橡胶树死皮相关蛋白HbMC2及其编码基因与应用的制作方法

本发明涉及生物
技术领域：
中橡胶树死皮相关相关蛋白HbMC2及其编码基因以及二者在调控细胞死亡、氧化胁迫抗性及橡胶树死皮发生中的应用。
背景技术：
：巴西橡胶树(HeveabrasiliensisMuell.Arg.)因具有橡胶含量高、质量好、经济寿命长、易采收等独特优点而成为天然橡胶的主要来源。我国是世界第一大天然橡胶消费国，年消费量高达370万吨。由于我国属于非传统植胶区，植胶区域有限，我国年产胶量不到80万吨，自给率不足22％。在植胶土地面积有限的情况下，要保障天然橡胶供给能力，就必须大幅提高单位面积的橡胶产量。在影响单产的因素中，死皮是主要限制性因子之一。目前，世界各植胶国胶园死皮率在20％～50％之间，年产量损失高达15％～20％(Venkatachalam等，2010)。鉴于死皮对天然橡胶产业的严重影响，提高单产必须解决死皮问题，而阐明死皮发生机制是解决死皮问题的前提，开展橡胶树死皮发生机制及防控研究具有重要的理论和应用价值。巴西橡胶树的树皮是由维管形成层向外分化形成的，具有韧皮射线、韧皮薄壁细胞、筛管、伴胞、韧皮纤维等基本组织的结构。作为最主要的产胶植物，橡胶树的树皮具有一种特化的产胶组织—乳管。在天然橡胶生产中，人们通过切割橡胶树树皮中的乳管，收集由割线排出的胶乳，作为提炼天然橡胶的原料。橡胶树死皮(TappingPanelDryness，TPD)的症状为割线排胶减少或完全停排。割胶对橡胶树来说是一种不可避免的机械伤害。橡胶树死皮的成因十分复杂，它既可以自发产生，也可以通过各种内外因素诱导产生，割胶强度过大、长期和过度使用乙烯利刺激排胶会导致橡胶树死皮的发生，研究发现死皮橡胶树中活性氧水平升高。研究者曾从病理、生理、遗传、土壤和生化等方面进行了探索与研究，但其发生机制仍不清楚。目前，死皮被认为是一种由过度割胶和强乙烯刺激引起的、复杂的生理综合症(范思伟和杨少琼，1995)。近年来，随着分子生物学和相关基因工程技术在橡胶树生理生化研究中的应用，对橡胶树死皮发生机制的研究取得了初步进展，推测活性氧代谢、泛素-蛋白酶体途径、细胞程序化死亡(ProgramedCellDeath，PCD)、茉莉酸生物合成及橡胶生物合成途径等基因表达改变与橡胶树死皮发生有关。Chen等(2003)在橡胶树树皮中鉴定并克隆死皮相关基因HbMyb1，该基因可能是细胞程序化死亡的负调控因子，并提出“橡胶树死皮是一种细胞程序化死亡现象”的观点。Peng等(2011)进一步研究表明：与健康橡胶树相比，死皮橡胶树乳管细胞具有细胞程序化死亡的典型特征，在烟草中超量表达HbMyb1可抑制逆境诱导的细胞死亡。Venkatachalam等(2007)、Li等(2010；2012)和覃碧等(2012)利用抑制性差减杂交及基因芯片技术对死皮和健康橡胶树胶乳或树皮间基因表达差异进行分析，发现大量与细胞程序化死亡途径相关的基因在二者之间差异表达，证明细胞程序化死亡在橡胶树死皮发生过程中扮演重要角色。研究细胞程序化死亡途径中重要基因在橡胶树死皮发生中的作用将有助于死皮发生的分子机制的解析，并能为橡胶树死皮防控提供重要的靶标基因。在动物细胞程序化死亡过程中，半胱天冬蛋白酶(cysteine-dependentaspartate-specificproteases,caspase)起着关键作用(LamandZhang，2012)。研究显示，有些植物能够产生类似caspase活性的物质，并且这种酶活性调控着细胞程序化死亡过程。尽管如此，在植物中并没有找到与caspase同源的蛋白质，但是发现有一类含有caspase结构域(caspasedomain)的类半胱天冬蛋白(caspase-likeprotein)，称为metacaspase(MC)。Metacaspases存在于蓝藻、真菌、酵母和高等植物中(Jiang等，2010)。根据caspase-like功能区的序列相似性和序列结构，metacaspases可以分成2种类型，即I型和II型(Uren等，2000)。除均含有与caspase大亚基相似的约150个氨基酸的保守区域及在C末端存在的与caspase小亚基相似的第二保守区域外，来自植物和真菌的I型metacaspase蛋白N端的prodomain含有1个特定的氨基酸模体(motif，通常是富含脯氨酸的重复模体(proline-richrepeatmotif)或者锌指模体(zincfingermotif)。这一锌指结构与植物超敏反应相关的蛋白LSD-1相似。植物中II型metacaspase没有prodomain，但是在p20和p10两个亚单位之间插入了一个长约200个氨基酸残基的片段(马聪和孔维文，2012)。尽管metacaspase没有表现出类caspase活性，但它们仍然在植物细胞程序化死亡过程中发挥作用(Zhang和Lam，2011)。Hoeberichts等(2003)在灰葡萄孢菌引起的番茄叶片超敏反应中观察到II型metacaspase基因LeMCA1表达量明显升高，说明metacaspase参与了植物抗病的超敏反应。在烟草中，超量表达metacaspase基因NbMC1能增强烟草对毁灭炭疽菌的抗性(Hao等，2007)。欧洲云杉II型metacaspase的下调能抑制其胚胎形成时期胚柄细胞的细胞程序化死亡过程(Suarez等，2004)。拟南芥基因组中共存在9个metacaspase基因，其中，两个I型metacaspase基因(AtMC1和AtMC2)已被证实能调控细胞程序化死亡过程，AtMC1是正调控因子，而AtMC2是负调控因子(Coll等，2010)。Watanabe和Lam(2011)证明在生物和非生物胁迫诱导的拟南芥细胞程序化死亡中，AtMC4都发挥着正调控因子的作用。小麦中该基因的同源基因TaMC4也被证实调控了条锈菌诱导的细胞程序化死亡过程(Wang等，2012)。拟南芥II型metacaspase基因AtMC8在UVC和H2O2介导的细胞程序化死亡过程中表达上调，该基因的缺失会减弱细胞死亡，推测AtMC8参与了氧胁迫诱导的拟南芥细胞程序化死亡过程(He等，2008)。Ahmad等(2012)也发现玉米II型metacaspase基因的表达及活性受臭氧胁迫及衰老的诱导，metacaspase介导的蛋白质水解在叶片应对臭氧胁迫及年龄诱导的衰老中起重要作用。拟南芥metacaspase基因AtMC9则特异的在发育的木质部中表达，参与木质部细胞死亡调控(Bollhoner等，2013)。这些研究结果表明，metacaspase基因家族成员在发育、生物或非生物逆境诱导的细胞程序化死亡过程中发挥着关键作用。