaelvrpgvsvkisckgsgytltdyamhwvrqspakslewigvistyygdanynqkfkgkatmtvdrpsstaymelarltsedsaiyycardgydvfyamdywgqgtsvtvssesqsfpnvtsggggkgggg
ggt2的重链、轻链可变区氨基酸序列及其编码核苷酸序列：
轻链
gagctcgacattttgatgactcagactccactctccctgtctgtcagtcttggagatcaagcctccatctcttgcagatctaatcggagccttgtacacagtaatggaaacacctatttacattggtacctgcagaagccaggccagtctccaaagctcctgatctacaaagtttccaaccgattttctggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcacactcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttatttctgctctcaaagtacacatgttccgtacacgttcggaggggggaccaagctggagctgaaa
氨基酸序列：
eldilmtqtplslsvslgdqasiscrsnrslvhsngntylhwylqkpgqspklliykvsnrfsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedlgvyfcsqsthvpytfgggtklelk
重链
ctcgaggtgcagctgcagcagtctggggctgagctggtgaggcctggagtctcagtgaagatttcctgcaagggttctggctacacgttcactgattatgctatgcactgggtgaggcagagtcctgcaaagagtctagagtggattggagttattagtacatactatggtgatgctaactacaaccagaagttcaagggcaaggccacaatgactgttgacagatcctccagcacagcctatatggaacttgccagactgacatctgaggattctgccatctattactgtgcaagagatggttacgacgtcttctatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagccaaaacaacagccccatctgtcactagtggaggtggaggtaaaggaggtggaggt
氨基酸序列：
levqlqqsgaelvrpgvsvkisckgsgytftdyamhwvrqspakslewigvistyygdanynqkfkgkatmtvdrssstaymelarltsedsaiyycardgydvfyamdywgqgtsvtvssakttapsvtsggggkgggg
hgf的重链、轻链可变区氨基酸序列及其编码核苷酸序列：
轻链
gagctcgatattcagatgatacagtctccatcctccgtggaggcagctgtgggaggcacagtcaccatcaagtgccaggccagtgaggatattagtagtaatttagcctggtgtcagcagaaaccaggacagcctcccaagctcctgatctatggtgcatccactctggcatctggggtcccatcgcggttcaaaggcagtggatctgggacacagtatactctcaccatcagcgacgtgcagtgtgacgatgctgccacttactactgtgcaggcggttatagtcgtggtagtgatacttttgctttcggcgtggggaccaagctggaaataaaa
氨基酸序列：
eldiqmiqspssveaavggtvtikcqasedissnlawcqqkpgqppklliygastlasgvpsrfkgsgsgtqytltisdvqcddaatyycaggysrgsdtfafgvgtkleik
重链
