本发明属于生物技术领域，具体地说涉及一种重组蛋白a及其制备方法和用途。
背景技术：
葡萄球菌蛋白a(staphylococcusaureusproteina，spa)为金黄色葡萄球菌细胞壁相关蛋白，为单链多肽结构，具有与人类和其它哺乳动物血液中免疫球蛋白分子的fc段特异性结合的能力，主要吸附igg和含igg的免疫复合物。1940年，vevwey发现在某些金黄色葡萄球菌中，含有一种物质，在双向扩散试验中，能与正常人血清形成沉淀。1959年，jensen也发现了类似的现象，将其命名为a抗原。1960年grov将其命名为葡萄球菌蛋白a，简称spa蛋白a，1963年lofkvist等分离了a抗原，并证明它是一种蛋白质，且与糖有区别。
蛋白a(proteina)具有与抗体特异性结合的能力，蛋白a亲和层析柱已成为生物技术领域广泛应用的纯化抗体的亲和柱，可从腹水，血清和细胞培养上清或细胞抽提物中分离和纯化多种哺乳动物不同亚型的抗体或包含抗体fc片段的基因工程重组蛋白。蛋白a可以通过基因工程重组技术生产。
目前，随着生物技术产业，尤其是生物制药产业的快速发展，蛋白a的市场需求迅速增加，且对蛋白a亲和柱的亲和力、纯化效率等要求越来越高。但在使用含有蛋白a的亲和层析技术是，存在亲和力低、纯化效率低等问题，因此在施用该亲和层析技术时，需要一种改进的蛋白a，来实现更高的亲和力，提高纯化效果。
技术实现要素：
本发明经过大量研究，开发一种重组蛋白a，其具有如seqidno.1所示的氨基酸序列，其与现有的蛋白a相比具有更高的蛋白亲和力。具体的，本发明提供了：
1、一种葡萄球菌蛋白a，其特征在于，所述葡萄球菌蛋白a的氨基酸序列如seqidno：1所示。
2、编码如上述1所述的葡萄球菌蛋白a的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如seqidno：2所示。
3、一种重组表达载体，其特征在于，所述表达载体含有上述2所述的核苷酸序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列。
4、如上述3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体可选自pcho1.0、pdr1、pcdna3.1(+)、pcdna3.1/zeo(+)、pdhfr和pet32a，其中所述表达载体优选为pet32a。
5、一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞转化有上述4所述的表达载体。
6、如上述5所述的宿主细胞，其特征在于，所述及的宿主细胞是大肠杆菌。
7、如上述1所述的葡萄球菌蛋白a用于抗体检测、分离、纯化的应用。
8、一种亲和层析介质，其特征在于，所述亲和层析介质包含上述1所述的葡萄球菌蛋白a和层析介质载体。
9、如上述8所述的亲和层析介质，其特征为，所述层析介质载体是琼脂糖凝胶、葡聚糖、纤维素、硅胶或带羟基的高分子聚合物。
10、如上述9所述的亲和层析介质在抗体纯化中应用。
本发明的亲和层析介质，其包含固相载体以及与固相载体偶联的重组葡萄球菌蛋白a，其中重组葡萄球菌蛋白a的基因是以3个人 工合成的重组蛋白a基因单体串连而成，5‘端由ala-asp突变成asn-val，以形成acli酶切位点(aacgtt)，各重组蛋白a基因单体间以acli酶切位点相连，其中第一个重组蛋白a基因单体前端加入与表达载体相连的ncoi酶切位点，6个his(用于亲和层析，与镍柱结合，减少纯化步骤)和ek酶切位点(将his和ddddk切去)，最后一个重组蛋白a基因单体末端加入中止密码子taa和及克隆用bamhi限制性内切酶接头。该基因由580个核苷酸构成。本发明重组葡萄球菌蛋白a基因序列如seqidno.2所示，其编码的氨基酸序列如seqidno.1所示。
