本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种核酸信号放大检测试剂盒。
背景技术：
：原位杂交技术(Insituhybridization，ISH)是利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将有放射性或非放射性的外源核酸(即探针)与组织、细胞或染色体上待测DNA或RNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，经一定的检测手段将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来的技术，待测DNA或RNA可以是内源DNA、信使RNA(mRNA)、微小RNA(miRNA)、病毒序列或细菌序列。此技术的灵敏度即检测的域值水平可达每个细胞10-20个拷贝的mRNA。原位杂交探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。目前，直接标记法是将荧光素直接与探针核苷酸或磷酸戊糖骨架共价结合，或在缺口平移法标记探针时将荧光素核苷三磷酸掺入。直接标记法在检测时步骤简单，但由于不能进行信号放大，因此灵敏度往往较差。间接标记是采用生物素标记DNA探针，杂交之后用藕联有荧光素亲和素或者链霉亲和素进行检测，同时还可以利用亲和素-生物素-荧光素复合物，将荧光信号进行放大，从而可以检测500bp的片段。其灵敏度比直接标记法要高。然而对于细胞中低拷贝数的DNA或RNA靶标的检测，现有的基于ISH的检测技术的灵敏度和特异性通常表现较差，这限制它们的应用。为了克服ISH的限制，AdvancedCellDiagnostics,Inc.开发出了称为RNAscope的新型ISH信号放大方法。这种测定包括独特设计的低聚捕获探针以及由预扩增子(preamplifier)、扩增子(amplifier)和标记探针组成的信号放大系统，从而使得能够在不放大背景信号的情况下显著放大信号，并能够对几乎任何基因进行单个RNA分子检测。然而，单独利用RNAscope仍不能可靠地检测以往的其中RNA被显著降解的福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)的组织切片中的一些低拷贝基因。另外，使用当前的RNAscope○R技术不能使单个RNA分子以40×放大显象。考虑到上述情况，因此需要一个对于细胞中低拷贝数的DNA或RNA靶标检测具有高灵敏度、高特异性地放大核酸的方法。技术实现要素：本发明的目的之一在于提供一种特异性强、灵敏度高的核酸信号放大检测试剂盒。实现上述目的的技术方案如下。一种核酸信号放大检测试剂盒，主要包括有：针对每种目标基因有至少一条一级信号放大探针和至少一条二级信号放大探针，或者主要包括有：针对每种目标基因有至少一条一级信号放大探针和至少一条二级信号放大探针，以及捕获探针，其中所述一级信号放大探针从5’端到3’端依次为：P4序列、间隔臂序列、P3序列；所述二级信号放大探针从5’端到3’端依次为：P5序列、间隔臂序列、P6序列；所述P6序列的3’端还修饰有荧光基团，针对不同目标核酸的荧光基团的颜色互不相同或发射波长互不相同，所述P5序列为5bp～15bp；所述P4序列含有至少一个与P5序列互补配对的碱基片段，且每个与P5序列互补配对的碱基片段之间设有间隔臂序列；所述捕获探针能用于连接目标核酸与一级信号放大探针，每条捕获探针从5’端到3’端依次为：能与待检测的目标基因的核酸互补配对结合的特异性P1序列、间隔臂序列、P2序列，针对不同目标基因的P2序列互不相同，所述P1序列为15bp～30bp，P2序列为8bp～25bp；当试剂盒中含有捕获探针时，所述P3序列含有至少一个与P2序列互补配对的碱基片段，且每个与P2序列互补配对的碱基片段之间设有间隔臂序列；当试剂盒中不含有捕获探针时，所述P3序列为能与待检测的目标基因的核酸互补配对结合的特异性碱基片段；所述P2序列、P3序列、P4序列、P5序列、P6序列均为不存在发夹结构，各探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与整个检测体系的其它核酸之间均不存在特异性结合的序列。