本发明属于医疗产品
技术领域：
，具体而言，涉及一种特异性检测结核分枝杆菌感染的蛋白。
背景技术：
：我国体外诊断产业现正处于快速增长时期。然而巨大的市场需求与我国诊断试剂行业相对落后的自主研发能力的存明显的差距。如何从源头上开展自主创新，如何在诊断试剂原材料供应上不受制于个别境外医药巨头，如何将现有的生物医药领域的科研成果转化为产品是我国政府、科研院所和医药行业在近年来都非常关注的热点。并且现今市场上对更灵敏、高效的诊断试剂提出了刚性需求，能够快速准确的确诊结核病患者对于医务工作者和病人本人都具有重要意义。近年来数据调查结果显示，有结核病症状的患者76.6％接受过结核病病前相关检查，但是仅有35.8％被诊断为肺结核患者，提高病人发现率仍是当前结核病防治工作的重点也是难点。利用抗原特异性T细胞的细胞免疫反应进行病原微生物感染的体外诊断，是今年发展起来的一种新的检测方法。我们通过分离新鲜全血中的外周血单核细胞并进行刺激培养，然后利用ELISPOT检测能够分泌IFN-γ的细胞的数量。该方法目前主要应用于结核分枝杆菌感染的诊断。目前临床普遍采用的结核诊断主要依赖于临床症状、影响学诊断和病原学诊断，对结核分枝杆菌潜伏性感染的诊断不敏感。同时，在结核病筛查过程中，直接检测病原体或检测结核分枝杆菌抗体的灵敏度和特异性也不理想。技术实现要素：针对上述临床实际工作情况，我们筛选了结核分枝杆菌来源的蛋白片段，提供了一种检测结核病的结核分枝杆菌标识物抗原，通过该抗原来体外检测特异性T细胞免疫反应，可以作为诊断结核病患者的参照，用于诊断患者是否被结核分枝杆菌感染。同时，进一步动物实验表明，该蛋白抗原能够诱导针对结核分枝杆菌的免疫反应，具有制备相应的疫苗的功能。具体而言，本发明首先涉及一种结核分枝杆菌的特异性蛋白抗原Rv3899c，所述的抗原氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，其氨基酸序列结构为：编码所述蛋白抗原Rv3899c的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，其DNA序列结构为：本发明还涉及所述的Rv3899c蛋白抗原作为检测结核分枝杆菌的免疫原的应用，所述的应用为，将该Rv3899c蛋白抗原单独用于检测结核分枝杆菌。本发明还涉及所述的Rv3899c蛋白抗原在制备结核分枝杆菌检测试剂盒中的应用，所述的应用为，将所述的Rv3899c蛋白抗原单独作为检测抗原制备检测试剂盒。所述的现有结核分枝杆菌检测抗原为结核分枝杆菌来源的ESAT-6抗原、CFP10抗原、PPD抗原、BCG抗原、LAM抗原、ES-31抗原。本发明还涉及由所述的Rv3899c蛋白抗原制备的单一抗原型结核分枝杆菌检测试剂盒，所述试剂盒包含，(1)检测有效量浓度(优选浓度为75ug/ml)的Rv3899c蛋白抗原；(2)必要的检测试剂及显色试剂。本发明还涉及所述的单一型结核分枝杆菌检测试剂盒在检测结核分枝杆菌中的应用，其特征在于，所述的检测方法为，(1)检测样品为由待测患者血样制备得到的抗凝全血或PBMC细胞；(2)Rv3899c蛋白抗原作为免疫原与抗凝全血或者PBMC细胞孵育20-30个小时，优选20-24个小时(3)检测受到Rv3899c蛋白抗原刺激分泌的细胞因子，与阳性参照对比确定检测结果，所述的细胞因子为IFN-gamma、IFN-alpha、TNF-alpha、IL-2、IL-13、IP-10、IL-1ra、GM-CSF、MIP-1betta、IL-6、IL-8、MCP-1、IL-10和IL-12，优选IFN-gamma、TNF-alpha、IL-2、IL-13、 IP-10、IL-1ra、GM-CSF、MIP-1betta，进一步优选IFN-gamma、TNF-alpha、IL-2、IL-13，最优选IFN-gamma。本发明还涉及所述Rv3899c抗原在制备抗结核分枝杆菌的疫苗中的应用。