发明领域本发明总体上涉及免疫球蛋白和白介素-2(IL-2)的融合蛋白。更具体地，本发明涉及用作治疗剂例如治疗自身免疫疾病和免疫介导的炎性疾病的、免疫球蛋白和突变IL-2的显示出改善特性的融合蛋白。此外，本发明涉及编码这类融合蛋白的多核苷酸和包含这类多核苷酸的载体及宿主细胞。本发明还涉及用于产生本发明融合蛋白的方法，和涉及在治疗疾病时使用它们的方法。背景调节型T细胞(Treg)代表对维持自我耐受性至关重要的特定T淋巴细胞亚群。具有阻抑物功能的这些CD4+CD25hi细胞能通过胞内表达转录因子FOXP3以及其他细胞标志物如CD127低、CTLA-4+、LAP、CD39+、PD-1+、GARP等与效应T细胞区分。FOXP3对于Treg分化和功能为关键，并且在患有免疫失调多内分泌腺病、肠病、X-染色体连锁综合征(IPEX)的带皮屑小鼠和患者中，FOXP3基因缺陷和突变导致自我耐受性破坏和自身免疫疾病形成，原因在于Treg缺损或缺少功能。1型糖尿病、系统性红斑狼疮(SLE)、多发性硬化和许多其他疾病中的自身免疫反应与Treg或Treg功能的缺损相关。来自动物模型的数据支持以下假设：控制针对自身的破坏性免疫反应的Treg失效促进自身免疫反应，这大多归因于自身反应性CD4+记忆T效应细胞的作用。1型糖尿病是在胰脏中大部分产生胰岛素的β细胞破坏后发生的自身免疫疾病。在美国，1型糖尿病的频率是人群的约0.3％并且在美国、欧洲和尤其斯堪地纳维亚(几乎1％)，其发生率持续增加并预计在下一个20年内加倍。细胞因子IL-2在Treg以及效应T细胞(Teff)的活化和功能中发挥主要作用。产生IL-2的缺损或反应性的缺少偏好地导致Treg功能丧失和自身免疫性的概率增加。因为Treg以比Teff更高的水平组成型表达高亲和力IL-2受体，所以与Teff细胞相比，低剂量的IL-2偏好地支持Treg的维持。采用IL-2在体外和在体内活化Treg的偏好作用，低剂量、长寿命IL-2疗法的潜力似乎在自身免疫疾病中具有高度的成功前景。设定一项200名患者、双盲、安慰剂对照的1型糖尿病的IL-2(重组人IL-2)临床试验在2013年晚期启动。最近的日低剂量Proleukin临床试验改善了慢性移植物抗宿主病(GVHD)和丙型肝炎病毒诱导的血管炎的一些体征和症状(Koreth等人,NewEnglJMed365,2055-2066(2011)；Saadoun等人,NewEnglJMed365,2067-2077(2011))。在这两项研究中，低剂量诱导了Treg并且增加了Treg:Teff比。然而，的低劣PK特性使其在维持人体内一致性低水平的IL-2方面不佳。临床试验中正在检验的其他方法是Treg离体个性化扩增随后再输注，但是这种方法不够理想并且代表一类富有挑战性的质量控制问题。因此，再建立天然调节型T细胞(Treg)介导的优势免疫耐受性并且对CD4+记忆T效应细胞的任何潜在刺激性影响极度最小化的治疗方案将大大增强治疗患有自身免疫疾病如1型糖尿病、多发性硬化、系统性红斑狼疮、节段性回肠炎以及其他自身免疫疾病及基于免疫的促炎性疾病如慢性移植物抗宿主病、哮喘、肺纤维化、慢性阻塞性肺病、心血管疾病如动脉粥样硬化和急性冠状动脉综合征和移植排斥(实体器官和骨髓)的患者的能力。WO2009/135615描述了先前已知的IL-2突变蛋白(IL-2N88R、BAY50-4798，WO1999/60128中描述)用于治疗或预防自身免疫疾病的用途。它宣称与野生型IL-2相比，IL-2突变蛋白对Treg细胞产生增加的活性，同时其对CD8+T细胞和NK细胞的影响小。未描述IL-2突变蛋白的融合蛋白。WO2010/85495描述了选择性促进Treg细胞中的活性胜过非调节型T细胞中活性而用于治疗炎性疾病的IL-2变体。所述的IL-2变体包含影响与IL-2受体不同亚基结合的8个或更多个氨基酸置换的组合。本发明的IL-2融合蛋白偏好地激活人类和非人类Treg，很少影响或不影响人CD4+记忆T效应细胞，使平衡转向更高的Treg:Teff比，并且减少自身免疫反应。它们是长寿命的，从而允许便利的给药方案，并且缺少效应子功能，从而减少潜在的副作用和功效受损。发明概述在一个方面，本发明提供一种融合蛋白，融合蛋白包含(i)一个免疫球蛋白分子和(ii)两个突变白介素-2(IL-2)分子，与野生型IL-2分子相比，所述突变白介素-2分子包含减少突变IL-2分子对中等亲和力IL-2受体的亲和力的氨基酸突变。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白分子是IgG类免疫球蛋白分子，特别是IgG1亚类免疫球蛋白分子。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白分子是人免疫球蛋白分子。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白分子能够与抗原特异性结合。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白分子是单克隆抗体。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白分子不能够与抗原特异性结合。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白分子包含基于人Vh3-23种系序列的重链可变区序列。在一个具体实施方案中，所述免疫球蛋白分子包含SEQIDNO:9的重链可变区序列。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白分子包含基于人Vk3-20种系序列的轻链可变区序列。在一个具体实施方案中，所述免疫球蛋白分子包含SEQIDNO:11的轻链可变区序列。在一个甚至更具体的实施方案中，所述免疫球蛋白分子包含SEQIDNO:9的重链可变区序列和SEQIDNO:11的轻链可变区序列。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白分子不能够与抗原特异性结合，并且包含基于人Vh3-23种系序列的重链可变区序列和基于人Vk3-20种系序列的轻链可变区序列。在一个实施方案中，与无所述修饰的相应免疫球蛋白分子相比，所述免疫球蛋白分子包含减少免疫球蛋白分子对Fc受体的结合亲和力的修饰。在一个实施方案中，所述Fc受体是Fcγ受体，特别地是人Fcγ受体。在一个实施方案中，所述Fc受体是活化性Fc受体。在一个实施方案中，所述Fc受体选自FcγRIIIa(CD16a)、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)和FcαRI(CD89)。在一个具体实施方案中，所述Fc受体是FcγRIIIa，特别地是人FcγRIIIa。在一个实施方案中，所述修饰减少免疫球蛋白分子的效应子功能。在一个具体实施方案中，所述效应子功能是抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在一个实施方案中，所述修饰在所述免疫球蛋白分子的Fc区内，特别地在其CH2区内。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白分子包含在免疫球蛋白重链第329位置(EU编号)处的氨基酸置换。在一个具体实施方案中，所述氨基酸置换是P329G。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白分子包含在免疫球蛋白重链第234和235位置(EU编号)处的氨基酸置换。在一个具体实施方案中，所述氨基酸置换是L234A和L235A(LALA)。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白分子包含在免疫球蛋白重链第234、235和329位置处(EU编号)的氨基酸置换。在一个具体实施方案中，所述免疫球蛋白分子包含免疫球蛋白重链中的氨基酸置换L234A、L235A和P329G(EU编号)。在一个实施方案中，所述突变IL-2分子包含在与人IL-2(SEQIDNO:1)的残基88相对应的位置处的氨基酸突变。在一个实施方案中，所述氨基酸突变是氨基酸置换。在一个具体实施方案中，所述氨基酸置换是N88D。在一个实施方案中，所述IL-2分子还包含氨基酸突变，与天然存在的天然IL-2相比，所述氨基酸突变不改变所述IL-2分子对IL-2受体的结合亲和力。在一个实施方案中，所述IL-2分子包含在与人IL-2的残基125相对应的位置处的氨基酸突变。在一个更具体的实施方案中，所述氨基酸突变是氨基酸置换C125A。在一个实施方案中，所述突变IL-2分子还包含在与人IL-2的残基3相对应的位置处消除IL-2的O-糖基化位点的氨基酸突变。在一个实施方案中，在与人IL-2的残基3相对应的位置处消除IL-2的O-糖基化位点的所述氨基酸突变是选自T3A、T3G、T3Q、T3E、T3N、T3D、T3R、T3K和T3P的氨基酸置换。在一个具体实施方案中，在与人IL-2的残基3相对应的位置处消除IL-2的O-糖基化位点的氨基酸突变是T3A。在一个实施方案中，所述突变IL-2分子是人IL-2分子。在一个具体实施方案中，所述突变IL-2分子包含选自SEQIDNO:58、SEQIDNO:60、SEQIDNO:62和SEQIDNO:64的序列，尤其SEQIDNO:58的序列。在一个实施方案中，所述突变IL-2分子具有选自SEQIDNO:58、SEQIDNO:60、SEQIDNO:62和SEQIDNO:64的序列，尤其SEQIDNO:58的序列。在一个实施方案中，所述突变IL-2分子各自在其N端氨基酸处与所述免疫球蛋白分子的免疫球蛋白重链之一的C端氨基酸融合，任选地通过肽接头融合。在一个实施方案中，所述突变IL-2分子各自与所述免疫球蛋白分子通过肽接头融合。在一个实施方案中，所述肽接头包含至少10个、特别地至少15个氨基酸。在一个实施方案中，所述肽接头包含氨基酸序列(G4S)3(SEQIDNO:66)。在一个具体实施方案中，所述融合蛋白包含SEQIDNO:19和SEQIDNO:50的多肽序列。在一个具体实施方案中，所述融合蛋白包含SEQIDNO:19的免疫球蛋白轻链和SEQIDNO:50的免疫球蛋白重链-IL-2融合多肽。在一个实施方案中，所述融合蛋白基本上由免疫球蛋白分子和两个突变白介素-2(IL-2)分子和任选地一个或多个肽接头组成，与野生型IL-2分子相比，所述突变白介素-2分子包含减少突变IL-2分子对中等亲和力IL-2受体的亲和力的氨基酸突变。在一个实施方案中，所述融合蛋白基本上由SEQIDNO:19的两条免疫球蛋白轻链和SEQIDNO:50的两个免疫球蛋白重链-IL-2融合多肽组成。在一个实施方案中，所述融合蛋白选择性地活化调节型T细胞。在一个实施方案中，所述融合蛋白选择性地活化调节型T细胞超过效应T细胞，特别地超过常规CD4+T细胞和CD8+T细胞。在一个实施方案中，所述融合蛋白选择性地活化调节型T细胞超过常规CD4+记忆T细胞。在一个实施方案中，所述融合蛋白活化调节型T细胞超过常规CD4+记忆T细胞至少10倍，至少100倍或至少1000倍。在一个实施方案中，通过测量胞内STAT磷酸化水平、尤其STAT5磷酸化水平确定所述活化。在一个实施方案中，通过流式细胞分析进行所述胞内STAT磷酸化水平测量。本发明还提供编码本发明融合蛋白的多核苷酸。还提供载体，特别是表达载体，其包含本发明的多核苷酸。在另一个方面，本发明提供了包含本发明多核苷酸或载体的宿主细胞。本发明也提供一种用于产生本发明融合蛋白的方法，包括步骤(i)在适于表达融合蛋白的条件下培养本发明的宿主细胞，和(ii)回收融合蛋白。还提供一种通过所述方法产生的融合蛋白，所述融合蛋白包含(i)一个免疫球蛋白分子和(ii)两个白介素-2(IL-2)分子，与野生型IL-2分子相比，所述白介素-2分子包含减少突变IL-2分子对中等亲和力IL-2受体的亲和力的氨基酸突变。在一个方面，本发明提供一种包含本发明融合蛋白和可药用载体的药物组合物。还提供本发明的融合蛋白或药物组合物用作药物并且用于治疗或预防自身免疫疾病、特别地用于治疗或预防1型糖尿病、多发性硬化(MS)、系统性红斑狼疮(SLE)、炎性肠病、节段性回肠炎或溃疡性结肠炎，最特别地用于治疗或预防1型糖尿病或移植物抗宿主病或移植排斥。进一步提供本发明的融合蛋白用于制造在有需求的个体中治疗疾病的药物中的用途和治疗个体疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含处于可药用形式的本发明融合蛋白。在一个实施方案中，所述疾病是自身免疫疾病。在一个更具体的实施方案中，所述自身免疫疾病是1型糖尿病、多发性硬化(MS)、系统性红斑狼疮(SLE)、炎性肠病、节段性回肠炎或溃疡性结肠炎。在一个甚至更具体的实施方案中，所述自身免疫疾病是1型糖尿病。在另一个实施方案中，所述疾病是移植排斥或移植物抗宿主病。在一个实施方案中，所述个体是哺乳动物，特别是人。还提供本发明的融合蛋白用于体外或体内选择性活化调节型T细胞。在一个实施方案中，所述活化包括诱导调节型T细胞增殖和/或诱导调节型T细胞中的IL-2受体信号传导、尤其STAT5磷酸化。在一个实施方案中，所述用途是体外的并且所述融合蛋白以约10ng/mL或更小，特别地约1ng/mL或更小的浓度使用。在另一个实施方案中，所述用途是体内的并且所述融合蛋白以约100μg/kg体重或更小、具体地约25μg/kg体重或更小、更具体地约10μg/kg体重或更小的剂量使用。本发明也提供一种用于体外或体内选择性活化调节型T细胞的方法，包括使所述调节型T细胞与本发明的融合蛋白接触。在一个实施方案中，所述活化包括诱导调节型T细胞增殖和/或诱导调节型T细胞中的IL-2受体信号传导、尤其STAT5磷酸化。在一个实施方案中，所述方法是体外的并且所述融合蛋白以约10ng/mL或更小，特别地约1ng/mL或更小的浓度使用。在另一个实施方案中，所述方法是体内的并且所述融合蛋白以约100μg/kg体重或更小、具体地约25μg/kg体重或更小、更具体地约10μg/kg体重或更小的剂量使用。附图简述图1.DP47GSIgG-IL-2融合蛋白(参见SEQIDNO:13、15、19)的纯化。(A)蛋白A亲和层析步骤的洗脱图。(B)大小排阻层析步骤的洗脱图。产率：4mg/L。(C)终产物的分析性毛细管电泳法SDS(Caliper)。观察到以下条带：非还原的–在111kDa处的7.5％面积，在174kDa处的92.5％面积；还原的–在29kDa处的23.6％面积、在67kDa处的23.5％面积，在82kDa处的52.9％面积。产物含有约7.5％的“半IgG”。(D)TSKgelG3000SWXL柱上终产物的分析性大小排阻层析(91％单体含量)。图2.DP47GSIgG-(IL-2)2融合蛋白(参见SEQIDNO:17、19)的纯化。(A)蛋白A亲和层析步骤的洗脱图。(B)大小排阻层析步骤的洗脱图。产率：13mg/L。(C)终产物的分析性毛细管电泳法SDS(Caliper)。观察到以下条带：非还原的–在172.5kDa处的2.3％面积，在185kDa处的97.7％面积；还原的–在27.3kDa处的18.3％面积、在29.2kDa处的0.6％面积，在78.3kDa处的81.1％面积。(D)Superdex200柱上终产物的分析性大小排阻层析(100％单体含量)。图3.DP47GSIgG-IL-2N88D融合蛋白(参见SEQIDNO:15、19、48)的纯化。(A)蛋白A亲和层析步骤的洗脱图。(B)大小排阻层析步骤的洗脱图。产率：23.7mg/L。加框表示收集的级分。(C)终产物的分析性毛细管电泳法SDS(Caliper)。观察到以下主条带：非还原的–在167.0kDa处的100％面积；还原的–在28.6kDa处的31.5％面积、在63.5kDa处的31.7％面积，在77.5kDa处的35.3％面积。(D)TSKgelG3000SWXL柱上终产物的分析性大小排阻层析(97.3％单体含量)。图4.DP47GSIgG-(IL-2N88D)2融合蛋白(参见SEQIDNO:19和50)的纯化。(A)蛋白A亲和层析步骤的洗脱图。(B)大小排阻层析步骤的洗脱图。产率：32.9mg/L。加框表示收集的级分。(C)终产物的分析性毛细管电泳法SDS(Caliper)。观察到以下主条带：非还原的–在180.4kDa处的20.7％面积，在184.0kDa处的78.0％面积；还原的–在27.3kDa处的16.2％面积、在76.0kDa处的82.7％面积。(D)TSKgelG3000SWXL柱上终产物的分析性大小排阻层析(98.3％单体含量)。图5.DP47GSIgG-(IL-2E95A)2融合蛋白(参见SEQIDNO:19和52)的纯化。(A)蛋白A亲和层析步骤的洗脱图。(B)大小排阻层析步骤的洗脱图。产率：8.0mg/L。加框表示收集的级分。(C)终产物的分析性毛细管电泳法SDS(Caliper)。观察到以下主条带：非还原的–在166.0kD处的10.3％面积，在175.5kDa处的61.4％面积，在181.2kDa处的28.2％面积；还原的–在26.1kDa处的16.0％面积，在75.0kDa处的83.1％面积。(D)TSKgelG3000SWXL柱上终产物的分析性大小排阻层析(100％单体含量)。图6.CD4+Treg亚群、NK细胞亚群和NKT细胞上的CD25(IL-2RA)和CD122(IL-2RB)表达。细胞表面标志物用来定义CD4+Treg亚群、NKT细胞和NK细胞。为了优化CD25和CD122的染色，不进行胞内FOXP3染色。(A、B)三种调节型CD4+T细胞(Treg)群体：幼稚型(CD45RA+，CD25+；点线)、记忆型(CD45RA-，CD25+；实线)和活化型(CD45RA-，CD25hi；短划线)。(C、D)NKT(点线)，CD56亮NK细胞(短划线)、CD56中间NK细胞(实线)。灰色：同种型对照(IC)。图7.在CD4+和CD8+常规T细胞亚群上的CD25(IL-2RA)和CD122(IL-2RB)表达。细胞表面标志物用来定义幼稚型(CD45RA+；点线)和记忆型(CD45RA-；实线)常规CD4+T细胞(A、B)、记忆型常规CD8+T细胞(CD45RA-；实线)和CD45RA+CD8T细胞(幼稚亚群和TEMRA亚群的组合；TEMRA指已经回复成表达CD45RA的效应子记忆细胞；点线)(C、D)。灰色：同种型对照(IC)。图8.人外周血细胞亚群中响应于DP47GSIgG-IL-2诱导pSTAT5a。在独立的时间对三名不同的人供体(C4至C6)评估各种剂量的DP47GSIgG-IL-2对诱导STAT5a磷酸化的影响。显示以下结果：CD4+Treg亚群的活化型、记忆型和幼稚型Treg；常规CD4+记忆型T效应细胞；CD56亮NK细胞；CD8+记忆型T效应细胞；CD4+幼稚型T效应细胞；NK细胞；NKT细胞；和CD8+幼稚型T效应细胞+CD45RA+记忆细胞。图9.人外周血细胞亚群中响应于DP47GSIgG-(IL-2)2诱导pSTAT5a。在独立的时间对五名不同的人供体(N1、N2、C4至C6)评估各种剂量的DP47GSIgG-(IL-2)2免疫缀合物对诱导STAT5a磷酸化的影响。显示以下结果：CD4+Treg亚群的活化型、记忆型和幼稚型Treg；常规CD4+记忆型T效应细胞；CD56亮NK细胞；CD8+记忆型T效应细胞；CD4+幼稚型T效应细胞；NK细胞；NKT细胞；和CD8+幼稚型T效应细胞+CD45RA+记忆细胞。图10.在人外周血细胞亚群中诱导pSTAT5a：比较DP47GSIgG-IL-2和DP47GSIgG-(IL-2)2。每个细胞亚群的结果对来自每种亚群的观测最大作用归一化并且表2中展示Treg的近似EC50。(A)DP47GSIgG-IL-2的归一化结果，(B)DP47GSIgG-(IL-2)2的归一化结果。图11.比较DP47GSIgG-IL-2和DP47GSIgG-(IL-2)2时，三名供体中Treg亚群敏感性的详细检验。曲线代表三名供体的pSTAT5aMFI的均数±SD。(A)总CD3+CD4+FoxP3+Treg。(B)活化型Treg。(C)记忆型Treg。(D)幼稚型Treg。图12.人外周血细胞亚群中响应于DP47GSIgG-(IL-2E95A)2诱导pSTAT5a。在独立的时间对三名不同的人供体(C4至C6)评估各种剂量的DP47GSIgG-(IL-2E95A)2对诱导STAT5a磷酸化的影响。显示以下结果：CD4+Treg亚群的活化型、记忆型和幼稚型Treg；常规CD4+记忆型T效应细胞；CD56亮NK细胞；CD8+记忆型T效应细胞；CD4+幼稚型T效应细胞；NK细胞；NKT细胞；和CD8+CD45RA+幼稚型T效应细胞。图13.人外周血细胞亚群中响应于DP47GSIgG-(IL-2N88D)2诱导pSTAT5a。在独立的时间对五名不同的人供体(C4、C5、C6、N1、N2)评估各种剂量的DP47GSIgG-(IL-2N88D)2对诱导STAT5a磷酸化的影响。显示以下结果：CD4+Treg亚群的活化型、记忆型和幼稚型Treg；常规CD4+记忆型T效应细胞；CD56亮NK细胞；CD8+记忆型T效应细胞；CD4+幼稚型T效应细胞；NK细胞；NKT细胞；和CD8+CD45RA+幼稚型T效应细胞。图14.在人外周血细胞亚群中诱导pSTAT5a：比较DP47GSIgG-IL-2、DP47GSIgG-(IL-2)2、DP47GSIgG-(IL-2E95A)2、DP47GSIgG-(IL-2N88D)2和DP47GSIgG-IL-2N88D。显示CD4+Treg亚群(A-C)的结果：活化型(A)、记忆型(C)和幼稚型(B)Treg；常规CD4+记忆型T效应细胞(D)；CD56亮NK细胞(E)。图15.人外周血细胞亚群中响应于DP47GSIgG-(IL-2N88D)2和DP47GSIgG-(IL-2)2诱导pSTAT5a。在独立的各天对十名不同的人供体评估大(≥6log)剂量范围的DP47GSIgG-(IL-2N88D)2和DP47GSIgG-(IL-2)2对诱导STAT5a磷酸化的影响。显示以下细胞亚群的结果：(A)记忆型Treg、(B)幼稚型Treg、(C)CD56亮NK细胞、(D)总NK细胞、(E)中央记忆型CD4+T细胞、(F)效应记忆型CD4+T细胞、(G)幼稚型CD4+T细胞、(H)中央记忆型CD8+T细胞、(I)效应记忆型CD8+T细胞、(J)幼稚型CD8+T细胞、(K)Temra[Teff记忆型RA+]CD8+T细胞、(L)NKT细胞和(M)CD3+CD4-CD8-CD56-T细胞。全部结果均显示为均数±SEM(n＝10名供体)。图16.比较DP47GSIgG-(IL-2N88D)2和DP47GSIgG-(IL-2)2对人NK细胞和CD8+T细胞的体外影响。来自正常人供体(n＝10)的PBMC按5x106个细胞/U型底孔与50ng/mlDP47GSIgG-(IL-2N88D)2(空心符号)或DP47GSIgG-(IL-2)2(灰色加阴影符号)一起培养6天，此时通过流式细胞术定量细胞数目。在CD56暗和CD56亮NK细胞上定量对NK细胞的影响(A)。(B)中显示对CD8+T细胞的影响。结果显示为中位数±四分位数范围，使用Mann-WhitneyU检验确定统计差异。图17.比较DP47GSIgG-(IL-2N88D)2和DP47GSIgG-(IL-2)2对CD34+干细胞人源化小鼠的体内影响。CD34+干细胞移植后10至12周，将小鼠用运载体(DP47GSIgG，无IL-2)、DP47GSIgG-(IL-2N88D)2或DP47GSIgG-(IL-2)2每周二次处理。在3次处理后观察到血液中人Treg细胞和NK细胞的最大增长并且显示Treg细胞的结果(A)和NK细胞的结果(B)。结果显示为中位数±四分位数范围；运载体(n＝21)、IgG-(IL-2N88D)2(n＝22)和IgG-(IL-2)2(n＝24)。图18.比较DP47GSIgG-(IL-2N88D)2和DP47GSIgG-(IL-2)2对CD34+干细胞人源化小鼠存活的体内影响。CD34+干细胞移植后10至12周，将小鼠用运载体(DP47GSIgG，无IL-2)、DP47GSIgG-(IL-2N88D)2或DP47GSIgG-(IL-2)2每周二次处理直至人异种移植物抗宿主反应的严重程度达到需要从研究中移除它们的预定阶段(≥15％体重丧失)。从GraphPadPrism，将运载体(n＝7)、DP47GSIgG-(IL-2N88D)2(n＝12)和DP47GSIgG-(IL-2)2(n＝13)的结果作为Kaplan-Meier存活曲线作图。图19.比较DP47GSIgG-(IL-2N88D)2和DP47GSIgG-(IL-2)2对CD34+干细胞人源化小鼠中Treg、NK细胞和CD8+T细胞的体内影响。CD34+干细胞移植后10至12周，将小鼠用运载体(DP47GSIgG，无IL-2)、DP47GSIgG-(IL-2N88D)2或DP47GSIgG-(IL-2)2每周二次处理直至人异种移植物抗宿主反应的严重程度达到需要从研究中移除它们的预定阶段(≥15％体重丧失)，此时评估血液的各个人类细胞亚群。血液中人Treg、NK细胞和CD8+细胞显示为人CD45+细胞％。