ctcgaggtgaagctgatggaatctggggctgagctggtgaggcctggggcttcagtgacgctgtcctgcaaggcttcgggctacacatttactgactatgaaatgcactgggtgaagcagacacctgtgcatggcctggaatggattggagctattgatcctgaaactggtggtactgcctacagtcagaagttcaagggcaaggccacactgactgcagacaaatcttccagcacagcctacatggagctccgcagcctgacatctgaggactctgccgtctattactgtacgctaaggattgcttactggggccaagggactctggtcactgtctctgcagagagtcagtccttcccaaatgtcactagtggaggtggaggtaaaggaggtggaggt
氨基酸序列：
levklmesgaelvrpgasvtlsckasgytftdyemhwvkqtpvhglewigaidpetggtaysqkfkgkatltadkssstaymelrsltsedsavyyctlriaywgqgtlvtvsaesqsfpnvtsggggkgggg
gpc3的重链、轻链可变区氨基酸序列及其编码核苷酸序列：
轻链
gagctcgacattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctgtgtctcctggggaaacagccaccctctcctgctgggccagtcagagtattggcacctacttagcctggtaccaacagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctacggtgcattcaccagggccgctggtgtcccagacaggttcactggcagtggctctgggacactcttcactctcaccatcagcagcctgcagtctgaagattttgcaatttattattgtcagcagtttaataactggcctcggacgttcggccgggggaccaagctggaaatcaaa
氨基酸序列：
eldivltqspatlsvspgetatlscwasqsigtylawyqqkpgqaprlliygaftraagvpdrftgsgsgtlftltisslqsedfaiyycqqfnnwprtfgrgtkleik
重链
ctcgaggtgcagctgaaggagtcgggacctggcctggtgaaaccttctcagtctctgtccctcacctgcactgtcactggctactcaatcaccagtgattatggctggaactggatccggcagtttccaggaaacaaactggagtggatgggctacataagctacagtggtggcactagctacaacccatctctcaaaagtcgaatctctatcactcgagacacatccaagaaccagttcttcctgcagttgaattctgtgactactgaggacacagccacatatttctgtgcaagagatcctggggaatattactatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctccccagccaaaacgacacccccatctgtcactagtggaggtggaggtaaaggaggtggaggt
氨基酸序列：
levqlkesgpglvkpsqslsltctvtgysitsdygwnwirqfpgnklewmgyisysggtsynpslksrisitrdtsknqfflqlnsvttedtatyfcardpgeyyyamdywgqgtsvtvspakttppsvtsggggkgggg
实施例5：单链抗体的表达与纯化(以hgf为例，其余抗体步骤相同)
1)将重组的融合蛋白表达载体payz-hgfvh-vl转化大肠杆菌16c9，将测序正确的单菌落接种于15ml含氨苄青霉素100μg/ml的2×yt培养基中，在恒温摇瓶箱中37℃，200rpm，震荡培养过夜。将培养好的小量菌液移入1000ml含氨苄青霉素100μg/ml的2×yt培养基中扩大培养，在4℃，8000rpm，离心10min,，收集菌体。