或者，核酸信号放大检测试剂盒，主要包括有：针对每种目标基因至少一条一级信号放大探针、至少一条二级信号放大探针、和至少一条三级信号放大探针，或者主要包括有：针对每种目标基因有至少一条一级信号放大探针、至少一条二级信号放大探针、和至少一条三级信号放大探针，以及捕获探针，其中，所述一级信号放大探针从5’端到3’端依次为：P4序列、间隔臂序列、P3序列；所述二级信号放大探针从5’端到3’端依次为：P5序列、间隔臂序列、P6序列；所述P4序列含有至少一个与P5序列互补配对的碱基片段，且每个与P5序列互补配对的碱基片段之间设有间隔臂序列；所述P5序列为5bp～15bp；所述捕获探针用于连接目标核酸与一级信号放大探针，每条捕获探针从5’端到3’端依次为能与待检测的目标基因的核酸互补配对结合的特异性序列P1、间隔臂序列、P2序列，针对不同目标基因的P2序列互不相同；所述P1序列为15bp～30bp，P2序列为8bp～25bp；当试剂盒中含有捕获探针时，所述P3序列含有至少一个与P2序列互补配对的碱基片段，且每个与P2序列互补配对的碱基片段之间设有间隔臂序列；当试剂盒中不含有捕获探针时，所述P3序列为能与待检测的目标基因的核酸互补配对结合的特异性碱基片段；所述三级信号放大探针从5’端到3’端依次为：P8序列、间隔臂序列、P7序列，所述P8序列5’端还修饰有荧光基团，针对不同目标核酸的荧光基团互不相同，且所对应的荧光基团的颜色互不相同或发射波长互不相同，所述P7序列为4bp～10bp；所述P6序列含有至少一个与P7序列互补配对的碱基片段，且每个与P7序列互补配对的碱基片段之间设有间隔臂序列；所述P2序列、P3序列、P4序列、P5序列、P6序列、P7序列、P8序列均为不存在发夹结构，各探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与整个检测体系的其它核酸之间均不存在特异性结合的序列。在其中一个实施例中，所述捕获探针的P1序列选自SEQIDNO.121～SEQIDNO.135，所述捕获探针的P2序列选自：SEQIDNO.101～SEQIDNO.120；所述一级信号放大探针P3序列选自SEQIDNO.1～SEQIDNO.20，P4序列选自SEQIDNO.21～SEQIDNO.40；二级信号放大探针选自P5序列SEQIDNO.41～SEQIDNO.60，P6序列选自SEQIDNO.61～SEQIDNO.80；三级信号放大探针P7序列选自SEQIDNO.81～SEQIDNO.100，P8序列为polyT。在其中一个实施例中，polyT的为3-10个T。在其中一个实施例中，一级信号放大探针中所述P4序列与P3序列之间的间隔臂序列选自5－20个T；二级信号放大探针中所述P5序列与P6序列之间的间隔臂序列选自5－10个T；三级信号放大探针中P7序列与P8序列之间的间隔臂序列选自2－10个T。在其中一个实施例中，当试剂盒中含有捕获探针时，所述P3序列含有2～5个与P2序列互补配对的碱基片段，且每个与P2序列互补配对的碱基片段之间设有间隔臂序列，所述间隔臂序列为4－10个T。在其中一个实施例中，所述P4序列含有2-4个与P5序列互补配对的碱基片段，且每个与P5序列互补配对的碱基片段之间设有间隔臂序列，所述间隔臂序列为3—10个T。在其中一个实施例中，所述P6序列含有2-4个与P7序列互补配对的碱基片段，且每个与P7序列互补配对的碱基片段之间设有间隔臂序列，该间隔臂序列可以为2—10个T。在其中一个实施例中，所述荧光基团选自：FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、TexasRed、LCRED640、Cy5、LCRED705和AlexaFluor488，且针对不同目标核酸的荧光基团互不相同。在其中一个实施例中，所述目标核酸为mRNA，包括有：EGFR基因、KIT基因、和/或B2M基因，其中，针对EGFR基因的P1序列选自SEQIDNO.121～SEQIDNO.125，所述P2序列为：SEQIDNO.103，所述P3序列为：SEQIDNO.3，所述P4序列为：SEQIDNO.25，所述的P5序列为SEQIDNO.45，所述的P6序列为SEQIDNO.67，所述的P7序列为SEQIDNO.87；针对KIT基因的P1序列选自SEQIDNO.126～SEQIDNO.130，所述P2序列为：SEQIDNO.109，所述P3序列为：SEQIDNO.9，所述P4序列为：SEQIDNO.30，所述的P5序列为SEQIDNO.50，所述的P6序列为SEQIDNO.74，所述的P7序列为SEQIDNO.94；针对B2M基因的P1序列选自SEQIDNO.131～SEQIDNO.135，所述P2序列为：SEQIDNO.115，所述P3序列为：SEQIDNO.15，所述P4序列为：SEQIDNO.35，所述的P5序列为SEQIDNO.55，所述的P6序列为SEQIDNO.79，所述的P7序列为SEQIDNO.99。针对每种目标核酸如果有一条以上的捕获探针，其P1序列不同，P2序列相同或者不同。本发明的主要优点在于：(1)原位杂交方法本身具有荧光信号灵敏度低的缺点，但是本发明采用新型的原位杂交方法所设计的检测试剂盒，通过信号放大体系提高荧光信号强度。本发明检测流程能够在8h内完成，单一拷贝的核酸杂交探针通过信号放大系统，与相应的荧光探针结合，显著提高RNA原位杂交的检测灵敏度，此外，由于多位点特异配对、级联放大的方式来实现信号的放大，而不是PCR扩增的方法，提高了检测信号，实现了检测的特异性，避免了逆转录PCR和实时荧光定量PCR技术的假阳性。(2)本发明所选择的信号放大探针，是发明人经过大量试验进行综合评估、统计分析、多种参数的优化组合而得出的。本发明方法采用多重信号放大探针，该探针的选取，能够实现包括二级探针或三级使用，均能够实现信号放大检测，当三种探针共同使用时，极大地提高检测的灵敏度。(3)本发明所设计的针对EGFR基因、KIT基因和B2M基因mRNA的各种具体探针，能够在均一的反应条件下进行杂交反应，且各种探针之间基本不存在非特异性结合；所设计的探针在检测中特异性好、信噪比高。同时，多种探针的组合使用使鉴定试剂盒和检测方法形成一个检测效果完好的系统。具体实施方式为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的
技术领域：
的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。实施例1本实施例设计了一套灵敏度高的信号放大检测系统，将对一级信号放大探针、二级信号放大探针、三级信号放大探针和捕获探针的信号放大组分做详细的描述。1)一级信号放大探针信号放大组分中包括一条或以上的一级信号放大探针，所述每条一级信号放大探针从5’端到3’端依次为：P4序列、间隔臂序列、与待检测的目标核酸结合的P3序列，P3序列通过与捕获探针的结合实现目标信号的级联放大。本发明所设计的信号放大探针，除以下所限定的特定探针反向互补完全匹配的情况以外，所述P3、P4、P5、P6、P7、P8序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与整个检测体系的其它核酸之间均不存在特异性结合的序列。本发明所述P3序列含有至少一个与捕获探针的P2序列反向互补的碱基片段，优选5～15个相同的碱基片段，本实施例中，P3含有2个与捕获探针的P2序列反向互补的碱基片段，相同碱基片段之间有间隔臂序列，该间隔臂序列可以选自4—10个T，本实施例中使用6个T，P4序列可含有至少一个与P5反向互补的碱基片段，本实施例中，为含有3个与P5反向互补的碱基片段。本发明P3与P4序列之间的间隔臂序列可以选自5－20个T，本实施例使用的间隔臂为10个T。表1一级信号放大探针的P3序列SEQIDNO.P3序列(5’→3’)1CATCATGTCATTTTTTCATCATGTCA2CAATACAATCTTTTTTCAATACAATC3TCAGTCTTCATTTTTTTCAGTCTTCA4CACAATCAATTTTTTTCACAATCAAT5CACTATAGACTTTTTTCACTATAGAC6TCACTGAATCTTTTTTTCACTGAATC7CATTACTCAATTTTTTCATTACTCAA8ACTCATTACATTTTTTACTCATTACA9ATCACTAATCTTTTTTATCACTAATC10ACTAATCTACTTTTTTACTAATCTAC11TACTGTCATCTTTTTTTACTGTCATC12CACAAGTACTTTTTTTCACAAGTACT13CTTCAAGACTTTTTTTCTTCAAGACT14CAATTCATCATTTTTTCAATTCATCA15CTATCGTCATTTTTTTCTATCGTCAT16TTCACGTCAATTTTTTTTCACGTCAA17TCATGTCACATTTTTTTCATGTCACA18CTCAATTACATTTTTTCTCAATTACA19ACATGCATCATTTTTTACATGCATCA20ATGCACTTCATTTTTTATGCACTTCA所述P4序列含有一个或以上与二级信号放大探针的P5序列反向互补的碱基片段；优选为2-4个碱基片段，本实施例中，P4序列含有3个与P5反向互补的碱基片段，相同碱基片段间有间隔臂序列，该间隔臂序列可以选自3—10个T，本实施例中使用5个T。表2一级信号放大探针的P4序列2)二级信号放大探针本发明含有一条或以上的二级信号放大探针，所述二级信号放大探针从5’端到3’端依次为：与P4序列反向互补结合的P5序列、间隔臂序列、P6序列，当技术方案中不包含三级信号放大探针时，所述P6序列3’端还修饰有荧光基团，针对不同目标核酸的荧光基团互不相同，即所对应的荧光基团的颜色互不相同或发射波长互不相同；所述P5序列为5bp～15bp。本发明P5与P6序列之间的间隔臂序列可以选自5－10个T，本实施例使用的间隔臂为6个T。表3二级信号放大探针的P5序列所述P6序列含有一个或以上与三级信号放大探针的P7序列反向互补的碱基序列，优选为2-4个碱基片段，本实施例中，所述P6序列含有三个与P7序列反向互补的碱基片段，相同碱基片段间有间隔臂序列，该间隔臂序列可以选自2—10个T，本实施例中使用3个T。表4二级信号放大探针的P6序列SEQIDNO.P6序列(5’→3’)61TACGATTTTACGATTTTACGA62CATAGTTTCATAGTTTCATAG63TAGCATTTTAGCATTTTAGCA64CTAAGTTTCTAAGTTTCTAAG65TGAACTTTTGAACTTTTGAAC66CCTAGTTTCCTAGTTTCCTAG67CGATCTTTCGATCTTTCGATC68CTACGTTTCTACGTTTCTACG69ATCAGTTTATCAGTTTATCAG70ACGCTTTTACGCTTTTACGCT71TCTAGTTTTCTAGTTTTCTAG72CTCGATTTCTCGATTTCTCGA73GTCGATTTGTCGATTTGTCGA74GTGTCTTTGTGTCTTTGTGTC75TAGTCTTTTAGTCTTTTAGTC76GAGTCTTTGAGTCTTTGAGTC77ACTAGTTTACTAGTTTACTAG78CATCTTTTCATCTTTTCATCT79GCTAGTTTGCTAGTTTGCTAG80GCTCATTTGCTCATTTGCTCA3)三级信号放大探针本发明所述三级信号放大探针从5’端到3’端依次为：P8序列、间隔臂序列、P7序列，所述P8序列5’端还修饰有荧光基团，所述P7序列为4bp～10bp，本实施例的P7序列如下表。本发明P7与P8序列之间的间隔臂序列可以选自2－10个T，本实施例使用的间隔臂为5个T。表5三级信号放大探针的P7序列SEQIDNO.P7序列(5’→3’)SEQIDNO.P7序列(5’→3’)81TCGTA91CTAGA82CTATG92TCGAG83TGCTA93TCGAC84CTTAG94GACAC85GTTCA95GACTA86CTAGG96GACTC87GATCG97CTAGT88CGTAG98AGATG89CTGAT99CTAGC90AGCGT100TGAGCP8序列可为3～10个碱基的polyT序列，本实施例中，P8序列为5个碱基的polyT序列，当技术方案中含有三级信号放大探针时，P8序列5’端带有荧光基团标记，荧光基团可以选自：FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、TexasRed、LCRED640、Cy5、LCRED705和AlexaFluor488，针对不同目标核酸的荧光基团互不相同，即所选择的荧光基团的颜色互不相同或发射波长互不相同，以便于区分不同类型的目标核酸。