本发明属于生物技术领域。特别是涉及一种检测棉花材料中转基因抗虫棉MON757转化体状态的定性PCR检测试剂盒及方法。
背景技术：
转基因棉花是全球种植的主要转基因作物之一，也是我国种植面积最大的转基因作物。2014年，我国710万农户种植了转基因棉花390万公顷，占棉花总种植面积93％，高于2013年90％的比例。目前我国批准商业化种植的转基因棉花主要有国内研发的转cry1Ab/Ac融合基因的抗虫棉和孟山都公司的转基因cry1Ac基因的抗虫棉MON531转化体(http://www.moa.gov.cn/ztzl/zjyqwgz/spxx/)。转基因棉花MON757转化体是由孟山都公司研发的，采用MON531转化体同一质粒载体进行转化。MON757转化体与MON531转化体在棉花基因组的插入位点、插入片段结构都不相同(https://www.aphis.usda.gov/brs/aphisdocs/94_30801p.pdf)。目前，MON757转化体在美国、加拿大、澳大利亚、新西兰、日本、韩国和南非等批准种植或允许用作食品饲料原(http://www.isaaa.org/gmapprovaldatabase/event/default.asp？EventID＝55)，但在我国作为转化体尚未获得批准种植。然而，汪巧等2011年在检测我国市场上的转基因棉花时发现，转基因抗虫棉鄂杂棉1号与新棉33B(新棉33B是MON531转化体的衍生品种)具有相同构建，但转化事件并不相同，采用GenomeWalking的方法获得了鄂杂棉1号的旁侧序列，并建立了转化体特异性定性检测方法。
本实验室在偶然的实验中，通过序列比对发现，鄂杂棉1号旁侧序列与专利US6893826中公开的MON757转化体序列高度相似，因此可以确定鄂杂棉1号的转基因转化体来源于MON757转化体。
鄂杂棉1号中检出MON757转化体也说明以MON757转化体为亲本获得的育种后代已经流传到我国。但是，由于杂交，自交分离等原因，含有MON757转化体的品种的种子中，一些为含有MON757转化体的纯合体，一些为杂合体，一些为不含有MON757转化体的材料，如何快速鉴定这样的品种是否含有MON757转化体，并对其中的个体的纯杂合状态进行鉴别，目前没有可行方法报道。传统的区分转基因植株纯杂合方法是通过检测自交产生的子一代是否发生分离以及计算分离比进行的，不仅耗时费力，而且浪费了子一代的宝贵资源。而快速高效地筛选纯合植株，可显著加快转基因植株的育种进程，因此区分转基因植株是纯合体还是杂合体具有重要的应用价值。目前，国内外尚未有MON757转化体的纯杂合定性PCR方法和定量PCR方法的报道。
技术实现要素：
针对上述领域中的空白，本发明提供一种可检测待测棉花品种中是否含有MON757转化体，并鉴别出该品种中特定个体的纯杂合状态的检测方法。
本发明公开的技术方案如下：
本发明提供的定性检测待测材料中MON757转化体的PCR检测试剂盒，其特征在于，包括粉剂或溶液状的以下三条引物
757-GF：5‘-CTAACCTCAATGAGAGCTACC-3’，
757-TF：5‘-TCATGTAGCAATGTCCTGCC-3’，
757-GR：5‘-GTAATAACTTGATGATGATTTGAG-3’。
优选地，所述试剂盒还包括进行PCR反应的通用试剂。
根据上述试剂盒，提供的检测方法入下：一种鉴定转基因抗虫棉MON757转化体的的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)制备待测个体棉花材料的DNA作为模板，
(2)采用以下三条引物组成的引物组对待测棉花材料进行PCR扩增：
757-GF：5‘-CTAACCTCAATGAGAGCTACC-3’，
757-TF：5‘-TCATGTAGCAATGTCCTGCC-3’，
757-GR：5‘-GTAATAACTTGATGATGATTTGAG-3’
(3)对PCR扩增产物进行检测，
扩增出一条184bp条带的样品为纯合的MON757转化体，
同时扩增出291bp和184bp两条条带的样品为杂合MON757转化体；
仅扩增出291bp条带的样品不是或不含有MON757转化体。
所述PCR扩增的反应体系：
总体积20μL中GoGreenMasterMix10μL，10μmol/L的757-GF、757-GR和757-TR各1μL，DNA模板2μL，其余为超纯水至。
PCR反应程序为：95℃预变性4min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，扩增反应进行35个循环，72℃保温10min。
对于检测有限群体中MON757转化体的比例，也可以采用上述定性方法，具体如下：一种检测棉花材料群体中转基因抗虫棉MON757转化体含量的方法，包括如下步骤：