2)将收集到的菌体在室温与-20℃间反复冻融几次，增加细菌壁的通透性，便于裂解；按照培养基：裂解液体积比为40:1的比例，向化冻后的菌体内加入50ml细菌周质腔裂解液，轻轻震荡混匀后，置于4℃轻摇1h；4℃，12000rpm离心10min，取上清；
3)将含有目的蛋白的上清液放入预先处理过(经edta和碳酸氢钠混合煮沸5min取出，edta再煮沸5min)的透析袋内，用1×pbs透析24h，前4h内每2h换一次透析液，后20h内逐渐延长更换透析液间隔直至过夜；
4)透析过的周质腔蛋白液经0.22μm的滤膜过滤后，hitrapff亲和层析柱纯化。洗脱并浓缩蛋白后分装后保存于-20℃，即为hgf单链抗体。
5)sds-page凝胶电泳检测纯化后的单链抗体。
实施例6：elisa法验证所制备的单克隆抗体(以hgf为例，其余抗体步骤相同)
1)酶标板包被hgf单克隆抗体，4℃过夜；
2)pbs清洗一遍后，0.2％bsa室温封闭1h；
3)将30例hcc患者血清和30例正常人血清分别1:2稀释后加入酶标板微孔中，pbs为空白对，37℃孵育2h；
4)加入生物素标记的hgf抗体1:500稀释，37℃孵育1h；
4)pbs清洗三遍后，加入亲和素-辣根过氧化物酶(advin-hrp)，37℃孵育1h；
5)pbs清洗五遍后，opd显色5-l0min；
6)终止液终止，492nm波长下检测吸光度。
实施例7：westernblotting法验证所制备的单克隆抗体
1)将培养好的肝癌细胞hepg2(atcchb-8065)、hep3b(atcchb-8064)、smmc-7721(可商购自上海复祥生物科技有限公司)、hl-7702(可商购自通派(上海)生物科技有限公司)等使用sds裂解液提取蛋白，使用bca法测定蛋白浓度后上样或-80℃保存。
2)配置10％的sds-page分离胶和5％的浓缩胶。
3)取30-50μg蛋白上样，上样前在蛋白中加入5×loadingbuffer，95℃变性5min；选择合适分子量的蛋白marker作为标尺。
4)电泳：开始时恒压60v，待条带进入分离胶后，将电压调至120v，电泳至溴酚蓝跑到胶的底部即可停止，进行考马斯亮蓝染色或者转膜。
5)考马斯亮蓝染色：用至少5倍体积的考马斯亮蓝染色液浸泡凝胶，在摇床上孵育3-4h，吸走染色液后用脱色液脱至目的条带清晰，将凝胶扫描。
6)如不染色则进行转膜。转膜夹中放置海绵、滤纸、pvdf膜和胶(正极方向先是一层海绵垫—再放三层滤纸—将pvdf膜放在滤纸上—胶—三层滤纸—海绵垫—负极)，装到转膜仪中，250ma恒流，根据目的蛋白分子量的大小转膜l-3h。
7)转膜结束后，将pvdf膜用tbst清洗一遍，用5％脱脂奶粉或bsa室温孵育1h封闭抗原。
8)加入一抗：用脱脂奶粉将抗体稀释到合适的浓度，his-tag(l:1000)，单克隆培养上清液或腹水(1:1000-1:5000)加在膜上，4℃孵育过夜，tbst清洗三次，每次10min。
9)室温孵育二抗1h，二抗用1％脱脂奶粉或者1％的bsa稀释到合适浓度(1:5000-1:10000)，tbst清洗三次，每次10min。
10)化学发光法(ecl)显色，暗室曝光。
实施例8：免疫组织化学法验证所制备的单克隆抗体
1)肝癌组织石蜡切片脱蜡：干烤65℃过夜——二甲苯i20min——二甲苯ii20min——无水乙醇i5～10min——无水乙醇ii5～10min——95％乙醇2min——85％乙醇2min——75％乙醇2min——60％乙醇2min——蒸馏水清洗。
2)抗原热修复：切片中加入400mlpbs+8ml抗原修复液，使用高压锅140℃，维持2min，室温自然冷却。
3)灭活内源性过氧化物酶：片子甩、擦干，3％h2o2常温避光作用10min(在湿盘中操作，每张片子50～60μl的液量)。
4)孵育一抗(单克隆抗体)：pbs清洗3次×2min；用3％bsa将单克隆抗体稀释至适合浓度(1:500～1:2000)加到切片上，一抗室温半小时孵育后，4℃过夜。
5)孵育二抗：从4℃拿出的切片首先在室温孵育半小时，pbs清洗3次×2min；用3％bsa将二抗稀释至适合浓度(1:500)加到切片上，37℃孵育箱30～40min。
6)dab显色。
7)复染：①苏木素3～5min，自来水冲洗；②盐酸酒精约30秒，自来水冲洗，紫—深红—浅红(观察颜色)；③0.5％氨水1～2min，自来水冲洗。镜下观察细胞染色，染色深则分化时间(盐酸酒精)稍长些即可；染色浅则再置于苏木素中染色即可。
