提高含纤维素结合域的融合蛋白的发酵产量的方法与流程

本发明属于纤维素结合域融合酶领域，涉及提高含纤维素结合域的融合蛋白的发酵产量的方法。
背景技术：
：纤维素结合域(Cellulosebindingdomain，CBD)为存在于纤维类原料酶(如纤维素酶)中的相对分子质量在0.4×104～2.0×104不等的片段，它可插入和分开纤维素的结晶区，通过芳香族氨基酸疏水平面(疏水作用)以及芳香环与葡萄糖环的堆积力吸附到纤维素链表面〔SugimotoN、IgarashiK、SamejimaM，Celluloseaffinitypurificationoffusionproteinstaggedwithfungalfamily1cellulose-bindingdomain.ProteinExpressionandPurification，2012；82:290-6〕。所以该区域常被用来跟纤维素酶〔NaohisaSugimoto、KiyohikoIgarashi、MasahiroSamejima，Celluloseaffinitypurificationoffusionproteinstaggedwithfungalfamily1cellulose-bindingdomain，ProteinExpressionandPurification，2012，82,290-296；M.A.Lemos、J.A.Teixeira、M.R.M.Domingues、M.Mota、F.M.Gama，TheenhancementofthecellulolyticactivityofcellobiohydrolaseIandendoglucanasebytheadditionofcellulosebindingdomainsderivedfromTrichodermareesei，EnzymeandMicrobialTechnology，2003，32:35-40；MarkusLinder、IrmaSalovuori、LauraRuohonen和TuulaT.Teeri，CharacterizationofaDoubleCellulose-bindingDomain.TheJournalofBiologicalChemistry，1996，271,No.35,21268-21272；JantapornThongekkaew、HirokoIkeda、KazuoMasaki、HaruyukiIefuji，FusionofcellulosebindingdomainfromTrichodermareeseiCBHItoCryptococcussp.S-2cellulaseenhancesitsbindingaffinityandits cellulolyticactivitytoinsolublecellulosicsubstrates，EnzymeandMicrobialTechnology，2013，52:241-246〕，脂肪酶〔AhnJ、ChoiE、LeeH、HwangS、KimC、JangH等，EnhancedsecretionofBacillusstearothermophilusL1lipaseinSaccharomycescerevisiaebytranslationalfusiontocellulose-bindingdomain，Appliedmicrobiologyandbiotechnology，2004，64:833-839；ThongekkaewJ、IkedaH、IefujiH，Increasesthermalstabilityandcellulose-bindingcapacityofCryptococcussp.S-2lipasebyfusionofcellulosebindingdomainderivedfromTrichodermareesei，BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications，2012，420:183-187〕，伴侣蛋白〔Ramón-LuingLA、Cruz-MigoniA、Ruíz-MedranoR、Xoconostle-CázaresB、Ortega-LopezJ，One-steppurificationandimmobilizationincelluloseoftheGroELapicaldomainfusedtoacarbohydrate-bindingmoduleanditsuseinproteinrefolding，Biotechnologyletters，2006，28:301-7〕，果糖苷酶〔Santiago-HernándezJ、Vásquez-BahenaJ、Calixto-RomoM、Xoconostle-CázaresG、Ortega-LópezJ、Ruiz-MedranoR等，DirectimmobilizationofarecombinantinvertasetoAvicelbyE.colioverexpressionofafusionproteincontainingtheextracellularinvertasefromZymomonasmobilisandthecarbohydrate-bindingdomainCBDCexfromCellulomonasfimi，Enzymeandmicrobialtechnology，2006，40:172-6〕，有机磷酸酶〔RichinsRD、MulchandaniA、ChenW，Expression,immobilization,andenzymaticcharacterizationofcellulose-bindingdomain-organophosphorushydrolasefusionenzymes，Biotechnologyandbioengineering，2000，69:591-6〕等融合，使得这些酶或蛋白获得一些新的特性或可被固定化。那么，提高CBD融合酶特别是CBD脂肪酶的产量也是随之而来的一个问题。提高CBD融合酶的正常途径有很多种，比如启动子优化，突变筛选等分子生物学手段，改变发酵温度，培养基成分，调节pH或添加一些金属离子等方式。这些方式存在周期长，普适性不高等缺点，而本发明利用脱脂棉通过方案优化，在一定时间点，将CBD脂肪酶吸附出来，达到了提高CBD脂肪酶发酵总量的目的。技术实现要素：本发明第一方面提供一种提高含纤维素结合域的融合蛋白的发酵产量的方法，所述方法包括利用纤维素吸附已与菌体分离的发酵液中的融合蛋白、分离发酵液与纤维素后再用所述发酵液和/或所分离的菌体进行发酵的步骤。本发明第二方面提供一种含纤维素结合域的融合蛋白的发酵方法，所述方法包括利用纤维素吸附已与菌体分离的发酵液中的融合蛋白、分离发酵液与纤维素后再用所述发酵液和/或所分离的菌体进行发酵的步骤。本发明第三方面提供一种含纤维素结合域的融合蛋白的制备方法，所述方法包括发酵含有能表达所述含纤维素结合域的融合蛋白的表达载体的微生物，其中，所述方法包括利用纤维素吸附已与菌体分离的发酵液中的融合蛋白、分离发酵液与纤维素后再用所述发酵液和/或所分离的菌体进行发酵的步骤。本发明第四方面提供一种分离和/或纯化含纤维素结合域的融合蛋白的方法，所述方法包括发酵含有能表达所述含纤维素结合域的融合蛋白的表达载体的微生物的步骤和纯化所述融合蛋白的步骤，其特征在于，所述方法还包括利用纤维素吸附已与菌体分离的发酵液中的融合蛋白、分离发酵液与纤维素后再用所述发酵液和/或所分离的菌体进行发酵的步骤。在本发明上述方面的一个具体实施例中，所述方法包括：(1)吸附诱导表达一段时间之后，将菌体与发酵液分离，获得分离的菌体和分离的发酵液，使发酵液与纤维素接触、以允许其中的融合蛋白被吸附到纤维素上，和使发酵液与吸附了融合蛋白的纤维素分离；(2)继续发酵将前述分离的菌体和/或与纤维素分离的发酵液用于发酵；和任选的(3)重复前述(1)和(2)的步骤。在本发明上述方面的一个具体实施例中，步骤(2)中，使用选自新鲜的菌体、所述分离的菌体或其混合物的菌体和选自新鲜的发酵培养基、所述已与纤维素分离的发酵液或两者的混合物的发酵培养基进行继续发酵，条件是，菌体和发酵培养基中至少有一种包含来自步骤(1)的菌体或发酵液。在本发明上述方面的一个具体实施例中，所述发酵以流加方式进行，将流出 的发酵液与纤维素接触后再以反加的方式进行流加培养，其中，将与纤维素分离后的发酵液单独反加，或与新鲜发酵培养基混合后反加，或者与新鲜发酵培养基分别流加。在本发明上述方面的一个具体实施例中，所述方法包括：诱导表达一段时间后，将发酵液与菌体分离，将分离的发酵液与纤维素接触一段时间，然后使纤维素与发酵液分离，之后再使分离的发酵液与先前分离出来的菌体混合，继续发酵。在本发明上述方面的一个具体实施例中，以流加方式进行发酵，将流出的发酵液与纤维素接触后再以反加方式进行流加培养。在本发明上述方面的一个具体实施例中，将与纤维素分离的发酵液单独反加，或与新鲜培养液混合后反加，或将其与新鲜培养液分别流加。在本发明上述方面的一个具体实施例中，所述方法包括将与纤维素分离的发酵液与新鲜菌体混合进行发酵的步骤。在本发明上述方面的一个具体实施例中，所述方法包括将所分离的菌体加到新鲜培养基中进行发酵的步骤。在本发明上述方面的一个具体实施例中，所述方法包括将与纤维素分离的发酵液与新鲜发酵液混合后在与新鲜菌体或所分离的菌体混合发酵的步骤。在本发明上述方面的一个具体实施例中，所述方法包括：(a)诱导表达一段时间后，将发酵液与含能表达所述含纤维素结合域的融合蛋白的表达载体的菌体分离；(b)使步骤(a)获得的发酵液与纤维素接触一段时间，然后使纤维素与发酵液分离；和(c)将步骤(b)所得发酵液与步骤(a)获得的菌体混合，继续发酵。本发明第五方面提供纤维素在发酵制备含纤维素结合域的融合蛋白中的应用，其中，所述应用包括在发酵过程中使所述纤维素与分离出来的发酵液接触的步骤。在本发明上述方面的一个具体实施例中，所述融合蛋白是纤维素酶、脂肪酶、伴侣蛋白、果糖苷酶或有机磷酸酶与纤维素结合域形成的融合蛋白。在本发明上述方面的一个具体实施例中，所述纤维素选自脱脂棉、微晶纤维素和棉布。