实验结果表明，本发明的亲和层析介质具有蛋白结合特异性强，亲和力高，纯化效率高的优点，与市售的mabselectsure(美国ge公司)相比，其动态吸附载量明显提高。
具体实施方式
以下结合实施例进一步说明本发明，下述实施例不应理解为对本发明的限制。实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于构建载体和质粒的方法，将编码蛋白的基因插入到这样的载体和质粒的方法或将质粒引入宿主细胞的方法以及经典的细胞融合和单克隆抗体筛选及纯化的方法等。这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述。
实施例1重组葡萄球菌蛋白a的制备
1、构建重组葡萄球菌蛋白a基因单体
通过化学合成的方法，设计合成葡萄球菌蛋白a基因一个重复片段(重复片段序列如seqidno:2所示的第47-217位核苷酸所示)的序列单体，其包括长度为171bp的重复片段，以及前端加入与表达载体相连的ncoi酶切位点、6个his(用于亲和层析，与镍柱结合， 减少纯化步骤)、ek酶切位点(用于将his和ddddk切去，形成正确的proteina)和acli酶切位点(aacgtt，用于连入多个重复片段)。另外，还包括终止密码子taa，及克隆用bamhi限制性内切酶接头共9bp。标记为“单体1”。
另外，通过化学合成的方法，设计合成葡萄球菌蛋白a基因一个重复片段(重复片段序列如seqidno:2的第47-217位核苷酸所示)的序列单体，其序列包括长度为171bp重复片段，以及两端acli酶切位点。标记为“单体2”。
2、构建重组葡萄球菌蛋白a基因的表达载体
用限制型内切酶ncoi和bamhi酶切实施例1所获得的单体1，然后与经ncoi及bamhi酶切的载体pet32a连接，转化大肠杆菌，筛选具有氨苄青霉素抗性的转化子，经质粒提取，酶切鉴定后证明葡萄球菌蛋白a基因单体已克隆至pet32a中，从而成功构建汗一个葡萄球菌蛋白a基因单体的pet32a载体。
3、含葡萄球菌蛋白a基因单体的pet32a-p载体的构建
将上述步骤1所获得的单体2以acli酶切，回收相应片段，然后与上述步骤2所构建的含有一个重组葡萄球蛋白a基因单体的pet32a载体连接，转化大肠杆菌，筛选具有氨苄青霉素抗性的转化子，经质粒提取，酶切筛选获得含有3个蛋白a基因单体的葡萄球菌蛋白a的表达载体，标记为“pet32a-p”，经检测，pet32a-p表达载体包含如seqidno：2所示基因序列。
4、构建表达重组葡萄球菌蛋白a的大肠杆菌菌株
用cacl2法将上述步骤2所获得的pet32a-p转化bl21de3，在含有氨苄青霉素的lb平板上筛选转化子，经质粒检测和酶切分析获得含有pet32a-p的重组转化子，标志为“bl21de3/pet32a-p”。
5、重组葡萄球菌蛋白a的生产与纯化
(1)菌种的培养发酵
挑取大肠杆菌工程菌bl21de3/pet32a-p，接种于lb培养基中，接种量1～2％v/v，于28℃培养过夜，次日在无菌条件下将上述培养好的种子培养基按l:10-1:5接种于发酵培养基上，28℃发酵至o.d600达到0.4～0.8，升温至45℃诱导，2～4小时后离心收菌。
取少量细胞加2×上样缓冲液，进行sds-page凝胶电泳检测，结果显示葡萄球菌蛋白a已诱导可溶表达。
(2)重组葡萄球菌蛋白a的纯化
将步骤(1)收集的菌体用磷酸盐缓冲液(0.2m，ph7.0-8.0，含有0.1mnacl)悬浮，超声破碎，4℃离心，收集上清，得粗提液。