到目前为止，尚没有有关橡胶树metacaspase家族基因的研究报道。细胞程序化死亡在橡胶树死皮发生中扮演重要角色，而metacaspase家族基因又在细胞程序化死亡中起着重要调控作用。Metacaspase家族成员可能参与了橡胶树死皮发生调控。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是如何调控细胞的死亡，以及如何抑制或防治橡胶树死皮。为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种与橡胶树死皮相关的蛋白质，其名称为HbMC2,来源于大戟科橡胶树属的巴西橡胶树(HeveabrasiliensisMuell.Arg.)，是如下A1)或A2)：A1)氨基酸序列为序列表中序列1的蛋白质；A2)在序列1的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有相同功能的由A1)衍生的蛋白质；其中，序列1由361个氨基酸组成。为了使A1)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列1所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1.标签的序列标签残基序列Poly-Arg5-6(通常为5个)RRRRRPoly-His2-10(通常为6个)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述A2)中的HbMC2可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述A2)中的HbMC2的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。为解决上述技术问题，本发明还提供了与上述HbMC2蛋白相关的生物材料，所述生物材料为下述B1)至B12)中的任一种：B1)编码HbMC2的核酸分子；B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；B9)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；B10)含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；B11)含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；B12)含有B4)所述重组载体的转基因植物细胞系。上述生物材料中，B1)所述核酸分子可为如下b1)或b2)或b3)或b4)的基因：b1)核苷酸序列是序列表中序列2的第98-1183位的cDNA分子或DNA分子；b2)核苷酸序列是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有90％以上同一性，且编码HbMC2的cDNA分子或基因组DNA分子；b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码HbMC2的cDNA分子或基因组DNA分子。其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。其中，序列2由1267个核苷酸组成，第98-1183位为编码区，编码序列1所示的HbMC2。本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码HbMC2的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的编码HbMC2的核苷酸序列90％或者更高同一性的核苷酸，只要编码HbMC2且具有HbMC2功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码HbMC2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。上述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。上述90％以上同一性，可为90％或95％以上的同一性。上述生物材料中，B2)所述的含有编码HbMC2的核酸分子的表达盒(HbMC2基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达HbMC2的DNA，该DNA不但可包括启动HbMC2基因转录的启动子，还可包括终止HbMC2基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S；来自番茄的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)PlantPhysiol120：979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆betaconglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBOJ.4：3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV35S终止子、tml终止子、豌豆rbcSE9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(1985)Nature313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人GenesDev.,5:141；Mogen等人(1990)PlantCell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)NucleicAcidsRes.17:7891；Joshi等人(1987)NucleicAcidRes.,15:9627)。可用现有的表达载体构建含有所述HbMC2基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒可为酵母表达载体pYES2。上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如大肠杆菌。所述酵母可为酿酒酵母菌株INVScl。上述生物材料中，所述转基因植物细胞系不包括繁殖材料。在本发明的一个实施方式中，HbMC2的编码基因通过含有HbMC2基因表达盒的重组载体导入酿酒酵母菌株INVScl中得到重组微生物。