4)捕获探针捕获探针是连接靶核酸与一级信号放大探针，每条捕获探针的碱基序列从5’端到3’端依次为能与不同目标基因的待检测的靶核酸中的配对结合的特异性序列P1序列、间隔臂序列、能与一级信号放大探针P3序列互补配对结合的P2序列，所述P3序列含有一个或以上与P2序列反向互补的碱基片段；针对不同目标基因的P2序列互不相同，所述P2序列为8bp～25bp。所述P1序列为10bp～25bp，GC含量为45％-65％，与整个检测体系的其它核酸之间均不存在特异性结合的序列；所述间隔臂为用于将捕获探针P2序列与P1序列间隔开来，通过在探针内部设置适当长度的间隔臂序列，可减少空间位阻，提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。本发明捕获探针的间隔臂优选为2－10个T，本实施例优选为5个T。表6捕获探针的P2序列实施例2一种检测核酸检测试剂盒本发明提供了一种核酸检测试剂盒，该试剂盒能够检测目标基因EGFR、KIT、B2M等mRNA表达水平，具体为：1)捕获探针针对EGFR、KIT、B2M等目标基因的mRNA设计捕获探针，所述捕获探针连接目标基因mRNA与一级信号放大探针，每条捕获探针的碱基序列从5’端到3’端依次为：能与待检测的目标基因mRNA互补配对结合的特异性序列P1、间隔臂序列、能与一级信号放大探针P3序列互补配对的P2序列，所述P3序列含有一个或以上与P2序列反向互补的碱基序列；本实施例中每个标志基因分别设计5条捕获探针，捕获探针的P2序列选自实施例2的表6，捕获探针的P1序列具体见表7，以提高检测的特异性(使用时，针对每种目标基因，选择1条或以上捕获探针即可完成检测，特异性和稳定性都很好，可参考实施例6)。所述P1序列选自SEQIDNO.121～SEQIDNO.135，所述P2序列选自：SEQIDNO.101～SEQIDNO.120；针对不同目标基因mRNA的P2序列互不相同，所述P1序列为15bp～30bp。所述间隔臂为用于将捕获探针P2序列与P1序列间隔开来，通过在探针内部设置适当长度的间隔臂序列，可减少空间位阻，提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。本发明捕获探针的间隔臂优选为5－10个T，本实施例优选为5个T。表7针对目标基因捕获探针的P1序列2)试剂盒的组分本实施例中，荧光基团可以选自：FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、TexasRed、LCRED640、Cy5、LCRED705和AlexaFluor488，其中针对不同目标基因mRNA的荧光基团互不相同，即所对应的荧光基团的颜色互不相同或发射波长互不相同，以便于区分不同类型的标志基因。本实施例检测试剂盒的组分包括有：捕获探针、信号放大探针和荧光基团，具体探针组分见表8所示。表8针对具体目标基因的检测试剂盒实施例3运用实施例2中的试剂盒对样品进行检测本实施例将使用实施例2的试剂盒，对不同癌细胞来源的样本进行检测，具体见下表，本领域技术人员，根据细胞株名称，即可在现有产品中获得相关的细胞株。本实施例将各癌种细胞株均一的细胞保存液，分别取相同体积的细胞保存液，作为检测样本，用于以下试验。样本编号癌种细胞株名称1～5肺癌NCI-H19756～10前列腺癌PC311～15胃癌KtaoIII16～20乳腺癌MCF-7所述各种溶液的配方如下：本实施例中的信号放大探针混合液均使用实施例2相应列表中的全部探针。一、样本预处理，将癌细胞过滤至滤膜上1.在样本保存管中使用保存液保存的癌细胞样本，600×g水平离心5min，弃上清。2.加入4mLPBS和1mL固定剂，涡旋混匀，室温静置8min。3.样本过滤：将样本保存管中的液体转移至过滤器中，打开真空抽滤泵抽尽液体；在本保存管中加入4mLPBS，洗涤管壁后抽滤液体。4.将滤膜转移至24孔板中，加入400μL4％甲醛溶液，室温固定1h。5.去除液体，每孔加入1mLPBS洗涤三次，每次浸泡2min。二、透化处理1.在新的24孔板中每孔加入50μL透化剂，将滤膜从PBS中取出，滤膜片边缘接触吸水纸，去除多余的液体，将滤膜倒扣在透化剂上，即滤膜铁圈刻有编码的一面向下贴近液体。室温孵育5min。2.去除液体，每孔加入1mlPBS洗涤两次，每次浸泡2min。将滤膜保持在PBS中至下一步实验操作。三、消化细胞，暴露核酸，使其与探针杂交1.