1.一种提高TNFR75-Fc 融合基因表达量的方法,其特征在于,包括如下步骤:构建一种含有SEQ ID NO:3所述碱基序列的重组TNFR75-Fc融合基因;构建一种含有SEQ ID NO:3所述的碱基序列的重组载体,所述载体为pCI-gs-TNFR75-Fc,该载体在进行高效表达细胞株筛选过程中,最终将MSX 浓度提高到500μm;pCI-gs是由pCI-neo改造得到的,利用pCI-gs的EcoR I单酶切位点,插入经DNA序列测定结果正确的rhTNFR-Fc基因片段,用Spe1单酶切鉴定插入片段的正反方向,得到pCI-gs-TNFR75-Fc。
2.如权利要求1 所述方法,其特征在于,所述SEQ ID NO:3 融合基因构建过程中,TNFR75 的3’端引物中引入了18 个碱基与人IgG1Fc 基因片段5’端的18 个碱基互补;
所述SEQ ID NO:3 序列中人可溶性TNFR75 cDNA 的制备方法为:
1)、PCR 扩增TNFR75 cDNA
设计引物A :5’TC AAG CTT ATG GCT CCC GTC GCC GTC TGG 3’引物B :5’GTC ACA AGA TTT GGG CTC GTC GCC AGT GCT CCC TTC AGC 3’,
设计另外一组引物,在引物B 中将引入linker 序列,该序列(Gly4Ser)3, 为一编码15个氨基酸的疏水性多肽,它们的活动度较好,不影响TNFR 和Fc 的天然三维结构,其linker的DNA 序列为5’- GGT GGC GGT GGA AGC GGC GGT GGC GGA AGC GGC GGT GGC GGC AGC -3’;
设计引入linker序列的引物B ;引物Linker-B :5’GCT GCC GCC ACC GCC GCT TCC GCC ACC GCC GCT TCC ACC GCC ACC GTC ;
以人早幼粒白血病细胞总RNA 为模板, 分别以引物A 和B 为模板、以A 和Linker-B 为模板,进行RT-PCR 反应,94℃变性5min 开始循环,94℃ 30sec,58℃ 30sec,72℃ 1min,共32个循环,最后72℃延伸8min ;得到编码sTNFR75 和对照sTNFR75-linker 的基因片段;
2)、PCR 产物的鉴定和凝胶回收
将上述条件进行PCR,在琼脂糖凝胶电泳上进行鉴定,发现产物中目的基因分子量800bp 的带,将该片段回收;
所述SEQ ID NO:3 序列中人IgG1 重链恒定区Fc 段基因片段的克隆:
设计引物C :5’GAG CCC AAA TCT TGT GAC GAG CCC AAA TCT TGT GAC AAA 3’,引物D:
5’AGT GAA TTC TCA TTT ACC CGG AGA CAG GGA 3’;
设计引物linker-C:GGT GGC GGT GGA AGC GGC GGT GGC GGA AGC GGC GGT GGC GGC AGC GAG ;
以IgG1 Fc/T easy 载体质粒为模板,分别以C 和D 为引物、以Linker-C 和D 为引物,进行RT-PCR 反应,94℃变性5min 开始循环,94℃ 20sec,62℃ 30sec,72℃ 2min,共35 个循环,最后72℃延伸10min ;扩增得到编码人IgG1 Fc 和对照linker-IgG1 Fc 的基因片段。