所述重组载体为将酵母表达载体pYES2的BamHI和NotI识别位点间的序列替换为序列表中序列2的第98-1183核苷酸所示的DNA分子，得到的重组载体。所述重组载体表达序列1所示的HbMC2。所述重组微生物表达序列1所示的HbMC2。为解决上述技术问题，本发明提供了HbMC2或其相关的生物材料在下述C1)-C5)任一中的应用：C1)调控细胞死亡；C2)调控生物氧化胁迫抗性；C3)调控橡胶树死皮发生；C4)选育死皮发生率降低的橡胶树品种；C5)制备橡胶树死皮的防治产品。上述应用中，所述死皮可为自然条件下发生的死皮，也可为诱发因子诱发的死皮；所述细胞死亡可为细胞死亡诱发因子诱导的细胞死亡。所述细胞死亡诱发因子和所述死皮诱发因子均可为伤害、过氧化氢或乙烯利。所述伤害可为机械伤害和/或自然伤害。所述氧化胁迫可为过氧化氢诱导的氧化胁迫。上述应用中，所述细胞可为微生物细胞或植物细胞。所述微生物细胞可为酵母细胞；所述植物细胞可为橡胶树树皮的细胞。为解决上述技术问题，本发明还提供了HbMC2或B1)所述核酸分子作为靶标在防治橡胶树死皮中的应用。本发明所提供的HbMC2或B1)所述核酸分子作为靶标在防治橡胶树死皮中的应用为下述任一用途：I1)抑制HbMC2表达的物质在防治橡胶树死皮中的应用；I2)抑制HbMC2编码基因的转录的物质在防治橡胶树死皮中的应用；I3)降低HbMC2的表达水平的物质在防治橡胶树死皮中的应用；I4)降低HbMC2编码基因的转录水平的物质在防治橡胶树死皮中的应用；I5)使HbMC2失活的物质在防治橡胶树死皮中的应用。上述应用中，所述死皮可以为自然条件下发生的死皮，也可为死皮诱发因子诱发的死皮；所述死皮诱发因子可为伤害、过氧化氢或乙烯利。所述伤害可为机械伤害和/或自然伤害。上述应用中，所述HbMC2编码基因可为B1)所述核酸分子。具有如下D1)-D5)中至少一种功能的物质在制备防治橡胶树死皮产品中的应用也属于本发明保护的范围：D1)抑制HbMC2的表达；D2)抑制B1)所述核酸分子的表达；D3)降低HbMC2的表达；D4)降低B1)所述核酸分子的表达；D5)使HbMC2失活。上述应用中，所述死皮可以为自然条件下发生的死皮，也可为死皮诱发因子诱发的死皮；所述死皮诱发因子可为伤害、过氧化氢或乙烯利。所述伤害可为机械伤害和/或自然伤害。为解决上述技术问题，本发明还提供了下述E1)-E4)中任一种方法：E1)培育氧化胁迫抗性降低的转基因生物的方法，包括如下步骤：向受体生物中导入B1)所述核酸分子，得到转基因生物；所述转基因生物与所述受体生物相比对氧化胁迫的抗性降低；E2)培育氧化胁迫抗性提高转基因生物的方法，包括如下步骤：敲除目的生物中B1)所述核酸分子或抑制所述目的生物中B1)所述核酸分子的表达，得到转基因生物；所述转基因生物与所述目的生物相比对氧化胁迫的抗性提高；E3)培育抗死皮发生转基因生物的方法，包括如下步骤：敲除目的生物中B1)所述核酸分子或抑制所述目的生物中B1)所述核酸分子的表达，得到转基因生物；所述转基因生物群体中的死皮发生率低于所述目的生物群体中的死皮发生率；E4)培育非抗死皮发生转基因生物的方法，包括如下步骤：向受体生物中导入B1)所述核酸分子，得到转基因生物；所述转基因生物群体中的死皮发生率高于所述目的生物群体中的死皮发生率。上述方法中，B1)所述核酸分子可先进行如下修饰，再导入所述受体生物中，以达到更好的表达效果：1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述HbMC2编码基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％、多于45％、多于50％或多于约60％；2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；5)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV,MCMV和AMV)。上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述基因转化受体植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。上述方法中，所述HbMC2编码基因可为B1)所述核酸分子。上述方法中，所述目的生物或所述受体生物可为微生物和植物。所述微生物具体可为酵母，所述植物具体可为橡胶树。上述方法中，所述死皮可以为自然条件下发生的死皮，也可为死皮诱发因子诱发的死皮。所述死皮诱发因子可为伤害、过氧化氢或乙烯利。所述伤害可为机械伤害和/或自然伤害。所述氧化胁迫可为过氧化氢诱导的氧化胁迫。实验证明，本发明的HbMC2及其编码基因可以降低生物的氧化胁迫抗性，促进氧化胁迫下细胞的死亡：在未经H2O2处理时，含有HbMC2编码基因的重组酵母INVSc1(pYES2-HbMC2)和不含HbMC2编码基因的重组酵母INVSc1(pYES2)在液体和固体诱导培养基中的生长没有明显差异。将等量的重组酵母INVSc1(pYES2-HbMC2)和INVSc1(pYES2)接种到3mMH2O2的固体诱导培养基上，30℃培养3天后，发现H2O2胁迫处理下，重组酵母INVSc1(pYES2-HbMC2)的菌斑数要明显少于INVSc1(pYES2)。将等量的重组酵母INVSc1(pYES2-HbMC2)和INVSc1(pYES2)接种到3mMH2O2的液体诱导培养基中，30℃，200rpm振荡培养，于不同时间点测定菌液OD600值。结果表明，H2O2处理24h后，INVSc1(pYES2-HbMC2)的OD600值明显小于INVSc1(pYES2)，且随着处理时间延长，这种差距逐渐加大，在处理48h时，INVSc1(pYES2)菌液的OD600值约为INVSc1(pYES2-HbMC2)的10倍。进一步研究发现，高浓度H2O2(10mM)处理6h后，重组酵母INVSc1(pYES2-HbMC2)的细胞死亡率明显高于INVSc1(pYES2)。以上结果表明，在酵母中表达HbMC2基因会抑制重组酵母INVSc1(pYES2-HbMC2)在氧化胁迫下的生长，提高氧化胁迫下的细胞死亡率，降低重组酵母对氧化胁迫的抗性。荧光定量PCR分析表明，HbMC2基因在死皮橡胶树树皮中的表达水平高于健康橡胶树，且HbMC2基因的表达受死皮诱导因子伤害、过氧化氢及乙烯利诱导，表明HbMC2基因的表达与橡胶树死皮发生密切相关。利用酵母表达系统对HbMC2基因的功能鉴定表明，HbMC2基因正调控H2O2介导的细胞死亡。