配制相应浓度的消化酶工作液：试剂组分每个样本用量消化酶1.25μLPBS48.75μL总体积50μL2.消化酶工作液涡旋混匀，分装至24孔板中，每孔50μl。3.将滤膜取出，倒扣至24孔板中消化酶工作液上，保证滤膜向下一面与液体充分接触，不能有气泡存在。室温静置1h。4.去除液体，每孔加入1mlPBS洗涤三次，每次浸泡2min。将滤膜保持在PBS缓冲液中至下一步实验操作。四、探针杂交，探针特异性序列与目标核酸序列结合1.探针缓冲液和显色缓冲液使用前需40℃水浴预热20min。2.配制探针工作液：试剂组分每个样本用量探针混合液8μL探针缓冲液(40℃预热)42μL总体积50.0μL涡旋混匀，分装至24孔板中，每孔50μl。3.将滤膜取出，倒扣至24孔板中探针工作液上，保证滤膜向下一面与液体充分接触，不能有气泡存在。4.盖上24孔板盖，40±1℃孵育3小时。5.去除液体，每孔加入1ml洗涤液洗涤三次，每次浸泡2min。将滤膜保持在洗涤液中至下一步实验操作，样本在洗涤液中浸泡时间不能超过30min。五、扩增杂交，目标核酸序列信号放大1.配制扩增工作液：试剂组分每个样本用量信号放大探针混合液2μL探针缓冲液(40℃预热)48μL总体积50.0μL涡旋混匀，分装至24孔板中，每孔50μl2.将滤膜取出，倒扣至24孔板中扩增工作液上，保证滤膜向下一面与液体充分接触，不能有气泡存在。3.盖上24孔板盖，40±1℃孵育30min。4.去除液体，每孔加入1ml洗涤液洗涤三次，每次浸泡2min。将滤膜保持在洗涤液中至下一步实验操作，样本在洗涤液中浸泡时间不能超过30min。六、显色，荧光标记目标信号1.显色缓冲液(40℃预热)避光涡旋混匀，分装至24孔板中，每孔50μl。2.将滤膜取出，倒扣至24孔板中RI显色缓冲液上，保证滤膜向下一面与液体充分接触，不能有气泡存在。3.盖上24孔板盖，40±1℃孵育30min。4.去除液体，每孔加入1mlRI洗涤液洗涤三次，每次浸泡2min。将滤膜保持在洗涤液中至下一步实验操作，样本在RI洗涤液中浸泡时间不能超过30min。七、荧光显微镜观察本发明的对照品使用DAPI作为细胞核荧光基团，其发射蓝色荧光信号。1.将滤膜细胞面朝上置于载玻片上，沿铁圈内环将滤膜割下，加10μLRI抗淬灭剂，盖上18mm×18mm的盖玻片，直接镜检或置于-20℃保存。2.通过20倍物镜计数癌细胞异性核数量。3.根据10倍物镜定位异性核位置，滴油，用油镜观察实验结果，并拍照记录结果。4.然后再根据10倍物镜定位下一个异性核位置，滴油，用油镜观察实验结果并视野拍照记录结果。5.重复操作至拍完所有的异性核，数量与20倍物镜计数结果一致。显微镜使用通道如下：表9荧光基团的激发波长和发射波长八、检测结果判断及分析1.阳性癌细胞鉴定标准在滤膜上，富集有癌细胞，癌细胞的判定标准为：1)具有EGFR基因特异性标识物，在本试剂盒中表现为在Cy3通道下显示红色荧光信号点。2)具有KIT基因特异性标记物，在本试剂盒中表现为在AlexaFluor488通道显示绿色荧光信号点。3)具有B2M基因特异性标识物，在本试剂盒中表现为在Cy5通道下显示紫色荧光信号点。4)细胞核DAPI染色阳性。5)癌细胞核形状不规则，直径大于10μm，明显大于滤膜孔径，滤膜孔径为7μm。白细胞大小与滤膜孔大小相近。2.使用上述检测方法，对每个样本进行检测和观察，其中，针对细胞核的DAPI染色，使用“-”或“+”表示是否检测到荧光；针对目标检测mRNA的荧光信号强度，分别读取每个样本中50个癌细胞的相应颜色的mRNA荧光点数量，并计算平均点数，具体结果为：表10样本检测结果(荧光信号点数)样本Cy3AlexaFluor488Cy5DAPI1361614+2381317+335128+4371712+5351516+6406938+7487440+8386834+9396737+10446234+1182611+129313+1315255+148279+15173113+1623119+1725716+1816914+1929198+20241210+从上述结果可以看出，本实施例试剂盒能实现检测，针对不同癌细胞株来源的5个样本，其检测结果相近，针对不同癌细胞株来源的4类样本，能明细区分其mRNA表达水平，由此可见，本试剂盒重复性好，检测结果稳定可靠。