运载体(n＝6)、DP47GSIgG-(IL-2N88D)2(n＝9)或DP47GSIgG-(IL-2)2(n＝9)的结果显示为均数±SEM。图20.食蟹猴血液中响应于DP47GSIgG-(IL-2)2和DP47GSIgG-(IL-2N88D)2诱导TregpSTAT5a。在相同时间对三名正常健康供体(C1-C3)评估最大剂量(20ng/mL)的DP47GSIgG-(IL-2)2和DP47GSIgG-(IL-2N88D)2对Treg中诱导STAT5a磷酸化的影响。(A)用来鉴定CD4+CD25+Treg亚群的FOXP3(y-轴)和CD45RA(x-轴)流式细胞术设门策略：幼稚型Treg(CD45RA+FOXP3+)、记忆型Treg(CD45RA-FOXP3+)和活化型(CD45RA-FOXP3hi)。(B)刺激之前Treg亚群中CD25+细胞表面染色的表达。(C)三只食蟹猴(C1-C3)每只的CD4+CD25+Treg亚群：活化型、记忆型和幼稚型的pSTAT5a反应。图21.食蟹猴血液中响应于DP47GSIgG-(IL-2)2或DP47GSIgG-(IL-2N88D)2活化常规CD4+记忆型T效应细胞pSTAT5a。使用来自图11中描述的三个猴供体中相同的20ng/mL刺激的血液样品，检验常规CD4+记忆型T效应细胞中pSTAT5a的诱导。(A)用来以y轴上的CD45RA和x-轴上的CD25鉴定常规CD4+FOXP3-CD45RA-记忆型T效应细胞的流式细胞术设门策略。(B)对总CD4+FOXP3-CD45RA-记忆型T效应细胞的pSTAT5a反应。(C)对也呈现CD25-的记忆型T效应细胞的pSTAT5a反应。(D)对也呈现CD25+的记忆型T效应细胞的pSTAT5a反应。图22.食蟹猴外周血T细胞亚群中响应于DP47GSIgG-(IL-2)2和DP47GSIgG-(IL-2N88D)2诱导pSTAT5a。对两名健康成年供体评估各种剂量(0.03-300ng/mL)的DP47GSIgG-(IL-2)2和DP47GSIgG-(IL-2N88D)2对诱导STAT5a磷酸化的影响。显示了如下结果：CD4+Treg亚群(A-C)的活化型(A)、记忆型(C)和幼稚型(B)Treg和常规CD4+记忆型T效应细胞(D)。对两只猴获得了类似的结果并且显示来自一个供体的结果以展示DP47GSIgG-(IL-2)2和DP47GSIgG-(IL-2N88D)2的影响。图23.在小鼠中，与DP47GSIgG-(IL-2)2相比，DP47GSIgG-IL-2具有优越的药代动力学(PK)特性，而DP47GSIgG-(IL-2N88D)2居中。(A)NOD和NOD.scid小鼠是以0.3mg/kgDP47GSIgG-IL-2或0.3mg/kgDP47GSIgG-(IL-2)2静脉内注射(i.v.)。(B)NOD.scid.IL2Rα-/-小鼠以0.1mg/kgDP47GSIgG-IL-2、0.3mg/kgDP47GSIgG-(IL-2)2或0.1mg/kgDP47GSIgG-(IL-2N88D)2静脉内注射。在所示的时间通过基于mAb的捕获测定法评估血清样品中的人IL-2。图24.用DP47GSIgG-IL-2，DP47GSIgG-(IL-2)2，和DP47GSIgG-(IL-2N88D)2处理后，鼠Treg中的CD25和FoxP3均增加。将BALB/c小鼠用(20,000和100,000IU/小鼠，n＝3)、DP47GSIgG-IL-2、DP47GSIgG-(IL-2)2或DP47GSIgG-(IL-2N88D)2(60、300或1500IU/小鼠，n＝3)处理，纳入运载体处理的小鼠作为未刺激的对照(n＝4)。处理后24小时，对脾Treg评定CD25水平和FOXP3水平。(A)对全部四种IL2分子均观察到细胞表面CD25的剂量依赖性变化和(B)胞内FoxP3的剂量依赖性变化。数据表示为均数±SD，黑色柱代表所用的最大剂量并且浅灰色柱代表最低剂量。图25.在从未用过生物药的正常健康成年食蟹猴中评定DP47GSIgG-IL-2和DP47GSIgG-(IL-2)2的PK特性。(A)将DP47GSIgG-IL-2作为短的大丸剂(shortbolus)按剂量10、25和100μg/kg(n＝2只/剂量)静脉内注射(i.v.)。(B)将DP47GSIgG-(IL-2)2作为短的大丸剂按剂量10和25μg/kg(n＝2只/剂量)静脉内注射。在所示的时间通过基于mAb的捕获测定法评估血清样品中的人IL-2。图26.DP47GSIgG-IL2在食蟹猴中具有剂量依赖性作用，增加调节型T细胞。处理后第7天全血CD4+CD25+FOXP3+调节型T细胞(Treg)的变化显示为(A)Treg绝对细胞数目/mm3全血和(B)Treg倍数变化。全部数据均表示为均数±SD。空心柱：DP47GSIgG-IL-2(n＝6)；加阴影柱：运载体(n＝3)。图27.DP47GSIgG-IL-2对食蟹猴中Treg的时间影响和低剂量影响。(A)给予2或6μg/kgDP47GSIgG-IL-2(分别n＝4和6只)后Treg倍数增加的时间依赖性变化。(B)给予2或6μg/kgDP47GSIgG-IL-2(分别n＝4和6只)后血液中Treg绝对计数的时间依赖性变化。全部数据均显示为均数±SD。图28.单剂量Proleukin在食蟹猴中刺激了瞬时剂量依赖性Treg反应。(A)用3x104至3x105IU/kgProleukin单剂量处理后外周血Treg数目的变化；(B)用3x104至3x105IU/kgProleukin单剂量处理后TregpSTAT5a的变化。数据显示为均数±SD。图29.低剂量DP47GSIgG-IL-2在食蟹猴中诱导Treg方面比大剂量更有效。将正常健康食蟹猴(n＝5的组)用低剂量DP47GSIgG-IL-2或大剂量Proleukin处理并且在第10天检验调节型T细胞的变化。在第0天和第7天，DP47GSIgG-IL-2以剂量16,800IU/kg(12μg/kg)皮下给予。用Proleukin处理(200,000IU/kg)，每周皮下给予3次(MWF)，总计5个剂量。结果显示为(A)总Treg/mm3血液的变化、(B)Treg的增加倍数和(C)Treg对常规CD4+FOXP3-细胞之比变化的均数±SD。空心柱描述IL-2处理并且加阴影柱描述运载体对照。图30.离体全血磷酸化STAT5作为体内DP47GSIgG-IL-2Treg活化的敏感生物标志物。在体内施用单个低剂量DP47GSIgG-IL-2(12μg/kg)至健康食蟹猴(n＝5)后1天和3天，采集全血并且在不刺激的情况下立即检测磷酸化STAT5(pSTAT5a)。每只猴在处理前第0天采血并且测量pSTAT5a的量(加阴影柱)并将其独立用于评估处理后的倍数变化(空心柱)。显示了(A)在第1和第3天TregpSTAT5a的倍数变化、(B)常规CD4+CD45-记忆型T细胞中pSTAT5a的倍数变化，和(C)幼稚型T细胞pSTAT5a的倍数变化。数据显示为均数±SD。图31.离体全血pSTAT5a作为体内低剂量DP47GSIgG-IL-2Treg活化的敏感生物标志物。从体内施用单个低剂量DP47GSIgG-IL-2至健康食蟹猴后1天至7天，采集全血并且在不刺激的情况下立即检测pSTAT5a。每只猴在处理前第0天采血得到未刺激的pSTAT5a水平并且与处理后pSTAT5a的变化进行比较。(A)在2μg/kgDP47GSIgG-IL-2(n＝4)处理之前和之后的TregpSTAT5a。(B)在6μg/kgDP47GSIgG-IL-2(n＝6)处理之前和之后的TregpSTAT5a。数据显示为均数±SD。图32.离体食蟹猴全血Ki-67充当体内DP47GSIgG-IL-2诱导的T细胞增殖的标志物。还对如图14中所述那样用2和6μg/kgDP47GSIgG-IL-2处理的食蟹猴离体监测胞内标志物Ki-67的变化以评估体内增殖程度。将细胞周期中细胞的正常稳态百分数(Ki-67+)在处理前第0天定量并且随后接下来的7至11天每日监测。显示(A)Treg的％Ki-67+、(B)常规CD4+CD45-记忆/效应T细胞的％Ki-67+和(C)幼稚CD4+CD45RA+T细胞的％Ki-67+。数据显示为均数±SD。图33.DP47GSIgG-(IL-2)2对未用过药的健康食蟹猴中Treg的时间影响和低剂量影响。(A)在6μg/kgDP47IgG-(IL-2)2后Treg绝对数目的时间依赖性变化。(B)处理后TregpSTAT5a的时间依赖性变化，(C)Treg倍数增加的时间依赖性变化，和(D)比较来自DP47GsIgG-IL-2(空心柱，2至36μg/kg)处理的猴的Treg倍数变化与DP47GSIgG-(IL-2)2处理(加阴影柱，6μg/kg)的猴的Treg倍数变化。全部数据均显示为均数±SD(n＝4至6)。图34.很低剂量DP47GSIgG-(IL-2)2对未用过药的健康食蟹猴中Treg的时间和剂量依赖性影响。(A)在施用0.7和2μg/kgDP47GSIgG-(IL-2)2后Treg倍数增加的时间依赖性变化。(B)在处理前第0天和处理后第1-4天所测量的TregpSTAT5a的时间依赖性变化，(C)Teff/mem细胞pSTAT5a的时间依赖性变化。全部数据均显示为均数±SD(在0.7μg/kg，n＝3，并且在2μg/kg，n＝8)。图35.DP47GSIgG-IL-2对DP47GSIgG-(IL-2)2的剂量依赖性比较及它们增加全血食蟹猴Treg的能力。全部数据均表示为均数±SD(n＝3至6)。图36.下一代测序法(NGS)用来分析转录因子FOXP3和免疫抑制性分子CTLA-4的T细胞亚群特异性DNA去甲基化。在用最佳剂量DP47GSIgG-IL-2(25μg/kg，n＝4)和DP47GSIgG-(IL-2)2(6μg/kg，n＝4)处理前和之后，分析来自未用过生物药的成年食蟹猴的血液。用BDFACSAria从全血PBMC分选CD4+T细胞亚群并且100,000个细胞/亚群用于基因特异性DNA去甲基化。两种处理观察到类似结果并且在顶部小图显示来自DP47GSIgG-(IL-2)2处理的猴的FOXP3数据并且在底部小图显示CTLA-4数据(n＝4，均数±SD)。图37.在从未用过生物药的正常健康的食蟹猴中评定DP47GSIgG-(IL-2N88D)2的PK特性。(A)将DP47GSIgG-(IL-2N88D)2作为短的大丸剂按照剂量30和100μg/kg(n＝2只/剂量)静脉内(iv)注射。(B)将DP47GSIgG-(IL-2N88D)2以0.2ml在背侧按照剂量30和100μg/kg(n＝2只/剂量)皮下(sc)注射。在所示的时间用基于单克隆抗体的捕获测定法评估血浆样品中的人IL-2。(C)作为IL-2暴露的生物标志物，在以剂量30和100μg/kg注射IgG-(IL-2N88D)2后测量血浆中的可溶性CD25；在已知与食蟹猴sCD25交叉反应的基于人sCD25mAb的捕获测定法中测量食蟹猴sCD25。结果显示为均数±SEM(n＝4)。图38.DP47GSIgG-(IL-2N88D)2对未用过药的健康食蟹猴中Treg的体内时间依赖性影响和剂量依赖性影响。在注射(A)100μg/kgDP47IgG-(IL-2N88D)2或(B)30μg/kgDP47IgG-(IL-2N88D)2后总Treg、CD4+记忆型Treg、CD4+幼稚型Treg和CD8+FOXP3+Treg的绝对数目(x106/ml血液)的时间依赖性变化。在注射100μg/kgDP47IgG-(IL-2N88D)2(C)或30μg/kgDP47IgG-(IL-2N88D)2(D)后总Treg、CD4+记忆型Treg、CD4+幼稚型Treg和CD8+FOXP3+Treg的作为CD4+或CD8+T细胞％的Treg时间依赖性变化。结果显示为均数±SEM(n＝4)。图39.DP47GSIgG-(IL-2N88D)2对未用过药的健康食蟹猴中淋巴细胞的体内时间依赖性影响和剂量依赖性影响。CD4+记忆型T效应细胞的时间依赖性变化显示为注射100μg/kgDP47IgG-(IL-2N88D)2或30μg/kgDP47IgG-(IL-2N88D)2(A)后的总CD4+T细胞％(A)。CD4+CD25hi记忆型T效应细胞的时间依赖性变化显示为注射100μg/kgDP47IgG-(IL-2N88D)2或30μg/kgDP47IgG-(IL-2N88D)2(A)后的CD4+记忆型T效应细胞％(B)。结果显示为均数±SEM(n＝4)。图40.离体全血pSTAT5a是体内IL-2活化的敏感生物标志物。从体内施用单个剂量DP47GSIgG-(IL-2N88D)2至食蟹猴后1天至11天，采集全血并且在不刺激的情况下立即检测pSTAT5a。每只猴在处理前第0天采血得到未刺激的pSTAT5a水平并且与处理后pSTAT5a的变化进行比较。(A)用100μg/kgDP47GSIgG-(IL-2N88D)2处理前和之后的pSTAT5a(MFI，最大平均荧光强度)，n＝4。(B)用30μg/kgDP47GSIgG-(IL-2N88D)2处理前和之后的pSTAT5a，n＝4。数据显示为所示细胞亚群的均数±SEM。图41.离体全血细胞表面CD25染色是体内IL-2活化的敏感生物标志物。从体内施用单个剂量DP47GSIgG-(IL-2N88D)2至食蟹猴后1天至14天，采集全血并且在不刺激的情况下立即检测所示细胞类型上的表面CD25。每只猴在处理前第0天采血得到未刺激的CD25水平并且与处理后CD25的变化进行比较。(A)用100μg/kgDP47GSIgG-(IL-2N88D)2处理前和之后的CD25染色(最大MFI，平均荧光强度)，n＝4。(B)用30μg/kgDP47GSIgG-(IL-2N88D)2处理前和之后的CD25染色，n＝4。数据显示为所示细胞亚群的均数±SEM。图42.离体全血胞内Ki-67染色是体内IL-2活化后细胞增殖的敏感生物标志物。从体内施用单个剂量DP47GSIgG-(IL-2N88D)2至食蟹猴后1天至14天，采集全血并且在不刺激的情况下立即检测所示细胞类型上的胞内Ki-67。每只猴在处理前第0天采血得到未刺激的Ki-67+细胞水平并且与处理后Ki-67+细胞％的变化进行比较。(A)用100μg/kgDP47GSIgG-(IL-2N88D)2处理前和之后的Ki-67染色(Ki-67+细胞％)，n＝4。(B)用30μg/kgDP47GSIgG-(IL-2N88D)2处理前和之后的Ki-67(％Ki-67+细胞)染色，n＝4。结果显示为所示细胞亚群的均数±SEM。图43.对比总结IL-2对食蟹猴Treg的体内影响。作为CD4+T细胞％，显示Proleukin、IgG-IL-2、IgG-(IL-2)2和IgG-(IL-2N88D)2的总Treg的最大增加；为了比较，全部体内剂量均换算成pmole/kg。Proleukin每周给予3次(MWF)，给予2周；和IL-2融合蛋白作为单次注射施用。结果显示为均数±SEM；Proleukin(n＝5)、IgG-IL-2(n＝6)、IgG-(IL-2)2(n＝6)和IgG-(IL-2N88D)2(n＝4)。图44.大剂量IL-2在食蟹猴中诱导嗜酸粒细胞增多症。在采用Proleukin或IL-2免疫缀合物的全部试验中均监测血液嗜酸性粒细胞计数的变化。用大剂量Proleukin((2x105IU/kg每周3次，2周)或更高剂量的DP47GSIgG-IL-2处理后7至14天检出嗜酸粒细胞增多症，但用DP47GSIgG-(IL-2)2或DP47GSIgG-(IL-2N88D)2处理后未检出。对于IL-2剂量，基线嗜酸性粒细胞计数是显示为“0”的空心圆圈并且进行2次，对野生型IL-2分子的检测进行1次，和对DP47GSIgG-(IL-2N88D)2的检测进行1次。数据显示为均数±SD。图45.用DP47GSIgG-IL-2体内处理阻抑鼠绵羊红细胞迟发型超敏反应(DTH)。显示用运载体(100％反应)、IgG-IL-2(4,000IU/小鼠)处理的个体小鼠或作为阳性对照的小鼠CTLA-4-Ig(200μg/小鼠)的全部数据。(A)来自NOD小鼠和(B)C57BL/6小鼠的结果。第4天DTH反应的幅度显示为与未免疫的小鼠相比爪重量的变化(Δ爪重量)。数据显示为均数±SD。图46.用DP47GSIgG-IL-2(4,000IU/小鼠)体内处理抑制(A)免疫后21天C57BL/6小鼠中和(B)免疫后7天NOD小鼠中针对KLH的鼠IgG抗体反应。数据显示为均数±SD。发明详述定义除非下文中另外定义，否则术语如本领域通常所用那样在本文使用。如本文所用，术语“融合蛋白”指包含免疫球蛋白分子和IL-2分子的融合多肽分子，其中融合蛋白的组分彼此通过肽键直接或经肽接头连接。为了清晰起见，融合蛋白的免疫球蛋白组分的各条肽链可以非共价地连接，例如通过二硫键连接。“融合”指由肽键直接连接或借助一个或多个肽接头连接的组分。如本文所用，术语“特异性结合”意指结合作用对抗原具有选择性并且可以与不想要的或非特异的相互作用区别。免疫球蛋白与特定抗原结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其他技术，例如表面等离子体共振(SPR)技术(在BIAcore仪上分析)(Liljeblad等人,GlycoJ17,323-329(2000))和常规结合测定法(Heeley，EndocrRes28,217-229(2002))测量。在一个实施方案中，免疫球蛋白与不相关蛋白质结合的程度小于免疫球蛋白与抗原结合的程度约10％，如通过SPR所测量。在某些实施方案中，与抗原结合的免疫球蛋白具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM、或≤0.001nM(例如10-8M或更小、例如从10-8M至10-13M、例如从10-9M至10-13M)的解离常数(KD)。“亲和力”或“结合亲和力”指分子(例如抗体)的单一结合位点及其结合配偶物(例如抗原)之间非共价相互作用的强度总和。除非另外指出，否则如本文所用，“结合亲和力”指反映结合对子的成员(例如，抗体和抗原)之间1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其配偶物Y的亲和力可以通常由解离常数(KD)代表，解离常数是解离速率常数和缔合速率常数(分别是koff和kon)的比例。因此，等同亲和力可以包含不同的速率常数，只要速率常数的比例保持相同。亲和力可以由本领域已知的常见方法测量，包括本文所述的那些方法。用于测量亲和力的一个具体方法是表面等离子体共振法(SPR)。“减少的结合”，例如减少的Fc受体或IL-2受体结合，指相应相互作用的亲和力下降，如通过例如SPR测量。为清晰起见，该术语还包括亲和力减少到零(或低于分析方法的检测限)，即相互作用完全消除。相反，“增加的结合”指相应相互作用的结合亲和力增加。如本文所用，术语“抗原决定簇”同义于“抗原”并且指多肽大分子上的与抗体结合，形成抗体-抗原复合物的位点(例如一段连续氨基酸或由不同区域的不连续氨基酸构成的构象构型)。有用的抗原决定簇可以存在于例如细胞表面上、游离于血清中和/或在胞外基质(ECM)中。如本文所用，术语“单链”指包含由肽键线性连接的氨基酸单体的分子。术语“抗体”在本文中以最广意义使用并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们显示出所需的抗原结合活性。“抗体片段”指不同于完整抗体的分子，所述分子包含完整抗体的一部分，该部分结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2、双体抗体、线性抗体、单链抗体分子(例如scFv)和单结构域抗体。术语“免疫球蛋白分子”指具有天然存在抗体的结构的蛋白质。例如，IgG类免疫球蛋白是由二硫键结合的两条轻链和两条重链组成的约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白。从N端至C端，每条免疫球蛋白重链具有一个可变区(VH)，也称作可变重链域或重链可变结构域，随后是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)，也称作重链恒定区。类似地，从N端至C端，每条免疫球蛋白轻链具有一个可变区(VL)，也称作可变轻链域或轻链可变结构域，随后一个恒定轻链(CL)结构域，也称作轻链恒定区。免疫球蛋白的重链可以归属5个类别之一，称作α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)或μ(IgM)，其中某些类别可以进一步划分成亚类，例如γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)和α2(IgA2)。免疫球蛋白的轻链可以基于其恒定结构域的氨基酸序列而划分成两种类型之一，称作κ和λ。免疫球蛋白基本上由借助免疫球蛋白铰链区连接的两个Fab分子和一个Fc结构域组成。如本文所用，“Fab片段”指包含轻链的VL结构域和恒定结构域(CL)以及重链的VH结构域和第一恒定结构域(CH1)的免疫球蛋白片段。抗体或免疫球蛋白的“类别”指其重链拥有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五个主要类别的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类别中的几种可以进一步划分成亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。与不同类别免疫球蛋白相对应的重链恒定结构域分别称作α、δ、ε、γ和μ。术语“可变区”或“可变结构域”指免疫球蛋白或抗体重链或轻链的通常参与免疫球蛋白或抗体结合抗原的结构域。然而，包含于本发明融合蛋白中的免疫球蛋白可以包含不赋予抗原结合特异性的可变区。免疫球蛋白或抗体重链和轻链的可变结构域(分别是VH和VL)通常具有相似的结构，每种结构域包含四个保守的构架区(FR)和三个高变区(HVR)。参见例如，Kindt等人，KubyImmunology，第6版，W.H.FreemanandCo.，第91页(2007)。单个VH结构域或VL结构域可能足以赋予抗原结合特异性。如本文所用，术语“高变区”或“HVR”指免疫球蛋白或抗体可变结构域的下述区域的每一个，所述区域在序列上高变和/或形成结构上定义的环(“高变环”)。通常，天然4链抗体包含六个HVR；VH中三个(H1、H2、H3)和VL中三个(L1、L2、L3)。HVR通常包含来自高变环和/或来自互补决定区(CDR)的氨基酸残基，后者具有最高序列变异性和/或参与抗原识别。示例性高变环出现在第26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)氨基酸残基处(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196,901-917(1987))。示例性CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)出现在L1的第24-34位、L2的第50-56位、L3的第89-97位、H1的第31-35B位、H2的第50-65位和H3的第95-102位氨基酸残基(Kabat等人，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，第5版，PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991))。例外是VH中的CDR1，CDR通常包含形成高变环的氨基酸残基。CDR还包含“特异性决定残基”或“SDR”，它们是接触抗原的残基。SDR含于称作短缩-CDR或a-CDR的CDR区域内部。示例性a-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2和a-CDR-H3)存在于L1的第31-34位氨基酸残基、L2的第50-55位氨基酸残基、L3的第89-96位氨基酸残基、H1的第31-35B位氨基酸残基、H2的第50-58位氨基酸残基和H3的第95-102位氨基酸残基处(参见Almagro和Fransson,Front.Biosci.13,1619-1633(2008))。除非另外说明，否则可变结构域中的HVR残基和其他残基(例如，FR残基)在本文中根据上文Kabat等人编号(称作“Kabat编号”)。“构架”或“FR”指除高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由以下4个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR序列和FR序列通常按以下顺序出现在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。“人免疫球蛋白”是这样一种免疫球蛋白，其拥有对应于人或人细胞产生的免疫球蛋白的氨基酸序列或从利用人免疫球蛋白库或其他编码人免疫球蛋白的序列的非人来源衍生。人免疫球蛋白的这种定义特别排除包含非人抗原结合残基的人源化免疫球蛋白。