以上结果表明，橡胶树HbMC2基因在死皮发生中起着重要作用，该基因表达的上调会导致细胞死亡，进而引发死皮的发生。这不仅丰富了橡胶树死皮发生的分子机制，也为进一步研究细胞程序性死亡在橡胶树死皮发生中的作用奠定了基础。HbMC2及其编码基因也可作为橡胶树死皮防控的重要靶标，有望通过调控HbMC2及其编码基因的表达来防治橡胶树死皮，包括:(1)构建针对HbMC2编码基因的反义表达、RNAi及基因敲除载体，并将其转化到橡胶树中，通过抑制HbMC2基因的表达或敲除HbMC2基因培育筛选得到死皮发生率降低的转基因橡胶树；(2)以HbMC2或其编码基因为靶标开发橡胶树死皮防治药物。附图说明图1为橡胶树HbMC2蛋白保守结构域预测结果。图2为橡胶树HbMC2与其他植物metacaspase蛋白的系统进化树。图3为橡胶树HbMC2基因在健康和死皮橡胶树胶乳及树皮中的表达差异分析。其中“**”表示在0.01水平上HbMC2基因的表达量在健康树与死皮树之间具有显著差异。图4为伤害处理对胶乳中HbMC2基因表达的影响。图5为H2O2处理后胶乳中HbMC2基因的表达变化。其中，“*”和“**”分别表示处理与对照(0h)在0.05和0.01水平上具有显著差异。图6为乙烯利处理后胶乳中HbMC2基因的表达变化。其中“*”和“**”分别表示处理与对照(0h)在0.05和0.01水平上具有显著差异。图7为不同诱导时间点重组酵母中HbMC2基因的表达检测。其中1、2和3分别为对照重组酵母INVSc1(pYES2)诱导24、36和48h时HbMC2基因特异引物的检测结果；4、5和6分别为重组酵母INVSc1(pYES2-HbMC2)诱导24、36和48h时HbMC2基因特异引物的检测结果。图8为氧化胁迫下重组酵母INVSc1(pYES2-HbMC2)和INVSc1(pYES2)的生长差异。其中HbMC2代表重组酵母INVSc1(pYES2-HbMC2)；pYES2为对照INVSc1(pYES2)；A图为对照组(即未经H2O2氧化胁迫处理)；B图为氧化胁迫(3mMH2O2)处理。图9为氧化胁迫下重组酵母INVSc1(pYES2-HbMC2)和INVSc1(pYES2)的菌液浓度(OD600值)差异比较。其中HbMC2-CK和pYES2-CK分别为重组酵母INVSc1(pYES2-HbMC2)和对照INVSc1(pYES2)在正常条件(未经H2O2氧化胁迫处理)下的生长曲线；HbMC2-3和pYES2-3分别为重组酵母INVSc1(pYES2-HbMC2)和对照INVSc1(pYES2)在氧化胁迫(3mMH2O2)处理下的生长曲线。图10为氧化胁迫处理6h后，重组酵母INVSc1(pYES2-HbMC2)和INVSc1(pYES2)的存活情况。其中HbMC2代表重组酵母INVSc1(pYES2-HbMC2)；pYES2代表对照INVSc1(pYES2)。A图为对照组(未经H2O2胁迫处理的重组菌)；B图为10mMH2O2处理6h后的重组菌。具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的巴西橡胶树(HeveabrasiliensisMuell.Arg.)热研7-33-97(黄华孙,梁茂寰,吴云通,黎德舜,何进威.中规模推广级橡胶树优良品种热研7-33-97的选育.热带作物学报,1994,02:1-6.)，为中国热带农业科学院橡胶研究所产品。下述实施例中的YPD液体培养基为由溶质和溶剂组成的无菌液体培养基，溶质及其浓度为1％(质量百分比浓度)酵母膏，2％(质量百分比浓度)蛋白胨和2％(质量百分比浓度)葡萄糖，溶剂为水。下述实施例中的SC-Ura－液体培养基为缺乏尿氨酸的无菌酵母基本培养基，1LSC-Ura－液体培养基为向去离子水中加入酵母基本氮源(yeastnitrogenbase,YNB,不含氨基酸)6.7g,葡萄糖20g,腺嘌呤、精氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苏氨酸及色氨酸各0.1g，天冬氨酸、组氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、酪氨酸及缬氨酸各0.05g，并定容至1L得到的培养基。1LSC-Ura－固体培养基为向上述液体培养基中加入20g琼脂粉得到的培养基。下述实施例中的液体诱导培养基为以2％半乳糖为碳源的SC-Ura－液体培养基，1L液体诱导培养基为向去离子水中加入酵母基本氮源(yeastnitrogenbase,YNB,不含氨基酸)6.7g,半乳糖20g,腺嘌呤、精氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苏氨酸及色氨酸各0.1g，天冬氨酸、组氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、酪氨酸及缬氨酸各0.05g，并定容至1L得到的培养基。1L固体诱导培养基为向上述诱导培养基加入20g琼脂粉得到的培养基。下述实施例中的0mMH2O2的固体诱导培养基即为上述固体诱导培养基；2mMH2O2的固体诱导培养基为向固体诱导培养基中加入H2O2，得到的H2O2的浓度为2mM的固体诱导培养基；2.5mMH2O2的固体诱导培养基为向固体诱导培养基中加入H2O2，得到的H2O2的浓度为2.5mM的固体诱导培养基；3mMH2O2的固体诱导培养基为向固体诱导培养基中加入H2O2，得到的H2O2的浓度为3mM的固体诱导培养基。下述实施例中的2mMH2O2的液体诱导培养基为向液体诱导培养基中加入H2O2，得到的H2O2的浓度为2mM的液体诱导培养基；2.5mMH2O2的液体诱导培养基为向液体诱导培养基中加入H2O2，得到的H2O2的浓度为2.5mM的液体诱导培养基；3mMH2O2的液体诱导培养基为向液体诱导培养基中加入H2O2，得到的H2O2的浓度为3mM的液体诱导培养基。下述实施例中的0mMH2O2水溶液即为无菌蒸馏水。5mM和10mMH2O2水溶液分别为向无菌蒸馏水中加入H2O2，得到的H2O2的浓度分别为5mM和10mM的水溶液。实施例1.橡胶树死皮相关蛋白HbMC2及其编码基因的获得及序列分析申请人利用RNA-Seq技术分析了健康和死皮橡胶树树皮间的基因表达差异，发现一EST在健康和死皮橡胶树树皮间差异表达，在死皮橡胶树树皮中高表达。然后申请人以该EST序列为探针，对巴西橡胶树EST(ExpressedSequenceTags)、TSA(TranscriptomeShotgunAssembly)及基因组数据库进行同源比对分析，通过电子拼接及生物信息学分析，从巴西橡胶树中获得一条包含完整编码区的基因序列，该基因编码metacaspase蛋白，故将其命名为HbMC2,将编码该蛋白的基因命名为HbMC2基因。