本发明涉及一种能高效表达脂肪酶的质粒、其构建方法及其应用，属于基因工程技术领域。
背景技术：
脂肪酶(lipase，ec3.1.1.3)，全称为三酰基甘油水解酶，是一类能将长链脂肪酸甘油酯水解成脂肪酸和二酰甘油酯、单酰甘油酯和甘油的生物酶。脂肪酶除了能够催化脂肪水解反应，还能够催化酯交换反应、酯化反应、脂肪的酸解反应和醇解反应。脂肪酶的催化反应主要发生在油水界面，具有独特的界面活化特性。羧酸酯酶(ec3.1.1.1)也是催化酯水解反应的酶，无界面活化特性，仅作用于水溶性底物，且底物是由短链脂肪酸(≤c8)形成的酯。为了区别不同的酯水解酶，脂肪酶也称为纯脂肪酶(truelipase)。在动植物和微生物细胞中，脂肪酶广泛存在。其中微生物来源的脂肪酶具有底物广泛、酶活性高、稳定性好、易于工业化生产等特性，在食品、造纸、皮革、化妆品、制药等许多工业领域都有广泛的应用。
枯草芽孢杆菌(b.subtilis)脂肪酶(lipa)属于第4亚族，分子量约为19.3kd，是已知3个分子量最小的脂肪酶之一；由于b.subtilis脂肪酶没有“盖子”结构，而缺少界面活化特性，使其在极性和非极性介质中都能发挥催化作用，而且底物范围较广、稳定性好、能够适应碱性条件(ph>9.5)。
b.subtilis不分泌外毒素、安全性高、易于基因调控、无密码子偏向性、生长快、易于大规模培养、且能够直接分泌胞外蛋白到培养基中，因此被视为优良的蛋白表达系统。目前利用b.subtilis表达微生物脂肪酶的研究主要集中于脂肪酶表达元件的修饰替换和载体及蛋白质信号肽的筛选。表达元件的修饰替换一般是将lip基因的启动子替换为强启动子以及将稳定子替换为强稳定子。
lesuisse等将lip基因与表达质粒连接，构建了重组质粒pma5-lip，然后将其转入b.subtilisbcl1050，发酵液最高脂肪酶活性为7.5u/ml。ma等向 质粒pbd64中插入一个强启动子和终止子，然后再将脂肪酶基因插入其中，转入b.subtilisa.s.1.1655后，构建了能表达脂肪酶的重组菌bsl2，其脂肪酶活力相比野生型菌株iffi10210提高了将近100倍，发酵液最高酶活为0.012u/ml。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种能高效表达脂肪酶的质粒及其构建方法，本发明的目的还在于提供一种包含上述质粒的高产脂肪酶的重组枯草芽孢杆菌基因工程菌及其构建方法。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现：
本发明第一方面涉及一种能高效表达脂肪酶的质粒php13l，包含所述质粒php13l的细菌菌株为枯草芽孢杆菌，该菌株已于2015年10月21日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)，其保藏编号为cgmccno.11522。所述质粒php13l包括以下结构部分：
a.pas基因表达盒，由噬菌体φ29的a1启动子a1以及枯草芽孢杆菌(b.subtilis)apre基因的稳定子a2构成；其中所述pas为该基因表达盒的命名；
b.编码枯草芽孢杆菌脂肪酶lipa的基因lip的编码区；
c.质粒php13；
其中a、b、c三个结构部分之间的结构关系为a与b拼接为ab，然后将ab插入c中。
在本发明优选的实施方案中，所述噬菌体φ29的a1启动子a1的碱基序列如seqidno.1所示；所述枯草芽孢杆菌(b.subtilis)apre基因的稳定子a2的碱基序列如seqidno.2所示；所述结构部分b的碱基序列如seqidno.3所示；所述结构部分c的碱基序列如seqidno.4所示。