8)脱水：70％乙醇3min——85％乙醇3min——95％乙醇3min——无水乙醇i5～10min——无水乙醇ii5～10min——二甲苯i1小时——二甲苯ii1小时(时间不定)。
9)用中性树脂封片，保存，照相。
实施例9：免疫荧光法验证所制备的单克隆抗体
1)实验前一天将含2-3×104细胞(hepg2)的单细胞悬液铺种在放有盖玻片的十二孔盘中一个孔中(要保证有单个细胞)。每个条件做两个附孔，待细胞贴壁12～24h后，用于实验分析。
2)用pbs洗涤细胞3次，1ml/孔4％的pfa于室温固定10min。吸出pfa，用pbs洗3次，加入1ml的50mm氯化铵于室温孵育10min，吸取氯化铵，pbs洗3次。
3)加入1ml的0.2％tritonx-100，10min；吸出triton，pbs洗3次；
4)加入1ml3％的bsa封闭，室温1h，可在摇床上晃动；吸出bsa，用pbs洗10min。
5)加一抗(单克隆抗体)，稀释比例为1：200-1：500，将抗体(双染各加20μl，单染加40μl)到保鲜膜或封口膜上，将盖玻片从十二孔盘中取出，吸干多余的水分，有细胞的一面接触抗体，室温>1h或4℃过夜。
6)将玻片重新放回到十二孔盘中，有细胞的一面朝上，用pbs洗3次，10min/次；加二抗，稀释比例一般为1：400，避光室温反应1h。
7)将玻片重新放回到十二孔盘中，有细胞的一面朝上，pbs洗3次，10min/次。加dapi染细胞核，一般稀释比例为1：1000，每个盖玻片20μl，避光于室温反应10min。
8)将玻片重新放回到十二孔盘中，有细胞的一面朝上，pbs洗2次，10min/次。把封片剂(mowoil)滴在载玻片上，每片15μl，将有细胞的面朝下，勿有气泡。等封片剂干后室温约30min后放在4℃，避光保存。
9)荧光显微镜下观察染色结果。
如从附图中可以看出，本发明所制备的hgf单克隆抗体能很好应用于elisa和westernblotting对hgf的检测；所制备的afp单克隆抗体能很好应用于elisa、westernblotting和ihc对afp的检测；所制备的afu单克隆抗体能够很好地应用于elisa和westernblotting对afu的检测；所制备的ggtⅱ单克隆抗体能很好应用于elisa、westernblotting和if对ggtⅱ的检测；所制备的gpc3单克隆抗体能很好地应用于elisa、westernblotting和if对gpc3的检测。
实施例10.本发明抗体或其组合诊断肝癌的应用
在天津医科大学肿瘤医院，分别收集肝癌患者、乙肝患者及正常者外周血各60-300例。在实验中收集了肝癌患者血清288例，乙肝患者血清87例，肝硬化患者80例，正常者血清241例。
外周血收集1小时内，3000g离心5-10分钟，取血清移入新的离心管，-80℃冰箱保存。
通过使用上述实施例中制备的单克隆抗体或单链抗体，通过elisa检测待测血清中afp、afu、gpc3、ggt2和hgf的浓度。
1)诊断试验评价指标及选择
采用灵敏度(真阳性率，sensitivity)、特异度(真阴性率，specificity)、阳性预测值(ppv)、阴性预测值(npv)评价待测指标的诊断效果：
灵敏度＝tp/(tp+fn)×100％
特异度＝tn/(tn+fp)×100％
阳性预测值＝tp/(tp+fp)×100％
阴性预测值＝tn/(tn+fn)×100％
正确指数(youdenindex)＝(灵敏度+特异度)-100％
其中，tn(truenegative)＝真阴性；fp(falsepositive)＝假阳性；tp(truepositive)＝真阳性；fn(falsenegative)＝假阴性。
选用受试者工作曲线(receiveroperatingcharacteristiccurve，roc)对所有可能的切点作计算显示灵敏度和特异度之间相互关系。通过改变切点，获得多对真阳性率(即灵敏度)与假阳性率(1-特异度)值，以假阳性率为横坐标，以灵敏度为纵坐标，绘制roc曲线，从而动态、客观地反映诊断系统的效能。roc曲线下面积(auc)表示诊断系统中阳性和阴性诊断结果分布的重叠程度，反映诊断系统区分阳性和阴性诊断结果的能力大小，也就是诊断试验的价值大小。通过找到roc曲线上正确指数最大点确定诊断指标临界值，并通过bootstrap方法随机抽样1000次，确定临界值95％可信区间。