将粗提液使用sds-page电泳检测，结果显示大部分葡萄球菌蛋白a被粗提，残存于菌体的量极微：将粗提液进行sephacryl5200分子筛纯化，收集特征峰(第二洗脱峰)即为纯化的重组葡萄球菌蛋白a(命名为“proteina1”)，其纯度可达90％以上，经检测，proteina1氨基酸序列如seqidno：1所示。
实施例2elisa法检测重组葡萄球菌蛋白a与抗体结合活性
采用elisa法检测上述实施例1制备的proteina1与抗体结合活性，具体过程如下：
1)包被：在96孔板中每孔包被proteina1样品150u1，38℃，1h；
2)封闭：每孔以150u1的1％的bsa封闭，38℃，1h；
3)加一抗：每孔加入约150ug人igg抗体(购自mlbio公司)，38℃，1h；
4)加二抗：每孔加入约150u1，1:1000辣根过氧化物酶标记抗体 (购自mlbio公司)，38℃，1h；
5)显色。
同样的方法检测市售proteina(购自古朵生物)与抗体结合活性。
elisa检测结果：本发明的proteina1与人igg抗体结合，每孔包被1.0-2.5ng葡萄球菌蛋白a即可获得明显的检测信号，而市售的proteina需每孔包被7.5-10.5ng葡萄球菌蛋白a时才获得明显的检测信号。可见本发明的proteina1具有更强的抗体结合活性。
实施例3重组葡萄球菌蛋白a琼脂糖凝胶亲和层析介质的制备
利用实施例1的proteina1制备琼脂糖凝胶亲和层析介质，包括以下步骤：
1、琼脂糖凝胶的活化：用环氧氯丙烷、氢氧化钠与琼脂糖(5％的交联琼脂糖凝胶)在水介质中进行反应，在35-60℃的温度下反应2-3小时，反应完后用蒸馏水清洗至中性后抽干，获得活化的琼脂糖凝胶；
2、重组葡萄球菌蛋白a与活化的琼脂糖凝胶的化学偶联：将上述步骤1获得的活化琼脂糖凝胶与实施例1制备的proteina1在5-25℃温度下反应15-20小时，反应完后清洗抽干，获得葡萄球菌蛋白a琼脂糖凝胶亲和层析介质。
经检测，制备的重组葡萄球菌蛋白a琼脂糖凝胶亲和层析介质特性如表1所示：
表1、重组葡萄球菌蛋白a琼脂糖凝胶亲和层析介质特性
实施例4重组葡萄球菌蛋白a葡聚糖凝胶亲和层析介质的制备
利用实施例1的proteina1制备葡聚糖凝胶亲和层析介质,包括以下步骤：
1、用环氧氯丙烷、氢氧化钠与葡聚糖凝胶在水介质中进行反应，在35-60℃的温度下反应2-3小时，反应完后用蒸馏水清洗至中性后抽干，获得活化的葡聚糖凝胶；
2、将上述步骤1获得的活化葡聚糖凝胶与实施例1制备的proteina1在8-25℃温度下反应15-20小时，反应完后清洗再抽干，即得到葡萄球菌蛋白a葡聚糖凝胶亲和层析介质。
经检测，制备的重组葡萄球菌蛋白a葡聚糖凝胶亲和层析介质特性如表2所示：
表2、重组葡萄球菌蛋白a葡聚糖凝胶亲和层析介质特性
实施例5亲和层析介质分离纯化抗体
使用上述实施例3、实施例4中制备的重组葡萄球菌蛋白a亲和层析介质从抗体培养液中分离纯化抗体(按照cn01132225.x所述的方法制备人源化抗her2单克隆抗体)，具体过程如下：
1、重组葡萄球菌蛋白a琼脂糖凝胶亲和层析介质分离纯化抗体
1)、上述实施例3制备的重组葡萄球菌蛋白a琼脂糖凝胶亲和层析介质装柱，1.6×20cm，柱床体积为l0ml；
2)、用缓冲液a(ph7.4的pbs溶液，以下同)平衡5-10个床体积，流速为lml/min；
3)、将2m1人源化抗her2单克隆抗体培养液用缓冲液a稀释到20m1，0.45μm滤膜过滤，上样，流速为lml/min；
4)、用缓冲液a再洗5-10个床体积，流速为lml/min；
5)、用缓冲液b(ph4.0的20mm柠檬酸缓冲液，其配制方法如下：柠檬酸2.1g加水950m1，用5mnaoh调至ph4.0，加水至1000ml)洗脱，流速为lml/min，收集洗脱峰；