在本发明优选的实施方案中，其中所述a1与所述a2的结构关系为a1位于a2的上游；所述a与所述b的位置关系为a位于b的上游；所述ab在所述a1上游的酶切位点psti和所述b下游的酶切位点ecori之间插入c。其中，沿转录进行的方向，将转录起始较早的部位定义为上游，较晚的部位定义为下游。
本发明第二方面根据本发明第一方面所述的质粒php13l的构建方法，其包 括以下步骤：
a.首先将所述噬菌体φ29的a1启动子a1与所述枯草芽孢杆菌(b.subtilis)apre基因的稳定子a2拼接，得到结构部分a；然后将所述结构部分a与所述结构部分b拼接得到所述ab；
该步骤的具体操作方法可以参照吕娟的硕士论文(吕娟，枯草芽孢杆菌lipa基因表达元件的修饰：[硕士学位论文]，天津；天津大学，2010.)中公开的方法。
b.通过设计引物p1和p2在a1的上游添加酶切位点psti，在b的下游添加酶切位点ecori，然后通过pcr扩增，获得带有酶切位点的已修饰的编码枯草芽孢杆菌脂肪酶lipa的基因lip片段，pcr产物即为带有酶切位点的ab；其中，设计引物及酶切位点的添加为本领域常规技术手段，本文不在赘述；
c.将所述带有酶切位点的ab和c分别用限制性核酸内切酶进行双酶切并进行纯化；
d.通过dna连接酶的作用，将经双酶切后的包含ab的基因片段与经双酶切后的c连接，即得到构建好的所述质粒php13l，其碱基序列如seqidno.5所示；
其中所述引物p1和p2的序列如下：
p1：5’-aaaactgcagttctgaaccgacttctcctt-3’
p2：5’-ccggaattcccattgtccgttacctgatag-3’
所述限制性核酸内切酶识别位点以加下划线的碱基表示。
在本发明优选的实施方案中，其各步骤中具体工艺条件如下:
步骤b的工艺条件如下：
(1)pcr反应体系
其中所述“10×全式hifidna聚合酶缓冲液”表示的含义为：所用所述全式hifidna聚合酶缓冲液的浓度为其工作浓度的10倍，所述工作浓度指的是dna聚合酶能够正常催化反应的浓度；
(2)pcr反应条件
步骤c的工艺条件如下：
(1)双酶切反应体系
其中，所述“2×缓冲液o”表示的含义为：所用所述缓冲液o的浓度为其工作浓度的2倍，所述工作浓度指的是两种限制性核酸内切酶能够正常催化反应的浓度；其中所述缓冲液o购自thermofisher公司，“o”代表缓冲液的型号；
(2)dna纯化
dna纯化采用多功能dna纯化回收试剂盒对得到的双酶切产物进行纯化以去除干扰的杂片段；
步骤d的工艺条件如下：步骤d反应体系
本发明第三方面涉及包含根据本发明第一方面所述的质粒php13l的细菌。本发明提供的菌株为枯草芽孢杆菌，该菌株已于2015年10月21日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)，其保藏编号为cgmccno.11522。
在本发明优选的实施方案中，宿主菌在分类系统中属于：门：firmicutes；纲：bacilli；目：bacillales；科：bacillaceae；属：bacillus；种：subtilis。
在本发明优选的实施方案中，宿主菌是以枯草芽孢杆菌(b.subtilis)168为出发菌，敲除了编码中性蛋白酶的基因npre和编码碱性蛋白酶的基因apre的细菌。敲除了上述两个基因的作用是能够提高分泌的脂肪酶的稳定性。
在本发明优选的实施方案中，所述宿主菌细胞大小为直径×长＝(0.7～0.8)×(2～3)微米，着色均匀，无荚膜，周生鞭毛，能运动；芽孢大小为直径×长＝(0.6～0.9)×(1.0～1.5)微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。
本发明第四方面涉及根据本发明第三方面所述的细菌的构建方法，其包括以下步骤：