如本文中所用的术语“单克隆抗体”指从基本上均一的抗体群体获得的抗体，即，构成该群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位，除了可能的变体抗体之外(例如，含有天然存在突变或在产生单克隆抗体制备物期间出现)，这类变体通常以微小的量存在。与一般包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相反，单克隆抗体制备物的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆的”指示该抗体的特征为从基本上均一的抗体群体获得，并且不得解释为要求通过任何特定方法产生该抗体。例如，可以通过多种技术产生待根据本发明使用的单克隆抗体，所述技术包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法和利用含有全部或部分的人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文中描述了用于产生单克隆抗体的这类方法和其他示例性方法。术语“Fc结构域”或“Fc区”在本文中用来定义免疫球蛋白重链的含有至少一部分恒定区的C端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。IgGFc区包含IgGCH2结构域和IgGCH3结构域。人IgGFc区的“CH2结构域”通常从约位置231处的氨基酸残基延伸至约位置340处的氨基酸残基。在一个实施方案中，糖链与CH2结构域连接。本文中的CH2结构域可以是天然序列CH2结构域或变体CH2结构域。“CH3结构域”包含一段在Fc区中CH2结构域C末端的残基(即从IgG的约位置341处的氨基酸残基延伸至约位置447处的氨基酸残基)。本文中的CH3区可以是天然序列CH3结构域或变体CH3结构域(例如在其一条链中具有引入的“突出部分”(“结”)和在其另一条链中具有引入的相应“空穴”(“扣”)的CH3结构域；参见US专利号5,821,333，所述文献通过引用的方式明确并入本文)。这类变体CH3结构域可以用来促进如本文所述的两条不相同免疫球蛋白重链的异二聚化。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或可以不存在。除非本文中另外说明，否则Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号根据如Kabat等人,SequencesofProteinsofImmunologicalInteres,第5版,PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD,1991中所述的EU编号体系，也称作EU索引。术语“效应子功能”指随免疫球蛋白同种型变动的归因于免疫球蛋白Fc区的那些生物学活性。免疫球蛋白效应子功能的例子包括：C1q结合和补体依赖的细胞毒性(CDC)、Fc受体结合作用、抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖的细胞吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌、免疫复合物介导的抗原呈递细胞摄取抗原、下调细胞表面受体(例如B细胞受体)和B细胞活化。“活化性Fc受体”是这样的Fc受体，其中由免疫球蛋白Fc区接合后，所述Fc受体激发了刺激携带受体的细胞执行效应子功能的信号传导事件。活化性Fc受体包括FcγRIIIa(CD16a)、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)和FcαRI(CD89)。具体的活化性Fc受体是人FcγRIIIa(参见UniProt登录号P08637(141版))。如本文所用术语“白介素-2”或“IL-2”指来自任何脊椎动物来源的任何天然IL-2，其中除非另外说明，否则所述脊椎动物来源包括哺乳动物如灵长类(例如，人类)和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。本术语涵盖未加工的IL-2以及因细胞中加工而产生的任何形式的IL-2。本术语还涵盖天然存在的IL-2变体，例如，剪接变体或等位变体。SEQIDNO:1中显示示例性人IL-2的氨基酸序列。未加工的人IL-2额外地包含N端20个氨基酸信号肽，该信号肽在成熟IL-2分子中不存在。“天然IL-2”，还称作“野生型IL-2”，意指天然存在的IL-2。SEQIDNO:1中显示人天然IL-2分子的序列。出于本发明的目的，术语野生型还涵盖这样的IL-2形式，其包含一个或多个与天然存在的天然IL-2相比，不改变IL-2受体结合作用的氨基酸突变，如例如与人IL-2残基125对应的位置处的半胱氨酸置换成丙氨酸。出于本发明的目的，在一些实施方案中，野生型IL-2包含氨基酸置换C125A(参见SEQIDNO:3)。如本文所用，术语“CD25”或“IL-2受体α”指来自任何脊椎动物来源的任何天然CD25，其中除非另外说明，否则所述脊椎动物来源包括哺乳动物如灵长类(例如，人类)和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。本术语涵盖“全长”、未加工的CD25以及因细胞中加工而产生的任何形式的CD25。本术语还涵盖天然存在的CD25变体，例如，剪接变体或等位变体。在某些实施方案中，CD25是人CD25。SEQIDNO:25中显示一个示例性人CD25(具有信号序列、Avi标签和His标签)的氨基酸序列。如本文所用的术语“高亲和力IL-2受体”指IL-2受体的异三聚体形式，由受体γ-亚基(也称作共同细胞因子受体γ-亚基、γc或CD132)、受体β-亚基(也称作CD122或p70)和受体α-亚基(也称作CD25或p55)组成。相对得，术语“中等亲和力IL-2受体”或“IL-2受体βγ”指仅包括γ-亚基和β-亚基而无α-亚基的IL-2受体(关于综述，参见例如Olejniczak和Kasprzak,MedSciMonit14,RA179-189(2008))。示例性人CD122和CD132(与Fc区融合，具有His标签)的氨基酸序列分别在SEQIDNO:21和23中显示。“调节型T细胞”或“Treg细胞”意指特化类型的CD4+T细胞，所述T细胞可以抑制其他T细胞(效应T细胞)的反应。Treg细胞以表达CD4(IL-2受体(CD25)的α-亚基)和转录因子叉头框P3(FOXP3)为特征(Sakaguchi,AnnuRevImmunol22,531-62(2004))并且在诱导和维持对抗原(包括肿瘤表达的那些抗原)的外周自我耐受性中发挥至关重要的作用。“常规CD4+T细胞”意指除调节型T细胞之外的CD4+T细胞。常规CD4+记忆型T细胞以表达CD4、CD3、但不表达FOXP3为特征。“常规CD4+记忆型T细胞”是常规CD4+T细胞的亚群，其进一步以缺少表达CD45RA为特征，与表达CD45RA的“常规CD4+幼稚型T细胞”相反。“选择性活化Treg细胞”意指基本上在不同时活化其他T细胞亚群(如CD4+辅助T细胞、CD8+细胞毒T细胞，NKT细胞)或天然杀伤(NK)细胞的情况下活化Treg细胞。实施例中描述了用于确定和区分这些细胞类型的方法。活化可以包括诱导IL-2受体信号传导(如通过例如检测磷酸化STAT5a所测量)，诱导增殖(如通过例如检测Ki-67所测量)和/或上调活化标志物表达(如例如CD25)。术语“肽接头”指包含一个或多个氨基酸、一般约2-20个氨基酸的肽。本领域已知或本文中描述了肽接头。合适地，无免疫原性接头肽例如包括(G4S)n、(SG4)n或G4(SG4)n肽接头。“n”通常是1和10之间、一般2和4之间的数字。术语“修饰”指对肽主链(例如氨基酸序列)的任何操作或多肽的翻译后修饰(例如糖基化)。“结入扣修饰”指在CH3结构域中两条免疫球蛋白重链之间的界面内部的修饰，其中i)在一条重链的CH3结构域中，将氨基酸残基替换为具有更大侧链体积的氨基酸残基，因而在一条重链的CH3结构域中的界面内部产生突出部分(“结”)，所述突出部分可放置在另一条重链的CH3结构域中界面内部的空腔(“扣”)中，和ii)在另一条重链的CH3结构域中，将氨基酸残基替换为具有更小侧链体积的氨基酸残基，因而在第二CH3结构域中的界面内部产生空腔(“扣”)，在所述空腔内部可放置第一CH3结构域中界面内部的突出部分(“结”)。在一个实施方案中，“结入扣修饰”在抗体重链之一中包含氨基酸置换T366W和任选地氨基酸置换S354C，并且在另一条抗体重链中包含氨基酸置换T366S、L368A、Y407V和任选地Y349C。结入扣技术例如在US5,731,168；US7,695,936；Ridgway等人,ProtEng9,617-621(1996)和Carter，JImmunolMeth248,7-15(2001)中描述。通常，该方法涉及在第一多肽的界面处引入突出部分(“结”)并在第二多肽的界面中引入相应空穴(“扣”)，从而可以将突出部分安置在空穴中，从而促进异二聚体形成并阻碍同型二聚体形成。通过将源自第一多肽界面小氨基酸侧链替换为较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)，构建突出部分。通过将大氨基酸侧链替换为较小侧链(例如，丙氨酸或苏氨酸)，在第二多肽的界面中产生与突出部分具有相同或相似尺寸的代偿“空穴”。分别在第S354和Y349位置处引入两个半胱氨酸残基导致Fc区内两条抗体重链之间形成二硫键，进一步稳定二聚体(Carter，JImmunolMethods248,7-15(2001))。氨基酸“置换”指在多肽中将一个氨基酸替换为另一个氨基酸。在一个实施方案中，将氨基酸替换为具有相似结构特性和/或化学特性的另一个氨基酸，例如，保守性氨基酸替换。可以基于所涉及残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两性本质的相似性进行“保守性”氨基酸置换。例如，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸及甲硫氨酸；极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺及谷氨酰胺；带正电荷(碱性)的氨基酸包括精氨酸、赖氨酸及组氨酸；并且带负电荷(酸性)的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。非保守性置换将使这些类别之一的成员交换为另一个类别的成员。例如，氨基酸置换还可以导致将一个氨基酸替换为具有不同结构特性和/或化学特性的另一个氨基酸，例如，将来自来自一个组(例如，极性)的氨基酸替换为来自来自不同组(例如，碱性)的另一种氨基酸。可以使用本领域熟知的遗传方法或化学方法产生氨基酸置换。遗传方法可以包括位点定向诱变、PCR、基因合成等。构思了也可以使用通过除基因工程之外的方法(如化学修饰法)改变氨基酸侧链基团的方法。多种名称可以在本文中用来指示相同的氨基酸置换。例如，从免疫球蛋白重链的第329位置处的脯氨酸置换成甘氨酸可以表示为329G、G329、G329、P329G或Pro329Gly。相对于参考多肽序列，将“氨基酸序列同一性百分数(％)”定义为比对序列并根据需要引入空位以实现最大序列同源性百分数并且不考虑任何保守性置换作为序列同一性的部分之后，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分数。为了确定氨基酸序列同一性百分数的比对可以按本领域能力范围内的多种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适宜参数，包括为实现正在比较的全长序列范围内最大比对所需要的任何算法。然而，出于本文目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生氨基酸序列同一性％值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.授权，并且源代码已经随用户文档提交至华盛顿特区20559的美国版权局，在那里它以美国版权登记号TXU510087登记。ALIGN-2程序从Genentech,Inc.,SouthSanFrancisco,加利福尼亚州可公开获得或可以从源代码汇编。应当将ALIGN-2程序汇编在UNIX操作系统(包括数字式UNIXV4.0D)上使用。全部序列比较参数由ALIGN-2程序设定并且不变动。在使用ALIGN-2比较氨基酸序列的情况下，如下计算给定氨基酸序列A与给定氨基酸序列B、同给定氨基酸序列B或针对给定氨基酸序列B(这可以备选地描述为与给定氨基酸序列B、同给定氨基酸序列B或针对给定氨基酸序列B具有或包含某个氨基酸序列同一性％的给定氨基酸序列A)的氨基酸序列同一性％：100乘以分数X/Y其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对结果中评定为相同匹配的氨基酸残基的数目，并且其中Y是B中氨基酸残基的总数。可以理解在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A相对于B的氨基酸序列同一性％将不等于B相对于A的氨基酸序列同一性％。除非另外特别声明，否则本文所用的全部氨基酸序列同一性值％如紧接前段中所述那样使用ALIGN-2计算机程序获得。如本文中可互换使用的“多核苷酸”或“核酸”指任何长度的核苷酸聚合物，并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基和/或其类似物，或可以由DNA或RNA聚合酶或通过合成反应掺入聚合物的任何底物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，如甲基化核苷酸和它们的类似物。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分打断。多核苷酸可以包含合成后所做的修饰，如与标记物缀合。就核酸或多核苷酸具有与本发明的参考核苷酸序列至少例如95％“同一”的核苷酸序列而言，它意指除了该多核苷酸序列可以包括参考核苷酸序列的每100个核苷酸至多5个点突变之外，该多核苷酸的核苷酸序列与参考序列同一。换而言之，为了获得具有与参考核苷酸序列至少95％同一的核苷酸序列的多核苷酸，可以将参考序列中至多5％的核苷酸缺失或用另一个核苷酸置换，或可以将参考序列中多个核苷酸直至5％的总核苷酸插入参考序列中。参考序列的这些改变可以在参考核苷酸序列的5’或3’端位置出现或在这些末端位置之间的任何位置出现，个别间插在参考序列中的残基之间或间插在参考序列内部的一个或多个连续群组中。实际来看，可以常规地使用已知的计算机程序，如上文对多肽讨论的那种(例如ALIGN-2)，确定任何特定多核苷酸序列是否与本发明的核苷酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一。如本文所用，术语“载体”指能够增殖与其连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制型核酸结构的载体以及并入已经将该载体引入其中的宿主细胞的基因组内的载体。某些载体能够指导与它们有效连接的核酸表达。此类载体在本文中称作“表达载体”。术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”互换使用并且指已经向其中引入外源核酸的细胞，包括这类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，这包括原代转化的细胞和从中衍生的子代，而无论传代次数是多少。后代可以在核酸含量含量方面不与亲本细胞完全相同，反而可以含有突变。本文包括具有与最初转化细胞中所筛选或选择的相同功能或生物活性的突变后代。宿主细胞是可以用来产生本发明融合蛋白的任何类型的细胞系统。宿主细胞包括培养的细胞，例如培养的哺乳动物细胞，如CHO细胞、BHK细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、YO骨髓瘤细胞、P3X63小鼠骨髓瘤细胞、PER细胞、PER.C6细胞或杂交瘤细胞、酵母细胞、昆虫细胞和植物细胞，这里仅提到了一些细胞，还包括含于转基因动物、转基因植物或培养的植物组织或动物组织内部的细胞。药剂的“有效量”指在施用该药物的细胞或组织中产生生理变化所需的量。药剂(例如，药物组合物)的“治疗有效量”指有效实现所需治疗性或预防性结果的量、以实现前述结果的剂量和持续实现前述结果所需要的时间段。药剂的治疗有效量例如消除、减少、延迟、最小化或防止疾病的不良作用。“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯化动物(例如，奶牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类(例如，人和非人灵长类如猴)、兔和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。特别地，个体或受试者是人。术语“药物组合物”指一种制备物，所述制备物处于这类形式从而允许其中所含的有效成分的生物活性有效，并且不含有对于施用该制剂的受试者不可接受地有毒的额外组分。“可药用载体”指药物组合物中除有效成分之外的对受试者无毒的成分。可药用载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。如本文所用，名词“治疗”(和其语法变型如动词“治疗”或分词“治疗”)指意欲改变正在接受治疗的个体中疾病之天然过程的临床介入，并且可以旨在预防或在临床病理学过程期间实施。想要的治疗效果包括但不限于防止疾病出现或复发、减轻症状、减小疾病的任何直接或间接病理学后果、防止转移、降低病情进展速率、改善或缓和疾病状态，以及缓解或预后改善。在一些实施方案中，本发明的抗体用来延缓疾病发展或用来减慢疾病的进展。“自身免疫疾病”指源自和针对个体自身组织的非恶性疾病或病症。自身免疫疾病或病症的例子包括但不限于炎性反应如炎性皮肤病，包括银屑病和皮炎(例如异位性皮炎)；与炎性肠病(如节段性回肠炎和溃疡性结肠炎)相关的反应；皮炎；过敏性疾病如湿疹和哮喘；类风湿性关节炎；系统性红斑狼疮(SLE)(包括但不限于狼疮肾炎、皮肤狼疮)；糖尿病(例如1型糖尿病或胰岛素依赖性糖尿病)；多发性硬化和幼发型糖尿病。本发明的融合蛋白本发明提供具有在如本文所述的治疗方法中使用的特别有利特性的新免疫球蛋白-IL-2融合蛋白。在第一方面，本发明提供一种融合蛋白，所述融合蛋白包含(i)一个免疫球蛋白分子和(ii)两个突变白介素-2(IL-2)分子，与野生型IL-2分子相比，所述突变白介素-2分子包含减少突变IL-2分子对中等亲和力IL-2受体的亲和力的氨基酸突变。在一个实施方案中，所述融合蛋白基本上由免疫球蛋白分子和两个突变白介素-2(IL-2)分子和任选地一个或多个肽接头组成，与野生型IL-2分子相比，所述突变白介素-2分子包含减少突变IL-2分子对中等亲和力IL-2受体的亲和力的氨基酸突变。如实施例中所示，包含两个IL-2分子的融合蛋白如与包含单个IL-2分子的相应融合蛋白相比，令人惊讶地提供在活化调节型T细胞中明显改善的功效和选择性。另外，仅包含与中等亲和力IL-2受体的结合作用减低的两个(而非仅一个)突变IL-2分子的融合蛋白保留对调节型T细胞明显的刺激性活性。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白分子是IgG类免疫球蛋白分子，特别是IgG1亚类免疫球蛋白分子。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白分子是人免疫球蛋白分子，即它包含完全人类可变区和恒定区。SEQIDNO:8中显示示例性人IgG1恒定区的序列。IgG类免疫球蛋白分子包含(i)两条免疫球蛋白轻链，所述轻链各自从N端至C端包含轻链可变结构域(VL)和轻链恒定结构域(CL)，和(ii)两条免疫球蛋白重链，所述重链各自从N端至C端包含重链可变结构域(VH)、重链恒定结构域(CH)1、免疫球蛋白铰链区、CH2结构域和CH3结构域。后两个结构域形成免疫球蛋白分子的Fc区的一部分。两条重链在Fc区内二聚化。在本发明融合蛋白的一个实施方案中，所述两个突变IL-2分子各自是在其N端氨基酸处与所述免疫球蛋白分子的免疫球蛋白重链之一的C端氨基酸融合，任选地通过肽接头融合。两个(相同)IL-2分子与免疫球蛋白重链的融合允许简单产生融合蛋白，避免形成不想要的副产物及避免需要促进不相同重链的异二聚化的修饰，如结入扣修饰。在本发明融合蛋白的某些实施方案中，所述两个突变IL-2分子与所述免疫球蛋白分子通过肽接头融合。在一个实施方案中，所述两个突变IL-2分子各自与所述免疫球蛋白分子通过肽接头融合。在一个实施方案中，所述两个突变IL-2分子各自在其N端氨基酸处与所述免疫球蛋白分子的免疫球蛋白重链之一的C端氨基酸通过肽接头融合。在一个实施方案中，所述突变IL-2分子各自与所述免疫球蛋白分子通过具相同氨基酸序列的肽接头融合。在一个实施方案中，所述肽接头包含至少10个氨基酸。在一个具体实施方案中，所述肽接头包含至少15个氨基酸。不希望受理论约束，这个长度的肽接头可以为突变IL-2分子与IL-2受体、尤其高亲和力(异三聚体)IL-2受体最佳结合提供灵活性。在一个具体实施方案中，所述肽接头包含15个氨基酸。在一个甚至更具体的实施方案中，所述肽接头包含氨基酸序列(G4S)3(SEQIDNO:66)。在一个实施方案中，所述肽接头长15个氨基酸。在一个实施方案中，所述肽接头具有氨基酸序列(G4S)3(SEQIDNO:66)。在一个实施方案中，所述肽接头由15个氨基酸组成。在一个实施方案中，所述肽接头由氨基酸序列(G4S)3(SEQIDNO:66)组成。与游离(未融合的)IL-2相比，IL-2分子与免疫球蛋白分子融合提供有利的药代动力学特性，包括长血清半寿期(归因于通过与FcRn结合而再循环，和分子大小远高于肾过滤的阈值)。另外，免疫球蛋白分子的存在还使得通过例如蛋白A亲和层析简单纯化融合蛋白成为可能。有趣地，如实施例中所示，包含两个与中等亲和力IL-2受体的结合作用减低的突变IL-2分子的融合蛋白具有比包含两个野生型IL-2分子的相应融合蛋白更长的血清半寿期。与免疫球蛋白分子(即天然存在类型的分子)融合还可以最小化融合蛋白通过形成抗药物抗体所致的毒性。尽管免疫球蛋白分子、尤其免疫球蛋白分子Fc区的存在有利于融合蛋白的药代动力学特性，但它可能同时导致融合蛋白不利地靶向至表达Fc受体的细胞而非靶向至携带IL-2受体的优选细胞。另外，Fc受体的接合可以导致(促炎)细胞因子的释放和除调节型T细胞之外的各种免疫细胞的不利活化。因此，在某些实施方案中，与无所述修饰的相应免疫球蛋白分子相比，包含于本发明融合蛋白中的所述免疫球蛋白分子包含减少免疫球蛋白分子对Fc受体的结合亲和力的修饰。在一个具体实施方案中，所述Fc受体是Fcγ受体，特别地是人Fcγ受体。可以使用标准仪器如BIAcore仪器(GEHealthcare)和如可以通过重组表达获得的Fc受体，例如通过ELISA或通过表面等离子体共振法(SPR)容易地确定与Fc受体的结合亲和力。在下文中描述用于测量结合亲和力的具体示意性和示例性实施方案。根据一个实施方案，在25℃，配体(Fc受体)固定在CM5芯片上的情况下，使用T100仪(GEHealthcare)，通过表面等离子体共振法测量Fc受体的结合亲和力。简而言之，根据供应商的说明书，用盐酸N-乙基-N'-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5,GEHealthcare)。重组配体用10mM乙酸钠，pH5.5稀释至0.5-30μg/ml，之后，按流速10μl/分钟进样以实现大约100-5000响应单位(RU)的偶联蛋白质。在配体上样后，注入1M乙醇胺以封闭未反应的基团。对于动力学测量，将3倍至5倍抗体连续稀释物(范围约0.01nM至300nM之间)在25℃于HBS-EP+(GEHealthcare，10mMHEPES，150mMNaCl，3mMEDTA，0.05％表面活性剂P20，pH7.4)中按大约30-50μl/分钟流速上样。使用简单一对一Langmuir结合模型(T100评价软件1.1.1版)，通过同时拟合缔合和解离传感图(sensorgram)，计算缔合速率(kon)和解离速率(koff)。将平衡解离常数(KD)计算为koff/kon比。参见，例如，Chen等人，JMolBiol293,865-881(1999)。备选地，可以使用已知表达特定的Fc受体的细胞系，如表达FcγIIIa受体的NK细胞，评价抗体对Fc受体的结合亲和力。在一个实施方案中，修饰包含减少免疫球蛋白对Fc受体的结合亲和力的一个或多个氨基酸突变。在一个实施方案中，氨基酸突变是氨基酸置换。一般，相同的一个或多个氨基酸突变存在于两条免疫球蛋白重链的每条重链内。在一个实施方案中，所述氨基酸突变减少免疫球蛋白对Fc受体的结合亲和力至少2倍、至少5倍或至少10倍。