在本发明上述方面的一个具体实施例中，所述纤维素结合域为纤维素酶中 的相对分子质量在0.4×104～2.0×104之间的片段。在本发明上述方面的一个具体实施例中，所述纤维素结合域的编码序列含SEQIDNO:1第16～327位，或如SEQIDNO:10所示。在本发明上述方面的一个具体实施例中，所述脂肪酶是疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyceslanuginosus)的脂肪酶突变体(TTL)、米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)的脂肪酶(RML)，南极假丝酵母(Candidaantarctica)的脂肪酶B(CALB)。在本发明上述方面的一个具体实施例中，所述TTL的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示。在本发明上述方面的一个具体实施例中，所述CALB的氨基酸序列由SEQIDNO:9的第64-1014位核苷酸序列编码。在本发明上述方面的一个具体实施例中，所述RML的氨基酸序列由SEQIDNO:11编码。在本发明上述方面的一个具体实施例中，所述方法包括，诱导表达一段时间后，使菌体与发酵液分离，所述一段时间为15～30小时，优选为18～28小时，更优选为20～24小时。在本发明上述方面的一个具体实施例中，纤维素与发酵液的接触时间为10～60分钟。在本发明上述方面的一个具体实施例中，纤维素与发酵液的接触温度为4～15℃。在本发明上述方面的一个具体实施例中，发酵结束前，重复数次所述将菌体与发酵液分离、将纤维素与发酵液接触、分离出纤维素并使发酵液与菌体重新混合和继续发酵的步骤，时间间隔为15～30小时，优选为20～26小时。在本发明上述方面的一个具体实施例中，每次接触纤维素的用量为0.1～2.0g纤维素/升发酵液。在本发明上述方面的一个具体实施例中，所述方法还包括从吸附了融合蛋白的纤维素上分离出融合蛋白的步骤。在本发明上述方面的一个具体实施例中，所述从纤维素上分离出融合蛋白的步骤包括使用乙二醇或纤维二糖洗脱纤维素上吸附的融合蛋白的步骤。在本发明上述方面的一个具体实施例中，可所述吸附有融合蛋白的纤维素 直接当做固定化产品使用。在本发明上述方面的一个具体实施例中，所述融合蛋白是脂肪酶与纤维素结合域的融合蛋白，所述方法使用酵母发酵生产所述融合蛋白。在本发明的一个具体实施方案中，所述融合蛋白为CALB-CBD，所述纤维素为微晶纤维素。在本发明的一个具体实施方案中，所述融合蛋白为RML-CBD，所述纤维素为棉布。附图说明图1显示纤维素结合域融合酶(TTL-CBD)表达。图中，泳道1～3分别为融合酶TTL-CBD三个转化子发酵浓缩液。图2显示脱脂棉直接加入培养基对融合酶表达的影响。(a)中，泳道1：脱脂棉变性液(含10M尿素的Tris-Cl缓冲液变性)；泳道2：取出脱脂棉后的发酵液；泳道3：对照发酵液(未经处理的正常发酵液)。(b)显示脱脂棉加入培养基后的培养状态。图3显示脱脂棉离线吸附对融合酶表达的影响。图(a)中，泳道1：对照发酵液；泳道2：脱脂棉离线吸附后从脱脂棉分离得到的变性液；泳道3：离线吸附后的残余发酵液。图(b)中，泳道1为甲醇诱导48h发酵液(吸附前)，2为经纤维素吸附部分融合蛋白的发酵液(吸附后)，3为纤维素上变性洗脱的融合蛋白样品。图4显示脱脂棉吸附融合酶总量检测电泳图。泳道1到4分别显示浓度为50、100、200和500μg/mL的牛血清白蛋白(BSA)溶液的电泳图，泳道5显示脱脂棉变性液的电泳图。图5显示脱脂棉吸附融合酶对总产量的提升结果。图6显示CALB-CBD和TTL-CBD表达。a和b分别为CALB-CBD和RML-CBD的表达情况，根据序列和预测分子量大小，箭头处为目的蛋白(CALB-CBD为原发酵液上样，RML-CBD为浓缩10倍上样)。具体实施方式本发明涉及含纤维素结合域的融合蛋白的制备，所述制备优选通过发酵的 方法实施。纤维素结合域(CBD)是存在于纤维类原料酶(如纤维素酶)中的相对分子质量在0.4×104～2.0×104之间的片段，它可插入并分开纤维素的结晶区，通过芳香族氨基酸疏水平面(疏水作用)以及芳香环与葡萄糖环的堆积力吸附到纤维素链表面。适用于本发明的CBD可以是本领域周知的用于形成含CBD融合蛋白的各种CBD，包括但不限于前述文献(如NaohisaSugimoto等，ProteinExpressionandPurification，2012，82,290-296；M.A.Lemos等，EnzymeandMicrobialTechnology，2003，32:35-40；MarkusLinder等，TheJournalofBiologicalChemistry，1996，271,No.35,21268-21272；JantapornThongekkaew等，EnzymeandMicrobialTechnology，2013，52:241-246；AhnJ等，Appliedmicrobiologyandbiotechnology，2004，64:833-839；ThongekkaewJ等，BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications，2012，420:183-187；Ramón-LuingLA等，Biotechnologyletters，2006，28:301-7；Santiago-HernándezJ等，Enzymeandmicrobialtechnology，2006，40:172-6；RichinsRD等，Biotechnologyandbioengineering，2000，69:591-6)中提及的各种用于与纤维素酶、脂肪酶、伴侣蛋白、果糖苷酶或有机磷酸酶形成融合蛋白的CBD，本文将上述文献的全部内容以引用的方式纳入本文。作为示例性的CBD，本发明提供了含SEQIDNO:2第6～108位所示的CBD，以及含SEQIDNO:10所编码的氨基酸序列的CBD，或由这些氨基酸序列组成的CBD。适用于本发明的融合蛋白通常是CBD与目的蛋白形成的融合蛋白。“目的蛋白”在本文中指人们期望制备和分离的各种蛋白，尤其是具有特定功能的各种酶。本发明中，目的蛋白包括但不限于纤维素酶、脂肪酶、伴侣蛋白、果糖苷酶或有机磷酸酶。本发明特别优选脂肪酶。脂肪酶可以是本领域周知的各种脂肪酶，例如TTL、CALB和RML。作为示例性的例子，TTL的核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQIDNO:3和4所示；CALB的核苷酸序列如SEQIDNO:9第64-1014位所示，RML的核苷酸序列如SEQIDNO:11所示。应理解，除CBD和目的蛋白之外，融合蛋白中还可含有其它成分，例如CBD 与目的蛋白之间的接头序列。对接头序列无特殊的限制，本领域已知的各种适合用于连接两种蛋白以形成融合蛋白的接头序列都可用于本发明。当然融合蛋白中还可包括其它利于融合蛋白的表达、筛选、分泌和/或纯化的序列，这些序列也都是本领域已知的在通过菌体发酵生产融合蛋白中常用的序列。因此，通常，本发明的融合蛋白由CBD、活性蛋白、任选的接头序列和任选的有利于融合蛋白的表达、筛选、分泌和/或纯化的序列组成。构建表达本发明的融合蛋白的表达载体的技术是现有技术已知的，包括例如通过overlap-PCR的方法将目的蛋白的编码序列和CBD的编码序列串联起来，然后用连接酶将目的蛋白-CBD重组编码序列连接到合适的载体上，提取质粒，测序等步骤。构建获得所需的表达载体后，可将该表达载体转化到合适的宿主中。可根据所需表达的目的蛋白选择相应的宿主微生物。例如，优选选用本领域已知的用于表达生产该目的蛋白的宿主微生物来实施本发明。例如，对于TTL而言，可选用毕赤酵母；对于CALB和RML而言，可选用黑曲霉。转化之后，可采用常规的发酵培养基和发酵条件(例如发酵时间、温度、接种密度等)进行发酵。本发明的特征在于，发酵过程中，具体是诱导表达一段时间后至发酵结束，利用纤维素吸附已与菌体分离的发酵液中的融合蛋白、分离发酵液与纤维素后再用所述发酵液和/或所分离的菌体进行发酵。因此，本发明的方法通常包括：(1)吸附诱导表达一段时间之后，将菌体与发酵液分离，获得分离的菌体和分离的发酵液，使发酵液与纤维素接触、以允许其中的融合蛋白被吸附到纤维素上，和使发酵液与吸附了融合蛋白的纤维素分离；(2)继续发酵将前述分离的菌体和与纤维素分离的发酵液用于发酵；和任选的(3)重复前述(1)和(2)的步骤。具体而言，发酵一段时间之后，具体为诱导表达一段时间之后，首先使菌体与发酵液分离，然后使发酵液与纤维素接触，以使其所含的融合蛋白被吸附到纤维素上，然后使发酵液与纤维素分离。可如此反复多次，例如两次、三次、四次甚 至更多次，具体次数可根据总发酵时长予以确定。通常，两次吸附之间的时间间隔不宜过短，也不宜过长，通常在15～30小时的范围之内，优选在20～26小时的范围之内。分离的菌体可暂存在例如4℃冰箱中，也可直接加到其它的正在进行的发酵操作中，或者可直接加到新鲜的发酵培养基中进行发酵。用于其它发酵过程时，可单独使用，或者可与新鲜菌体混合后在进行发酵。与纤维素分离后的发酵液可用于与所述分离的菌体混合，继续发酵，也可用于发酵新鲜菌体。不论是与所述分离的菌体混合，还是用于发酵新鲜的菌体，可单独使用所述分离的发酵液，或者可将其与新鲜发酵培养基混合后，再进行发酵。在一个具体实施例中，本发明的发酵可以流加方式进行。即，将流出的发酵液与纤维素接触后再以反加的方式进行流加培养。可将与纤维素分离后的发酵液单独反加，也可与新鲜发酵培养基混合后反加，或者与新鲜发酵培养基分别流加。优选的是，将流出的发酵液与纤维素接触后再以反加的方式对原先分离处理的菌体进行流加培养。在一个具体实施例中，将菌体与发酵液分离，用纤维素处理(接触)发酵液一段时间、并在将发酵液与纤维素分离之后，再将分离所得的发酵液与先前分离的菌体混合，继续发酵。可如此反复多次，例如两次、三次、四次甚至更多次，具体次数可根据总发酵时长予以确定。