a.将重组质粒php13l转化进入枯草芽孢杆菌(b.subtilis)中，得到重组细胞，用含氯霉素的lb平板筛选所述重组细胞；其中所述氯霉素的含量优选为6 μg/ml；
其中所述重组质粒的转化按照枯草芽孢杆菌的spirizzen转化方法，其包括以下步骤：
1、挑取活化好的b.subtilis单菌落，接于5mlgmi培养基中，37℃、200r/min振荡培养14h～16h。
2、取500μl上述菌液转接于4.5mlgmi培养基中，37℃、200r/min振荡培养4.5h，使菌体生长至指数生长中后期。
3、取750μl上述菌液转接于4.25mlgmii培养基中，37℃、240r/min振荡培养1.5h，制得感受态细胞。
4、每毫升感受态细胞加入0.5μg所述重组质粒。混匀后，200r/min振荡培养1.5h。
5、将所得菌液13000r/min离心1min。除去900μl上清液，重悬菌体，涂布于抗性平板上。37℃培养14～18h，然后挑选转化子。
其中所述gmi液体培养基(体积为5ml)配方以下：取0.5ml10×spizizen基本培养基，0.1ml2％酸水解酪素，取0.1ml5％酵母抽提物，0.1ml40％葡萄糖，50μl0.5％l-色氨酸，5μl20％mgso4·h2o，蒸馏水定容至5ml。母液115℃分别灭菌25min。所述gmii液体培养基(体积为5ml)配方如下：取0.5ml10×spizizen基本培养基，0.1ml40％葡萄糖，50μl2％酸水解酪素，40μl20％mgso4·h2o。蒸馏水定容至5ml。母液115℃分别灭菌25min。所述10×spizizen基本培养基配方如下：称取2g(nh4)2so4，18.3gk2hpo4，6gkh2po4，1.2g柠檬酸钠，蒸馏水定容至100ml。121℃灭菌15min。10×spizizen基本培养基指的是所得培养基中各物质浓度为spizizen基本培养基的10倍。
b.将得到的筛选后的重组细胞涂布于中性红油脂平板上划线，于37℃环境下培养24小时，得到使培养平板变为深红色的菌株，即为所述重组质粒正确表达的转化子；其中所述中性红油脂平板是在lb培养基的基础上，添加0.2％的质量浓度为1.6％中性红溶液和2％的花生油。所述中性红溶液为中性红的水溶液。
本发明第五方面涉及包含根据本发明第三方面所述的细菌的制剂。
本发明第六方面涉及根据本发明第三方面所述的细菌用于食品生产、养殖、饲料生产以及脂肪酶生产领域的用途。
如本文所用，下列术语将具有以下含义：
“pcr(聚合酶链式反应)”:是指dna在体外95℃高温时变性会变成单链，低温(经常是60℃左右)时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至dna聚合酶最适反应温度(72℃左右)，dna聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链的反应。
“宿主菌”：是指将外源的质粒导入进去的细菌。
“质粒”：存在于细菌染色体以外的独立的dna分子。
“感受态细胞”：是指处于能吸收外源dna的生理状态的细胞。
“限制性内切核酸内切酶”：是一类能特异性地识别双链dna序列并进行切割的酶。
“转化”：是指将外源的dna导入到细菌内进行表达的过程。
“转化子”：宿主菌吸收了表达载体的dna片段并把它组合到自己的基因组中，从而获得表达载体部分遗传性状，转化后的宿主菌称为转化子(transformant)。
“表达载体”：是指能将目的dna片段带入宿主菌，并能进行扩增并进行表达的一类dna分子，比较常用的是质粒。
“t4连接酶”：一种dna连接酶。
如本文所用，下列英文缩写将具有以下含义：