(1)随机选取待测棉花材料群体中的多个材料，分别提取每种所选材料的DNA，
(2)采用以下三条引物组成的引物组对每种所选材料的DNA进行PCR扩增：
757-GF：5‘-CTAACCTCAATGAGAGCTACC-3’，
757-TF：5‘-TCATGTAGCAATGTCCTGCC-3’，
757-GR：5‘-GTAATAACTTGATGATGATTTGAG-3’
(3)对PCR扩增产物进行检测，
扩增出一条184bp条带的样品为纯合的MON757转化体，
同时扩增出291bp和184bp两条条带的样品为杂合MON757转化体；
仅扩增出291bp条带的样品不是或不含有MON757转化体；
(4)转基因抗虫棉MON757转化体含量＝
(纯合的MON757转化体的材料数+1/2*杂合的MON757转化体的材料数)/所选材料的总数。
所述PCR扩增的反应体系：
总体积20μL中GoGreenMasterMix10μL，10μmol/L的757-GF、757-GR和757-TR各1μL，DNA模板2μL，其余为超纯水至。
PCR反应程序为：95℃预变性4min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，扩增反应进行35个循环，72℃保温10min。
由于转基因抗虫棉MON757转化体在美国等已经批准种植近20年，在我国进口的棉花及其加工产品中很难避免有上述成分。而且在我国部分省区的转基因棉花中也检测到这个转化体。
本发明通过序列比对发现，鄂杂棉1号旁侧序列与专利US6893826中公开的MON757转化体序列高度相似，因此可以确定鄂杂棉1号的转基因转化体来源于MON757转化体。
本发明在MON757转化体插入位点两侧基因组上设计引物，以及插入序列上设计引物，三条引物分别扩增插入位点的棉花基因组序列和5’连接区序列，在MON757转化体纯合样品中，仅能获得5’连接区序列的184bp的扩增产物，而在含有转化体的基因组中，插入位点的引物之间的片段为包括完整插入片段的区域，预期超过10kb，这么长的片段在普通PCR条件下则不能获得扩增；而不含MON757转化体的样品中，仅能获得棉花基因组序列的291bp的扩增产物。
实验数据证明，纯合MON757转化体植株仅扩增得到一条184bp的片段，杂合植株得到184bp和291bp两条条带，不含MON757转化体的植株只得到一条291bp的条带，这与预期结果完全一致。因此，建立的MON757转化体定性PCR方法能有效地鉴别MON757转化体及其存在状态。可以用于检测棉花群体材料中MON757转化体的含量。
综上，因此本发明为特异性鉴定转基因抗虫棉MON757转化体提供了便利，这些方法的优点在于快速、灵敏度高、特异性好、所需实验条件不高，因此有非常高的实用价值。
附图说明
图1.转基因棉花MON757转化体定性PCR检测的引物示意图
图2.MON757转化体的定性PCR检测
1-6：MON757纯合样品；7-14：MON757杂合样品；15-20：非转基因样品；21-22：空白对照；M：DL2000
图3.单粒转基因棉花材料的MON757转化体定性PCR检测
A.鄂杂棉7号F1B.华惠4号
图4.定量PCR方法扩增曲线和标准曲线
A.MON757转化体；B.ACP1基因
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等的分子克隆：实验室手册(NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress，2001)中所述的条件，或按照仪器或者试剂制造厂商所建议的条件。
实施例1.引物设计
本发明偶然通过序列比对发现，鄂杂棉1号旁侧序列(其全长序列Genbank登录号为AR656168，全长4973bp)与专利US6893826中公开的MON757转化体序列高度相似，因此可以确定鄂杂棉1号的转基因转化体来源于MON757转化体。
定性检测引物的设计
本发明在MON757转化体插入位点两侧基因组上设计引物，以及插入序列上设计引物，三条引物如下：
757-GF：5‘-CTAACCTCAATGAGAGCTACC-3’(SeqIDNo.1)，
757-TF：5‘-TCATGTAGCAATGTCCTGCC-3’(SeqIDNo.2)，
757-GR：5‘-GTAATAACTTGATGATGATTTGAG-3’(SeqIDNo.3)，如图1所示。
其中757-GF/757-TF扩增区域为MON757转化体的5‘端棉花基因组与转基因序列的连接区，757-GF/757-TF对MON757转化体的扩增序列，184bp，如SeqIDNo.4所示；