为验证获取HbMC2基因序列的准确性，利用通用植物总RNA提取试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)提取巴西橡胶树热研7-33-97树皮总RNA，采用DNaseI去除RNA中DNA，参照RevertAidTMFirstStrandcDNASynthesisKit(Fermentas公司)说明书合成第一链cDNA。根据推测序列设计引物(正向引物序列：5′-TGATTTTCCAGTCCTGATCCTGA-3′；反向引物序列：5′-ACAGCCAGTCAGTTGCAAAC-3′)，以树皮cDNA为模板，通过PCR扩增目标基因。PCR反应体系为：cDNA模板2μL，FastPfuBuffer5μL，2.5mMdNTPs2μL，正、反向引物(10μmol/L)各0.5μL，FastPfuDNAPolymerase(2.5U/μL)0.5μL，加ddH2O至总体积25μL。反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸1min30s，共设置35个循环；72℃延伸10min。对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明获得约1200bp左右的条带，与预期目标相符。切下条带，用琼脂糖凝胶回收试剂盒(OMEGA公司)回收该片段。然后将纯化的DNA片段连接至载体-BluntSimpleCloningVector(北京全式金生物技术有限公司)，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，挑取阳性克隆，送上海生工生物工程有限公司测序。测序结果表明，获得的HbMC2基因cDNA的核苷酸序列长1267bp，核苷酸序列如序列表中序列2所示。HbMC2基因的编码序列如序列表中序列2的第98-1183位核苷酸所示，编码序列1所示的蛋白质HbMC2。其中，序列2为HbMC2基因的cDNA序列。预测HbMC2蛋白分子量为39.55kD，理论等电点为6.59。利用NCBI保守结构域数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)对HbMC2氨基酸进行保守结构域分析，发现该蛋白含有LSD1锌指结构域和caspase结构域(Peptidase—C14)(图1)，表明HbMC2蛋白属于I型metacaspase家族蛋白。在NCBI网站上对HbMC2氨基酸序列进行Blastp同一性比对分析，并选取与HbMC2同源的其他植物metacaspase蛋白利用ClustalX和MEGA6.0软件绘制进化树，结果表明：HbMC2与麻疯树JcMC1、苹果MdMC1、番茄SlMC1、马铃薯StMC1-like和葡萄VvMC1近缘关系较近，位于同一亚分支(图2)。拟南芥中与HbMC2蛋白亲缘关系最近的是AtMC1。实施例2.橡胶树死皮相关基因HbMC2的表达模式分析(1)HbMC2基因在死皮橡胶树中高表达申请人分别以巴西橡胶树热研7-33-97健康及死皮橡胶树的树皮和胶乳cDNA为模板进行实时荧光定量PCR，实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：以分别从橡胶树热研7-33-97健康及死皮橡胶树树皮和胶乳中提取得到的总RNA反转录的cDNA为模板，用基因特异引物(正向引物为5′-CTCCTAATTCCTCTTACGCGGG-3′，反向引物为5′-TTCTTCCTACCGTGCGCATT-3′)进行实时荧光定量PCR分析。实时荧光定量PCR在Bio-RadCFX96荧光定量PCR仪进行，一次平行试验设3次重复。反应体系：PremixExTaqTM(2×)10μL，正反向引物各1μL，cDNA模板2μL，补ddH2O至总体积20μL。反应条件：95℃5min；95℃10s；58℃30s；40个循环后进行熔解曲线分析，以确定引物的特异性。以巴西橡胶树18SrRNA基因作为内参基因，内参基因的正、反向引物序列分别为5′-GCTCGAAGACGATCAGATACC-3′和5′-TTCAGCCTTGCGACCATAC-3′。基因相对表达量的计算采用公式2–ΔΔCt。数据处理与作图采用SigmaPlot12.0软件，相对表达量结果为3次重复的平均值±SD，差异显著性分析采用Student’sttest。HbMC2基因在死皮橡胶树中表达的结果如图3所示，同健康橡胶树相比，HbMC2基因在死皮橡胶树胶乳中的表达量没有发生显著变化，但HbMC2基因在死皮橡胶树树皮中的表达量显著升高。表明该基因与橡胶树死皮发生密切相关，该基因可能正调控橡胶树死皮发生，即橡胶树树皮中HbMC2基因表达量升高可能会导致橡胶树死皮的发生。(2)HbMC2基因表达受橡胶树死皮诱发因子伤害、过氧化氢(H2O2)及乙烯利处理的诱导在天然橡胶生产中，人们采用特制的刀具(胶刀)切割橡胶树树皮中的乳胶(俗称割胶)，使胶乳从割口流出，作为提炼天然橡胶的原料。割胶对橡胶树来说是一种不可避免的机械伤害。研究表明，割胶强度过大、长期和过度使用乙烯利刺激排胶会导致橡胶树死皮的发生。同时，研究发现死皮橡胶树中活性氧水平升高。为进一步研究死皮发生相关因子对HbMC2基因表达的影响，申请人分析了伤害、H2O2及乙烯利等橡胶树死皮诱发因子处理后胶乳中HbMC2基因的表达变化，实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：选取树围已达到开割标准的未开割巴西橡胶树热研7-33-97分别进行伤害、H2O2及乙烯利处理。伤害处理参照Tang等(Tangetal.,2010,ThesucrosetransporterHbSUT3playsanactiveroleinsucroseloadingtolaticiferandrubberproductivityinexploitedtreesofHeveabrasiliensis(pararubbertree),PlantCellEnviron.,33(10):1708-1720)的方法，H2O2处理参照Zhu等(Zhuetal.,2010,HbMT2,anethephon-inducedmetallothioneingenefromHeveabrasiliensisrespondstoH2O2stress,PlantPhysiol.Biochem.,48:710-715)的方法，乙烯利处理参照Hao和Wu(HaoB.Z.,WuJ.L.,2000,LaticiferdifferentiationinHeveabrasiliensis:inductionbyexogenousjasmonicacidandlinolenicacid.Ann.Bot.,85:37-43)的方法，以未作处理的正常植株作对照。