附图说明图1.Rv3899c蛋白质SDS-PAGE检测图，左侧为Marker(单位Kd)，具体实施方式1、仪器试剂1.1抗生素与IPTG名称缩写分子量储液工作液溶剂卡那霉素Kan58.2830mg/ml30ug/ml水异丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG238.301M0.05mM水1.2培养基的配制LB培养基：10g蛋白胨、5g酵母膏、10g氯化钠(1L的量)加单蒸水至1L，检测PH＝6.8-7.2左右。如果PH偏差大于0.5，需要用NaOH或者HCl调节。固体的LB培养基多增加15-20％的琼脂1.3纯化bufferlysisbuffer：20mMTris-HCl、500mM氯化钠、10％甘油、pH7.5Washbuffer：20mMTris-HCl、20mM咪唑、500mM氯化钠、10％甘油、pH7.5Elutionbuffer：20mMTris-HCl、250mM咪唑、500mM氯化钠、10％甘油、pH7.5层析缓冲液：PBS、pH7.5。其他试剂固化Ni+层析树脂(Novagen)，Ni-NTAHis，(Cat.NO70691-5，北京华美；2-8度保存)；蛋白结合能力大于5mg/mlresin层析柱(玻璃或者聚丙烯)PMSFsuperdex200：(GE)实施例1.Rv3899c-pDEST17表达载体构建基础流程以LREnzymemix催化Rv3899c的入门载体(美国CraigVentorInstitute下设的PFGRC所免费提供)和pDESTTM17载体重组生成Rv3899c的表达载体。具体方法：A.克隆反应体系：Rv3899c的入门载体1.5μL，pDESTTM17载体1μL，BPIIEnzymemix2.5μL；反应条件：25℃，过夜反应。B.转化方法：反应体系中加入100μL大肠杆菌DH5α感受态(自制)，冰浴30min后，42℃热激90s，体系冰上放置10min，加入200μLLB培养基复性后，涂布在含氨苄青霉素(100mg/l)的LB固体培养基上，37℃培养20h。C.质粒提取：以N96高纯度质粒小提试剂盒(DP114)提取质粒，获得Rv3899c的表达载体。D.酶切验证：以BsrG1酶切试剂盒(R0575SNEB)酶切质粒验证克隆是否完成，结果显示，酶切片段大小约为1200bp，质粒构建成功。实施例2.目标蛋白Rv3899c的表达及复性1.蛋白表达a)LB平板划线活化(加入kan)，37℃静置过夜(16h左右)。b)将转化了实施例1制备获得的整合了Rv3899c的表达载体的大肠杆菌宿主细胞接种于5ml液体LB培养基(加入5ulkan)37℃200rpm，培养至OD大于0.6-0.8(大约3h)。c)按接种量5ml接种于300mlLB液体培养基中，37℃，200rpm培养至OD600≈0.6-0.8(大约2h)。降温到16℃，加入终浓度0.04mMIPTGd)16℃，200rpm培养培养16h，4℃，4000rpm离心10min收集菌体。2.蛋白纯化a)菌体重悬：每1L培养基所收集的菌体用40ml左右lysisbuffer重悬(加入1％蛋白酶抑制剂PMSF，则终浓度为0.5-1mM)b)菌体破碎：超声6s每次、功率为38％，超声20min。(悬浊液透亮为标准，酌情调整超声工作总时间)。c)去除细菌碎片：4℃，12000g离心30分钟。d)Ni柱处理：3mlNi柱先用水处理8cv(8倍柱体积)，再用8cvlysisbuffer作为平衡液平衡，流速为25cm/h。e)上样：破菌离心上清以25cm/ml的流速进行上样，收集流穿峰。f)平衡：样品上样后用平衡液平衡5cv。g)洗涤：用washbuffer洗涤5cvh)洗脱：用elutionbuffer洗脱，分管收集。用bradford试剂检测洗脱液，了解蛋白是否完全洗脱。如含有蛋白，则继续洗脱，直至完全。