757-GF/757-GR扩增片段为棉花基因组序列，位于棉花基因组(陆地棉)的Dt_chr11染色体的10276759-10277039位，扩增序列为291bp。而在含有转化体的基因组中，插入位点的引物之间的片段为包括完整插入片段的区域，预期超过10kb，这么长的片段在普通PCR条件下则不能获得扩增；因此即仅能在不含MON757转化体的样品中，获得棉花基因组序列的291bp的扩增产物，如SeqIDNo.5.所示；
三条引物联合使用，预计在杂合体可以扩增出两条条带。
可用于常规PCR方法快速准确鉴定田间棉花单株或单粒棉花种子中的MON757转化体的纯杂合状态。
定量检测引物的设计
本发明还同时以为MON757转化体的转基因序列与3’端棉花基因组的连接区(SeqIDNo.9所示，其全长序列Genbank登录号为AR656167，全长513bp)为靶标，设计了用于MON757转化体特异性的定量PCR检测方法的引物和探针，适合棉花批量样品中MON757转化体的含量测定。具体如下：
2条引物为：757-3QF：5‘-GGCATGCACATACAAATG-3’(SeqIDNo.6)，757-3QR：5‘-CCCATTATTATTCTGTTGTTG-3’(SeqIDNo.7)，
探针为：757-3QP：5‘-FAM-ACGAACGGATAAACCCTTTCTGGA-BHQ1-3’(SeqIDNo.8)。
实施例2.转基因抗虫棉MON757转化体的定性PCR检测方法
1实验材料
1.1转基因抗虫棉材料
鄂杂棉1号(润富棉839)(生厂商：湖北中香米业有限责任公司，生产批号：2009-10，审定编号：鄂审棉001-2000)，2010年购自湖北省棉花种子市场。在中国农业科学院植物保护研究所温室种植，经单株筛选鉴定、自交繁殖等获得MON757转化体的纯合材料和杂合材料。
鄂杂棉7号F1(别名宏杂棉071)(生厂商：湖北省仓谷满种业有限公司，审定编号：鄂审棉2004003)，2014年购自湖北省棉花种子市场。
华惠4号(生厂商：湖北惠民农业科技有限公司，生产批号：201310，审定编号：国审棉2000010)，2014年购自湖北省棉花种子市场。
1.2试剂
分子生物学试剂，如dNTPs、TaqDNA聚合酶、DL2000Marker等购自大连宝生物工程有限公司。
其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。引物由北京三博生物技术有限责任公司合成。
1.3实验仪器
PCR扩增仪：型号S1000(Bio-Rad公司)
核酸电泳仪：DYY-III型核酸电泳仪(北京六一仪器厂)
凝胶成像系统：BiospectrumAC(UVP公司)
其它仪器包括：离心机，恒温加热板，电子天平，培养箱等。
2实验方法和过程
2.1样品前处理
温室种植的棉花材料，分别取单株叶片。鄂杂棉7号F1和华惠4号样品随机选取60粒种子，单粒研磨。
2.2棉花基因组DNA提取
依照植物DNA提取试剂盒(TIANGEN生物技术有限公司)的操作手册，进行棉花材料总DNA的提取。取5μl提取的DNA溶液，以0.8％的琼脂糖凝胶电泳，根据其亮度和带型来初步判断提取DNA的质量。采用紫外分光光度计测定所提取的DNA的浓度和纯度。
2.3温室种植单株棉花材料的检测
采用建立的由3条引物757-GF、757-GR和757-TR组成的MON757转化体定性PCR检测方法，选择纯合、杂合和不含MON757转化体的温室棉花材料单株进行验证。
PCR反应体系：GoGreenMasterMix10μL，引物757-GF、757-GR和757-TR(10μmol/L)各1μL，DNA模板2μL，补超纯水至总体积20μL。反应程序：95℃预变性4min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，扩增反应进行35个循环，72℃保温10min。
在MON757转化体杂合样品中，三条引物分别扩增插入位点的棉花基因组序列和5’连接区序列，获得291和184bp的两种扩增产物；在MON757转化体纯合样品中，仅能获得5’连接区序列的184bp的扩增产物，而基因组引物之间的片段为包括完整插入片段的区域(预期超过10kb)，在普通PCR条件下则不能获得扩增；而不含MON757转化体的样品中，仅能获得棉花基因组序列的291bp的扩增产物。
验证结果表明，如图1所示，纯合MON757转化体植株仅扩增得到一条184bp的片段，杂合植株得到184bp和291bp两条条带，不含MON757转化体的植株只得到一条291bp的条带，这与预期结果完全一致。因此，建立的MON757转化体定性PCR方法能有效地鉴别MON757转化体及其存在状态。
2.4棉花种子样品中MON757转化体的定性PCR检测