dntp脱氧核糖核苷三磷酸,包括datp,dgtp,dttp,dctp
dna脱氧核糖核酸
ddh2o双蒸水
rna核糖核酸
rnaserna水解酶
od600溶液在600nm波长处的吸光值
tris三羟甲基氨基甲烷
sds-page聚丙烯酰胺凝胶电泳
marker分子量标准
kda千道尔顿
rpm转/分钟
本发明的优点：本发明中构建了一种新的重组质粒，并将其导入细菌中得到重组基因工程菌，所得重组细菌可用于食品生产、养殖、饲料生产以及脂肪酶生产等领域。得到的重组枯草芽孢杆菌用于脂肪酶发酵可以得到酶活为221u/ml的发酵液，为脂肪酶的大规模生产及其在其他领域的应用奠定了良好的基础。
附图说明
图1为pcr产物和质粒php13双酶切后纯化电泳图；其中各泳道物质如下：
泳道1:双酶切后的质粒php13(双酶切后的c)；
泳道2：双酶切后的pcr产物；
泳道3：dnamarker。
图2为本发明的所述质粒php13l的构建关系示意图。图2中的1代表酶切位点psti；2代表酶切位点ecori。
图3为本发明实施例1中构建的重组枯草芽孢杆菌基因工程菌发酵产生的脂肪酶的蛋白电泳图(sds-page)；其中各泳道含义如下：
泳道m：蛋白质marker；
泳道1：不含质粒php13l的枯草芽孢杆菌发酵液；
泳道2：含有质粒php13l的枯草芽孢杆菌发酵液。
具体实施方式
下面通过对具体实施例的详细描述来进一步阐明本发明，但应理解，其并不是对本发明技术方案的限制。
实施例1-高产脂肪酶的重组枯草芽孢杆菌的构建及鉴定
步骤一：重组质粒php13l的构建
所述质粒php13l包括以下结构部分(如图2所示)：
a.pas基因表达盒，由噬菌体φ29的a1启动子a1以及枯草芽孢杆菌(b.subtilis)apre基因的稳定子a2构成；
b.编码枯草芽孢杆菌脂肪酶lipa的基因lip的编码区；
c.质粒php13；按照ctab法从带有质粒php13的枯草芽孢杆菌(b.subtilis)中提取该质粒；
所述ctab法操作过程如下：
1、挑取平板上活化好的单菌落，接于5mllb培养液中，37℃、220r/min振荡培养12h。
2、取1ml菌液于1.5ml的离心管，13000r/min离心2min。弃上清，加入200μl的stet溶液重悬菌体。
3、在上述溶液中，加入5μl的溶菌酶溶液(50g/l)，混匀后室温下静置5min。
4、将上述离心管于恒温混合器中99℃煮沸1min，然后13000r/min离心6min。
5、用牙签挑去离心管中的粘稠物，然后加入10μlctab(十六烷基三甲基溴化铵)溶液，混匀后在室温下放置2min。
6、将上述溶液13000r/min离心8min，弃上清。加入300μl的nacl溶液溶解沉淀，而后加入900μl的无水乙醇，混匀后于-20℃冰箱中放置20min。
7、将上述溶液，13000r/min离心8min，弃上清。于50℃烘箱中干燥沉淀。20μl无菌水溶解沉淀，混匀后于-20℃冰箱中保存。
其中a、b、c三个结构部分之间的结构关系为a与b拼接为ab，然后将ab插入c中。所述噬菌体φ29的a1启动子a1的碱基序列如seqidno.1所示；所述枯草芽孢杆菌(b.subtilis)apre基因的稳定子a2的碱基序列如seqidno.2所示；所述结构部分b的碱基序列如seqidno.3所示；所述结构部分c的碱基序列如seqidno.4所示。其中所述a1与所述a2的结构关系为a1位于a2的上游；所述a与所述b的位置关系为a位于b的上游；所述ab在所述a1上游的酶切位点psti和所述b下游的酶切位点ecori之间插入c。
所述的质粒php13l的构建方法包括以下步骤：
a.首先将所述噬菌体φ29的a1启动子a1与所述枯草芽孢杆菌(b.subtilis)apre基因的稳定子a2拼接，得到结构部分a；然后将所述结构部分a与所述结构部分b拼接得到所述ab；