每处理每时间点3次重复，每重复5棵橡胶树，每种处理的橡胶树均为不同的橡胶树。伤害及H2O2处理在处理0、6、24和48h采集胶乳，乙烯利处理在处理0、4、8、24及48h采集胶乳，样品采集后液氮冻存。按照步骤(1)中的荧光定量PCR方法分析伤害、H2O2及乙烯利处理后的HbMC2基因的表达水平。结果表明，伤害、H2O2及乙烯利处理均能上调胶乳中HbMC2基因的表达。伤害、H2O2及乙烯利处理均能上调胶乳中HbMC2基因的表达。伤害处理后，HbMC2基因在胶乳中的表达略有上升，但与处理前相比差异不显著(图4)。氧化胁迫下，胶乳中HbMC2基因的表达呈先升高后降低趋势。处理24h时，HbMC2基因的相对表达量最高，显著高于处理前HbMC2基因的表达水平，为处理前的3.0倍。此后，HbMC2基因的表达下降，但表达水平仍显著高处理前(图5)。乙烯利处理后，HbMC2基因在胶乳中的表达呈先升高后下降趋势，在处理8h时，该基因的表达水平达到最大值，为处理前的2.3倍，显著高于处理前HbMC2基因的表达水平，此后，HbMC2基因的表达下降，处理48h时，该基因的表达基本恢复到处理前表达水平(图6)。以上结果表明，HbMC2基因的表达受H2O2和乙烯利等死皮诱发因子的诱导，这进一步表明，HbMC2基因的表达与橡胶树死皮发生密切相关。实施例3.HbMC2基因可以降低转基因酵母的氧化胁迫抗性，诱导转基因酵母的死亡一、重组酵母的构建(一)酵母表达载体的构建根据序列表中序列2设计扩增编码区(5′端第98至1183位核苷酸)的引物对，正、反向引物5′端分别引入BamHI和NotI酶切位点及保护碱基。正向引物：5′-GCGGATCCATGTTCATGCTCGTCGACTG-3′(下划线处为BamHI的识别序列)，反向引物：5′-TAGCGGCCGCTCAGAAAGAAAAAGGTCTGG-3′(下划线处为NotI的识别序列)。以树皮cDNA为模板，通过PCR扩增目标基因。PCR反应体系为：cDNA模板2μL，FastPfuBuffer5μL，2.5mMdNTPs2μL，正、反向引物(10μmol/L)各0.5μL，FastPfuDNAPolymerase(2.5U/L)0.5μL，加ddH2O至总体积25μL。反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸1min10s，共设置35个循环；72℃延伸10min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳、回收纯化后连接到-BluntSimpleCloningVector(北京全式金生物技术有限公司)，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，挑取阳性克隆，送上海生工生物工程有限公司测序。采用质粒提取试剂盒(OMEGA公司)抽提测序正确克隆及酵母表达载体pYES2(Invitrogen公司)空载体质粒，用限制性内切酶BamHI和NotI(Fermentas公司)进行双酶切。双酶切体系：BamHI(10U/L)1μL，NotI(10U/μL)1μL，10×TangoBuffer6μL，质粒DNA8μL，补ddH2O至30μL。37℃水浴3h。酶切产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收目标条带。采用T4DNA连接酶将回收的目标基因和pYES2载体骨架连接，连接体系：目标基因回收产物6μL，pYES2载体骨架2μL，T4DNA连接酶1μL，10×Buffe1μL；16℃连接过夜。连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，然后在含氨苄青霉素(100mg/L)的LB固体平板上37℃培养过夜。挑取单克隆摇菌，利用pYES2载体引物(T7：5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′)加基因特异反向引物对菌落进行阳性筛选，阳性克隆进一步进行测序鉴定。测序结果显示在重组质粒pYES2-HbMC2的BamHI和NotI识别位点之间含有序列2中的第98至1183位核苷酸序列，表明构建的重组表达载体正确。将该重组载体命名为pYES2-HbMC2，pYES2-HbMC2表达氨基酸序列为序列表中序列1的蛋白质HbMC2。(二)重组酵母的构建1.重组酵母的构建酿酒酵母菌株INVScl(Invitrogen公司)是尿氨酸营养缺陷型(Ura－)的菌株，在SC-Ura－培养基上，该酵母菌株几乎不能生长和繁殖。而酵母表达载体pYES2上含有URA3基因，且该基因的表达可以使酵母转化子在SC-Ura－培养基上正常生长。因此，可以用SC-Ura－培养基对阳性酵母转化子进行筛选。抽提pYES2和重组表达载体pYES2-HbMC2质粒，并通过醋酸锂法将它们分别转化到酵母感受态菌株INVSc1中，将转化酵母菌液涂在SC-Ura－固体培养基上，以未转化的酵母做对照，30℃倒置培养，2天后除未转化的酵母完全不长外，转化两种质粒的酵母均可以生长并有菌落长出，说明酵母转化成功。挑取酵母单菌落，过夜培养后进行破除细胞壁，并通过菌液PCR方法进行阳性转化子的进一步鉴定。具体构建步骤如下：1)挑取酵母INVSc1单克隆加入到10mLYPD液体培养基中，30℃，200rpm摇培过夜。2)检测酵母菌液的OD600值，在50mLYPD液体培养基加入过夜培养的酵母菌液，稀释至OD600为0.4，30℃，200rpm继续摇培2-4h。3)4℃，2500rpm离心5min，弃上清收集菌体，用40mLl×TE缓冲液重悬菌体。4)4℃，2500rpm再次离心5min，弃上清收集菌体，用2mLl×LiAc/0.5×TE重悬菌体。5)将获得的重悬菌体分装到1.5mL离心管，每管100μL。6)将分装的酵母细胞置于室温孵育10min。7)在每个转化体系(100μL)中，加入1μgpYES2-HbMC2，100μg变性鲑鱼精DNA，混匀。8)加入700μLl×LiAc/40％PEG-3350/l×TE，混匀。9)30℃孵育步骤1.8中的混合液30min。10)加入88μL的DMSO，混匀后，42℃热击7min。11)4℃5000rpm离心lmin，弃去上清。