在存在多于一个减少免疫球蛋白对Fc受体的结合亲和力的氨基酸突变的实施方案中，这些氨基酸突变的组合可以减少免疫球蛋白对Fc受体的结合亲和力至少10倍、至少20倍或甚至至少50倍。在一个实施方案中，与无所述修饰的相应免疫球蛋白分子相比，所述免疫球蛋白分子显示出小于20％、具体地小于10％、更具体地小于5％的Fc受体结合亲和力。在一个实施方案中，所述Fc受体是活化性Fc受体。在一个具体实施方案中，所述Fc受体选自FcγRIIIa(CD16a)、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)和FcαRI(CD89)。在一个具体实施方案中，Fc受体是Fcγ受体，更具体地是FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa受体。优选地，对这些受体中每种受体的结合亲和力减低。在一个甚至更具体的实施方案中，所述Fc受体是FcγIIIa，特别地是人FcγIIIa。在一些实施方案中，对补体组分的结合亲和力、尤其对C1q的结合亲和力也减低。在一个实施方案中，对新生儿Fc受体(FcRn)的结合亲和力不减低。当免疫球蛋白分子显示大于约70％的未修饰形式免疫球蛋白分子与FcRn的结合亲和力时，实现基本上相似的FcRn结合作用，即保留免疫球蛋白分子对所述受体的结合亲和力。包含于本发明融合蛋白中的免疫球蛋白分子可以显示出大于约80％和甚至大于约90％的这类亲和力。在一个实施方案中，减少免疫球蛋白分子对Fc受体的结合亲和力的所述修饰在免疫球蛋白分子的Fc区内，特别地在其CH2区内。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白分子包含在免疫球蛋白重链第329位置(EU编号)处的氨基酸置换。在一个更具体的实施方案中，所述氨基酸置换是P329A或P329G，特别地是P329G。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白分子包含在免疫球蛋白重链第234和235位置(EU编号)处的氨基酸置换。在一个具体实施方案中，所述氨基酸置换是L234A和L235A(LALA)。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白分子包含在抗体重链第329位置(EU编号)处的氨基酸置换和在选自免疫球蛋白重链第228、233、234、235、297和331位置(EU编号)处的进一步的氨基酸置换。在一个更具体的实施方案中，所述进一步的氨基酸置换是S228P、E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S。在一个具体实施方案中，所述免疫球蛋白分子包含在免疫球蛋白重链第P329、L234和L235位置处(EU编号)的氨基酸置换。在一个更具体的实施方案中，所述免疫球蛋白分子包含免疫球蛋白重链中的氨基酸置换L234A、L235A和P329G(LALAP329G；EU编号)。这种氨基酸置换组合特别高效地消除人IgG类免疫球蛋白的Fcγ受体结合作用，如通过引用方式完整并入本文的PCT公开号WO2012/130831中所述。PCT公开号WO2012/130831还描述了制备这类修饰的免疫球蛋白的方法和用于确定其特性如Fc受体结合作用或效应子功能的方法。可以使用本领域熟知的遗传方法或化学方法，通过氨基酸缺失、取代、插入或修饰，制备在免疫球蛋白重链中包含修饰的免疫球蛋白。遗传方法可以包括DNA编码序列的位点特异性诱变、PCR、基因合成等。能够例如通过测序，验证正确的核苷酸变化。与未修饰的相应免疫球蛋白或抗体相比，包含减少Fc受体结合作用的修饰的免疫球蛋白或抗体通常具有减低的效应子功能，特别是减低的ADCC。因此，在一个实施方案中，减少免疫球蛋白分子对Fc受体的结合亲和力的所述修饰减少免疫球蛋白分子的效应子功能。在一个具体实施方案中，所述效应子功能是抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在一个实施方案中，减少ADCC到小于20％的无所述修饰的相应免疫球蛋白分子引起的ADCC。可以通过通过本领域已知的方法测量免疫球蛋白或抗体的效应子功能。评估目的分子的ADCC活性的体外测定法的例子在美国专利号5,500,362；Hellstrom等人,ProcNatlAcadSciUSA83,7059-7063(1986)和Hellstrom等人,ProcNatlAcadSciUSA82,1499-1502(1985)；美国专利号5,821,337；Bruggemann等人，JExpMed166,1351-1361(1987)中描述。备选地，可以使用非放射性分析方法(见例如用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定法(CellTechnology,Inc.MountainView,CA)；和CytoTox非放射性细胞毒性测定法(Promega,Madison,WI))。用于此类测定法的有用效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。备选地或额外地，可以在体内，例如，在动物模型中，如在Clynes等人,ProcNatlAcadSciUSA95,652-656(1998)中公开的那种动物模型中，评估目的分子的ADCC活性。在一些实施方案中，免疫球蛋白分子对补体组分、尤其对C1q的结合作用也减低。因此，补体依赖的细胞毒性(CDC)也可以减低。可以实施C1q结合测定法以确定免疫球蛋白是否能够结合C1q并因此具有CDC活性。参见例如，WO2006/029879和WO2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以进行CDC测定法(参见，例如，Gazzano-Santoro等人,JImmunolMethods202,163(1996)；Cragg等人,Blood101,1045-1052(2003)；和Cragg和Glennie，Blood103,2738-2743(2004))。除上文和PCT公开号WO2012/130831中所述的免疫球蛋白分子之外，Fc受体结合作用和/或效应子功能减低的免疫球蛋白还包括置换Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中一者或多者的那些免疫球蛋白(美国专利号6,737,056)。这类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327的两个或更多个位置处具有置换的Fc突变体，包括残基265和297置换成丙氨酸的所谓“DANA”Fc突变体(美国专利号7,332,581)。与IgG1免疫球蛋白相比，IgG4亚类免疫球蛋白显示减低的Fc受体结合亲和力和减低的效应子功能。因此，在一些实施方案中，包含于本发明融合蛋白中的所述免疫球蛋白分子是IgG4亚类免疫球蛋白，特别是人IgG4亚类免疫球蛋白。在一个实施方案中，所述IgG4亚类免疫球蛋白在Fc区中第S228位置(EU编号)处包含氨基酸置换，特别是氨基酸置换S228P。为了进一步减低其对Fc受体结合的亲和力和/或其效应子功能，在一个实施方案中，所述IgG4亚类免疫球蛋白在第L235位置处包含氨基酸置换，特别是氨基酸置换L235E(EU编号)。在另一个实施方案中，所述IgG4亚类免疫球蛋白在第P329位置处包含氨基酸置换，尤其氨基酸置换P329G(EU编号)。在一个具体实施方案中，所述IgG4亚类免疫球蛋白在第S228、L235和P329位置处包含氨基酸置换，尤其氨基酸置换S228P、L235E和P329G(EU编号)。这类修饰的IgG4亚类免疫球蛋白和它们的Fcγ受体结合特性在通过引用方式完整并入本文的PCT公开号WO2012/130831中描述。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白分子能够与抗原特异性结合。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白分子是单克隆抗体。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白分子不能够与抗原特异性结合，尤其不能够与人抗原特异性结合。可以例如通过如本文所述的ELISA或表面等离子体共振法确定不存在这种免疫球蛋白分子与抗原的特异性结合(即不存在可以与非特异性相互作用区别的任何结合)。这种免疫球蛋白分子特别可用于例如当不希望靶向特定组织时增强融合蛋白的血清半寿期。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白分子包含基于人Vh3-23种系序列的重链可变区序列。在一个具体实施方案中，所述免疫球蛋白分子包含至少95％、96％、97％、98％、99％或100％与SEQIDNO:9的序列同一的重链可变区序列。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白分子包含基于人Vk3-20种系序列的轻链可变区序列。在一个具体实施方案中，所述免疫球蛋白分子包含至少95％、96％、97％、98％、99％或100％与SEQIDNO:11的序列同一的轻链可变区序列。在一个甚至更具体的实施方案中，所述免疫球蛋白分子包含SEQIDNO:9的重链可变区序列和SEQIDNO:11的轻链可变区序列。包含这些可变区序列的免疫球蛋白分子不能够与抗原、尤其人抗原特异性结合。它们缺少与正常组织以及PBMC的结合作用，没有多重反应性并且通过成像显示无体内非特异性蓄积(数据未显示)。可变区序列完全基于人种系序列，例外是其中已经引入GSG序列以产生非结合性免疫球蛋白的重链CDR3。在一个实施方案中，所述突变IL-2分子包含在与人IL-2(SEQIDNO:1)的残基88相对应的位置处的氨基酸突变。在一个实施方案中，所述氨基酸突变是氨基酸置换。在一个更具体的实施方案中，所述氨基酸置换选自N88D、N88R、N88I和N88G。在一个具体实施方案中，所述氨基酸置换是N88D。在一个实施方案中，所述突变IL-2分子是人IL-2分子。在一个具体实施方案中，所述突变IL-2分子包含SEQIDNO:60的序列(IL-2N88D)。在一个实施方案中，与野生型IL-2分子相比，所述突变IL-2分子包含仅一个减少突变IL-2分子对中等亲和力IL-2受体的亲和力的氨基酸突变。在一个实施方案中，与野生型IL-2分子相比，所述突变IL-2分子不包含改变突变IL-2分子对高亲和力IL-2受体的亲和力的氨基酸突变。在一个实施方案中，与野生型IL-2分子相比，所述突变IL-2分子仅包含改变突变IL-2分子对IL-2受体的亲和力的单个氨基酸突变。在一个实施方案中，所述突变IL-2分子还包含在与人IL-2的残基125相对应的位置处的氨基酸置换。在一个实施方案中，所述氨基酸置换是C125A。在一个具体实施方案中，所述突变IL-2分子包含SEQIDNO:62的序列(具有氨基酸置换C125A的IL-2N88D)。备选地，可以将第125位置处的半胱氨酸替换为另一个中性氨基酸如丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸，分别产生C125SIL-2、C125TIL-2或C125VIL-2，如美国专利号4,518,584中所述。如其中所述那样，还可以缺失IL-2的N末端丙氨酸残基，产生这类突变体如des-A1C125S或des-A1C125A。备选地或共同地，IL-2分子可以包括正常情况下出现在野生型人IL-2第104位置处的甲硫氨酸由中性氨基酸如丙氨酸替换的突变(参见美国专利号5,206,344)。在人IL-2中的这类种修饰可以提供额外优点，如表达或稳定性增加。包含于本发明融合蛋白中的突变IL-2分子也可以是非糖基化的IL-2分子。例如，当融合蛋白在哺乳动物细胞如CHO或HEK细胞中表达时，消除IL-2分子的O-糖基化位点导致更均一的产物。因此，在某些实施方案中，突变IL-2分子还包含在与人IL-2的残基3相对应的位置处消除IL-2的O-糖基化位点的修饰。在一个实施方案中，在与人IL-2的残基3相对应的位置处消除IL-2的O-糖基化位点的所述修饰是氨基酸置换。示例性氨基酸置换包括T3A、T3G、T3Q、T3E、T3N、T3D、T3R、T3K和T3P。在一个具体实施方案中，所述修饰是氨基酸置换T3A。在一个具体实施方案中，所述突变IL-2分子包含SEQIDNO:64的序列(IL-2T3AN88D)。在一个具体实施方案中，突变IL-2分子包含氨基酸置换T3A、N88D和C125A。在一个具体实施方案中，所述突变IL-2分子包含SEQIDNO:58的序列(IL-2T3AN88DC125A)。在一个实施方案中，与包含两个野生型IL-2分子的相应融合蛋白与IL-2βγ受体的结合相比，本发明的融合蛋与IL-2βγ受体的结合减少至少1.5倍、优选地至少2倍或至少3倍。在一个实施方案中，在25℃通过SPR测量时，本发明的融合蛋与IL-2βγ受体以高于包含两个野生型IL-2分子的相应融合蛋白的KD至少2倍的亲和常数(KD)结合IL-2βγ受体。在一个具体实施方案中，所述IL-2βγ受体是人IL-2βγ受体。在一个实施方案中，本发明的融合蛋白与IL-2α受体的结合约等于包含两个野生型IL-2分子的相应融合蛋白与IL-2α受体的结合。在一个实施方案中，在25℃通过SPR测量时，本发明的融合蛋与IL-2α受体以约等于包含两个野生型IL-2分子的相应融合蛋白的KD的亲和常数(KD)结合IL-2α受体。在一个具体实施方案中，所述IL-2α受体是人IL-2α受体。本文描述了一种通过SPR测量与IL-2βγ受体或IL-2α受体的结合亲和力的方法。根据一个实施方案，使用T200仪(GEHealthcare)在25℃用固定在CM5或链霉亲和素芯片上的IL-2受体，通过表面等离子体共振法测量KD。将亲和常数(KD)计算为koff/kon比。参见，例如，Chen等人,JMolBiol293,865-881(1999)。在一个特定方面，本发明提供一种融合蛋白，所述融合蛋白包含(i)在免疫球蛋白重链中包含氨基酸置换L234A、L235A和P329G(EU编号)的IgG1亚类免疫球蛋白分子，和(ii)包含氨基酸置换N88D的两个突变白介素-2(IL-2)分子，所述分子各自在其N端氨基酸通过肽接头融合于免疫球蛋白重链之一的C端氨基酸。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白分子和所述IL-2分子是人类的。在一个具体实施方案中，所述免疫球蛋白分子包含SEQIDNO:9的重链可变区序列和SEQIDNO:11的轻链可变区序列。在又一个具体实施方案中，所述IL-2分子各自包含SEQIDNO:58的氨基酸序列。在又一个实施方案中，所述肽接头包含氨基酸序列(G4S)3(SEQIDNO:66)。在一个甚至更具体的实施方案中，所述融合蛋白包含与SEQIDNO:50的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的多肽序列和与SEQIDNO:19的序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的多肽序列。如实施例中所示，本发明的融合蛋白选择性地活化调节型T细胞(即基本上不同时活化其他T细胞亚群和/或天然杀伤(NK)细胞)。因此，在一个方面，本发明提供一种包含免疫球蛋白分子和两个突变IL-2分子的融合蛋白，其中所述融合蛋白选择性地活化调节型T细胞超过效应T细胞和NK细胞，特别地超过常规CD4+T细胞、CD8+T细胞和NK细胞。在一个实施方案中，所述融合蛋白活化调节型T细胞超过效应T细胞和NK细胞至少10倍、至少100倍或至少1000倍。在一个实施方案中，所述融合蛋白选择性地活化调节型T细胞超过常规CD4+记忆T细胞。在一个实施方案中，所述融合蛋白活化调节型T细胞超过常规CD4+记忆T细胞至少10倍，至少100倍或至少1000倍。在一个实施方案中，通过测量胞内STAT磷酸化水平、尤其STAT5磷酸化水平确定所述活化。在一个实施方案中，通过流式细胞分析进行所述胞内STAT磷酸化水平测量。在一个实施方案中，所述融合蛋白诱导调节型T细胞中IL-2受体信号传导的EC50值比其诱导效应T细胞和NK细胞中IL-2受体信号传导的EC50值低至少10倍、至少100倍或至少1000倍。在一个实施方案中，所述诱导IL-2受体信号传导是诱导STAT磷酸化。在一个实施方案中，所述融合蛋白诱导调节型T细胞中IL-2受体信号传导的EC50值比其诱导常规CD4+记忆型T细胞中IL-2受体信号传导的EC50值低至少10倍、至少100倍或至少1000倍。在一个实施方案中，所述诱导IL-2受体信号传导是诱导STAT磷酸化。在又一个方面，本发明特别地提供该融合蛋白用于体外或体内选择性活化调节型T细胞。在一个实施方案中，所述用途包括使调节型T细胞与所述融合蛋白在体外或在体内接触。在一个实施方案中，所述用途还包括使其他(非调节型)T细胞与所述融合蛋白接触。在一个实施方案中，所述用途是在体外的并且所述融合蛋白以约10ng/mL或更小，特别地约1ng/mL或更小的浓度使用。在另一个实施方案中，所述使用是在体内的并且所述融合蛋白以约100μg/kg体重或更小、特别地约25μg/kg体重或更小、更特别地约10μg/kg体重或更小的剂量使用(其中“体重”指施用融合蛋白的个体的体重)。本发明也提供一种用于体外或体内选择性活化调节型T细胞的方法，包括使所述调节型T细胞与本发明的融合蛋白接触。在一个实施方案中，所述方法还包括使其他(非调节型)T细胞与所述融合蛋白接触。在一个实施方案中，所述活化包括诱导增殖和/或诱导IL-2受体信号传导。在一个实施方案中，所述方法是在体外的并且所述融合蛋白以约10ng/mL或更小，特别地约1ng/mL或更小的浓度使用。在另一个实施方案中，所述方法是在体内的并且所述融合蛋白以约100μg/kg体重或更小、特别地约25μg/kg体重或更小、更特别地约10μg/kg体重或更小的剂量使用(其中“体重”指施用融合蛋白的个体的体重)。根据前述段落中描述的融合蛋白、用途或方法的某些实施方案，所述活化包含诱导调节型T细胞增殖和/或诱导调节型T细胞中的IL-2受体信号传导。诱导增殖可以例如通过检测胞内增殖标志物Ki-67来测量，如实施例中所述。在一个实施方案中，与未活化的调节型T细胞的增殖相比，由本发明融合蛋白活化的调节型T细胞的增殖增加至少约1.5倍、至少约2倍或至少约3倍。在一个实施方案中，与本发明融合蛋白接触的其他(非调节型)T细胞和/或NK细胞的增殖与不接触所述融合蛋白的相应细胞的增殖相比，增加少于约1.5倍、少于约1.2倍或少于约1.1倍。诱导IL-2受体信号传导可以例如通过检测磷酸化的STAT5来测量，如实施例中所述。在一个实施方案中，与未活化的调节型T细胞中的IL-2受体信号传导相比，由本发明融合蛋白活化的调节型T细胞中的IL-2受体信号传导增加至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍或或至少约5倍。在一个实施方案中，与本发明融合蛋白接触的其他(非调节型)T细胞和/或NK细胞中的IL-2受体信号传导与不接触所述融合蛋白的相应细胞中的IL-2受体信号传导相比，增加少于约1.5倍、或少于约1.2倍或少于约1.1倍。多核苷酸本发明还提供编码如本文所述的融合物或其片段的多核苷酸。本发明的多核苷酸包括与SEQIDNO:10、12、20、51、59、61、63和65中所述的序列(包括其功能性片段或变体)至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的那些多核苷酸。编码本发明融合蛋白的多核苷酸可以作为编码完整融合蛋白的单一多核苷酸表达或作为共表达的多个(例如，两个或更多个)多核苷酸表达。由共表达的多核苷酸编码的多肽可以经例如二硫键或其他手段缔和以形成有功能的融合蛋白。例如，免疫球蛋白的轻链部分可以由不同于免疫球蛋白重链部分的独立多核苷酸编码。当共表达时，重链多肽将与轻链多肽缔和以形成免疫球蛋白。在一个实施方案中，本发明涉及编码免疫球蛋白分子和两个IL-2分子的融合蛋白或其片段的多核苷酸，其中多核苷酸包含了编码如SEQIDNO:9或11中所示可变区序列的序列。在另一个实施方案中，本发明涉及编码免疫球蛋白分子和两个IL-2分子的融合蛋白或其片段的多核苷酸，其中多核苷酸包含了编码如SEQIDNO:19或50中所示多肽序列的序列。在另一个实施方案中，本发明还涉及编码免疫球蛋白分子和两个IL-2分子的融合蛋白或其片段的多核苷酸，其中多核苷酸包含这样的序列，所述序列与SEQIDNO:10、12、20、51、59、61、63或65中所示的核酸序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一。在另一个实施方案中，本发明涉及编码免疫球蛋白分子和两个IL-2分子的融合蛋白或其片段的多核苷酸，其中多核苷酸包含在SEQIDNO:10、12、20、51、59、61、63或65中所示的核酸序列。在另一个实施方案中，本发明涉及编码免疫球蛋白分子和两个IL-2分子的融合蛋白或其片段的多核苷酸，其中多核苷酸包含这样的序列，所述序列编码与SEQIDNO:9或11中所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一的可变区序列。在另一个实施方案中，本发明涉及编码免疫球蛋白分子和两个IL-2分子的融合蛋白或其片段的多核苷酸，其中多核苷酸包含这样的序列，所述序列编码与SEQIDNO:19或50中所示的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一的多肽序列。本发明涵盖一种编码免疫球蛋白分子和两个IL-2分子的融合蛋白或其片段的多核苷酸，其中多核苷酸包含这样的序列，所述序列编码SEQIDNO:9或11的具有保守性氨基酸置换的可变区序列。本发明还涵盖一种编码免疫球蛋白分子和两个IL-2分子的融合蛋白或其片段的多核苷酸，其中多核苷酸包含这样的序列，所述序列编码SEQIDNO:19或50的具有保守性氨基酸置换的多肽序列。在某些实施方案中，多核苷酸或核酸是DNA。在其他实施方案中，本发明的多核苷酸是RNA，例如，为信使RNA(mRNA)形式。本发明的RNA可以是单链的或双链的。重组方法本发明的融合蛋白可以例如通过固态肽合成(例如Merrifield固相合成)或重组生产获得。为了重组生产，将编码融合蛋白(片段)的一个或多个多核苷酸(例如，如上文所述)分离并插入一个或多个载体中以便进一步在宿主细胞中克隆和/或表达。使用常规方法，可以轻易地分离这种多核苷酸并测序。在一个实施方案中，提供包含本发明的一种或多种多核苷酸的载体，优选地表达载体。本领域技术人员熟知的方法可以用来构建表达载体，所述表达载体含有融合蛋白(片段)的编码序列，以及适宜的转录/翻译控制信号。这些方法包括体外重组DNA技术，合成技术和体内重组/遗传重组。参见，例如在Maniatis等人,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,N.Y.(1989)和Ausubel等人,CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingAssociatesandWileyInterscience,N.Y.(1989)中描述的技术。表达载体可以是质粒、病毒的部分，或可以是核酸片段。表达载体包括将编码融合蛋白(片段)的多核苷酸(即编码区)以与启动子和/或其他转录或翻译控制元件有效连接的方式克隆的表达盒。如本文所用，“编码区”是由翻译成氨基酸的密码子组成的核酸的一部分。虽然“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)不翻译成氨基酸，但是如果存在的话，可以将它视为编码区的部分，但是任何侧翼序列，例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子、5'和3'非翻译区等，均不是编码区的部分。两个或更多个编码区可以存在于单一多核苷酸构建体中，例如存在于单一载体上或存在于分立的多核苷酸构建体中，例如存在于分立(不同)的载体上。另外，任何载体可以含有单个编码区，或可以包含两个或更多个编码区，例如，本发明的载体可以编码一种或多种多肽，所述多肽借助蛋白酶剪切作用以翻译后方式或以共翻译方式分离成最终的蛋白质。此外，本发明的载体、多核苷酸或核酸可以编码异源编码区，所述异源编码区与编码本发明融合蛋白(片段)的多核苷酸或变体或其衍生物融合或不融合。异源编码区包括但不限于特定的元件或基序，如分泌信号肽或异源功能性结构域。有效连接是以下情况，此时基因产物(例如多肽)的编码区与一种或多种调节序列以如此方式连接，从而将基因产物的表达置于调节序列的影响或控制下。如果启动子功能的诱导导致编码所需基因产物的mRNA转录并且如果两个DNA片段之间连接的性质不干扰表达调节序列指导基因产物表达的能力或不干扰DNA模板被转录的能力，则这两个DNA片段(如多肽编码区和与之连接的启动子)是“有效连接”的。