b.通过设计引物p1和p2在a1的上游(即5’端)添加酶切位点psti，在b的下游(即3’端)添加酶切位点ecori，然后通过pcr扩增，获得带有酶切位点的已修饰的编码枯草芽孢杆菌脂肪酶lipa的基因lip片段，pcr产物即为带有酶切位点的ab；将扩增的片段以1％琼脂糖凝胶电泳验证扩增得到的片段大小正确；
c.将所述带有酶切位点的ab和c分别用限制性核酸内切酶进行双酶切，37℃ 体系下酶切3h，并进行纯化；纯化后利用琼脂糖凝胶电泳对酶切片段的长度进行验证，所得电泳图如图1所示。
d.通过dna连接酶的作用，将经双酶切后的包含ab的基因片段与经双酶切后的c连接，即得到构建好的所述质粒php13l，其碱基序列如seqidno.5所示；
其中所述引物p1和p2的序列如下：
p1：5’-aaaactgcagttctgaaccgacttctcctt-3’
p2：5’-ccggaattcccattgtccgttacctgatag-3’
所述限制性核酸内切酶识别位点以加下划线的碱基表示。
其各步骤中具体工艺条件如下:
步骤b的工艺条件如下：
(1)pcr反应体系
其中所述“10×全式hifidna聚合酶缓冲液”表示的含义为：所用所述全式hifidna聚合酶缓冲液的浓度为其工作浓度的10倍，所述工作浓度指的是dna聚合酶能够正常催化反应的浓度；
(2)pcr反应条件
步骤c的工艺条件如下：
(1)双酶切反应体系
其中，所述“2×缓冲液o”表示的含义为：所用所述缓冲液o的浓度为其工作浓度的2倍，所述工作浓度指的是两种限制性核酸内切酶能够正常催化反应的浓度；其中“o”代表缓冲液的型号；
(2)dna纯化
dna纯化采用多功能dna纯化回收试剂盒对得到的双酶切产物进行纯化以去除干扰的杂片段；所述纯化包括以下步骤：
1、每100μlpcr扩增后的体系或酶切后体系中加入500μl溶胶/结合液db，充分混匀。(如果初始体系小于100μl，应事先用双蒸水调至100μl)。
2、将上一步所得的溶液加入吸附柱ec中(吸附柱放入收集管中)，于室温下放置1min，然后12000rpm离心30～60秒，倒掉收集管中的废液。
3、向吸附柱中加入500μl漂洗液wb，12000rpm离心30s，弃掉收集管中的废液。
4、再向吸附柱中加入500μl漂洗液wb，12000rpm离心30s，弃掉收集管中的废液。
5、将吸附柱ec放入一个新的空收集管中，12000rpm离心2min，尽量除去残余的漂洗液，以免漂洗液中残留的乙醇抑制下游反应。
6、取出吸附柱ec，并将其放入一个干净的离心管中，在吸附膜中间部位加入50μl洗脱缓冲液eb(洗脱缓冲液需事先在65～70℃的水浴中加热)，室温放置2min，然后12000rpm下离心1分钟。
7、如果需要较多量的dna片段，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，12000rpm下离心1分钟。
已经获得的双酶切后质粒php13和双酶切后pcr产物的两端均含有限制性核酸内切酶psti和ecori的粘性末端，故运用t4dna连接酶将含有pas表达盒的重组lip基因片段(ab)整合到质粒载体php13上从而获得重组质粒php13l，按照琼脂糖凝胶电泳所得到的两酶切产物的浓度，根据双酶切后质粒php13与双酶切后pcr产物摩尔比1:3的比例算出所加入两个酶切产物的体积。
步骤d的工艺条件如下：于24℃环境下过夜连接，获得重组质粒php13l，所得质粒php13l图谱见图2；
步骤d反应体系