6)、用纯水流洗10个柱床体积，再用20％的乙醇流洗10个柱床体积，流速为2ml/min，柱子置于4-8℃环境中保存；
7)、将分离纯化的人源化抗her2单克隆抗体与对照品同时进行sds-page电泳分析。
(备注：柱子每使用几次后应该用以缓冲液c(ph3.0的0.5m醋酸缓冲液，其配制方法如下：0.5m醋酸溶液用固体naoh调至ph3.0)流洗1次，以便将吸附更牢的蛋白去除。)
sds-page电泳结果：本发明的重组葡萄球菌蛋白a琼脂糖凝胶亲和层析介质一次纯化获得的人源化抗her2单克隆抗体纯度约97.2％。
2、重组葡萄球菌蛋白a琼脂糖凝胶亲和层析介质分离纯化抗体
使用上述实施例4中制备的重组葡萄球菌蛋白a葡聚糖凝胶亲和层析介质从抗体培养液中分离纯化抗体(按照cn01132225.x所述的方法制备人源化抗her2单克隆抗体)，具体过程如下：
1)、上述实施例3制备的重组葡萄球菌蛋白a葡聚糖凝胶亲和层析介质装柱，1.6×20cm，柱床体积为l0ml；
2)、用缓冲液a(ph7.4的pbs溶液，以下同)平衡5-10个床体积，流速为lml/min；
3)、将2m1人源化抗her2单克隆抗体培养液用缓冲液a稀释到20m1，0.45μm滤膜过滤，上样，流速为lml/min；
4)、用缓冲液a再洗5-10个床体积，流速为lml/min；
5)、用缓冲液b(ph4.0的20mm柠檬酸缓冲液，其配制方法如下：柠檬酸2.1g加水950m1，用5mnaoh调至ph4.0，加水至1000ml)洗脱，流速为lml/min，收集洗脱峰；
6)、用纯水流洗10个柱床体积，再用20％的乙醇流洗10个柱床体积，流速为2ml/min，柱子置于4-8℃环境中保存；
7)、将分离纯化的人源化抗her2单克隆抗体与对照品同时进行 sds-page电泳分析。
(备注：柱子每使用几次后应该用以缓冲液c(ph3.0的0.5m醋酸缓冲液，其配制方法如下：0.5m醋酸溶液用固体naoh调至ph3.0)流洗1次，以便将吸附更牢的蛋白去除。)
sds-page电泳结果：本发明的重组葡萄球菌蛋白a葡聚糖凝胶亲和层析介质一次纯化获得的人源化抗her2单克隆抗体纯度约98.5％。
3、市售mabselectsure分离纯化抗体
另外，使用相同的方法，利用市售mabselectsure(购自美国ge公司)从培养液中分离纯化抗体(按照cn01132225.x所述的方法制备人源化抗her2单克隆抗体)。sds-page电泳结果显示，使用mabselectsure一次纯化获得的人源化抗her2单克隆抗体纯度约90％。
实验结果表明。本发明的重组葡萄球菌蛋白a琼脂糖凝胶亲和层析介质及重组葡萄球菌蛋白a琼脂糖凝胶亲和层析介质一步就能得到纯度大于97％的人源化抗her2单克隆抗体，其纯化效果明显优于市售产品。
实施例6亲和层析介质对抗体的动态吸附载量的检测
本发明的亲和层析介质与市售mabselectsure(购自美国ge公司)对抗体动态吸附载量比较(按照cn01132225.x所述的方法制备人源化抗her2单克隆抗体)，步骤如下：
1、用缓冲液a(ph7.4的pbs溶液)平衡5-10个床体积，流速为lml/min；
2、2mg/ml浓度人源化抗her2单克隆抗体上样，流速为lml/min， 至10％穿透时停止；
3、根据样品浓度、上样体积及柱体积计算出10％穿透时各凝胶的动态吸附载量。
实验结果：本发明的重组葡萄球菌蛋白a琼脂糖凝胶对抗体的动态吸附载量为约39.4mg/ml，本发明的重组葡萄球菌蛋白a葡聚糖凝胶对抗体的动态吸附载量为约34.6mg/ml，市售mabselectsure的动态吸附载量约25mg/ml。
实验结果表明，本发明的亲和层析介质对抗体的动态吸附载量明显高于市售的mabselectsure亲和层析介质的动态吸附载量，具有更好的纯化效果。