12)用lmLl×TE缓冲液重悬菌体，4℃，5000rpm离心lmin，弃去上清。13)用100μLl×TE的缓冲液将菌体重悬，并涂于SC-Ura－固体培养基上，30℃倒置培养2天。从SC-Ura－固体培养基上随机挑取INVSc1(pYES2-HbMC2)单克隆3个，30℃，200rpm振荡培养过夜。取过夜培养物，沸水浴5min，冰上放置5min破碎细胞，重复几次，以细胞破碎液离心浓缩样品作为模板进行菌液PCR阳性检测。阳性克隆为含有pYES2-HbMC2的重组酵母，将其命名为INVSc1(pYES2-HbMC2)。按照上述方法，将pYES2-HbMC2替换为pYES2，其他步骤均不变，得到含有pYES2的重组酵母，将其命名为INVSc1(pYES2)。2.重组酵母中HbMC2表达的检测将INVSc1(pYES2-HbMC2)和INVSc1(pYES2)(用作阴性对照)保存菌液分别接种于SC-Ura－液体培养基中，30℃，200rpm振荡培养24h，测量其OD600值。取一定量的培养物，4000r/min，离心1min，弃上清，用液体诱导培养基重悬菌体，并调整OD600＝0.2，各取50mL，30℃，200rpm诱导培养，于诱导培养24、36和48h时，各取10ml菌液，低速离心收集菌体，采用酵母总RNA快速提取试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)提取总RNA，采用DNaseI去除RNA中DNA，参照RevertAidTMFirstStrandcDNASynthesisKit(Fermentas公司)说明书合成第一链cDNA。首先利用酿酒酵母Actin基因(GeneBank登录号：L00026.1)将每PCR反应中模板cDNA的含量调一致，然后再利用HbMC2基因特异引物对模板进行PCR扩增。PCR反应体系为：模板2-3μL，Buffer2.5μL，dNTPs2μL，正、反向引物各0.5μL，Taq酶0.5μL，补ddH2O至总体积25μL。反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共设置30个循环；72℃延伸10min。结果显示，在诱导培养24、36和48h时，转空载体阴性对照INVSc1(pYES2)未检测到HbMC2基因表达，而在重组菌INVSc1(pYES2-HbMC2)中可以检测到HbMC2基因的表达，其中诱导培养36h时，HbMC2基因表达量最高(图7)。以上结果表明，橡胶树HbMC2基因能在重组酵母INVSc1(pYES2-HbMC2)中表达。二.重组酵母INVSc1(pYES2-HbMC2)的氧化胁迫抗性检测1.重组酵母INVSc1(pYES2-HbMC2)和INVSc1(pYES2)在含不同浓度H2O2固体诱导培养基上的生长差异比较将步骤一的INVSc1(pYES2-HbMC2)接种于SC-Ura－液体培养基中，30℃、200rpm振荡培养24h，至OD600值为2.0左右，4000r/min，离心1min，弃上清液，用液体诱导培养基重悬菌体，并调整OD600＝0.2，取10mL，于30℃、200rpm下诱导表达培养36h，测量其OD600值，并将其浓度调整至OD600＝1，得到INVSc1(pYES2-HbMC2)培养液。随后将INVSc1(pYES2-HbMC2)培养液分别用诱导培养基稀释5倍、52倍、53倍和54倍，分别得到稀释5倍的INVSc1(pYES2-HbMC2)培养液、稀释52倍的INVSc1(pYES2-HbMC2)培养液、稀释53倍的INVSc1(pYES2-HbMC2)培养液和稀释54倍的INVSc1(pYES2-HbMC2)培养液。按照上述方法，将INVSc1(pYES2-HbMC2)替换为INVSc1(pYES2)，其他步骤均不变，分别得到INVSc1(pYES2)培养液、稀释5倍的INVSc1(pYES2)培养液、稀释52倍的INVSc1(pYES2)培养液、稀释53倍的INVSc1(pYES2)培养液和稀释54倍的INVSc1(pYES2)培养液。H2O2的处理：将INVSc1(pYES2-HbMC2)培养液分别点样在0mMH2O2的固体诱导培养基和3mMH2O2的固体诱导培养基上，每个培养基平板点5μL培养液，每处理4次重复。30℃培养3天后，分别得到未处理的INVSc1(pYES2-HbMC2)和3mMH2O2处理的INVSc1(pYES2-HbMC2)。按照上述H2O2的处理方法，将INVSc1(pYES2-HbMC2)培养液替换为稀释5倍的INVSc1(pYES2-HbMC2)培养液，分别得到稀释5倍后未处理的INVSc1(pYES2-HbMC2)和稀释5倍后3mMH2O2处理的INVSc1(pYES2-HbMC2)。按照上述H2O2的处理方法，将INVSc1(pYES2-HbMC2)培养液替换为稀释52倍的INVSc1(pYES2-HbMC2)培养液，分别得到稀释52倍后未处理的INVSc1(pYES2-HbMC2)和稀释52倍后3mMH2O2处理的INVSc1(pYES2-HbMC)。按照上述H2O2的处理方法，将INVSc1(pYES2-HbMC2)培养液替换为稀释53倍的INVSc1(pYES2-HbMC2)培养液，分别得到稀释53倍后未处理的INVSc1(pYES2-HbMC2)和稀释53倍后3mMH2O2处理的INVSc1(pYES2-HbMC2)。按照上述H2O2的处理方法，将INVSc1(pYES2-HbMC2)培养液替换为稀释54倍的INVSc1(pYES2-HbMC2)培养液，分别得到稀释54倍后未处理的INVSc1(pYES2-HbMC2)和稀释54倍后3mMH2O2处理的INVSc1(pYES2-HbMC2)。按照上述H2O2的处理方法，将INVSc1(pYES2-HbMC2)培养液替换为INVSc1(pYES2)培养液，分别得到未处理的INVSc1(pYES2)和3mMH2O2处理的INVSc1(pYES2)。按照上述H2O2的处理方法，将INVSc1(pYES2-HbMC2)培养液替换为稀释5倍的INVSc1(pYES2)培养液，分别得到稀释5倍后未处理的INVSc1(pYES2)和稀释5倍后3mMH2O2处理的INVSc1(pYES2)。按照上述H2O2的处理方法，将INVSc1(pYES2-HbMC2)培养液替换为稀释52倍的INVSc1(pYES2)培养液，分别得到稀释52倍后未处理的INVSc1(pYES2)和稀释52倍后3mMH2O2处理的INVSc1(pYES2)。