通常，两次吸附之间的时间间隔不宜过短，也不宜过长，通常在15～30小时的范围之内，优选在20～26小时的范围之内。应理解，“发酵过程中”在本文中指诱导表达之后至发酵结束。通常，诱导表达后经过一段时间，将菌体与发酵液分离该“一段时间”约为15～30小时，通常为18～28小时，优选为20～24小时。换言之，本发明的方法可包括：诱导表达15～30小时、优选18～28小时、更优选20～24小时之后，将菌体与发酵液分离，使发酵液与纤维素接触、以使发酵液中的融合蛋白被吸附到纤维素上(“吸附”步骤)，然后再将发酵液与纤维素分离、将分离所得的发酵液与先前分离获得的菌体混合并继续发酵(“继续发酵”步骤)，然后每隔15～30小时、优选20～26小时再实施所述 吸附和继续发酵步骤，直至发酵结束。在另一个具体实施例中，继续发酵步骤中，菌体可以是新鲜的菌体，也可以是所述分离的菌体，或是其混合物；发酵培养基可以是新鲜的发酵培养基，也可以是所述已与纤维素分离的发酵液，或者是两者的混合物。但应理解的是，所述继续发酵步骤中，菌体和发酵培养基中至少有一种包含来自吸附步骤的菌体和发酵液。可根据实际的发酵情况(例如发酵时间、融合蛋白、发酵液中融合蛋白的浓度等)使分离出来的发酵液与一定量的纤维素接触。吸附通常是将发酵液与纤维素在约0～10℃，例如4℃，摇荡10～60min，例如约30分钟。应理解，与纤维素接触并非必须将发酵液中的全部融合蛋白吸附出来，只要将发酵液中的融合蛋白的量降低(例如，降低至少10％，优选降低至少20％、至少30％、至少40％、至少50％不等)即可。优选的是发酵液中的大部分融合蛋白被吸附到纤维素上，例如，至少60％、至少70％、至少80％、至少90％的融合蛋白被吸附到纤维素上。最优选的是，发酵液中几乎所有的融合蛋白都被吸附到纤维素上。因此，对于加入发酵液中的纤维素的量以及两者接触的时间并无特殊限制，技术人员可根据实际生产情况容易地予以调整和确定。通常，纤维素的加入量为0.1～2g纤维素/升发酵液，例如0.3～1.0g纤维素/升发酵液。分离纤维素与发酵液后，可根据具体情况，采用常规的方法分离出纤维素上吸附的融合蛋白。例如，如果是为了检测样品，可采用含8M尿素的Tris-Cl缓冲液煮沸变性洗脱。如为了获得纯融合蛋白可参考文献中方法用100％浓度的乙二醇(analyticachimicaacta621(2008)193–199)和1％浓度的纤维二糖溶液(Biosci.Biotech.Biochem.,60(7):1183-1185,1996.)洗脱。或者，如不需要从纤维素上将蛋白洗脱下来，也可直接将吸附有融合蛋白的纤维素复合体直接当做固定化产品(本案中为固定化脂肪酶)来使用。同样地，可采用常规的方法将发酵结束后发酵液中的融合蛋白分离出来，例如，采取将发酵液过滤浓缩的方式(将水除去)；当然，也可采用纤维素吸附的方式，使发酵结束后发酵液中与纤维素接触，从而将其所含有的融合蛋白分离出来。然后将每次分离所获得的的融合蛋白合并、纯化。或者也可分别纯化每次分离所获得的融合蛋白，然后再合并。在将融合蛋白从纤维素分离下来的情况下，可采用常规的方法进行纯化融合蛋白，包括但不限于凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析、亲和层析等等。适用于本发明的纤维素包括脱脂棉、微晶纤维素和棉布等。在阅读了本发明公开的内容之后，本领域技术人员可根据不同的融合蛋白选用不同的纤维素。例如，当融合蛋白为CALB-CBD时，优选使用微晶纤维素；当融合蛋白为RML-CBD时，优选使用棉布。下文将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅是示例性的，而非限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook&Russell所著的MolecularCloning:ALaboratoryManual(分子克隆实验指南第三版)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。本发明中若非特别说明，化合物均购自国药集团化学试剂有限公司，为纯级。实施例1：重组酵母菌的构建经过优化并经生工生物工程(上海)股份有限公司合成的CBD核苷酸序列为(含Linker)：CCGACGACGGGCTCGTGCGCCGTGACGTACACCGCGAACGGCTGGAGCGGTGGCTTCACGGCGGCCGTCACGCTCACCAACACGGGCACGACGGCGCTGAGCGGCTGGACGCTCGGGTTCGCCTTCCCGTCCGGGCAGACCCTGACCCAGGGCTGGAGCGCGCGGTGGGCGCAGTCCGGGTCGAGCGTCACGGCGACCAACGAGGCCTGGAACGCCGTCCTCGCCCCGGGGGCGAGCGTCGAGATCGGCTTCAGCGGCACGCACACCGGCACCAACACGGCGCCGGCGACGTTCACGGTCGGCGGCGCGACCTGCACGACGCGCTGA