因而，如果启动子能够实现编码多肽的核酸的转录，则该启动子区与该核酸有效连接。启动子可以是指导DNA仅在预定细胞中大量转录的细胞特异性启动子。除启动子之外的其他转录控制元件，例如增强子、操纵基因、阻遏物和转录终止信号，可以与多核苷酸有效连接以指导细胞特异的转录。本文中公开了合适的启动子和其他转录控制区。多种转录控制区是本领域技术人员已知的。这些包括但不限于在脊椎动物细胞中发挥功能的转录控制区，例如，但不限于，来自巨细胞病毒(例如立即早期启动子，连同内含子-A一起)、猴病毒40(例如早期启动子)和逆转录病毒(如，例如劳斯肉瘤病毒)的启动子和增强子区段。其他转录控制区包括源自脊椎动物基因如肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素和兔α-珠蛋白的那些，以及能够控制真核细胞中基因表达的其他序列。额外的合适转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及诱导型启动子(例如四环素诱导型启动子)。类似地，多种翻译控制元件是本领域普通技术人员已知的。这些包括但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子和源自病毒系统的元件(特别是内部核糖体进入位点，或IRES，也称作CITE序列)。表达盒也可以包括其他特征如复制起点，和/或染色体整合元件如逆转录病毒长末端重复序列(LTR)或腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)。本发明的多核苷酸和核酸编码区可以与编码分泌肽或信号肽的额外编码区连接，所述分泌肽或信号肽指导由本发明多核苷酸编码的多肽分泌。例如，如果需要分泌融合蛋白，则可以将编码信号序列的DNA置于编码本发明融合蛋白或其片段的核酸上游。根据信号假设，由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有一旦已经启动正在增长的蛋白质链跨粗面内质网输出则从成熟蛋白切下的信号肽或分泌前导序列。本领域普通技术人员知晓由脊椎动物细胞分泌的多肽通常具有与多肽N末端融合的信号肽，所述信号肽从翻译的多肽被切下以产生分泌的或“成熟”形式的多肽。在某些实施方案中，使用天然信号肽，例如免疫球蛋白重链或轻链的信号肽，或该序列的功能衍生物，所述功能衍生物保留指导与该序列有效连接的多肽分泌的能力。备选地，可以使用异源哺乳动物信号肽或其功能衍生物。例如，野生型前导序列可以用人组织纤溶酶原激活物(TPA)或小鼠β-葡糖醛酸糖苷酶的前导序列替换。SEQIDNO:39-47中显示了示例性分泌信号肽的氨基酸序列和核苷酸序列。可以在编码融合蛋白(片段)的多核苷酸的内部或末端处包含编码短蛋白质序列的DNA，所述短蛋白质序列可以用来促进稍后的纯化(例如组氨酸标签)或辅助标记融合蛋白。在又一个实施方案中，提供了包含一种或多种本发明多核苷酸的宿主细胞。在某些实施方案中，提供了包含一种或多种本发明载体的宿主细胞。多核苷酸和载体可以分别相对于多核苷酸和载体，单独或以组合方式合并本文中所述的任一特征。在一个这样的实施方案中，宿主细胞包含载体(例如已经用所述载体转化或转染)，所述载体包含编码本发明融合蛋白(部分)的多核苷酸。如本文所用，术语“宿主细胞”指可以工程化以产生本发明融合蛋白或其片段的任何种类的细胞系统。适于复制和支持融合蛋白表达的宿主细胞是本领域熟知的。根据需要，这类细胞可以用特定表达载体转染或转导，并且可以培育大量含有载体的细胞用于接种大规模发酵器以获得足够量的融合蛋白用于临床应用。合适的宿主细胞包括原核微生物，如大肠杆菌，或各种真核细胞，如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、昆虫细胞等。例如，可以在细菌中产生多肽，特别是当不需要糖基化时可以在细菌中产生多肽。在表达后，可以将多肽从细菌细胞糊状物分离于可溶性级分中并且可以进一步纯化多肽。除原核生物之外，真核微生物如丝状真菌或酵母是编码多肽的载体的合适克隆宿主或表达宿主，包括其糖基化途径已经“人源化”的真菌和酵母菌株，导致产生具有部分或完全人类糖基化模式的多肽。见Gerngross,NatBiotech22,1409-1414(2004)和Li等人,NatBiotech24,210-215(2006)。用于表达(糖基化)多肽的合适宿主细胞还源自多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的例子包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴定了可以与昆虫细胞一起使用、尤其用于转染草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞的许多杆状病毒毒株。也可以利用植物细胞培养物作为宿主。见，例如美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。也可以使用脊椎动物细胞作为宿主。例如，适应于悬浮培育的哺乳动物细胞系可以是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他例子是由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或293T细胞，在例如Graham等人,JGenVirol36，59(1977)中所述)，幼仓鼠肾细胞(BHK)，小鼠支持细胞(TM4细胞，在例如Mather，BiolReprod23，243-251(1980)中所述)，猴肾细胞(CV1)，非洲绿猴肾细胞(VERO-76)，人宫颈癌细胞(HELA)，犬肾细胞(MDCK)，布法罗大鼠肝细胞(BRL3A)，人肺细胞(W138)，人肝细胞(HepG2)，小鼠乳腺瘤细胞(MMT060562)，TRI细胞(在例如Mather等人,AnnalsN.Y.AcadSci383，44-68(1982)中所述)，MRC5细胞，和FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括dhfr-CHO细胞(Urlaub等人,ProcNatlAcadSciUSA77,4216(1980))；和骨髓瘤细胞系如YO、NS0、P3X63和Sp2/0。关于适于产生蛋白质的某些哺乳动物宿主细胞系的综述参见例如Yazaki和Wu，MethodsinMolecularBiology，第248卷(B.K.C.Lo编著，HumanaPress，Totowa，NJ)，第255-268页(2003)。宿主细胞包括培养的细胞，例如，培养的哺乳动物细胞、酵母细胞、昆虫细胞、细菌细胞和植物细胞，仅提到数种，还包括含于转基因动物、转基因植物或培养的植物组织或动物组织内部的细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，优选地是哺乳动物细胞，如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾(HEK)细胞或淋巴样细胞(例如，Y0、NS0、Sp20细胞)。本领域已知在这些系统中表达外来基因的标准技术。表达包含免疫球蛋白重链或轻链的多肽的细胞可以如此工程化，从而还表达免疫球蛋白的其他链，从而表达产物是具有重链和轻链的免疫球蛋白。在一个实施方案中，提供了产生本发明融合蛋白的方法，其中所述方法包括在适于表达融合蛋白的条件下培养如本文中提供的宿主细胞，所述宿主细胞包含编码融合蛋白的多核苷酸，并且从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收融合蛋白。在本发明的融合蛋白中，各组分(免疫球蛋白分子和IL-2分子)以遗传方式彼此融合。可以如此设计融合蛋白，从而其组件彼此直接融合或通过接头序列间接融合。接头的组成和长度可以根据本领域熟知的方法确定并且可以对功效进行测试。如果需要，也可以包括额外的序列以并入切割位点以便分隔融合蛋白的各个组分，例如内肽酶识别序列。在某些实施方案中，本发明的融合蛋白至少包含能够与抗原结合的免疫球蛋白可变区。可变区可以形成天然或非天然存在的抗体及其片段的部分，并且可变区可以衍生自天然或非天然存在的抗体及其片段。产生多克隆抗体和单克隆抗体的方法是本领域熟知的(见例如Harlow和Lane，\Antibodies,alaboratorymanual\,ColdSpringHarborLaboratory,1988)。非天然存在的抗体可以使用固相肽合成法构建，可以重组产生(例如，如美国专利号4,186,567中所述)，或可以例如通过筛选包含可变重链和可变轻链的组合文库获得(见例如授予McCafferty的美国专利号5,969,108)。任何动物物种的免疫球蛋白可以用于本发明中。可用于本发明中的非限制性免疫球蛋白可以是鼠源、灵长类源或人源的。如果融合蛋白意欲用于人类，则可以使用嵌合形式的免疫球蛋白，其中该免疫球蛋白的恒定区来自人类。也可以根据本领域熟知的方法制备人源化或完全人形式的免疫球蛋白(见例如授予Winter的美国专利号5,565,332)。人源化可以通过各种方法实现，所述方法包括但不限于(a)在保留或不保留关键构架残基(例如对保留良好抗原结合亲和力或抗体功能重要的那些残基)的情况下，将非人类(例如，供体抗体)CDR移植到人类(例如受体抗体)构架和恒定区上，(b)仅将非人类特异性决定区(SDR或a-CDR；对抗体-抗原相互作用至关重要的残基)移植到人构架和恒定区上，或(c)移植整个非人类可变结构域，但是通过更换表面残基用人样部分“掩蔽”它们。人源化抗体和制造它们的方法例如在Almagro和Fransson,FrontBiosci13,1619-1633(2008)中综述，并且例如还在Riechmann等人,Nature332,323-329(1988)；Queen等人,ProcNatlAcadSciUSA86,10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Jones等人,Nature321,522-525(1986)；Morrison等人,ProcNatlAcadSci81,6851-6855(1984)；Morrison和Oi,AdvImmunol44,65-92(1988)；Verhoeyen等人,Science239,1534-1536(1988)；Padlan,MolecImmun31(3),169-217(1994)；Kashmiri等人,Methods36,25-34(2005)(描述SDR(a-CDR移植)；Padlan,MolImmunol28,489-498(1991)(描述“表面重塑”)；Dall'Acqua等人,Methods36,43-60(2005)(描述“FR改组”)；和Osbourn等人,Methods36,61-68(2005)和Klimka等人,BrJCancer83,252-260(2000)(描述针对FR改组的“导向选择”方案)中描述。本发明的特定免疫球蛋白是人免疫球蛋白。人抗体和人可变区可以使用本领域已知的多种技术产生。人抗体总体上在vanDijk和vandeWinkel,CurrOpinPharmacol5,368-74(2001)和Lonberg,CurrOpinImmunol20,450-459(2008)中描述。人可变区可以形成通过杂交瘤方法产生的人单克隆抗体的部分，并且人可变区可以衍生自所述人单克隆抗体(见例如MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications(单克隆抗体生产技术及应用)，第51-63页(MarcelDekker,Inc.,NewYork,1987))。人抗体和人可变区也可以通过施用免疫原至转基因动物制备，其中所述转基因动物已经被修饰以反应于抗原攻击而产生完整人抗体或具有人可变区的完整抗体(见例如Lonberg,NatBiotech23,1117-1125(2005)。也可以通过分离从人衍生的噬菌体展示文库中选择的Fv克隆可变区序列产生人抗体和人可变区(见例如，Hoogenboom等人,引自MethodsinMolecularBiology178，1-37(O'Brien等人编著,HumanPress,Totowa,NJ,2001)；和McCafferty等人,Nature348,552-554；Clackson等人,Nature352,624-628(1991))。噬菌体一般将抗体片段展示为单链Fv(scFv)片段或展示为Fab片段。在某些实施方案中，根据例如在PCT公开WO2012/020006(参见涉及亲和力成熟的实施例)或美国专利申请公开号2004/0132066中公开的方法，将包含于本发明融合蛋白中的免疫球蛋白工程化以具有增强的结合亲和力，所述文献的完整内容因而通过引用的方式并入本文。本发明的融合蛋白与特定抗原决定簇结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其他技术，例如表面等离子体共振技术(Liljeblad等人,GlycoJ17,323-329(2000))和传统结合测定法(Heeley，EndocrRes28,217-229(2002))测量。竞争测定法可以用来鉴定与参考抗体竞争结合至特定抗原的抗体。在某些实施方案中，这种竞争性抗体与参考抗体结合的相同表位(例如线性表位或构象表位)结合。用于绘制与抗体结合的表位的详细示例性方法在Morris(1996)“EpitopeMappingProtocols(表位绘制法)”,引自MethodsinMolecularBiology第66卷(HumanaPress,Totowa,NJ)中提供。在示例性竞争测定法中，将固定的抗原在溶液中温育，所述溶液包含与该抗原结合的第一标记抗体和测试与第一抗体竞争结合至该抗原的能力的第二未标记抗体。第二抗体可以存在于杂交瘤上清液中。作为对照，将固定的抗原在包含第一标记抗体但是不包含第二未标记抗体的溶液中温育。在允许第一抗体与该抗原结合的条件下温育后，移除过多的未结合的抗体，并且测量与固定抗原结合的标记物的量。如果与固定抗原结合的标记物的量在测试样品中相对于对照样品实质降低，则这表示第二抗体正在与第一抗体竞争结合至该抗原。参见Harlow和Lane(1988)Antibodies:ALaboratoryManual第14章(ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，NY)。如本文所述那样制备的融合蛋白可以通过现有已知的技术如高效液相色谱、离子交换色谱、凝胶电泳、亲和层析、大小排阻层析等纯化。用来纯化特定蛋白质的实际条件将部分取决于诸多因素，如净电荷、疏水性、亲水性等并且将是本领域技术人员显而易见的。为了亲和层析纯化抗体，可以使用与融合蛋白结合的配体、受体或抗原。例如，对于本发明融合蛋白的亲和层析纯化，可以使用具有蛋白A或蛋白G的基质。基本上如实施例中所述，依次的蛋白A或G亲和层析和大小排阻层析可以用来分离融合蛋白。融合蛋白的纯度可以由多种熟知分析方法的任一种方法确定，所述熟知分析方法包括凝胶电泳、高压液相色谱等。例如，显示了如实施例中所述那样表达的融合蛋白是完整的并且正确装配，如还原的和非还原的SDS-PAGE所展示(参见例如图4)。组合物、制剂和施用途径在又一个方面，本发明提供了包含本文提供的任何融合蛋白的药物组合物，例如，用于下述任一种治疗方法中。在一个实施方案中，药物组合物包含本文提供的任何融合蛋白和可药用载体。在另一个实施方案中，药物组合物包含本文提供的任何融合蛋白和至少一种额外治疗药，例如，如下文描述。进一步提供一种产生处于适于体内施用形式的本发明融合蛋白的方法，所述方法包括(a)获得本发明的融合蛋白，和(b)将融合蛋白与至少一种可药用载体配制，因而配制了用于体内施用的融合蛋白制剂。本发明的药物组合物包含治疗有效量的溶解或分散于可药用载体中的一种或多种融合蛋白。短语“可药用或药理学可接受的”指在使用的剂量和浓度通常对接受者无毒，即施用至动物(根据需要，例如人)时不产生不良、变应性或其他不利反应的分子实体和组合物。根据本公开，制备含有至少一种融合蛋白并任选地含有额外有效成分的药物组合物将是本领域技术人员已知的，如Remington'sPharmaceuticalSciences,第18版,MackPrintingCompany,1990所例举，所述文献通过引用方式并入本文。另外，对于动物(例如，人类)施用，应当理解制品应当满足如FDA生物学标准办公室或其他国家的相应权力机关所要求的无菌性、致热原性、总体安全性和纯度标准。优选的组合物是冻干制剂或水溶液。如本文所用，“可药用载体”包括任何和全部溶剂、缓冲剂、分散介质、包衣剂、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗细菌药、抗真菌药)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、抗氧化剂、蛋白质、药物、药物稳定剂、聚合物、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、矫味剂、染料、这类相似材料及其组合，如本领域普通技术人员所已知(见例如，Remington'sPharmaceuticalSciences,第18版,MackPrintingCompany,1990,第1289-1329页，所述文献通过引用方式并入本文)。除了任何常规载体与有效成分不相容的情况之外，构思了载体在治疗组合物或药物组合物中的用途。该组合物可以包含不同类型的载体，这取决于它是否将以固态、液态或气溶胶形式施用及作为注射剂对这类施用途径而言它是否需要是无菌的。可以将本发明的融合蛋白(和任何额外治疗药)通过如本领域普通技术人员将会已知的任何方法或任何方法组合适用(参见，例如Remington'sPharmaceuticalSciences，第18版，MackPrintingCompany，1990，通过引用方式并入本文)。肠胃外施用，尤其静脉内注射，是最常使用的，用于施用多肽分子，如本发明的融合蛋白。肠胃外组合物包含设计成通过注射例如皮下、真皮内、病灶内、静脉内、动脉内、肌内、鞘内或腹膜内注射施用的那些组合物。对于注射剂，可以将本发明的融合蛋白在水溶液中、优选地在生理相容性缓冲液如Hank溶液、林格溶液或生理盐水中配制。所述溶液可以含有配制剂如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。备选地，融合蛋白可以处于用前与合适溶媒(例如，无菌无热原水)构成的粉末形式。通过以下方式制备无菌可注射溶液剂：将本发明的融合蛋白按要求的量，根据需要连同下文列举的多种其他成分一起并入适宜的溶剂中。可以例如通过借助无菌滤膜过滤轻易地实现无菌性。通常，通过将多种消毒的有效成分并入无菌溶媒中来制备分散体，所述无菌溶媒含有基础分散介质和/或其他成分。在用于现场制备无菌可注射溶液剂、混悬剂或乳剂的无菌粉末情况下，优选的制备方法是真空干燥或冷冻干燥技术，所述技术产生有效成分的粉末，外加来自其事先无菌过滤的液体介质中的任何额外所需成分。如果需要，应当合适地缓冲液体介质并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂在注射之前等渗。组合物必须在制造和储存条件下是稳定的；因此，受到保护免遭免微生物如细菌和真菌的污染作用。可以理解应当保持内毒素污染最小，处于安全水平，例如，小于0.5ng/mg蛋白质。合适的可药用载体包括但不限于：缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸和其他有机酸；抗氧化剂(包括抗坏血酸和甲硫氨酸)；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵、苯扎溴铵；苯酚、丁醇或苄醇；烷基尼泊金酯如尼泊金甲酯或丙酯；儿茶酚；雷琐辛；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他糖包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖如蔗糖、甘露糖、海藻糖或山梨糖；形成盐的反离子如钠；金属复合物(例如，Zn-蛋白质复合物)和/或非离子表面活性剂如聚乙二醇(PEG)。水性注射混悬剂可以含有增加混悬剂黏度的化合物，如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖等。任选地，混悬剂也可以含有合适的稳定剂或增加化合物的溶解度以允许制备高度浓缩的溶液剂的物质。另外，活性化合物的混悬剂可以制备为适宜的油性注射混悬剂。合适的亲脂溶剂或运载体包括脂肪油如芝麻油，或合成性脂肪酸酯，如油酸乙酯或甘油三酯，或脂质体。包含本发明融合蛋白的药物组合物可以按本领域已知的任何方式制造，例如，通过常规混合、溶解、乳化、包囊化、包埋或冻干法制造。药物组合物可以使用一种或多种促进蛋白质加工成可以按药学方式使用的制品的生理可接受载体、稀释剂、赋形剂或辅助剂以常规方式配制。合适的制剂取决于所选的施用途径。可以将融合蛋白以游离酸或碱、中性或盐形式配制到组合物中。可药用盐是基本上保留游离酸或碱的生物活性的盐。这些盐包括酸加成盐，例如，与蛋白质组合物的游离氨基形成的或与无机酸例如氢氯酸或磷酸或这类有机酸如乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸形成的那些盐。与游离羧基形成的盐也可以源自无机碱例如，氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁或这类有机碱如异丙胺、三甲胺、组氨酸或普鲁卡因。药用盐在含水溶剂和其他质子溶剂中较相应的游离碱形式而言溶解性更高。治疗方法和组合物本文提供的任何融合蛋白可以用于治疗方法中。为了用于治疗方法中，本发明的融合蛋白将以符合良好医学实践的方式配制、投予和施用。在这种情况下考虑的因素包括正在治疗的具体病症、正在治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床状况、病症原因、送递药物的部位、施用方法、施用计划和医疗执业者已知的其他因素。在一个方面，提供用作药物的本发明融合蛋白。在其他方面，提供用于治疗疾病的本发明融合蛋白。在某些实施方案中，提供用于治疗方法中的本发明融合蛋白。在一个实施方案中，本发明提供如本文所述的融合蛋白用于治疗有需求的个体中的疾病。在某些实施方案中，本发明提供融合蛋白用于治疗患有疾病的个体的方法中，所述方法包括向该个体施用治疗有效量的融合蛋白。在某些实施方案中，待治疗的疾病是自身免疫疾病。示例性自身免疫疾病包括1型糖尿病、银屑病、哮喘、类风湿性关节炎、炎性肠病、节段性回肠炎、溃疡性结肠炎、系统性红斑狼疮(SLE)和多发性硬化。在一个实施方案中，疾病是移植排斥或移植物抗宿主病。在一个具体实施方案中，疾病选自1型糖尿病、炎性肠病、节段性回肠炎、溃疡性结肠炎、SLE和多发性硬化。在一个更具体的实施方案中，疾病是1型糖尿病。在另一个具体实施方案中，疾病是炎性肠病。在另一个具体实施方案中，疾病是多发性硬化。在其他实施方案中，疾病是哮喘、肺纤维化或阻塞性肺病。在又一个实施方案中，疾病是心血管疾病、尤其动脉粥样硬化和急性冠状动脉综合征。在其他实施方案中，疾病是过敏性疾病、尤其食物过敏。在某些实施方案中，该方法还包括向个体施用治疗有效量的至少一种额外的治疗药，例如，如果待治疗的疾病是自身免疫疾病，施用免疫抑制剂。根据以上任一个实施方案的“个体”是哺乳动物，优选地是人类。在又一个方面，本发明提供本发明的融合蛋白在制造或制备治疗有需求的个体中疾病的药物中的用途。在一个实施方案中，该药物用于治疗疾病的方法中，所述方法包括向患有该疾病的个体施用治疗有效量的药物。在某些实施方案中，待治疗的疾病是自身免疫疾病。在一个实施方案中，疾病是移植排斥或移植物抗宿主病。在一个具体实施方案中，疾病选自1型糖尿病、炎性肠病、节段性回肠炎、溃疡性结肠炎、SLE和多发性硬化。在一个更具体的实施方案中，疾病是1型糖尿病。在另一个具体实施方案中，疾病是炎性肠病。在另一个具体实施方案中，疾病是多发性硬化。在其他实施方案中，疾病是哮喘、肺纤维化或阻塞性肺病。在又一个实施方案中，疾病是心血管疾病、尤其动脉粥样硬化和急性冠状动脉综合征。在其他实施方案中，疾病是过敏性疾病、尤其食物过敏。在一个实施方案中，该方法还包括向个体施用治疗有效量的至少一种额外的治疗药，例如，如果待治疗的疾病是自身免疫疾病，施用免疫抑制剂。根据以上实施方案中任一个实施方案的“个体”可以是哺乳动物，优选地是人。在又一个方面，本发明提供一种用于个体中治疗疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的本发明融合蛋白。在一个实施方案中，将组合物施用至所述个体，所述组合物包含处于可药用形式的本发明融合蛋白。在某些实施方案中，待治疗的疾病是自身免疫疾病。在一个实施方案中，疾病是移植排斥或移植物抗宿主病。