按照上述H2O2的处理方法，将INVSc1(pYES2-HbMC2)培养液替换为稀释53倍的INVSc1(pYES2)培养液，分别得到稀释53倍后未处理的INVSc1(pYES2)和稀释53倍后3mMH2O2处理的INVSc1(pYES2)。按照上述H2O2的处理方法，将INVSc1(pYES2-HbMC2)培养液替换为稀释54倍的INVSc1(pYES2)培养液，分别得到稀释54倍后未处理的INVSc1(pYES2)和稀释54倍后3mMH2O2处理的INVSc1(pYES2)。以上各种处理后的重组酵母的生长如图8所示，在未经H2O2处理对照组中，INVSc1(pYES2-HbMC2)和INVSc1(pYES2)的菌斑数没有明显差异(图8中A)，但在3mMH2O2胁迫处理下，INVSc1(pYES2-HbMC2)的菌斑数要明显少于INVSc1(pYES2)(图8中B)，表明超量表达HbMC2基因的重组酵母对氧化胁迫更敏感，HbMC2及其编码基因高表达会抑制氧化胁迫下细胞的生长。2.重组酵母INVSc1(pYES2-HbMC2)和INVSc1(pYES2)在不同浓度H2O2液体诱导培养基中的生长差异比较将步骤一的INVSc1(pYES2-HbMC2)接种于SC-Ura－液体培养基中，30℃、200rpm振荡培养24h，至OD600值为2.0左右，4000r/min，离心1min，弃上清液，用液体诱导培养基重悬菌体，并调整OD600＝0.2，得到未处理的INVSc1(pYES2-HbMC2)培养液，实验重复三次。按照上述方法，将液体诱导培养基替换为3mMH2O2的液体诱导培养基，其他步骤均不变，得到3mMH2O2处理的INVSc1(pYES2-HbMC2)培养液。按照上述方法，将INVSc1(pYES2-HbMC2)替换为INVSc1(pYES2)，其他步骤均不变，得到未处理的INVSc1(pYES2)培养液。按照上述方法，将INVSc1(pYES2-HbMC2)替换为INVSc1(pYES2)，并将液体诱导培养基替换为3mMH2O2的液体诱导培养基，其他步骤均不变，得到3mMH2O2处理的INVSc1(pYES2)培养液。将上述各培养液各取10mL，30℃、200rpm下诱导培养，每隔12h测量OD600值，连续测至培养48h，结果如图9和表2所示。结果显示，未经H2O2处理条件下，INVSc1(pYES2-HbMC2)和INVSc1(pYES2)菌液在不同培养时间点浓度基本没有差异；3mMH2O2处理前24h，INVSc1(pYES2-HbMC2)和INVSc1(pYES2)菌液的OD600值没有明显差异，但处理24h后，INVSc1(pYES2-HbMC2)的OD600值明显小于INVSc1(pYES2)，且随着处理时间延长，这种差距逐渐加大，在处理48h时，INVSc1(pYES2)菌液的OD600值约为INVSc1(pYES2-HbMC2)的10倍。这进一步证实转HbMC2基因的重组酵母对氧化胁迫更敏感，HbMC2负调控生物的氧化胁迫抗性，即HbMC2基因的高表达会降低生物的氧化胁迫抗性，HbMC2及其编码基因的高表达会抑制氧化胁迫下细胞的生长。表2.H2O2处理不同时间点，重组酵母INVSc1(pYES2-HbMC2)和INVSc1(pYES2)的OD600值3.高浓度H2O2胁迫处理后重组酵母菌INVSc1(pYES2-HbMC2)和INVSc1(pYES2)的存活差异将步骤一的INVSc1(pYES2-HbMC2)接种于SC-Ura－液体培养基中，30℃、200rpm振荡培养24h，至OD600值为2.0左右，4000r/min，离心1min，弃上清液，用诱导培养基重悬菌体，并调整OD600＝0.2，取10mL，于30℃、200rpm下诱导培养36h，取5mLINVSc1(pYES2-HbMC2)培养液两管，4000r/min，离心3min，弃上清液，将菌体分别重悬于0mMH2O2水溶液(即无菌蒸馏水)和10mMH2O2水溶液中，使得OD600＝1.0。混匀后，各取2mL于10mL离心管中，30℃、160rpm下孵育6h，分别得到未处理的INVSc1(pYES2-HbMC2)菌液和10mMH2O2处理的INVSc1(pYES2-HbMC2)菌液。将不同处理的菌液分别用无菌蒸馏水进行5倍的梯度稀释，分别得到稀释5倍的未处理的INVSc1(pYES2-HbMC2)菌液、稀释52倍的未处理的INVSc1(pYES2-HbMC2)菌液、稀释53倍的未处理的INVSc1(pYES2-HbMC2)菌液、稀释5倍的10mMH2O2处理的INVSc1(pYES2-HbMC2)菌液、稀释52倍的10mMH2O2处理的INVSc1(pYES2-HbMC2)菌液和稀释53倍的10mMH2O2处理的INVSc1(pYES2-HbMC2)菌液。将两种未稀释的菌液以及不同稀释倍数的菌液各取5μL分别点样在SC-Ura－固体培养基上，每处理4次重复。30℃培养3天，分别得到未处理的INVSc1(pYES2-HbMC2)、未处理的稀释5倍的INVSc1(pYES2-HbMC2)、未处理的稀释52倍的INVSc1(pYES2-HbMC2)、未处理的稀释53倍的INVSc1(pYES2-HbMC2)，10mMH2O2处理的INVSc1(pYES2-HbMC2)、10mMH2O2处理的稀释5倍的INVSc1(pYES2-HbMC2)、10mMH2O2处理的稀释52倍的INVSc1(pYES2-HbMC2)、10mMH2O2处理的稀释53倍的INVSc1(pYES2-HbMC2)。按照上述方法，将INVSc1(pYES2-HbMC2)替换为INVSc1(pYES2)，其他步骤均不变，分别得到未处理的INVSc1(pYES2)、未处理的稀释5倍的INVSc1(pYES2)、未处理的稀释52倍的INVSc1(pYES2)、未处理的稀释53倍的INVSc1(pYES2)，10mMH2O2处理的INVSc1(pYES2)、10mMH2O2处理的稀释5倍的INVSc1(pYES2)、10mMH2O2处理的稀释52倍的INVSc1(pYES2)、10mMH2O2处理的稀释53倍的INVSc1(pYES2)。上述各酵母的生长情况如图10所示，10mMH2O2处理6h后，相同稀释倍数下的INVSc1(pYES2-HbMC2)的菌斑数明显少于INVSc1(pYES2)，经稀释53倍后INVSc1(pYES2-HbMC2)已无菌斑生长，而INVSc1(pYES2)仍有菌斑生长。表明氧化胁迫下，INVSc1(pYES2-HbMC2)菌落死亡数较INVSc1(pYES2)升高，以上结果表明，氧化胁迫下，HbMC2的高表达会促进氧化胁迫下酵母细胞的死亡，进而表现出对氧化胁迫更敏感的表型。当前第1页1 2 3