(SEQIDNO:1，斜体部分为Linker)；CBD氨基酸序列为(含Linker)：PTTGSCAVTYTANGWSGGFTAAVTLTNTGTTALSGWTLGFAFPSGQTLTQGWSARWAQSGSSVTATNEAWNAVLAPGASVEIGFSGTHTGTNTAPATFTVGGATCTTR(SEQIDNO:2，斜体部分为Linker)；TTL核苷酸序列为：GAAGTCTCTCAAGACTTGTTCAACCAGTTCAACTTGTTCGCTCAATACTCTGCCGCTGCCTACTGTGGTAAGAACAATGATGCTCCAGCTGGTACTAACATTACCTGTACTGGTAACGCTTGTCCAGAAGTTGAGAAGGCTGATGCTACCTTCCTGTACTCCTTCGAAGACTCTGGAGTTGGAGATGTTACTGGTTTCCTGGCCTTGGATAACACTAACAAGTTGATCGTTCTGTCCTTCAGAGGTTCCAGATCCATCGAGAACTGGATTGGTAACTTGAACTTTGACTTGAAGGAGATCAACGACATCTGTTCTGGATGTCGTGGTCACGATGGATTTACCTCCTCTTGGAGATCTGTTGCTGATACCTTGAGACAGAAGGTCGAAGATGCTGTCAGAGAACATCCAGACTATAGAGTTGTCTTCACTGGTCACTCCTTGGGAGGTGCCTTGGCTACTGTTGCTGGTGCTGACTTGCGTGGTAATGGTTATGACATTGATGTCTTCTCCTACGGTGCTCCAAGAGTTGGTAATCGTGCCTTCGCTGAGTTTCTGACCGTCCAAACTGGAGGTACTTTGTACAGAATTACCCATACTAACGACATTGTTCCAAGATTGCCACCACGTGAGTTCGGATACTCTCATTCCTCTCCAGAGTACTGGATCAAGTCTGGAACCTTGGTTCCAGTCAGACGTAGAGACATCGTCAAGATTGAAGGTATTGATGCCACTGGAGGTAACAATCAACCAAACATTCCAGACATTCCAGCTCACTTGTGGTACTTTGGTCTGATTGGTACTTGCTTGTAA(SEQIDNO:3)；TTL氨基酸序列为：EVSQDLFNQFNLFAQYSAAAYCGKNNDAPAGTNITCTGNACPEVEKADATFLYSFEDSGVGDVTGFLALDNTNKLIVLSFRGSRSIENWIGNLNFDLKEINDICSGCRGHDGFTSSWRSVADTLRQKVEDAVREHPDYRVVFTGHSLGGALATVAGADLRGNGYDIDVFSYGAPRVGNRAFAEFLTVQTGGTLYRITHTNDIVPRLPPREFGYSHSSPEYWIKSGTLVPVRRRDIVKIEGIDATGGNNQPNIPDIPAHLWYFGLIGTCL(SEQIDNO:4)。所用扩增引物序列为：TL-FAvrII(5’-3’)TTTTCCTAGGGAAGTCTCTCAAGACTTGTTCAACC(SEQIDNO:5)；TL-R(5’-3’)CGAGCCCGTCGTCGGAAGCAAGTACCAATCAGAC(SEQIDNO:6)；CBD-F(5’-3’)ATTGGTACTTGCTTGCCGACGACGGGCTCGTGCG(SEQIDNO:7)；CBD-R-EcorI(5’-3’)TTTTGAATTCTCAGCGCGTCGTGCAGGTCGC(SEQIDNO:8)。用primerstar高保真聚合酶(Takara公司)对TTL和CBD序列分别进行PCR扩增，以TTL和CBD的PCR产物为模板，通过overlap-PCR的方法将TTL和CBD序列串联重复在一起，TL和CBD序列之间有CBD中天然存在的Linker连接。然后用T4连接酶(Fermentas)将TTL-CBD重组序列连接到载体pAOX1中。提取质粒，测序。将测序正确的载体用SalI单酶切线性化后，按照毕赤 酵母的标准转化方法，电击转化毕赤酵母感受态细胞，涂布到选择培养基MDS筛选平板，于28℃培养过夜。实施例2：纤维素结合域融合酶(TTL-CBD)表达挑取实施例1构建得到的酵母单菌落接种于5mLYPD培养基中，28℃，200rpm过夜培养。接种至50mL的BMGY培养基中，28℃，220rpm培养，收集菌体。用无菌水重悬洗涤菌体2次，然后用BMMY培养基重悬菌体。向BMMY培养基中添加2％的甲醇，28℃，220rpm诱导表达。每隔24h取样测定酶活，并向50mL培养基中补加0.5mL甲醇。诱导3d后，发酵液浓缩收集。聚丙烯胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测样品，结果如图1所示，可以看到，含目的基因的三个转化子经过发酵，目的蛋白均得以表达，分子量约为40kD。