2)统计模型的构建
通过logistic回归模型实现单指标、多指标联合诊断试验hcc，并分别应用于健康正常人、hbv感染者、肝硬化患者，在三组和病人群中进行roc分析。根据疾病状态建立logistic回归模型，通过形成的预测概率或联合预测因子为分析指标，并结合非参数模型和双正态模型建立roc曲线。
logistic回归模型：
且有
常数项β0表示暴露剂量为0时个体发病(hcc)与不发病(hbv感染者、肝硬化患者、健康人，或三者之和)概率之比的自然对数。回归系数β0，β1，…βn表示自变量xi改变一个单位时
分析和统计结果参见附图。
结果和讨论：
早期肝癌检出率低的现状反映出目前肝癌的诊断方法还有很大局限性。当前肝癌的诊断主要依靠血清学检查和影像学诊断。血清学检查主要检测血清中的肿瘤标志物，目前主要是依靠afp的检测，但afp在小肝癌中的敏感度仅为40％左右。
利用本发明制备的特异性结合于人肝癌标志物的抗体或其单链抗体片段，在afp、afu、hgf、gpc3和ggt2五个标志物中，进行hgf单指标检测，以及hgf联合其它标志物进行双指标、三指标、四指标及五指标检测时，能够与乙肝患者、肝硬化患者和健康者区别开来而检测肝癌。
在全部人群(肝癌、乙肝、肝硬化和正常人)中筛查肝癌，在乙肝患者中筛查肝癌，以及在肝硬化患者中筛查肝癌时，hgf单指标检测全期肝癌和早期肝癌均有很高的敏感度和特异性。通过利用本发明制备的特异性结合于hgf的抗体或其片段，利用所述的肝癌血清学检测方法，使用hgf单指标在全部人群(肝癌、乙肝、肝硬化和正常人)中筛查肝癌，其检测全期肝癌的敏感度为90.3％，特异性为90.5％，在巴塞罗那分期的早期(a期)肝癌患者中，检测的敏感度为90.2％，特异性为84.1％，纳入受试者的年龄和性别后，hgf在全期肝癌中的敏感度为91.3％，特异性为90.9％，在早期肝癌中的敏感度为86.3％，特异性为90.5％；在乙肝患者中筛查肝癌，hgf单指标检测全期肝癌的敏感度为94.4％，特异性为91.8％，检测早期肝癌的敏感度为90.2％，特异性为91.9％，纳入受试者年龄性别后，检测全期肝癌的敏感度为90.8％，特异性为95.2％，检测早期肝癌的敏感度为92.2％，特异性为90.2％；在肝硬化患者中筛查肝癌，hgf单指标检测全期肝癌和早期肝癌的敏感度和特异性均可达72％和73％以上，显著优于临床常用的afp，说明单独检测血清中hgf的含量，必要时并综合受试者年龄和性别可以满足临床肝癌诊断的需要。
检测两个指标在全部人群筛查肝癌，在乙肝患者中筛查肝癌，以及在肝硬化患者中筛查肝癌时，hgf与afp、afu、gpc3、ggt2四个标志物之一分别联用，检测全期肝癌和早期肝癌均可达到很高的敏感度和特异性，对于原发性肝癌患者的诊断具有显著意义，特别是hgf与afp的联合为肝癌患者血清学诊断及早期诊断的最佳组合。
特别地，检测两个指标在全部人群筛查肝癌时，只纳入受试者性别进行统计后，hgf与afp联用检测全期肝癌的敏感度为90.8％，特异性为93.1％，hgf与afu联用检测全期肝癌的敏感度为87.2％，特异性为94.6％，hgf与gpc3联用检测全期肝癌的敏感度为91.8％，特异性为90.6％，hgf与ggt2联用检测全期肝癌的敏感度为89.3％，特异性为93.1％；只纳入受试者年龄后，hgf与afp联用检测全期肝癌的敏感度为92.3％，特异性为90.9％，hgf与afu联用检测全期肝癌的敏感度为90.8％，特异性为91.6％，hgf与gpc3联用检测全期肝癌的敏感度为90.3％，特异性为90.9％，hgf与ggt2联用检测全期肝癌的敏感度为89.3％，特异性为92.3％。在检测早期肝癌时，将hgf与afp，hgf与afu，hgf与gpc3，hgf与ggt2分别联用，纳入年龄或性别之一后，均可达到86％以上的敏感度和和84％以上的特异性。