在一个具体实施方案中，疾病选自1型糖尿病、炎性肠病、节段性回肠炎、溃疡性结肠炎、SLE和多发性硬化。在一个更具体的实施方案中，疾病是1型糖尿病。在另一个具体实施方案中，疾病是炎性肠病。在另一个具体实施方案中，疾病是多发性硬化。在其他实施方案中，疾病是哮喘、肺纤维化或阻塞性肺病。在其他实施方案中，疾病是过敏性疾病、尤其食物过敏。在又一个实施方案中，疾病是心血管疾病、尤其动脉粥样硬化和急性冠状动脉综合征。在某些实施方案中，该方法还包括向个体施用治疗有效量的至少一种额外的治疗药，例如，如果待治疗的疾病是自身免疫疾病，施用免疫抑制剂。根据以上实施方案中任一个实施方案的“个体”可以是哺乳动物，优选地是人。在一些实施方案中，将有效量的本发明融合蛋白施用至细胞。在其他实施方案中，将治疗有效量的本发明融合蛋白施用至个体以治疗疾病。对于预防或治疗疾病，本发明融合蛋白的适宜剂量(当单独或与一种或多种其他额外治疗药组合使用时)将取决于待治疗疾病的类型、施用途径、患者体重、融合蛋白的类型、疾病的严重程度和过程、融合蛋白是否出于预防或治疗目的施用、既往或伴同治疗性介入、患者的临床史和对融合蛋白的应答以及主治医师的决定。在任何情况下，负责施用的执业者将决定用于单个受试者的组合物中的有效成分浓度及适宜剂量。本文中构思了各种给药方案，包括但不限于单次或在各种时间点多次施用、快速浓注施用和脉冲输注。将融合蛋白适当地按一次或经过一系列治疗施用至患者。取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)融合蛋白可以是向患者施用的起始候选剂量，无论是否例如通过一个或多个单独施用或通过连续输注来施用。取决于上文提到的因素，一个常见的每日剂量可能是从约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于在几日或更长时间范围内重复施用，取决于病状，治疗通常将持续直至对疾病症状的所需抑制作用出现。融合蛋白的一个示例性剂量处于约0.005mg/kg至约10mg/kg范围内。在其他非限制性例子中，剂量还可以包括每次施用约1μg/kg体重、约5μg/kg体重、约10μg/kg体重、约50μg/kg体重、约100μg/kg体重、约200μg/kg体重、约350μg/kg体重、约500μg/kg体重、约1mg/kg体重、约5mg/kg体重、约10mg/kg体重、约50mg/kg体重、约100mg/kg体重、约200mg/kg体重、约350mg/kg体重、约500mg/kg体重至约1000mg/kg体重或更多，以及其中可推导的任何范围。在从本文中列出的数值可推导的范围的非限制性例子中，基于上文描述的数值，可以施用约5mg/kg体重至约100mg/kg体重、约5μg/kg体重至约500mg/kg体重等的范围。因此，可以向患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、5.0mg/kg或10mg/kg的一种或多种剂量(或其任意组合)。这类剂量可以间歇地施用，例如，每周或每3周(例如，从而，患者接受从约2个至约20个或例如约6个剂量的融合蛋白)。可以施用较高的初始负荷剂量，随后是一个或多个较低剂量。然而，可以使用其他剂量方案。通过常规技术和测定法容易地监测这种疗法的进程。本发明的融合蛋白通常将按有效实现预期目的量使用。为了用来治疗或预防疾病状态，以治疗有效量施用或施加本发明的融合蛋白或其药物组合物。确定治疗有效量完全处于本领域技术人员的能力范围内，尤其是根据本文所提供的详细公开内容。对于全身性施用，可以从体外测定法初步估计治疗有效剂量，如细胞培养测定法。可以在动物模型中配制某个剂量以实现包括IC50的循环浓度范围，如细胞培养物中所测定。这种信息可以用来更精确地确定用于人类中的剂量。也可以使用本领域熟知的技术，从体内数据(如动物模型)估计初始剂量。本领域普通技术人员可以基于动物数据轻易地优化对人类施用。可以个体地调整剂量数量和间隔时间以提供足以维持治疗效果的融合蛋白的血浆水平。注射施用的患者常规剂量是约0.1至50mg/kg/日，一般约0.5至1mg/kg/日。治疗有效的血浆水平可以通过每日施用多个剂量实现。可以测量血浆中的水平，例如，通过HPLC测量。在局部施用或选择性摄入的情况下，融合蛋白的有效局部浓度可以与血浆浓度不相关。本领域技术人员能够在无需过多实验的情况下优化治疗有效的局部剂量。本文所述的融合蛋白的治疗有效剂量通常在不造成明显毒性的情况下提供治疗益处。可以通过标准药学流程在细胞培养物或实验动物中确定融合蛋白的毒性和治疗功效。细胞培养测定法和动物研究可以用来测定LD50(对50％群体致死的剂量)和ED50(50％群体中治疗有效的剂量)。毒性作用和治疗作用之间的剂量比是治疗指数，它可以表示为LD50/ED50比。优选显示出大治疗指数的融合蛋白。在一个实施方案中，本发明的融合蛋白显示出高治疗指数。从细胞培养物测定法和动物研究中获得的数据可以在配制适用于人类中的剂量范围时使用。该剂量优选地位于毒性低或无毒性情况下包括ED50的一系列循环浓度范围内。剂量可以在这个范围内部变动，这取决于多种因素，例如，所用的剂型、所用的施用途径、受试者状况等。确切配方、施用途径和剂量可以由各位医师根据患者的状况选择(参见，例如Fingl等人,1975,引自：ThePharmacologicalBasisofTherapeutics,第1章,第1页，所述文献通过引用方式完整并入本文)。用本发明融合蛋白治疗的患者的主治医生将知道如何和何时因所致毒性、器官功能障碍等而终止、中断或调节施用。反过来，如果临床反应不充分(不包括毒性)，主治医师也会知道将治疗调整到更高的水平。治疗目的病状时所施用剂量的大小将随待治疗病状的严重性、随施用途径等变动。病状的严重性可以例如部分地通过标准预后评价方法进行评价。另外，剂量和或许给药频率也将根据各位患者的年龄、体重和反应而变动。其他药物和治疗本发明的融合蛋白可以在疗法中与一种或多种药剂组合施用。例如，本发明的融合蛋白可以与至少一种额外的治疗剂共施用。术语“治疗剂”涵盖为了治疗需要这种治疗的个体中的症状或疾病所施用的任何药剂。这类种额外治疗剂可以包含适于正在治疗的特定适应症的任何有效成分，优选地具有互补活性的彼此无不利影响的那些。在某些实施方案中，额外的治疗剂是免疫抑制药。此类其他药剂适当地以有效用于预期目的的量组合存在。这类其他药剂的有效量取决于所用融合蛋白的量、疾病类型或疗法和上文讨论的其他因素。融合蛋白通常以与本文所述相同的剂量并且采用与本文所述相同的施用途径使用，或以约1％至99％的本文所述剂量使用，或以经验地/临床上确定适宜的任何剂量和任何途径使用。上文所示的这类联合疗法涵盖联合施用(其中在相同或独立的组合物中包括两种或更多种治疗药)，和独立施用，在这种情况下，本发明融合蛋白的施用可以在施用额外的治疗药和/或辅药之前、同时和/或之后进行。制造物在本发明的另一个方面，提供制造物，所述制造物含有上文描述的可用于治疗、预防和/或诊断病症的物质。该制造物包括容器和或在该容器上或与之结合的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶、小药瓶、注射器、静脉内输液袋等。容器可以从多种材料如玻璃或塑料中形成。该容器容纳了本身或与另一种组合物组合时有效治疗、预防和/或诊断病症的组合物并且可以具有无菌接入口(例如该容器可以是静脉内输液袋或是具有皮下注射针头可穿透的瓶塞的小药瓶)。在组合物中的至少一种活性物质是本发明的融合蛋白。标签或包装插页说明该组合物用于治疗选择的病状。另外，制造物可以包含(a)其中含有组合物的第一容器，其中所述组合物包含本发明的融合蛋白；和(b)其中含有组合物的第二容器，其中所述组合物包含其他治疗药。在本发明的这个实施方案中制造物还可以包含指示组合物可以用来治疗特定病状的包装插页。备选地或额外地，该制造物可以还包含第二(或第三)容器，其包含可药用缓冲剂，如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格溶液和葡萄糖溶液。它可以还包括从商业和用户观点看受欢迎的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、滤器、针头和注射器。实施例以下是本发明的方法和组合物的例子。应当理解，鉴于上文提供的一般性描述，可以实施多种其他实施方案。重组DNA技术如Sambrook等人,Molecularcloning:Alaboratorymanual；ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork,1989中所述的标准方法用来操作DNA。根据制造商的说明使用分子生物学试剂。关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息在Kabat,E.A.等人,(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，第5版，NIH出版编号91-3242中给出。DNA测序通过双链测序法测定DNA序列。基因合成在需要的情况下，使用适宜的模板通过PCR产生目的基因区段，或由GeneartAG(雷根斯堡，德国)从合成性寡核苷酸和PCR产物，通过自动化基因合成法合成目的基因区段。在精确基因序列不可获得的情况下，基于来自最接近同源物的序列设计寡核苷酸引物并且通过RT-PCR从源自适宜组织的RNA分离基因。将旁侧分布有单一限制性核酸内切酶切割位点的基因区段克隆至标准克隆/测序载体中。从转化的细菌纯化出质粒DNA并且通过紫外光谱法测定浓度。通过DNA测序证实亚克隆基因片段的DNA序列。基因区段设计成具有合适的限制性位点以允许亚克隆至相应的表达载体中。全部构建体均设计成具有编码前导肽的5'末端DNA序列，所述前导肽在真核细胞中引导蛋白质分泌。SEQIDNO:39-47给出示例性前导肽和编码它们的多核苷酸序列。IL-2Rβγ亚基-Fc融合物和IL-2Rα亚基Fc融合物的制备为了研究IL-2受体结合亲和力，产生了允许异二聚IL-2受体表达的工具。IL-2受体的β-亚基与Fc分子融合，所述的Fc分子经工程化以利用“结入扣”技术(Merchant等人,NatBiotech.16，677-681(1998))使(Fc(扣))(参见SEQIDNO:21和22(人)、SEQIDNO:27和28(小鼠)和SEQIDNO:33和34(食蟹猴))异二聚化。IL-2受体的γ-亚基随后与Fc(结)变体(参见SEQIDNO:23和24(人)，SEQIDNO:29和30(小鼠)和SEQIDNO:35和36(食蟹猴))融合，所述变体与Fc(扣)异二聚化。这种异二聚Fc-融合蛋白随后作为底物用于分析IL-2/IL-2受体相互作用。将IL-2Rα-亚基作为具有AcTev切割位点和AviHis标签(SEQIDNO:25和26(人)、SEQIDNO:31和32(小鼠)和SEQIDNO:37和38(食蟹猴))的单体链表达。将各IL-2R亚基在HEKEBNA293细胞中采用(对于IL-2Rβγ亚基构建体)血清和(α-亚基构建体)不采用血清的情况下瞬时表达。IL-2Rβγ亚基构建体在蛋白A(GEHealthcare)上、接着在大小排阻层析(GEHealthcare，Superdex200)上纯化。IL-2Rα-亚基借助His标签在NiNTA柱(Qiagen)上，随后在大小排阻层析(GEHealthcare，Superdex75)上纯化。在SEQIDNO:21-38中给出各种受体构建体的氨基酸序列和相应核苷酸序列。融合蛋白的制备将DNA序列通过基因合成和/或经典分子生物学技术产生并且亚克隆至哺乳动物表达载体中，处于MPSV启动子控制下并位于合成的聚腺苷酸化位点上游，每种载体携EBVOriP序列。使用磷酸钙转染法，通过用哺乳动物表达载体共转染指数生长的HEK293-EBNA细胞产生如下文实施例中所用的融合蛋白。备选地，通过聚乙烯亚胺(PEI)用相应的表达载体转染悬浮生长的HEK293细胞。备选地，稳定转染的CHO细胞汇集物或CHO细胞克隆用于无血清培养基中的产生。随后，从上清液纯化融合蛋白。简而言之，通过一个亲和步骤用20mM磷酸钠，20mM柠檬酸钠pH7.5中平衡的蛋白A柱(HiTrapProtA，GEHealthcare)纯化融合蛋白。在装载上清液后，将该柱首先用20mM磷酸钠，20mM柠檬酸钠，pH7.5洗涤并随后用13.3mM磷酸钠，20mM柠檬酸钠，500mM氯化钠，pH5.45洗涤。将融合蛋白用20mM柠檬酸钠，100mM氯化钠，100mM甘氨酸，pH3或10mM柠檬酸钠pH3.0洗脱。将级分用0.5MNa2HPO4pH8.0(1:10)中和、汇集并在最终配制缓冲液20mM组氨酸，140mMNaCl，pH6.0中通过大小排阻层析(HiLoad16/60Superdex200,GEHealthcare或HiLoad26/60Superdex200,GEHealthcare)纯化。通过使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，在280nm测量光密度(OD)确定纯化蛋白质样品的蛋白质浓度。还基于氨基酸序列测定分子量。在还原剂(5mM1,4-二硫苏糖醇)存在和不存在下通过SDS-PAGE并用考马斯蓝(SimpleBlueTMSafeStain，Invitrogen)染色，分析融合蛋白的纯度和分子量。根据制造商的说明使用预制凝胶系统(Invitrogen，美国)(4-20％Tris-甘氨酸凝胶或3-12％Bis-Tris)。备选地，根据制造商的说明，使用CaliperLabChipGXII(CaliperLifescience)，通过CE-SDS分析法在还原剂存在和不存在下分析分子的纯度和分子量。在25℃使用Superdex20010/300GL大小排阻分析柱(GEHealthcare)在2mMMOPS，150mMNaCl，0.02％NaN3，pH7.3运行缓冲液中分析融合蛋白样品的聚集物含量。备选地，在25℃使用TSKgelG3000SWXL分析性大小排阻柱(Tosoh)在25mMK2HPO4、125mMNaCl、200mML-精氨酸单盐酸盐、0.02％(w/v)NaN3，pH6.7运行缓冲液中分析抗体样品的聚集物含量。图1、2、3、4和5中分别显示纯化和表征DP47GSIgG-IL-2、DP47GSIgG-(IL-2)2、DP47GSIgG-IL-2N88D，DP47GSIgG-(IL-2N88D)2和DP47GSIgG-(IL-2E95A)2构建体的结果。对IL-2受体的亲和力通过表面等离子体共振(SPR)在BIAcoreT200(GEHealthcare)上针对人、鼠和食蟹猴IL-2Rβγ异二聚体，使用重组IL-2Rβγ异二聚体在以下条件下测定融合蛋白的亲和力：配体：固定在SA芯片(固定化水平分别是194、114和116RU)上的生物素酰化人、鼠和食蟹猴IL-2Rβ结γ扣异二聚体；分析物：DP47GSIgG-IL-2(参见SEQIDNO:13、15和19)、DP47GSIgG-(IL-2)2(参见SEQIDNO:17和19)、DP47GSIgG-IL-2N88D(参见SEQIDNO:15、19和48)、DP47GSIgG-(IL-2N88D)2(参见SEQIDNO:19和50)、和DP47GSIgG-(IL-2E95A)2(参见SEQIDNO:19和52)；温度：25℃；缓冲剂：HBS-EP；分析物浓度：100nM降至1.2nM(1:3稀释)，流速：30μl/分钟，结合：120秒，解离：对2个最高浓度600秒和对较低浓度120秒，再生：3MMgCl260秒，拟合：1:1朗格缪尔结合模型，RI≠0，Rmax＝局部。基于动力学速率常数kon和koff测定亲和力。还针对人、鼠和食蟹猴IL-2Rα-亚基，使用重组单体IL-2Rα-亚基在以下条件下测定融合蛋白的亲和力：配体：通过胺偶联作用固定在CM5芯片(固定化水平分别是240、245和220RU)上的人、鼠和食蟹猴IL-2Rα-亚基；分析物：DP47GSIgG-IL-2(参见SEQIDNO:13、15和19)、DP47GSIgG-(IL-2)2(参见SEQIDNO:17和19)、DP47GSIgG-IL-2N88D(参见SEQIDNO:15、19和48)、DP47GSIgG-(IL-2N88D)2(参见SEQIDNO:19和50)、和DP47GSIgG-(IL-2E95A)2(参见SEQIDNO:19和52)；温度：25℃；缓冲剂：HBS-EP；分析物浓度：300nM降至0.41nM(1:3稀释)，流速：30μl/分钟，结合：120秒，解离：180秒；再生：10mM甘氨酸pH1.5持续60秒。通过稳态分析法测定亲和力。表1中给出了基于IL-2Rβγ异二聚体的动力学和IL-2Rα-亚基的稳态的亲和力测量结果。表1.融合蛋白与IL-2Rβγ和IL-2Rα的结合。人DP47GSIgG–IL-2融合物和其突变体不仅与3种不同的人IL-2受体链α、β和γ结合，还与来自食蟹猴和小鼠的相应受体链结合，不过平均而言，亲和力倾向于对后两个物种略微较低。这些细胞因子融合物对人α链和食蟹猴α链的亲和力是可比较的，对于携带仅一个细胞因子部分的分子，与人α链相比，观察到对鼠α链约2倍的亲和力差异。对于具有两个细胞因子部分的分子，这种差异不存在，很可能因亲合力所致。DP47GSIgG-IL-2和DP47GSIgG-IL-2N88D对α链的亲和力理论上应当相等，因为N88D突变不应当影响α链的界面。N88位于面对IL-2受体β链的界面中并且诱变成D导致亲和力降低，这一点能够比较DP47GSIgG-IL-2和DP47GSIgG-IL-2N88D与全部三个物种的IL-2Rβγ的结合而观察到(分别是0.15nM、0.60nM和0.85nM对0.93nM、1.3nM和2.4nM)。对于至少针对人IL-2Rβγ的携带两个突变的IL-2细胞因子的DP47GSIgG-(IL-2N88D)2，这种差异较不明显，这很可能因为亲合力所致。DP47GSIgG-(IL-2)2和DP47GSIgG-(IL-2E95A)2在与全部三个物种的IL-2Rβγ结合方面显示出非常相似的亲合力。虽然E95也位于面对IL-2受体β链的界面中，但是至少当这两个突变体与IgG融合时，诱变成A未导致亲合力显著降低。在免疫细胞上表达IL-2受体高亲和力三聚体IL-2受体由α链(IL-2RA，CD25)、β链(IL-2RB，CD122)和γ链(IL-2RG，CD132)组成并且具有约10pM的KD。单一CD25仅对IL-2具有低亲和力(KD约10nM)。在IL-2RA不存在的情况下在某些细胞类型上表达的IL-2RB/IL-2RG二聚体也结合IL-2但以中等亲和力(KD约1nM)结合。借助IL-2受体的信号传导由IL-2RB链和IL-2RG链介导。从晶体结构分析获知，IL-2RA似乎不接触IL-2RB或IL-2RG。已经提出三聚体受体协同性的基础是CD25在细胞表面处捕获IL-2以呈递至IL-2RB和IL-2RG时熵减少，或备选地，CD25诱导的IL-2构象改变出现，因此使复合物稳定。在FOXP3+调节型CD4+T细胞中，与受体β和γ链相比，存在大的化学计量性IL-2RA过量，从而支持以下假设：α链的二聚体或甚至更大复合物辅佐IL-2结合作用。还存在以下证据：一个细胞上的CD25能够将IL-2以高亲和力胞间相互作用呈递给另一个细胞上的IL-2RB/IL-2RG二聚体，强调了构成高亲和力IL-2受体的三条链之间的独特关系。通过FACS测定在CD4+Treg亚群、NK细胞亚群和NKT细胞上以及CD4+和CD8+常规T细胞亚群上的CD25(IL-2RA)和CD122(IL-2RB)表达(图6和图7)。细胞表面标志物用来定义CD4+Treg亚群、NKT细胞和NK细胞(图6)。为了优化CD25和CD122的染色，不进行胞内FoxP3染色。简而言之，使用健康志愿者捐赠的150μl血液，将荧光抗体在室温在暗处温育45分钟(在开始时和在20分钟后涡旋混合)。将红细胞用BD裂解缓冲液(BDFACS裂解溶液，349202)裂解9分钟并且将剩余的细胞洗涤(2mlPBS+0.1％BSA)及固定(1％PFA)。在LSRFortessaTM细胞分析器(BectonDickinson)上分析细胞并且使用FloJo软件(TreeStar)分析数据。使用对TCRαβ-FITC(IP26,BioLegend)、CD4-Alexa700(RPA-T4,BioLegend)、CD127-PE/CY7(ebioRDR5,Ebioscience)、CD45RA-PacificBlue(HI100,BioLegend)、CD25-APC(2A3,M-A251,BDBiosciences)和CD122-PE(TU27,BioLegend)特异的抗体，鉴定Treg亚群。在单独的管中用对TCRαβ-FITC、CD4-Alexa700、CD8-PE/CY7(HTT8a,BioLegend)、CD56-PacificBlue(HCD56,BioLegend),CD25-APC和CD122-PE特异的抗体染色NK细胞和NKT细胞。基于FSC/SSC对淋巴细胞设门后并且排除二重峰后，将幼稚型Treg鉴定为TCRαβ+CD4+CD127-CD25+CD45RA+，将记忆型Treg鉴定为TCRαβ+CD4+CD127-CD25+CD45RA-并且将活化型Treg鉴定为TCRαβ+CD4+CD127-CD25高CD45RA-。将NK细胞鉴定为TCRαβ-CD56-/暗并且将活化型NK细胞鉴定为TCRαβ-CD56亮。将NKT细胞鉴定为TCRαβ+CD56+。分别使用与APC和PE缀合的同种型对照(IC)以评估CD25和CD122的背景荧光。类似地，细胞表面标志物用来定义幼稚型和记忆型常规CD4+T细胞(图7A和图7B)、记忆型常规CD8+T细胞和CD45RA+CD8T细胞(幼稚亚群和TEMRA亚群的组合；TEMRA指已经回复成表达CD45RA的效应记忆T细胞(图7C和图7D)。染色和分析如上文所述进行。使用上文描述的相同管表征CD4+Treg，将CD4+常规幼稚型T细胞鉴定为TCRαβ+CD4+CD127+CD25-/+CD45RA+并且将CD4+常规记忆型T细胞鉴定为TCRαβ+CD4+CD127+CD25-/+CD45RA-。使用TCRαβ-FITC、CD8-Alexa700(HTT8a,BioLegend)、CD28-PE/CY7(CD28.2,BioLegend),CD45RA-PacificBlue、CD25-APC和CD122-PE，定义CD8T细胞。将CD8+记忆型T细胞鉴定为TCRαβ+CD8+CD45RA-。将CD8+幼稚型细胞和TEMRA细胞鉴定为TCRαβ+CD8+CD45RA+。CD28未用来区分CD8+幼稚型T细胞与CD8+TEMRAT细胞，因为在下文描述的pSTAT5a分析中不包括CD28标志物(参见图8)。在一些测试(图15)中，额外的亚群如下定义：中央记忆型CD4+T细胞(TCRαβ+CD4+CD56-FOXP3-CD45RA-CD127+CD25-/+)、效应记忆型CD4+T细胞(TCRαβ+CD4+CD56-FOXP3-CD45RA-CD127-CD25-/+)、中央记忆型CD8+T细胞(TCRαβ+CD8+CD56-FOXP3-CD45RA-CD127+CD25-/+)、效应记忆型CD8+T细胞(TCRαβ+CD8+CD56-FOXP3-CD45RA-CD127-CD25-/+)和TEMRACD8+细胞(TCRαβ+CD8+CD56-FOXP3-CD45RA+CD127-CD25-/+)。在图6和图7中，显示人外周血中T细胞、NK细胞和NKT细胞亚群的细胞特异的IL-2RA和IL-2RB表达(IL-2RG在造血细胞上具有基本上普遍的表达，因为其与多种细胞因子受体配偶)。最高水平的IL-2RA存在于三个调节型CD4+T细胞(Treg)群体上：幼稚型(CD45RA+CD25+)、记忆型(CD45RA-CD25+)和活化型(CD45RA-CD25hi)(图6A)。平均地，常规记忆型CD4+T细胞表达比Treg小大约10倍的CD25(图7A)。幼稚型CD4+T细胞上的CD25表达在供体间显著变动，但总是低于记忆型CD4+T细胞上观察到的表达(图7A)。CD25在NK，NKT和CD8T细胞上的表达很低或检测不到，例外是CD56亮NK细胞(图6C和图7C)。CD56亮NK细胞和CD56+NK细胞表达最高水平的IL-2RB(图6D)，高于任何T细胞亚群(包括NKT细胞)大约10倍(图6B、图6D、图7B、图7D)。人外周血细胞亚群中pSTAT5a的诱导在IL-2诱导的三聚体IL-2R寡聚化后，分别与IL-2RB与IL-2RG的胞内结构域结合的JAK1和JAK3胞质蛋白酪氨酸激酶激活。这些激酶磷酸化充当STAT5a和STAT5b的对接位点的IL-2RB某些酪氨酸残基，所述STAT5a和STAT5b转而磷酸化。IL-2诱导的几条信号传导途径活化最终导致有助于与IL-2/IL-2R途径相关的各种功能的靶基因转录。由于各种细胞类型表达不同水平的IL-2受体IL-2RA和IL-2RB分子(图6和图7)，我们通过多色流式细胞术测量了各个细胞内部的pSTAT5a水平，以理解由高亲和力和中等亲和力受体的各种组合介导的针对IL-2的整合信号传导反应。