实施例3：脱脂棉直接加入培养基对融合酶表达的影响在将实施例1构建获得的酵母转至BMMY培养基这个步骤时，加入0.5g脱脂棉，其他步骤与实施例2的发酵工艺相同。发酵结束后，脱脂棉用4mL8M尿素溶液变性，另加入1mL5×Loadingbuffer(根据此配方自行配制：250mMTris-HCl(pH6.8)，10％(W/V)SDS，0.5％(W/V)考马斯亮蓝，50％(V/V)甘油，5％(W/V)β-巯基乙醇)共孵育，沸水煮15min，SDS-PAGE检测脱脂棉变性样品，残余发酵液以及正常发酵液同时制样检测，结果如图2所示。从图中可以看到，脱脂棉直接加入培养基会影响酵母本身的生长，不论棉花还是培养基本身都未检测到目的蛋白。实施例4：脱脂棉离线吸附对融合酶表达的影响如实施例2进行发酵，但在加入甲醇诱导24h后，4000rpm、4℃离心10min，菌体暂存4℃冰箱，菌液置于新离心管中，加入脱脂棉0.5g在4℃摇荡吸附30min，目的蛋白经吸除的残余发酵液继续与菌体混匀培养；48h时重复该步骤。脱脂棉用4mL8M尿素溶液变性，另加入1mL5×Loadingbuffer(同实施例3)共孵育，沸水煮15min，SDS-PAGE检测脱脂棉变性样品，残余发酵液以及正常发酵液同时制样检测，结果如图3所示。从图3(a)可以看到，脱脂棉上检测出大量目的蛋白，残余发酵液和对照样品的目的蛋白含量大致相等。图3(b)中，泳道1为甲醇诱导48h发酵液(吸附前)，2为经纤维素吸附部分融合蛋白的发酵液(吸附后)，3为纤维素上变性洗脱的融合蛋白样品。实施例5：脱脂棉吸附融合酶总量检测电泳图以1mg/mL浓度的牛血清白蛋白(BSA)为标准样品，稀释至500，200，100，50μg/mL，与实施例4获得的脱脂棉的尿素变性液共同制样并电泳检测，结果如图4所示。AlphaImagerHP软件分析条带，以条带面积与密度的乘积为横坐标，以浓度为横纵标，得到标准曲线方程y＝8×10-5*x-732.62(R2＝0.9856)，并计算所得脱脂棉上目的蛋白总量约为2.4mg。实施例6：脱脂棉吸附融合酶对总产量的提升结果利用实施例4和5相同方法，测定对照发酵液中目的蛋白含量和经脱脂棉吸附后残余发酵液中的目的蛋白含量并作图，结果如图5所示。从图5可以看到，由于脱脂棉的吸附，吸附发酵样品所获取的目的蛋白总量约为正常发酵所得目的蛋白总量的2倍。实施例7：以不同方式反加与纤维素接触后流出的培养液的结果采用流加方式进行培养，加入甲醇诱导24h后，4000rpm、4℃离心10min，菌体暂存4℃冰箱，菌液置于新离心管中，加入微晶纤维素或脱脂棉0.5g在4℃摇荡吸附30min，目的蛋白经吸除的残余发酵液再以反加方式(与新鲜培养液混合后反加，或将其与新鲜培养液分别流加)进行流加培养，其中，50％体积(25mL)的流出培养液与50％体积(25mL)新鲜培养液混合后反加，或者不混合分别流加。其余发酵条件同实施例2。再过48h后再进行一次吸附和反加操作。根据实施例4和5所述的方法计算纤维素基材吸附量和发酵液目的蛋白量。结果如下表1所示。表1中，“正常发酵”为按本实施例的方法进行发酵， 但不使用微晶纤维素或脱脂棉进行吸附的发酵。表1：TTL-CBD经不同方式流加所获得的纤维素诱导表达总量(50mL体系)实施例8：CALB-CBD和RML-CBD的发酵1、CALB-CBD序列与材料1.1宿主菌及转化方法黑曲霉N8：pyrG缺陷菌株；采用原生质体法将表达载体转化入宿主菌，筛选标记为pyrG。1.2培养基发酵培养基：2％葡萄糖，6％麦芽糖，4％胰蛋白胨大豆肉汤(TSB，购买自国药集团化学试剂有限公司)，7％柠檬酸钠，1.5％硫酸铵，0.1％磷酸二氢钠，0.1％硫酸镁，0.07％Tween80，微量元素。1.3CALB序列：采用CALB原始序列如下ATGATGGTCGCGTGGTGGTCTCTATTTCTGTACGGCCTTCAGGTCGCGGCACCTGCTTTGGCTCTGCCTTCTGGCAGCGATCCTGCCTTCAGCCAGCCCAAGAGCGTGCTCGATGCTGGTCTGACCTGCCAGGGTGCGTCGCCGTCCAGCGTCTCCAAGCCCATCCTTCTCGTCCCCGGAACTGGCACCACTGGTCCGCAGAGCTTCGACAGCAACTGGATTCCCCTGTCTACGCAGTTGGGCTACACTCCCTGCTGGATCTCTCCGCCTCCGTTCATGCTCAACGACACCCAGGTCAACACGGAATACATGGTCAACGCCATCACTGCGCTCTACGCTGGCTCGGGCAATAACAAGTTGCCCGTGTTGACCTGGAGCCAGGGTGGACTGGTTGCTCAGTGGGGTCTGACCTTCTTTCCCAGTATCCGCTCCAAGGTCGATCGACTTATGGCCTTTGCTCCCGACTACAAGGGCACCGTCCTCGCTGGCCCTCTCGATGCACTCGCTGTTAGTGCTCCGTCCGTATGGCAGCAAACTACCGGTTCGGCACTGACTACCGCACTCCGTAACGCTGGAGGTCTGACCCAGATCGTGCCCACTACCAACCTGTACTCGGCGACCGACGAGATCGTTCAGCCTCAAGTGAGCAACTCGCCGCTCGACTCT