而在乙肝患者中筛查肝癌时，只纳入受试者性别进行统计后，hgf与afp联用检测全期肝癌敏感度为92.9％，特异性为95.2％，hgf与afu联用检测全期肝癌敏感度为93.4％，特异性为93.5％，hgf与gpc3联用检测全期肝癌敏感度为93.4％，特异性为93.5％，hgf与ggt2联用检测全期肝癌敏感度为92.3％，特异性为93.5％。；只纳入受试者年龄进行统计后，hgf与afp联用检测全期肝癌敏感度为92.3％，特异性为93.5％，hgf与afu联用检测全期肝癌敏感度为93.9％，特异性为93.4％，hgf与gpc3联用检测全期肝癌敏感度为93.9％，特异性为93.4％，hgf与ggt2联用检测全期肝癌敏感度为93.4％，特异性为95.1％。在检测早期肝癌时，将hgf与afp，hgf与afu，hgf与gpc3，hgf与ggt2分别联用，纳入年龄或性别之一后，均可达到86.3％以上的敏感度和和83.9％以上的特异性。在肝硬化患者中筛查肝癌时，纳入年龄或性别之一后，hgf与其他四个标志物分别联用，检测全期肝癌和早期肝癌均可达到较高的敏感度和特异性。说明hgf与其他四个指标单独联合检测，并综合受试者年龄或性别后，对于原发性肝癌患者的诊断具有显著意义，特别是hgf与afp的联合为肝癌患者血清学诊断及早期诊断的最佳组合。
检测三个指标在全部人群中筛查肝癌，检测全期肝癌时，hgf+afp+afu联用，hgf+afp+gpc3联用，hgf+afp+ggt2联用，hgf+afu+gpc3联用时，均可达到91.8％以上的敏感度和90.2％以上的特异性，检测早期肝癌时，hgf+afp+afu联用，hgf+afp+gpc3联用，以及hgf+afp+ggt2联用时，均可达86.3％以上的敏感度和85.5％以上的特异性，在乙肝患者中筛查肝癌时，hgf+afp+afu，hgf+afp+gpc3，hgf+afp+ggt2，hgf+afu+gpc3以及hgf+gpc3+ggt2联合应用，检测全期肝癌的敏感度均可达92.3％以上，特异性可达93.5％以上，检测早期肝癌也有较好效果，特别是hgf+afp+afu的组合，敏感度达90.2％，特异性达98.4％；在肝硬化患者中筛查肝癌时，hgf与另两种标志物联用，也可达到较满意的效果，说明hgf与另外两种标志物联合检测，可以满足临床肝癌血清学诊断及早期诊断的需求。
检测四个指标筛查肝癌时，敏感度和特异性均有提高，在全部人群中筛查肝癌时，hgf、afp、gpc3和ggt2的组合检测全期肝癌的敏感度为91.3％，特异性为92.0％，检测早期肝癌的敏感度为86.3％，特异性为90.5％，在乙患者中筛查肝癌时，hgf、afp、afu和ggt2的组合检测全期肝癌的敏感度为91.8％，特异性为98.4％，检测早期肝癌的敏感度为92.2％，特异性为98.4％，在肝硬化患者中筛查肝癌时，hgf与另外三种指标联用时，均可达到较高的敏感度和特异性。
五种标志物联合应用，敏感度和特异性进一步提高，在全人群中筛查肝癌时，其检测全期肝癌的敏感度可达91.2％，特异性可达93％，检测早期肝癌的敏感度为84.3％，特异性可达87.2％，在乙肝患者中筛查肝癌时，检测全期肝癌的敏感度为91.8％，特异性为98.4％，检测早期肝癌的敏感度为92.2％，特异性为98.4％，在肝硬化患者中筛查肝癌时，检测全期肝癌的敏感度为91.3％，特异性为76.2％，检测早期肝癌的敏感度为92.2％，特异性为66.7％。显著优于目前临床肝癌检测的金标准afp。
为了验证检测结果的准确性，本发明将五种标志物在肝癌病人血清，正常人血清和乙肝病人血清中的检测值建立了模型，将全部研究对象的危险系数(rs)从小到大排列，分割为高危组(rs≥0.5)和低危组(rs<0.5)，大部分肝癌患者被正确分到高危组，散点图趋势明显，说明模型结果符合事实情况。该模型可以用于分析afp、afu、hgf、gpc3、ggt2五种标志物检测值与肝癌的相关性。
本发明通过大量样本验证和统计学分析，通过利用本发明制备的单克隆抗体或其单链抗体片段，证明hgf可以作为肝癌标志物单独用于肝癌的筛查和早期诊断，其检测灵敏度和特异性均大幅优于临床的金标准afp，hgf与其它一个或多个指标的联合使用，可作为hgf检测的补充，进一步提高肝癌血清学诊断的灵敏度和特异性。
虽然为了清楚的理解，已经借助于附图和实施例在一些细节上描述了上述发明，但是说明书和实施例不应当被视为限制本发明的范围。本文中引用的所有专利和科学文献的公开内容通过引用完整地清楚并入。
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