宿主菌以枯草芽孢杆菌(b.subtilis)168为出发菌，敲除了编码中性蛋白酶的基因npre和编码碱性蛋白酶的基因apre的细菌。其中，基因敲除采用本领域常规技术手段，本文不在赘述；构建包含所述质粒php13l的高产脂肪酶的重组枯草芽孢杆菌，所述构建方法包括以下步骤：
a.按照枯草芽孢杆菌(b.subtilis)的spirizzen转化方法，将重组质粒转化进入枯草芽孢杆菌(b.subtilis)中，得到重组细胞，并将得到的重组细胞涂布于含氯霉素(6μg/ml)的lb平板上培养约16h，筛选所述重组细胞；
b.长出单菌落后，将得到的筛选后的重组细胞涂布于中性红油脂平板上划线，于37℃环境下培养24小时，得到使培养平板变为深红色的菌株，证明该 菌株中所述重组质粒php13l转入并正常表达，即为所述重组质粒正确表达的转化子；其中所述中性红油脂平板是在lb培养基的基础上，添加0.2％的质量浓度为1.6％的中性红溶液和2％的花生油。未成功转入所述质粒php13l的菌株经培养，平板颜色没有明显变化。这是因为成功转入质粒php13l的菌株会产生脂肪酶，脂肪酶水解脂肪生成脂肪酸，使培养基中的ph发生变化，从而使指示剂产生颜色变化。
实施例2-发酵生产脂肪酶
培养基：(1)种子和平板固体培养基为lb培养基,每升所述lb培养基含有以下组分：胰蛋白胨10g，酵母抽提物5g，nacl10g，将ph调至7.5；固体培养基添加琼脂15g。(2)每升发酵培养基含有以下组分：甘油60g，酵母浸粉9.5g，玉米浆干粉16g，k2hpo413.098g，kh2po40.657g，mgso40.2g，将ph调至7.2。
培养方法：挑取平板上新活化的实施例1中构建的重组细菌的单菌落，接种于装有5mllb培养基的试管中，37℃、225r/min振荡培养12h(od600约为5-6)，得到种子液。将发酵培养基分装于500ml锥形瓶内，装液量为50ml。将上述种子液按1％接种量接种。36℃、225r/min振荡培养，发酵36h后酶活达到最大。
以不含本发明的所述质粒php13l的枯草芽孢杆菌(b.subtilis)，即本发明的所述质粒php13l转入之前的宿主菌作为对照，将对照菌和本发明的重组细菌分别按照相同的方法进行发酵，并将得到的发酵液通过蛋白电泳(sds-page)进行分析。本发明的重组细菌的发酵液通过蛋白电泳(sds-page)得到一条分子量大小约为19.4kda的蛋白条带(见图3)，即为脂肪酶lipa；同时测定该重组菌发酵液中脂肪酶酶活为221u/ml，而对照的不含本发明的所述质粒php13l的枯草芽孢杆菌发酵液中的脂肪酶酶活仅为0.1u/ml。可见，本发明取得了显著的技术进步。
脂肪酶酶活测定方法：采用以对硝基苯酚辛酸酯为底物的分光光度法，测定脂肪酶活性。反应体系的体积为10ml，包括9ml的50mmol/l、ph8.5的tris-hcl(羟甲基氨基甲烷-盐酸)缓冲液，500μl底物溶液以及500μl重组基因工程菌发酵液的稀释液。底物溶液为5μmol/ml的对硝基苯酚辛酸酯乙腈溶液。 在摇瓶发酵过程中，每间隔12h取样500μl，将所取样品13000r/min离心1min，取上清液，用50mmol/l、ph8.5的tris-hcl缓冲液稀释1000倍，取500μl稀释液加入反应体系，反应对照体系则用500μl的50mmol/l、ph8.5的tris-hcl缓冲液替代发酵液的稀释液。脂肪酶酶活测定反应在37℃水浴摇床中进行10min，然后加入5ml冰冷的无水乙醇终止反应。用对照反应液作为参比，在406nm处测定反应液的吸光度a。脂肪酶活性单位的定义(u)：在37℃，ph8.5条件下，1min内水解对硝基苯基辛酸酯产生1μmol的对硝基苯酚所需要的酶量。根据对硝基苯酚标准曲线计算出酶活。
可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。