在人CD4+Treg亚群、幼稚型和记忆型常规CD4+T细胞、记忆型常规CD8+T细胞、CD45RA+CD8T细胞、NKT细胞和NK细胞中评定各种剂量的DP47GSIgG-IL-2,DP47GSIgG-(IL-2)2、DP47GSIgG-(IL-2E95A)2、DP47GSIgG-IL-2N88D和DP47GSIgG-(IL-2N88D)2对STAT5a磷酸化诱导作用的影响(图8-图14和表2和表3)。全部亚群均在单个管中对每个剂量表征。简而言之，从健康人成年志愿者采集血液至肝素化管中。添加各种浓度的DP47GSIgG-IL-2融合蛋白至500μl血液并且在37℃温育。在30分钟后，将血液利用预温的裂解/固定缓冲液(BectonDickinson#558049)在37℃裂解并固定10分钟，用含有0.2％BSA的PBS洗涤2次，随后用-20℃预冷却的甲醇(Sigma，生物技术级#494437)在冰上透化20分钟。随后用含有0.2％BSA的PBS充分洗涤细胞4次，之后使用一组区分不同淋巴细胞亚群和NK细胞亚群和pSTAT5a状态的荧光抗体，进行FACS染色。所用的抗体是抗CD4-Alexa700(克隆RPA-T4)、CD3-PerCP/Cy5.5(UCHT1)、CD45RA-PE/Cy7(HI100)、CD8-亮紫605(RPA-T8)、CD56-亮紫421(HCD56)、FOXP3-PE(259D)(均来自BioLegend)、CD25-APC(克隆M-A251和2A3)及pSTAT5a-Alexa488(pY694)(BectonDickinson)。使用LSRFortessaTM细胞分析仪(BectonDickinson)获得样品并且使用FlowJo软件(FlowJo，LLC)分析数据。对淋巴细胞设门后并且排除二重峰后，Treg定义为CD3+CD4+FOXP3+并且再划分为CD45-FOXP3hi(活化型Treg)、CD3+CD4+CD45RA-FOXP3+(记忆型Treg)和CD3+CD4+CD45+FOXP3+(幼稚型Treg)。常规CD4+T细胞定义为CD3+CD4+CD45RA+(幼稚型)和CD3+CD4+CD45RA-(记忆型)。CD8T细胞定义为CD3+CD8+CD45RA-(记忆型)和CD3+CD8+CD45RA+。NKT细胞定义为CD3+CD56+并且NK细胞定义为CD3-CD56亮(活化型NK细胞)或CD3-CD56+(NK细胞)。全部剂量定量全部细胞亚群中的胞内pSTAT5a水平。图8显示DP47GSIgG-IL-2免疫缀合物对来自三名独立供体的人外周血中的T细胞、NK细胞和NKT细胞的剂量反应，其中所述供体各自在不同的天检测。全部三名供体中对DP47GSIgG-IL-2的反应性等级情况相同并与使用重组人IL-2时观察到的等级情况相同(数据未显示)。全部三个Treg群体即活化型(CD45RA-CD25hi)、记忆型(CD45RA-CD25+)和幼稚型(CD45RA+CD25+)均在0.1ng/ml浓度的DP47GSIgG-IL-2增加pSTAT5a水平，而其他细胞群体要求大于1ng/ml(CD56亮NK和记忆型CD4+T细胞)或10-100ng/ml(记忆型CD8+T细胞、CD56+NK细胞、幼稚型CD4+T细胞、NKT细胞和CD45RA+CD8T细胞)的DP47IgG-IL-2以产生可检测的pSTAT5a增长。关于Treg群体显示对DP47GSIgG-IL-2的高敏感性的更详细剂量反应，还参见图11。值得注意的是，与T细胞亚群上的IL-2RB表达相比，具有中等水平CD56的NK细胞上IL-2RB的高表达(图6D)不足以引起Treg样IL-2敏感性。总之，活化型、记忆型和幼稚型Treg亚群对DP47GSIgG-IL-2显示最大敏感性，而CD56亮NK细胞和CD4+常规记忆型T效应细胞的敏感性低20-50倍。在分析pSTAT5a增长情况的其他细胞亚群当中，CD8+记忆型T效应细胞、CD4+幼稚型T效应细胞、NKT细胞、“静息型”NK细胞(阳性，无亮的CD56染色)和CD8+幼稚型T效应细胞+CD45RA+记忆细胞对IgG-IL-2免疫缀合物相对不敏感。图9显示DP47GSIgG-(IL-2)2对来自五名独立供体的人外周血中的T细胞、NK细胞和NKT细胞的剂量反应，其中所述供体各自在不同的天检测。如对DP47GSIgG-IL-2观察到的那样(图8)，三个Treg亚群是对DP47GSIgG-(IL-2)2诱导的pSTAT5a最敏感的细胞(图9和图11)并且对全部五名供体中的其他细胞亚群均观察到相似等级的剂量反应。为了更轻易地比较DP47GSIgG-IL-2和DP47GSIgG-(IL-2)2，将pSTAT5a值归一化(图10)。为了归一化MFI值，从每个设门亚群的全部刺激的MFI值扣除对该细胞亚群特异的未刺激的pSTAT5aMFI值。所产生的值除以剂量反应中通过该亚群所获得的最高pSTAT5aMFI值。基于实现50％对该亚群观察到的最大pSTAT5aMFI所需要的IL-2融合蛋白的量，估计EC50。如图10中所示，DP47GSIgG-(IL2)2免疫缀合物在组成型表达CD25的细胞中产生更有力的pSTAT5a诱导作用，这可能因免疫缀合物对高亲和力IL-2受体的亲合力增加所致。当直接比较DP47GSIgG-(IL-2)2与DP47GSIgG-IL-2时，观察到pSTAT5a激活作用的EC50在Treg中为5-9倍较低。表2总结了不同细胞亚群中代表性EC50值和DP47GSIgG-IL-2相对于DP47GSIgG-(IL-2)2的pSTAT5a激活作用的倍数差异。表2不同细胞亚群中EC50值和DP47GSIgG-IL-2相对于DP47GSIgG-(IL-2)2的pSTAT5a激活作用的倍数差异。T细胞IgG-IL-2IgG-(IL-2)2倍数变化活化型Treg0.10ng/mL0.020ng/mL5记忆型Treg0.22ng/mL0.033ng/mL7幼稚型Treg0.20ng/mL0.023ng/mL9CD56亮NK2.0ng/mL0.63ng/mL3CD4+记忆型Teff5ng/mL0.7ng/mL7NK细胞35ng/mL10ng/mL4甚至在极端限制性浓度，与DP47GSIgG-IL-2相比，DP47GSIgG-(IL-2)2也产生较高水平的pSTAT5a(图11)。对于这个实验，在同一天分别检测来自三名健康志愿者的血液对IL-2限制性浓度下2倍滴定的DP47IgG-IL-2和DP47IgG-(IL-2)2的反应。图11中的曲线代表三名供体的pSTAT5aMFI的均数±SD。除分别检测的三个Treg亚群(图11B-D)之外，还应用一个门以评估总CD3+CD4+FoxP3+Treg中的pSTAT5a(图11A)。结果明确地显示尽管每分子IgG的IL-2仅增加2倍，DP47GSIgG-(IL-2)2活化Treg的效力却增加5-10倍。多色流式细胞术如上文所述进行(参见图8)。与DP47GSIgG-IL-2相比，CD4+常规记忆型T效应细胞还响应于较低(7倍较低)浓度的DP47GSIgG-(IL-2)2。尽管比较DP47GSIgG-(IL-2)2与DP47IgG-IL-2时CD56亮NK细胞和CD56+NK细胞的EC50值较低，但是分别仅降低3倍和4倍。这可能归因于这些细胞依赖于中等亲和力IL-2受体进行IL-2-介导的信号传导。Treg细胞相对于NK细胞的这种ED50差异性变动数倍增加了偏好地活化Treg。图12显示DP47GSIgG-(IL-2E95A)2对来自三名独立供体的人外周血中的T细胞、NK细胞和NKT细胞的剂量反应，其中所述供体各自在不同的天检测。IL-2E95A分子设计成并预测减少IL-2Rβγ结合活性，但是实际上显示出与野生型IL-2相似的IL-2Rβγ受体结合特性。全部三名供体中对DP47GSIgG-(IL-2E95A)2的反应性等级情况相同并与相同供体中采用野生型IL-2免疫缀合物DP47GSIgG-(IL-2)2时观察到的等级情况相同。全部三个Treg群体即活化型(CD45RA-CD25hi)、记忆型(CD45RA-CD25+)和幼稚型(CD45RA+CD25+)均在低于0.1ng/ml浓度的DP47GSIgG-(IL-2E95A)2增加pSTAT5a水平，而其他细胞群体要求1ng/ml(CD56亮NK细胞和CD4+常规记忆型T效应细胞)或10-100ng/ml(记忆型CD8+T细胞、CD56+NK细胞、幼稚型CD4+T细胞、NKT细胞和CD45RA+CD8+T细胞)的DP47IgG-(IL-2E95A)2以产生可检测的pSTAT5a增长。值得注意的是，与T细胞亚群上的IL-2RB表达相比，具有中等水平CD56的NK细胞上IL-2RB的高表达(图6D不足以引起Treg样IL-2敏感性。总之，活化型、记忆型和幼稚型Treg亚群对DP47GSIgG-(IL-2E95A)2显示最大敏感性，而CD56亮NK细胞和CD4+常规记忆型T效应细胞的敏感性低20-50倍。在分析pSTAT5a增长情况的其他细胞亚群当中，CD8+记忆型T效应细胞、CD4+幼稚型T效应细胞、NKT细胞、“静息型”NK细胞(阳性，无亮的CD56染色)和CD8+CD45RA+幼稚型T效应细胞对IgG-(IL-2E95A)2免疫缀合物相对不敏感。图13显示DP47GSIgG-(IL-2N88D)2对来自五名独立供体的人外周血中的T细胞、NK细胞和NKT细胞的剂量反应，其中所述供体各自在不同的天检验。IL-2N88D分子设计成减少IL2Rβγ结合活性并且不同于E95A点突变，通过BIAcore分析，它对IL2Rβγ具有6.2倍较少的结合亲和力(表1，KD0.15nM，相对于0.93nM而言)。如迄今对全部IL-2免疫缀合物观察到的那样，三个Treg亚群是对DP47GSIgG-(IL-2N88D)2所致的pSTAT5a激活作用最敏感的细胞并且对全部五名供体中的其他细胞亚群均观察到相似等级的剂量反应。特别值得注意的是用DP47GSIgG-(IL-2N88D)2刺激时，CD4+记忆型T效应细胞缺少反应性；甚至以1000ng/ml剂量时，它具有少量刺激这种重要自身免疫细胞群体的作用。在这个例子中，独特设计的IL-2单点突变N88D在目的细胞群体(CD4+记忆型T效应细胞)上大幅度降低刺激性活性，同时完全维持新的和改进的治疗性实体所需要Treg刺激性作用。为了比较野生型IL-2DP47GSIgG-(IL-2)2与E95A和N88DIL-2点突变免疫缀合物，将pSTAT5a值彼此对受测试的每个细胞类型作图(图14)。DPS47GSIgG-(IL-2E95A)2显示与其刺激人类每种细胞群体的野生型对应物DP47GSIgG-(IL-2)2相同的活性，剂量反应曲线可重叠。相反，降低的IL2Rβγ结合的分子DP47GSIgG-IL-2N88D和DP47GSIgG-(IL-2N88D2)2对CD4+记忆型T效应细胞具有微小影响并且仅双价缀合物DP47GSIgG-(IL-2N88D)2对不同的Treg群体保留显著的刺激活性。图15中的结果显示了从额外10名人类血液供体采集的全血pSTAT5a反应。在独立的各天，检测每名供体，比较DP47GSIgG-(IL-2)2和DP47GSIgG-(IL-2N88D)2的宽(≥6log)滴定范围。如先前用DP47GSIgG-(IL-2)2所见(图9)，记忆型Treg和幼稚型Treg是对DP47GSIgG-(IL-2)2和DP47GSIgG-(IL-2N88D)2诱导的pSTAT5a最敏感的细胞(图15A、B)；尽管每种融合蛋白均刺激最大pSTAT5a反应，它们在活化回折点所需的浓度以及活化的最大剂量方面不同。与野生型IL-2融合蛋白相比，CD56亮NK细胞表现为相比于Treg对DP47GSIgG-(IL-2N88D)2较不敏感的细胞亚群(图15C)；激活的回折点更高并且在这种情况下绝不实现最大影响，甚至在检测的最高剂量(5000ng/ml)也是如此。不同于DP47GSIgG-(IL-2)2，NK细胞不响应于DP47GSIgG-(IL-2N88D)2(图15D)。中央记忆型CD4+T细胞(图15E)和效应记忆型CD4+T细胞(图15F)均相对地不响应于DP47GSIgG-(IL-2N88D)2，活化回折点高于DP47GSIgG-(IL-2)21000倍并且在测试的最大剂量(5000ng/ml)仅诱导部分反应。尽管DP47GSIgG-(IL-2)2引起程度不同的活化作用，DP47GSIgG-(IL-2N88D)2对以下细胞亚群没有影响：幼稚型CD4+T细胞(图15G)、中央记忆型CD8+T细胞(图15H)、效应记忆型CD8+T细胞(图15I)、幼稚型CD8+T细胞(图15J)、效应记忆型CD45RA+CD8+T细胞(图15K)、NKT细胞(图15L)和CD3+CD4-CD8-CD56-T细胞(图15M)。在表3中显示EC50值并且基于实现50％对该细胞亚群观察到的最大pSTAT5a反应所需要的IL-2融合蛋白的量。DP47GSIgG-(IL-2E95A)2如同其野生型IL-2对应物DP47GSIgG-(IL-2)2那样，在Treg(组成型表达高亲和力受体CD25(IL2Rα)的细胞)中产生最有力的pSTAT5a诱导作用，可能原因在于其对高亲和力IL-2受体的亲合力增加。针对DP47GSIgG-(IL-2E95A)2和DP47GSIgG-(IL-2)2的剂量反应是可重叠的。与单价DP47GSIgG-IL-2相比，采用DP47GSIgG-(IL-2E95A)2和DP47GSIgG-(IL-2)2时Treg中pSTAT5a激活作用的EC50低6至7倍。同样地，与双价DP47GSIgG-(IL-2N88D)2相比，采用单价DP47GSIgG-IL-2时，Treg活化作用的EC50低7至10倍。并且最后，与双价DP47GSIgG-(IL-2N88D)2相比，采用双价DP47GSIgG-(IL-2)2时，Treg活化作用的EC50低36至61倍。表3中最佳说明了DP47GSIgG-(IL-2N88D)2治疗自身免疫疾病的最明显免疫优点，其中表3显示DP47GSIgG-(IL-2N88D)2相对于CD4+记忆型T效应细胞而言，活化Treg的引人注目的特异性差值(>320倍至>500倍)。相比而言，Treg相对于CD4+记忆型T效应细胞的特异性差值对于DP47GSIgG-(IL-2)2(13至14倍)和DP47GSIgG-IL-2(10至16倍)而言显著较小。表3.不同细胞亚群中EC50值和DP47GSIgG-(IL-2E95A)2、DP47GSIgG-IL-2和DP47GSIgG-(IL-2N88D)2的pSTAT5a激活作用的特异性倍数差异。IL-2融合蛋白在体外对人NK细胞和CD8+T细胞的差异性影响：在已知有利于NK细胞和CD8+T细胞存活和生长的体外条件下，除IL-2之外无其他刺激时培养新鲜的人外周血单个核细胞(PBMC)。人NK细胞可以再划分成表达少量或不可检出CD56的那些(称作CD56-/暗)和表达高水平CD56的“活化型”亚群(称作CD56亮)；血液中的大部分NK细胞为CD56-/暗，小部分划归为CD56亮。认为呈CD56亮的“活化型”NK细胞是缺少CD56表达的NK细胞前体(即CD56-/暗)。体外用DP47GSIgG-(IL-2)2和DP47GSIgG-(IL-2N88D)2(各自以0、5、50和500ng/ml)6日后，检测NKCD56-/暗细胞，NKCD56亮细胞和CD8+T细胞生长和存活的差异。在各刺激之间观察到细胞数目的显著差异，DP47GSIgG-(IL-2)2刺激CD56亮细胞的最大增长(中位数101x103，相对于38x103,p<0.005)(图16A)和还刺激CD8+T细胞的最大增长(中位数13.6x103个细胞，相对于2.5x103个细胞，p<0.0001)(图16B)。IL-2融合蛋白在人源化小鼠中的作用使用轻微照射的新生NOD.PrkdcscidIL2rgnull(NSG)小鼠作为免疫受损宿主，构建人源化小鼠，并且用IP注射的人胎儿肝CD34+干细胞植入它们。在8至10周龄，检测来自每只小鼠的血液以确保人类移植出现。比较Proleukin和DP47GSIgG-(IL-2)2，我们发现在体内受影响的原代细胞是NK细胞和Treg；在DP47GSIgG-(IL-2)2处理后，NK细胞和Treg均显著增加，而NK细胞按比例作出更大响应。Proleukin的各种体内影响是相似的，但是组内部对NK细胞和Treg的影响较不一致并且与DP47GSIgG-(IL-2)2相比，增加的程度减少。人源化小鼠还能够区分IL-2融合蛋白的体内影响。野生型DP47GSIgG-(IL-2)2增加Treg细胞(图17A)和NK细胞(图17B)，而DP47GSIgG-(IL-2N88D)2对NK(图17B)细胞没有影响，但增加Treg至显著大于野生型IgG-(IL-2)2的程度(图17A)。人源化NSG小鼠的长期结果是它们的存活时间较短，原因在于导致体重丧失和多系统器官衰竭的人异种移植物抗宿主反应。每周二次施用运载体没有影响并且在处理起始后产生中位存活期36天(图18)。类似于运载体，DP47GSIgG-(IL-2N88D)2处理产生中位存活期37天。相反，每周二次DP47GSIgG-(IL-2)2处理缩短这个组的中位存活时间至21天(图18，与DP47GSIgG-(IL-2N88D)2相比p<0.0037)。当移植物抗宿主反应的预定严重程度决定终止每只小鼠的生活阶段(体重丧失≥15％)时，评估血液中的人细胞组成。在危及生命的移植物抗宿主反应正在进行的情况下，处理组中血液的Treg、NK细胞和CD8+T细胞最终组成方面见到惊人差异(图19)。在运载体处理的小鼠中，人Treg占小于1％的人类总CD45+细胞并且NK细胞和CD8+T细胞占血液中人CD45+细胞的约3％。DP47GSIgG-(IL-2N88D)2处理分别增加NK细胞和CD8+T细胞至2％和5％，而增加Treg至6％。与之相反，野生型DP47GSIgG-(IL-2)2处理增加NK细胞和CD8+T细胞的分数至人总CD45+细胞的30％并增加Treg至3.5％，这可能解释这个组中与DP47GSIgG-(IL-2N88D)2处理的小鼠相比存活时间显著减少。食蟹猴外周血细胞亚群中pSTAT5a的诱导如人外周血中观察到的那样，在IL-2(Proleukin)刺激的食蟹猴外周血的Treg亚群中存在偏好的和相似的剂量-依赖性pSTAT5a诱导作用(数据未显示)。在直接比较DP47GSIgG-(IL-2)2和DP47GSIgG-IL-2诱导三个Treg亚群中pSTAT5a的能力时，要求比DP47GSIgG-IL-2少2倍至8倍的DP47GSIgG-(IL-2)2实现50％的pSTAT5a最大水平。表4总结了不同食蟹猴Treg亚群中DP47GSIgG-IL-2相对于DP47GSIgG-(IL-2)2激活pSTAT5a的EC50值结果，所述结果惊人地类似于采用人外周血所见的那些结果(表3)。类似于人全血，细胞表面和胞内标志物用来鉴定来自正常健康食蟹猴的全血中的调节型T细胞亚群和常规T细胞。在同一天从三只健康食蟹猴采集血液样品于肝素钠管中并且添加各种浓度的DP47GSIgG-IL-2或DP47GSIgG-(IL-2)2至500μl血液并且在37℃温育。在37℃时10分钟后，将样品用预温的BD裂解/固定缓冲液(BDBiosciences)裂解和固定。在洗涤后，将细胞在冰上用1mL甲醇透化30分钟。将样品洗涤3次并在4℃用一组FOXP3-Alexa(克隆：259D，Biolegend)、CD4-V500(克隆：L200，BDBiosciences)、CD45RA-V450(克隆：5H9，BDBiosciences)、CD25-PE(克隆：4E3，eBioscience)、pSTAT5a-Alexa488(克隆：47，BDBiosciences)和Ki-67-PerCP-Cy5.5(克隆：B56，BDBiosciences)染色1小时。全部样品均通过LSRFortessaTM细胞分析仪(BectonDickinson)获得并且随后用FlowJo软件(FlowJo，LLC)分析。表4.食蟹猴外周血Treg亚群中响应于DP47GSIgG-IL-2和DP47GSIgG-(IL-2)2诱导pSTAT5a。T细胞IgG-IL-2IgG-(IL-2)2倍数变化活化型Treg0.07ng/mL0.02ng/mL4记忆型Treg0.21ng/mL0.025ng/mL8幼稚型Treg0.04ng/mL0.02ng/mL2在又一个实验中，类似于采用人血的pSTAT5a测定法，用作为运载体对照的PBS、DP47GSIgG-(IL-2)2和DP47GSIgG-(IL-2N88D)2在体外刺激来自正常健康成年食蟹猴的肝素化新鲜血液，并且检测对Treg亚群和常规CD4+记忆型T效应细胞中STAT5a磷酸化的影响。基于在≤1ng/mL时人类最大Treg反应和在该剂量范围时常规CD4+记忆型T效应细胞的几乎最大反应(图9中的结果)，选择20ng/mL刺激剂量。实验条件如上文所述。在同一天从三只健康食蟹猴(供体C1、C2、C3)采集血液样品于肝素钠管中并且添加20ng/mLDP47GSIgG-(IL-2)2或DP47GSIgG-(IL-2N88D)2至500μl血液并且在37℃温育20分钟，之后裂解并分析。图20A中显示用于将食蟹猴CD4+CD25+Treg划分成幼稚型(FOXP3+CD45RA+)、记忆型(FOXP3+CD45RA-)和活化型(FOXP3hiCD45RA-)亚群以便分析的流式细胞术设门策略。如同人类中那样，来自每个供体的三个CD4+CD25+FOXP3+Treg亚群表达高水平的高亲和力IL-2受体CD25(图20B)。用20ng/mLDP47GSIgG-(IL-2)2和DP47GSIgG-(IL-2N88D)2体外刺激后，来自全部三个供体的Treg产生显著的STAT5a磷酸化(图20C)。类似于人类，与幼稚型Treg相比，食蟹猴活化型和记忆型Treg显示更大的pSTAT5a诱导潜力。人常规CD4+记忆型T效应细胞，尽管不如Treg那样敏感，却能够受IL-2刺激，使用pSTAT5a作为活化的生物标志物时，DP47GSIgG-(IL-2)2的估计ED90为20ng/mL(图14)。食蟹猴常规CD4+记忆型T效应细胞可以在血液中类似地鉴定为CD4+FOXP3-CD45RA-细胞，大部分细胞为CD25-并且一个较小亚群为CD25+(图21A)。当作为一个完整群体看待时，来自全部三个供体的食蟹猴记忆型Teff细胞响应于20ng/mLDP47GSIgG-(IL-2)2，pSTAT5A增加，而20ng/mLDP47GSIgG-(IL-2N88D)2对pSTAT5a具有轻微影响(食蟹猴2)或无影响(食蟹猴1和3)(图21B)。当记忆型Teff细胞进一步再划分成CD25-亚群和CD25+亚群时，发现对DP47GSIgG-(IL-2)2的反应主要位于CD25+亚群(图21D)中，CD25-亚群中反应轻微(图21C)。相反地，DP47GSIgG-(IL-2N88D)2对CD25-记忆型Teff细胞没有影响(图21C)并且对CD25+亚群具有70-80％较低的刺激性活性(图21D)。在新鲜的正常食蟹猴血液中的额外研究直接比较了不同浓度的DP47GSIgG-(IL-2)2和DP47GSIgG-(IL-2N88D)2以剂量反应方式在不同T细胞亚群(即活化型、幼稚型和记忆型Treg和CD4+记忆型T效应细胞)中刺激pSTAT5a的能力。DP47GSIgG-(IL-2)2和DP47GSIgG-(IL-2N88D)2均以剂量依赖性方式刺激Treg，野生型双价IL-2融合蛋白在每个Treg亚群中比双价IL-2N88D融合蛋白约10倍更有效(图22A-C)。与之相反，当评定CD4+记忆型T效应细胞的pSTAT5a诱导作用时，观察到两种分子之间的巨大差异(图22D)。DP47GSIgG-(IL-2)2在300ng/mL展示大约EC90，而DP47GSIgG-(IL-2N88D)2在这个大剂量事实上没有作用。表5中显示对食蟹猴pSTAT5a刺激作用的EC50值以及相对于CD4+记忆型T效应细胞而言刺激Treg的相对倍数特异性。食蟹猴全血中的这些结果相当类似于使用人全血时的结果(图14和表3)并且表明食蟹猴中的研究可以对人临床试验具有高度预测价值。表5.食蟹猴T细胞亚群中EC50值和DP47GSIgG-(IL-2)2和DP47GSIgG-(IL-2N88D)2的pSTAT5a激活作用的特异性倍数差异。小鼠中的药代动力学特性在小鼠中进行功能研究之前，在NOD、NOD.scid和NOD.scid.Il2rα-/-小鼠中评价野生型和N88D单价及双价IL-2免疫缀合物的药代动力学(PK)特性(图23)。将NOD小鼠和NOD.scid小鼠(n＝3)用含有0.5％小鼠血清的PBS中每小鼠0.3mg/kg的DP47GSIgG-IL-2或DP47GSIgG-(IL-2)2静脉内注射(i.v.)并且在注射后的多个时间(范围从2分钟至168小时)采血(图23A)。使用小鼠抗人IL-2mAb(BDPharmingen，#555051，克隆5344.111)包被96孔板以捕获IL-2，评定小鼠血清样品中的人IL-2。随后使用生物素酰化的小鼠抗人IL-2mAb(BDPharmingen，#555040，克隆B33-2)检测人IL-2。使用铕缀合的链霉亲和素，将IL-2结合作用可视化并定量。