实施例4三种信号放大组分的检测对比1、实施例1中三种信号放大组分检测效果的对比本发明实施例1提供了三种信号检测组分，三种信号放大组分均能实现检测，本实施例以EGRR基因mRNA检测为例，设计三种信号放大方案，具体见表11，对比本发明提供的三种信号放大组分的检测效果。本实施例的相关操作步骤如实施例1～3所示。表11三种不同探针组成的标志基因检测试剂盒2.本实施例将肺癌细胞株NCI-H1975来源的均一的细胞保存液，分别取相同体积，作为检测样本，共形成30个样本(样本21～50)，每组实验组使用10个样本，使用实施例3所述检测方法，进行检测和观察，其中，针对细胞核的DAPI染色，使用“-”或“+”表示是否检测到荧光；针对目标检测mRNA的荧光信号强度，分别读取每个样本中50个癌细胞的相应颜色的mRNA荧光点数量，并计算平均点数，具体结果为：表12三种信号放大方案的检测结果(荧光信号点数)从上述结果可以看出，三种信号放大组分均能实现检测，然而从上述的结果还可以看出，同时使用一级信号放大探针、二级信号放大探针以及三级信号放大探针组成的信号放大系统，荧光信号点数更多，其信号强度更好，检测效果更佳。实施例5捕获探针的作用为了验证捕获探针的作用，本实施例以EGFR和KIT基因标记物为例，设置含有捕获探针(Group4)，及不包含捕获探针(Group5)的检测试剂盒。其中Group4所选择的信号放大探针均选自实施例1中的信号放大探针；Group5中，针对EGFR基因的一级信号放大探针P3序列选自表13中SEQIDNO.136～SEQIDNO.140，针对KIT基因的一级信号放大探针P3序列选自表13中SEQIDNO.141～SEQIDNO.145，其它探针选自实施例1～2提供的探针。具体的探针组成如表14。表13一级信号放大探针的P3序列表14包括捕获探针与不包括加捕获探针的试剂盒2.本实施例将肺癌细胞株NCI-H1975来源的均一的细胞保存液，分别取相同体积，作为检测样本，共形成20个样本(样本51～70)，每组实验组使用10个样本，使用实施例3中所述检测方法，进行检测和观察，其中，针对细胞核的DAPI染色，使用“-”或“+”表示是否检测到荧光；针对目标检测mRNA的荧光信号强度，分别读取每个样本中50个癌细胞的相应颜色的mRNA荧光点数量，并计算平均点数，具体结果为：表15检测结果(荧光信号点数)从上述结果可以看出，本发明所述的信号放大方法，不使用捕获探针同样能实现对靶基因直接检测，然而从上述的结果还可以看出，使用捕获探针，然后再用本发明提供的信号放大系统，其荧光信号点数更多，信号强度更好，检测效果更佳。实施例6目标基因的捕获探针的数量选择1、试剂盒制备的设计(捕获探针数量的选择)本发明提供一种信号放大系统，针对不同类别的标志基因分别设计了5条捕获探针(表7)。在实际使用时，可以针对每种标志基因，选择对应的至少1条捕获探针即可完成检测，特异性和稳定性都能达到需求。本实施例以EGFR基因mRNA检测的捕获探针数量选择为例，参见实验组6-8，分别选取1条、3条及5条的捕获探针，信号放大探针选择一级信号方法探针、二级放大探针以及三级信号放大探针，对比其检测效果。表16选择不同数量EGFR的捕获探针2、本实施例将肺癌细胞株NCI-H1975来源的均一的细胞保存液，分别取相同体积，作为检测样本，共形成30个样本(样本71～100)，每组实验组使用10个样本，使用实施例3所述检测方法，进行检测和观察，其中，针对细胞核的DAPI染色，使用“-”或“+”表示是否检测到荧光；针对目标检测mRNA的荧光信号强度，分别读取每个样本中50个癌细胞的相应颜色的mRNA荧光点数量，并计算平均点数，具体结果为：表17使用不同数量捕获探针的检测结果比较(荧光信号点数)通过三组实验对比可知，针对EGFR基因，使用1条、3条和5条的捕获探针即可完成检测，特异性和稳定性都很好。其中，当使用全部5条的捕获探针时，荧光信号点数更多，检测信号更强更稳定，检测效果最佳。其它针对标志基因的使用不同数量捕获探针的试剂盒，其结果依然稳定可靠，具体数据省略。以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。当前第1页1 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