TCCTACCTGTTCAACGGAAAGAACGTTCAGGCACAGGCCGTGTGTGGGCCGCTGTTCGTCATTGACCACGCTGGCAGCCTCACCTCGCAGTTCTCCTACGTCGTTGGTCGATCTGCCCTACGCTCCACCACGGGCCAGGCTCGTAGTGCTGACTATGGCATTACGGACTGCAACCCTCTTCCCGCCAATGATCTGACTCCCGAGCAAAAGGTCGCCGCGGCTGCGCTCCTGGCTCCGGCAGCTGCAGCCATTGTGGCTGGTCCGAAGCAGAACTGCGAGCCCGACCTGATGCCCTATGCCAGACCGTTTGCAGTTGGCAAGCGCACCTGCTCTGGCATTGTCACTCCC(SEQIDNO:9，下划线部分为淀粉酶信号肽)1.4CBD序列：采用CBD序列如下AGCACTGGTAACCCTAGCGGCGGTAACCCACCGGGTGGTAACCGTGGTACTACCACGACGCGTCGCCCGGCTACTACCACCGGTTCTTCTCCGGGTCCGACCCAATCTCACTACGGTCAGTGTGGCGGCATCGGCTACTCCGGCCCGACCGTTTGTGCGTCCGGCACCACCTGCCAGGTGCTGAATCCGTACTATTCCCAGTGCCTGTAA(SEQIDNO:10)2、RML-CBD序列与材料2.1宿主菌及转化方法同TTL-CBD所用宿主菌，转化和培养方法。2.2RML序列：采用RML全序列如下TCCATCGACGGAGGTATTAGAGCCGCTACTTCTCAGGAAATCAACGAACTTACTTACTATACAACTTTGTCAGCTAATTCTTACTGTAGAACTGTTATTCCTGGTGCTACTTGGGATTGCATACATTGTGACGCCACTGAAGATTTAAAGATAATTAAAACCTGGTCTACTTTGATTTACGACACTAACGCTATGGTTGCTAGAGGAGATTCCGAGAAGACTATTTATATCGTGTTTAGAGGTTCTTCATCTATTCGTAATTGGATCGCTGATTTGACATTCGTTCCAGTCTCTTACCCTCCAGTTTCTGGTACTAAGGTTCACAAAGGATTTCTTGATTCTTATGGTGAAGTTCAAAACGAGTTGGTTGCTACTGTCTTGGATCAGTTTAAACAATACCCATCTTATAAGGTTGCTGTCACTGGTCACTCTTTGGGAGGTGCTACTGCCTTGCTGTGTGCTTTAGGTTTATACCAGAGAGAGGAAGGATTGTCTTCAAGTAACCTATTCTTGTACACTCAAGGTCAGCCTAGAGTTGGAGATCCAGCATTTGCTAATTATGTGGTTTCTACTGGTATTCCATATAGACGTACTGTTAACGAAAGAGACATAGTACCACACTTGCCTCCAGCTGCCTTCGGATTTCTGCATGCCGGTGAAGAGTACTGGATCACAGATAATTCTCCTGAAACCGTTCAAGTGTGTACATCTGATTTAGAGACTTCCGACTGCTCTAACAGTATTGTTCCATTTACTTCAGTTCTTGATCATTTGTCTTATTTTGGAATTAACACCGGTTTGTGTACTTAA(SEQIDNO:11)2.3CBD序列：采用CBD序列同TTL-CBD中所用的CBD序列(SEQIDNO:2)其他构建，筛选和培养方法同TTL-CBD(实施例1和2)3、CALB-CBD和RML-CBD表达聚丙烯胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测样品，结果如图6所示。a和b分别为CALB-CBD和RML-CBD的表达情况，根据序列和预测分子量大小，箭头处为目的蛋白(CALB-CBD为原发酵液上样，RML-CBD为浓缩10倍上样)。4、CALB-CBD和RML-CBD纤维素诱导表达总量采用与实施例4类似的方法进行发酵，CALB-CBD和RML-CBD分别用微晶纤维素(AvicelPH101)和棉布重复上述脱脂棉诱导步骤，纤维素基材吸附量和发酵液目的蛋白量分别用上述实施例4和5中尿素变性洗脱和目的蛋白电泳定量方法测定，数值如下表2所示。表2：CALB-CBD和RML-CBD纤维素诱导表达总量(50mL体系)正常发酵(μg)微晶纤维素(μg)棉布(μg)CALB-CBD1980.3±230.83433.5±240.53148.6±189.4RML-CBD921.7±98.61298.6±69.01539±249.2由表2可知，经纤维素吸附分离后，CBD目的蛋白总量均有不同程度增长。当前第1页1 2 3