i)透析：洗脱蛋白装入12KD的透析袋中放入装有100倍洗脱蛋白体积的离子交换缓冲液A的烧杯中进行透析过夜。离心取上清。j)分子筛层析层析柱：superdex200(根据样品的量来确定层析介质的体积)流速；30cm/h层析过程：先用水处理5cv，再用0.5MNaOH处理半小时，再用层析缓冲液平衡层析，直至层析柱电导和pH流出液与层析缓冲液一致。透析离心上清作为样品上样，收集洗脱峰。检测：SDS-PAGE检测目的蛋白是否存在，结果如图1所示，SDS-PAGE电泳结果显示，提纯后的蛋白的分子量约为55KD，纯度大于90％，蛋白浓度合格。实施例3.目标蛋白Rv3899c的免疫原性测试为了检测Rv3899c的免疫原性及其对于现有抗原检测试剂盒的增强效果，对于来自北京胸科医院临床确诊的多个病例进行了进一步的抗原检测筛选。测试血样：来自北京胸科医院就诊患者阳性对照试剂与耗材：T-SPOT试剂盒(ESAT-6和CFP10双抗原试剂盒)，Oxfordimmunotec(英国)产品，阴性对照：Rv2327蛋白抗原，随机选取的另一段来源于结核分枝杆菌的已知蛋白片段Rv2327，其核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQIDNO.3及SEQIDNO.4所示SEQIDNo.3SEQIDNo.4实验方法及评价方法如下：1)肝素抗凝血，抗凝血样本按体积1:1与RPMI1640混匀；按2-3:1比例小心将血样加在Ficoll淋巴细胞分离液上层；2)1000g离心22分钟；水平转子，缓升缓降；3)将单核细胞层(位于离心管中间层，为一层较薄的白膜状)从Ficoll分离管中转移到已加10mlAIM-V培养液的无菌15ml离心管，轻轻混匀，室温600g离心7min；4)小心去除上清，加入1mlAIM-V，轻缓重悬细胞，加入AIM-V培养液至10ml,350g离心7min；5)小心弃上清，加入1mlAIM-V培养液重悬细胞；6)细胞计数及稀释，取10μl细胞悬液加入40μl的1％trypanblue，制备1：5细胞稀 释液，进行活细胞计数，计算细胞稀释需要的体积并加入相应的AIM-V无血清培养液制备细胞稀释液，试剂盒检测要求加入每孔(24孔PVDF膜板)细胞数量2.5×105；7)将培养板从铝封袋中取出，按顺序加入：50μlAIMV至阴性对照孔；50μl抗原ESAT-6至抗原A孔；50μl抗原CFP10至抗原B孔；50μl阳性对照至阳性对照孔；在上述4孔中分别加入已制备细胞稀释工作液100μl。50μl实施例2制备获得的Sampleprotein(初始浓度为60ug/ml)加入到样品孔中，随后加入培养基和细胞，样品孔中Sampleprotein的终浓度为初始浓度的1/3。8)将培养板放入37℃，5％CO2培养箱孵育16-20hrs。9)用无菌PBS按1:200制备新鲜酶标抗体工作液。从培养箱取出培养板，弃去孔内液体。以200μl/well无菌PBS洗涤4遍。10)加入50μl/well酶标抗体工作液，将培养板在2-8℃孵育1小时。用PBS洗涤4遍去除未结合酶标抗体。11)每孔加入室温平衡过的底物工作液50μl，室温反应7分钟。以蒸馏水冲洗终止反应，在37℃2-3hrs或室温过夜干燥培养板。免疫原测试结果和分析：免疫原性测试在胸科医院分子生物学实验室进行，测试选用一定数量的已临床确诊的结核病患者，通过使用各种蛋白抗原检测上述已确诊患者的血样，并由此结果分析Rv3899c蛋白抗原的免疫原性及应用方向，具体的检测结果统计见下表1所示，表1.Rv3899c抗原对住院已确诊结核病患者的结核分枝杆菌检测结果由检测结果可以看出，Rv3899c抗原筛查结合分枝杆菌感染的患者的结果，相比于T-spot的检测结果，准确率相当，但Rv3899c抗原筛查相比于T-SPOT试剂盒的双抗筛查，检测流程相对简单。最后需要说明的是，以上实施例仅供本领域技术人员理解本发明的实质，并不用作对本法保护范围的限定。当前第1页1 2 3