分别随机抽取鄂杂棉7号F1和华惠4号样品的60个单粒，采用建立的MON757转化体特异性定性PCR方法进行鉴定(图3)，结果表明鄂杂棉7号F1样品中MON757转化体纯合、杂合和不含有的分别为0、2和58粒，而华惠4号样品中这三类分别为6、22和32粒。参照国家标准中转基因含量的计算方法进行计算：
MON757转化体含量＝(纯合MON757转化体数量+1/2*杂合MON757转化体数量)/60。
计算结果表明，鄂杂棉7号F1和华惠4号样品的MON757转化体含量分别为1.67％和28.33％。
实施例3.转基因抗虫棉MON757转化体的定量PCR检测方法
1实验材料
1.1转基因抗虫棉材料
鄂杂棉1号(润富棉839)(生厂商：湖北中香米业有限责任公司，生产批号：2009-10，审定编号：鄂审棉001-2000)，2010年购自湖北省棉花种子市场。
MON757转化体的纯合材料：鄂杂棉1号在中国农业科学院植物保护研究所温室种植，经单株筛选鉴定、自交繁殖等获得MON757转化体的纯合材料，用于定量检测方法标准曲线的制备。
鄂杂棉7号F1(别名宏杂棉071)(生厂商：湖北省仓谷满种业有限公司，审定编号：鄂审棉2004003)，2014年购自湖北省棉花种子市场。
华惠4号(生厂商：湖北惠民农业科技有限公司，生产批号：201310，审定编号：国审棉2000010)，2014年购自湖北省棉花种子市场。
1.2试剂
分子生物学试剂，如PremixExTaqTM(ProbeqPCR)等购自大连宝生物工程有限公司。
其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。引物和探针由北京三博生物技术有限责任公司合成。
1.3实验仪器
定量PCR扩增仪：型号ABI7500(ABI公司)
其它仪器包括：离心机，恒温加热板，电子天平，培养箱等。
2实验方法和过程
2.1样品前处理
鄂杂棉7号F1和华惠4号样品随机选取600粒种子，研磨混匀。
2.2棉花基因组DNA提取
依照植物DNA提取试剂盒(TIANGEN生物技术有限公司)的操作手册，进行棉花材料总DNA的提取。取5μl提取的DNA溶液，以0.8％的琼脂糖凝胶电泳，根据其亮度和带型来初步判断提取DNA的质量。采用紫外分光光度计测定所提取的DNA的浓度和纯度。
3定量PCR方法标准曲线的建立
将MON757转化体纯合材料的基因组DNA溶液用超纯水依次稀释至每微升22000、2200、220、44、22个棉花基因组拷贝。以模板拷贝数的对数值为横坐标，以Cq值为纵坐标建立MON757转化体特异性片段序列和棉花内标准基因的标准曲线。
MON757转化体的定量PCR反应体系：PremixExTaqTM(ProbeqPCR)10μL，上下游引物(10μmol/L)各1.5μL，探针(10μmol/L)0.75μL，50×ROX0.4μL，DNA模板2μL，补超纯水至总体积20μL。
使用ABIPRISM7500荧光定量PCR仪(美国)扩增，反应程序：95℃预变性2min，95℃变性5s，60℃退火和延伸34s，扩增反应进行40个循环。PCR扩增荧光信号在60℃收集。
建立的MON757转化体特异性的定量PCR扩增标准曲线。标准曲线的线性回归方程为y＝-3.456x+39.000，线性决定系数(R2)为0.998，扩增效率为94.7％，其中y为Cq值，x为拷贝数的对数值(图4，A)。
参照国家标准《农业部1943号公告-1-2013》，以每微升22000、2200、220、44、22个棉花基因组拷贝的MON757转化体纯合材料基因组DNA为模板，以国家标准《农业部1943号公告-1-2013》中公开的ACP基因的引物，探针，PCR程序和体系,制备标准曲线方程，y为Cq值，x为拷贝数的对数值，建立的棉花内标准基因ACP1基因的标准曲线回归方程为y＝-3.553x+40.494，线性决定系数(R2)为0.999，扩增效率为91.2％(图4，B)。
MON757转化体和ACP1基因的标准曲线参数完全符合实时荧光PCR方法实验室质量要求，可以用于定量检测。
2.4棉花种子样品中MON757转化体的定量PCR检测
采用建立的MON757转化体定量PCR方法测定鄂杂棉7号F1和华惠4号样品中MON757转化体和ACP1基因的拷贝数。
采用国家标准《农业部1943号公告-1-2013》中公开的ACP基因的引物/探针(第6页A2.1)，PCR程序和体系(第4页7.5.2节)测定ACP1基因的拷贝数。
由于在棉花基因组中ACP1基因的拷贝数为2，所以样品中棉花基因组拷贝数为ACP1基因的拷贝数的1/2。因此按照以下公式定量计算样品中MON757转化体的含量。
MON757转化体含量＝(MON757转化体拷贝数/ACP1基因拷贝数)*2
检测结果表明，鄂杂棉7号F1和华惠4号的MON757转化体含量分别为1.56％和25.88％，这与通过定性PCR鉴定单粒纯杂合估算的1.67％和28.33％比较吻合，说明两种方法的检测结果均比较准确可靠。