在前24小时范围内，DP47GSIgG-(IL-2)2在NOD小鼠和NOD.scid小鼠中均比DP47GSIgG-IL-2更快地清除。截止48小时，每种融合物的血清水平处于相似的浓度并且在72小时全部在检测限以下。IL-2检测限值是0.05ng/mL并且由点线指示。无获得性免疫系统的小鼠中快得令人惊讶的单价和双价IgG-IL-2免疫缀合物清除过程提示，非造血性IL-2区室或“池”存在于小鼠中并且可能驱动IL-2免疫缀合物的体内快速清除。为了检验这种假设，我们在也缺少高亲和力IL-2受体IL2Rα(CD25)的NOD.scid小鼠即NOD.scid.Il2rα-/-小鼠中进行PK研究(图23B)。在NOD.scid.Il2rα-/-小鼠中，尽管按3倍较高剂量给予(0.3mg/kg)，但DP47GSIgG-(IL-2)2仍在前24至48小时范围内比0.1mg/kgDP47GSIgG-IL-2和0.1mg/kgDP47GSIgG-(IL-2N88D)2更快速清除。但是，在48小时后，每种缀合物的血液水平展示缓慢稳定的消除阶段，血液中轻易可检出IL-2直至6天。有趣地，在这些高亲和力IL-2受体缺陷小鼠中，DP47GSIgG-(IL-2N88D)2分子具有略微快于IgG-IL-2的初始24小时分布阶段，但此后显示类似于野生型单价免疫缀合物的消除阶段直至6天(检测它们的最后时间)。DP47GSIgG-(IL-2N88D)2的这些数据特别相关，因为NOD.scid.Il2rα-/-小鼠中的PK结果似乎密切地预测非人灵长类中的PK结果。IL-2处理后小鼠Treg中FOXP3和CD25增加为了比较不同分子形式和构型的人IL-2在体内刺激FoxP3+Treg的能力，将小鼠用运载体、Proleukin(重组人IL-2)、DP47GSIgG-IL-2、DP47GSIgG-(IL-2)2或DP47GSIgG-(IL-2N88D)2皮下注射并且在事先确定的24小时最佳时间对Treg评估细胞表面CD25和胞内FOXP3表达的变化(图24)。将年青的健康BALB/c小鼠(n＝3/处理组，n＝4/运载体组)用Proleukin(20,000或100,000IU/小鼠)、DP47GSIgG-IL-2(60、300或1500IU/小鼠)、DP47GSIgG-(IL-2)2(60、300或1500IU/小鼠)或DP47GSIgG-(IL-2N88D)2(60、300或1500IU/小鼠)皮下注射。以含有0.5％无菌过滤的小鼠血清的100μlpH7.2无菌PBS组成的运载体递送剂量。在24小时后，将小鼠安乐死并且切除脾。脾细胞的单细胞悬液在1mlL-15培养基中生成并且储存在冰上，直至进一步处理。将过滤的单细胞悬液等分试样40μl转移至FACS管并用2mlFACS缓冲液洗涤(600xg，5分钟)。样品随后与以下针对细胞表面抗原的荧光色素缀合的抗体温育：CD4(克隆RM4-5，荧光色素A700)、CD25(eBio7D4，Af488)、CD44(IM7，e605)、CD62L(MEL-14，PE)、ICOS(C398.4A，PE/Cy7)、CD103(2E7，APC)。染色在4℃在100μlFACS缓冲液(PBSpH7.2+0.2％BSA)中进行30分钟。在细胞表面染色后，将样品用4mlFACS缓冲液(600xg，5分钟)洗涤，之后胞内染色(根据eBioscience胞内染色方案)。简而言之，将样品重悬于200μl固定/透化缓冲液(eBioscience#00-5521)中并且4℃温育1小时。将1ml1x透化缓冲液(eBioscience#00-8333)添加至样品，之后添加3mlFACS缓冲液并且洗涤(600xg，5分钟)。胞内抗原Ki-67(B56，PerCPCy5.5)和FOXP3(FJK-16S，e450)在4℃于100μl1x透化缓冲液中染色1小时。样品用4mlFACS缓冲液(600xg，5分钟-2次)洗涤并且在BDFortessaTM分析仪上获得数据并使用FlowJo软件(FlowJo，LLC)分析。Treg定义为来自淋巴细胞门内部单峰的CD4+FOXP3+；从这个群体，计算全部样品的CD25和FOXP3平均荧光强度(MFI)。如图24中所示，三种IL-2免疫缀合物在刺激小鼠Treg中CD25(24A)和FoxP3(24B)表达方面等效，并且在60、300和1500IU/小鼠剂量范围显示一致的剂量依赖性反应。在每种情况下1500IU的每种免疫缀合物(黑色柱)比100,000IUProleukin(黑色柱)显著更有效。在大多数情况下，300IU免疫缀合物(深灰色柱)等效于100,000IUProleukin，并且60IU免疫缀合物(浅灰色柱)等效于20,000IUProleukin(浅灰色柱)。在全部处理组中数据均显示为均数±SD。食蟹猴中的药代动力学特性在非人灵长类中进行功能研究之前，在从未用过生物药的健康成年食蟹猴中评价IL-2免疫缀合物的药代动力学(PK)特性(图25)。将猴(n＝2/剂量)用含有0.5％食蟹猴血清的PBS中的无菌DP47GSIgG-IL-2或DP47GSIgG-(IL-2)2短的大丸剂静脉内注射(i.v.)并且在注射后的多个时间(范围从30分钟至72小时)采血。使用小鼠抗人IL-2mAb(BDPharmingen，目录号555051，克隆5344.111)包被96孔板以捕获人IL-2，评定食蟹猴血清样品中的人IL-2。随后使用生物素酰化的小鼠抗人IL-2mAb(BDPharmingen，目录号#555040，克隆B33-2)检测人IL-2。使用铕缀合的链霉亲和素，将IL-2结合作用可视化并定量。使用食蟹猴血清时测定法中的检测水平是0.05ng/mLIL-2(图中的点线)。处理前取得的食蟹猴血清具有不可检出的IL-2(因此＜0.05ng/mL)。以全部剂量的DP47GSIgG-IL-2(图25A)和DP47GSIgG-(IL-2)2(图25B)静脉内注射后从30分钟至48小时在食蟹猴血清中检测到IL-2。截止72小时，用10和25μg/kgDP47GSIgG-IL-2或DP47GSIgG-(IL-2)2处理的全部动物的IL-2血清水平均在检测限(0.05ng/mL，点线)以下。在给予100μg/kgDP47GSIgG-IL-2后，可检测的血清IL-2在72小时仍然存在。诱导食蟹猴中的Treg数目给药后7天，用DP47GSIgG-IL-2体内处理的食蟹猴动物具有Treg绝对数目的剂量依赖性增加以及超过基线的倍数增加(分别是图26A和图26B)。全部试验中均适用年龄范围3至6岁的两个性别的正常健康食蟹猴并且所有动物均不使用超过一次。在麻醉的同时，将各种剂量的DP47GSIgG-IL-2(n＝4-6)或运载体(n＝3)背侧皮下注射。各个剂量的DP47GSIgG-IL-2基于体重并且配制在含有0.5％无菌正常食蟹猴血清的无菌PBSpH7.2的运载体中用于注射。血液样品在处理后的各种时间采集并且用Advia自动化血液学分析仪检验血液学变化(CBC和分类计数)以及上文详述(表4的实验程序)的细胞表面和胞内标志物。图26中将处理后第7天的全血CD4+CD25+FOXP3+调节型T细胞的变化显示为Treg绝对细胞数目/mm3全血(图26A)和Treg倍数变化(图26B)；全部数据均表示为均数±SD。在更高剂量25μg/kg和36μg/kgDP47GSIgG-IL-2，观察到Treg平均增加几乎3倍(范围111-255％，n＝6)和4倍(范围110-470％，n＝6)。DP47GSIgG-IL-2的皮下剂量进一步减少(12、6和2μg/kg)持续引起Treg数目和倍数变化的相应减少。不希望受理论约束，12μg/kgDP47GSIgG-IL2剂量时Treg增加约2倍(范围67-133％，n＝6)可以代表对于某些自身免疫和炎性疾病而言合乎需要的Treg增加。人类中存在Treg数目的大范围(20-90个Treg/mm3血液；4至10％CD4+T细胞)并且合理假定个体内部IL-2诱导的Treg增加将会导致功能性抑制作用总体增加。当评价DP47GSIgG-IL-2的较低剂量(2-6μg/kg)时，更频繁地采集血液样品以鉴定检测DP47GSIgG-IL-2施用后Treg变化的最佳时间(图27)。尽管在7天时存在Treg的变化，但是最大刺激作用在第4天出现，早于采用更高剂量的DP47GSIgG-IL-2时所测量的时间(第7日，图26)。当按照用来刺激Treg细胞和其他IL-2响应性细胞中pSTAT5a的IL-2活性的单位直接比较时，Proleukin和DP47GSIgG-IL-2在人和食蟹猴全血测定法中是体外可比较的(数据未显示)。在已知Proleukin在人类中半寿期短的情况下，在食蟹猴中进行单剂量研究以评估体内Treg诱导和活化作用。Proleukin在Treg中引起按绝对数目以及pSTAT5a活化的变化倍数测量的剂量与时间依赖性变化。尽管Treg数目增加是较少的(图28A：10-40％)，但是在处理后一天，诱导的Treg中pSTAT5a增加是明显的且剂量依赖的(图28B)，然而其体内持续时间短，在第2至第3天恢复正常。图29中显示DP47GSIgG-IL-2在食蟹猴中体内诱导Treg增加的能力与Proleukin的对应能力的比较。将正常健康食蟹猴(n＝5的组)用低剂量DP47GSIgG-IL-2或高剂量Proleukin处理并且在第10天检测调节型T细胞的变化。在第0天和第7天，将DP47IgG-IL-2以剂量16,800IU/kg(图26中显示的12μg/kg剂量)皮下给予。基于给予1型糖尿病患者Proleukin(4.5x106IU/人，3次/周)并且显示其增加Treg的已发表工作和图28中的单剂量数据，每周3次皮下给予Proleukin(M/W/F)，总计5个剂量，每次按200,000IU/kg(4.5x106IU/人的食蟹猴等效量)。结果在图29中对总Treg/mm3血液中的变化(图29A)、Treg数目的增加倍数(图29B)和Treg与常规CD4+FOXP3-细胞之比的变化(图29C)显示为均数±SD。虽然在10天时间范围内施用几乎30倍较少的DP47GSIgG-IL-2活性，但是DP47GSIgG-IL-2比Proleukin诱导更大的Treg数目增加(图29A，p＝0.06)。与Proleukin相比，给予DP47GSIgG-IL-2的猴中Treg数目超过基线增加的倍数(图29B)和Treg相对于常规CD4T细胞的增加(图29C)也较大(分别是p＝0.0011和p＝0.016)。在人类中，CD4+调节型T细胞(通常定义为FOXP3+和表面标志物的组合)对非调节型CD4T细胞(称作常规或效应细胞)的比率经常用来定义随时间推移患者中Treg的功能水平。食蟹猴外周血细胞亚群对低剂量DP47GSIgG-IL-2治疗的体内反应低剂量IL-2治疗的体内细胞特异性是关键参数。我们已经可以通过在食蟹猴或小鼠给药后的多个时间所取得的血液中离体测量pSTAT5a水平，灵敏地监测确定DP47GSIgG-IL-2或Proleukin诱导的体内细胞活化。也可以离体检测能在体外监测的全部细胞群体的体内反应(图8-10)。如上所述(表4的实验程序)，在体内施用单个低剂量DP47GSIgG-IL-2(12μg/kg)至健康食蟹猴(n＝5)后1天和3天，采集全血并且检测STAT5a磷酸化。每只猴在处理前第0天采血并且测量STAT5a磷酸化的量并将其独立用于评估处理后的倍数变化。图30A中显示第1和第3天Treg中pSTAT5a的倍数变化，图30B中显示常规CD4+CD45RA-记忆型T效应细胞中pSTAT5a的倍数变化，并且图30C中显示常规CD4+CD45RA+幼稚型T效应细胞中pSTAT5a的倍数变化。结果清晰显示，单个低剂量(12μg/kg)的DP47GSIgG-IL-2后1天和3天获得的食蟹猴血液显示与记忆型和幼稚型CD4+T细胞相比，Treg细胞中pSTAT5a偏好性增加(图30A-C)。单个低剂量DP47GSIgG-IL-2在产生持久体内Treg活化状态方面明显优于单个高剂量Proleukin(图28B)。使用STAT5a磷酸化作为Treg活化的体内生物标志物的初步研究仅在采用单剂量Proleukin时第1天(图28B)和采用低剂量(12μg/kg)DP47GSIgG-IL-2在第1天和第3天(图30A)观察到最大pSTAT5a。进一步滴定与额外采样时间组合的DP47GSIgG-IL-2显示，体内pSTAT5a信号能维持4天，之后在第7天降低恢复至正常(图31A、图31B)。2μg/kg剂量(图31A，n＝4)和6μg/kg剂量(图31B，n＝6)的pSTAT5a信号的MFI(平均荧光强度)显示，低于最大pSTAT5a的信号传导出现(参见图33B)。甚至这些非常低剂量的DP47GSIgG-IL-2就提供了持久的Treg体内信号传导并优于Proleukin(图28B)。这些结果支持我们的假设，即非常低水平的长寿命IL-2，即DP47GSIgG-IL-2而非Proleukin，可以在延长的时间段体内刺激Treg，因而降低为了再建立优势自我耐受性并改善疾病结局所需要的治疗频率。低剂量IL-2处理后外周血中Treg细胞的增加能反映身体内细胞分布的变化而非细胞的实际增加。为了证实Treg在体内增加至少部分地归因于通过IL-2治疗诱导细胞分裂，评估胞内增殖标志物Ki-67。Ki-67是一种能在G1、S、G2和有丝分裂期间在胞核中检出，但在处于细胞周期G0期的静息细胞中不存在的蛋白质。还对如上文(图31)所述那样用2和6μg/kgDP47GSIgG-IL-2处理的食蟹猴如所述那样(表4的实验程序)监测胞内标志物Ki-67的离体变化以评估体内增殖程度。在第0天处于细胞周期(Ki-67+)的细胞百分数与处理后第1天至第11天Ki-67+细胞的百分数比较。图32A中显示Ki-67+Treg，图32B中显示常规CD4+CDRA45-记忆型T效应细胞，并且图32C中显示常规CD4+CD45RA+幼稚型T效应细胞。在单个低剂量DP47GSIgG-IL-2(6μg/kg)后1至7天获得的食蟹猴血细胞显示，与常规CD4+幼稚型T效应细胞相比，Treg中Ki-67偏好性增加(图32A与图32C)。不同于幼稚型T效应细胞，DP47GSIgG-IL-2(6μg/kg)能够刺激常规记忆型CD4+T效应细胞增殖(图32B)。在DP47GSIgG-IL-2最低剂量(2μg/kg)，与6μg/kg剂量相比，存在进入细胞周期和增殖的最小活化作用。在人和食蟹猴全血测定法中，双价DP47GSIgG-(IL-2)2对Treg的体外活性总计比单价DP47GSIgG-IL-2强大约6倍(表2和表4)。因此，给予食蟹猴的首剂量比检测的DP47GSIgG-IL-2最大剂量(36μg/kg)小6倍。按6μg/kg(n＝4)施用的DP47GSIgG-(IL-2)2引起循环型Treg明显增加(其在处理后14天仍远高于正常)(图33A)、Treg中明显和延长的pSTAT5a(在1周时恢复正常)(图33B)和Treg数目增加几乎3倍(图33C)。DP47GSIgG-IL-2诱导的倍数变化(来自图26，空心柱)与双价DP47GSIgG-(IL-2)2的6μg/kg剂量比较(加阴影柱)(图33D)。类似于人和食蟹猴全血测定法，DP47GSIgG-(IL-2)2显示出增强的体内效力，超出其对每分子IgG的2倍IL-2增加。给予食蟹猴额外剂量的双价DP47GSIgG-(IL-2)2以评估其在非常低剂量(2和0.7μg/kg)时的体内作用(图34)。虽然在2μg/kg产生中等倍数变化(平均46％，范围从20％至70％，n＝8)，0.7μg/kg剂量对T细胞数目具有微弱影响(平均增加16％，n＝3)(图34A)。两种低剂量均刺激Treg中的pSTAT5a增加(图34B，各自n＝3)，同时对Teff/记忆型细胞pSTAT5a具有微弱影响(图34C，各自n＝3)。图35中显示单价和双价野生型IL-2融合蛋白治疗药的总体作用(overarchingeffect)及其增加食蟹猴中Treg的能力。两种形式的长寿命IgG-IL-2是Treg的强力诱导物，其中所述Treg可以在体内以pSTAT5a作为活化的生物标志物追踪并且在这张图中作为循环型Treg数目增加倍数追踪。通过IL-2分子在IgG的C末端加倍来实现其增强效力的DP47GSIgG-(IL-2)2具有超过DP47GSIgG-IL-2的剂量依赖性优效性。食蟹猴T细胞亚群中FOXP3和CTLA-4的DNA去甲基化。有功能活性的Treg能够产生免疫抑制性细胞因子CTLA-4，IL-10和TGFβ并且需要转录因子FOXP3的稳定表达。FOXP3在人和食蟹猴Treg中的表达取决于FOXP3基因座内部Treg特异性去甲基化区域(TSDR)中10个CpGDNA甲基化位点的去甲基化。同样，CTLA-4的表达和产生依赖于人和食蟹猴CTLA-4基因座中的7个CpGDNA甲基化位点的去甲基化。因此，我们评估了在按照先前显示显著增加血液中Treg数目的剂量和时间给予的DP47GSIgG-IL-2(n＝4，25μg/kg皮下)和DP47GSIgG-(IL-2)2(n＝4，6μg/kg皮下)处理之前和之后各种CD4+T细胞亚群中FOXP3和CTLA-4的去甲基化状态。本研究中仅使用未用过生物药的成年雄性食蟹猴并且它们的体重是9.1至10.9kg。治疗在初始基线血液采集后执行3周并且在4-5天采集治疗后血液。使用FACSAriaTM(BectonDickinson)，将30mL肝素化血液中的PBMC分选成有关的CD4+亚群，包括Treg(CD4+CD25+CD127低)、记忆型T效应细胞(CD4+CD45RA-)、幼稚型T效应细胞(CD4+CD45RA+)和CD4+CD25-CD127-细胞。分选的细胞亚群以100,000个细胞的等分试样冷冻并且作为干燥小块在-80℃储存以允许一起处理全部样品。将细胞沉淀物解冻，并且使用EpitectFastLyseAll试剂盒(Qiagen)遵循制造商的说明，按单个步骤提取DNA并对其进行亚硫酸氢盐处理。5ng(2μl)亚硫酸氢盐DNA用于20μl第一轮双重PCR中，所述双重PCR含有10μl多重PCR套装(Qiagen)、6μl水、0.5μlFOXP3正向引物tgtaaaacgacggccagtTTTAGAAGTTGTATGGGGGATGTT(SEQIDNO:54)、0.5μlFOXP3反向引物caggaaacagctatgaccAAAATATCTACCCTCTTCTCTTCCTC(SEQIDNO:55)、0.5μlCTLA-4正向引物tgtaaaacgacggccagtGGGTTTGGTTATGAAGGAGTATGA(SEQIDNO:56)和0.5μlCTLA-4反向引物caggaaacagctatgaccTTCACTTAATTTCCACTAAAAATACCC(SEQIDNO:57)。第一轮PCR循环是95℃15分钟，随后以下20个循环：95℃30秒；60℃90秒和72℃60秒，随后是72℃10分钟。使用AMPureXP珠(BectonCoulter)根据制造商的说明纯化PCR产物，并且洗脱于20μl水中。通过含有7.5μl多重PCR套装(Qiagen)、6.5μl第一轮PCR产物和1μl指标引物的15μlPCR，进行第二轮PCR，所述第二轮PCR增加独特指标序列至每份样品的起始阶段。第二轮PCR循环条件是95℃15分钟，随后以下7个循环：95℃30秒；54℃90秒和72℃60秒，随后是72℃5分钟。使用AMPureXP珠纯化PCR产物并且洗脱于15μl水中，并且使用4μl以利用ShimadzuMultiNA对PCR产物的量定量。汇集等摩尔浓度的每份样品，以产生使用KapaIllumina文库定量试剂盒定量的测序文库。使用IlluminaMiSeq连同v3试剂和2x300bp末端配对序列，将文库测序。使用定制的巨蛇版(python)脚本，将测序的数据去重，并且Cutadapt程序用来移除测序用衔接子。使用FLASH，复合正向和反向读取结果，并且提取每个甲基化位点的序列。用DP47GSIgG-IL-2和DP47GSIgG-(IL-2)2处理食蟹猴均引起处理的全部动物的血液中Treg数目大幅度增加，类似于之前使用相同方案所见的情况(图33和图35)。重要地，用DP47GSIgG-IL-2和DP47GSIgG-(IL-2)2处理后的Treg快速和大幅度增加并未不利地影响或减少FOXP3(图36，顶部小图)或CTLA-4(图36，底部小图)的去甲基化状态。两种分子均见到类似的结果并且图36中显示DP47GSIgG-(IL-2)2的数据。FOXP3和CTLA-4的去甲基化状态均不受处理影响并且均不因处理减少，这提示全部Treg均维持其天然成熟的功能性免疫抑制表型，尽管绝对数目大幅度增加。非人灵长类中的这些TregFOXP3和CTLA-4去甲基化结果表明，在人类中用低剂量的长寿命IgG-(IL-2)2样分子处理应当能够增加完整功能的成熟Treg的数目，这转而将会纠正在人类自身免疫疾病以及免疫介导的其他慢性炎性疾病中存在的免疫调节性不平衡。DP47GSIgG-(IL-2N88D)2在食蟹猴中的药代动力学在从未用过生物药的食蟹猴中评价DP47GSIgG-(IL-2N88D)2的PK特性(图37)。将猴(n＝2/剂量)用含有0.5％食蟹猴血清的PBS中的30或100μg/kg无菌DP47GSIgG-(IL-2N88D)2静脉内(i.v.)和皮下(sc)注射并且在注射后的多个时间(范围从30分钟至14天)采血。如先前所描述评估食蟹猴血浆样品中的人IL-2。使用食蟹猴血浆时测定法中的检测水平是0.05ng/mLIL-2。处理前取得的食蟹猴血浆具有不可检出的IL-2(因此＜0.05ng/mL)。不同于仅能检测血液水平直至48至72小时的野生型融合蛋白的PK(图25)，采用iv(图37A)和sc(图37B)施用途径情况下在来自全部动物的食蟹猴血浆中在全部时间点均检出DP47GSIgG-(IL-2N88D)2直至14天。血浆水平与头2天至3天成剂量正比关系并且与野生型IL-2融合分子相比展示延长的半寿期。作为体内IL-2暴露的生物标志物，测量可溶性CD25(sCD25，IL-2RA)的血浆水平(图37C)。使用Eu++缀合的链霉亲和素，在使用捕获抗体(MAB623，R&DSystems)和生物素酰化检测(BAF223，R&DSystems)抗体的夹心免疫测定中使用已知与食蟹猴sCD25交叉反应的针对人sCD25的单克隆抗体试剂检测结合的sCD25。在DP47GSIgG-(IL-2N88D)2施用后sCD25的增加是剂量-依赖的并且存在于第1天至第7天之间，在第8天返回正常水平。用DP47GSIgG-(IL-2N88D)2诱导食蟹猴中的Treg在野生型DP47GSIgG-IL-2和DP47GSIgG-(IL-2)2体内处理的食蟹猴中的前述试验治展示了Treg绝对数目的剂量依赖性增加2至4倍(分别是图26和图33)，这些增加反映它们在人类全血测定法中的体外活性，即6至9倍体外差异(表2和表3)。在人全血中其丧失体外效力的情况下(表3)，选择体内剂量30和100μg/kg用于DP47GSIgG-(IL-2N88D)2。类似于先前试验，将DP47GSIgG-(IL-2N88D)2通过静脉内或皮下途径注射，各个剂量基于体重并且配制在含有0.5％无菌正常食蟹猴血清的无菌PBSpH7.2的运载体中用于注射(每种剂量和注射途径n＝2)。在处理前(第-4天和第-5天)、紧邻处理前(第0日)和在处理后多个时间(第1-14日)采集血液样品并且检测血液学变化(CBC和分类计数)以及前述的细胞表面和胞内标志物。作为绝对细胞数目/ml血液(图38A和图38B)或作为总CD4+或CD8+T细胞％(图38C和图38D)，总CD4+Treg、CD4+记忆型Treg、CD4+幼稚型Treg和CD8+FOXP3+Treg增加显示了呈时间依赖性反应。总CD4+Treg数目在100μg/kg后从90,000/ml增加至810,000/ml(9倍)及总CD4+T细胞从4.2％增加至26％(6.2倍)并且在第14天仍然升高。在30μg/kg，总CD4+Treg从62,000/ml增加至447,000/ml(7.2倍)及总CD4+细胞从4.5％增加至16.7％(3.7倍)。记忆型Treg数目在100μg/kg后从42,000/ml增加至536,000/ml(12.8倍)及总CD4+T细胞从2％增加至17.4％(8.7倍)。在30μg/kg，记忆型Treg从51,000/ml增加至280,000/ml(5.5倍)及总CD4+T细胞从2.3％增加至10.5％(4.6倍)。幼稚型Treg数目在100μg/kg从35,000/ml增加至272,000/ml(7.8倍)及总CD4+T细胞从2％增加至8.6％(4.3倍)。在30μg/kg，幼稚型Treg从46,000/ml增加至166,000/ml(3.6倍)并且总CD4+T细胞从2.2％增加至6.2％(2.8倍)。在施用100μg/kgDP47GSIgG-(IL-2N88D)2后，CD8+FOXP3+Treg从16,000/ml的罕有细胞类型增加至183,000/ml(11.4倍)及总CD8+T细胞从0.7％增加至7.8％(11.1倍)。在30μg/kg剂量的DP47GSIgG-(IL-2N88D)2时，总CD8+Treg从17,000/ml增加至101,000/ml(5.9倍)及总CD8+T细胞从0.5％增加至4.3％(8.6倍)。在100μg/kg或30μg/kgDP47GSIgG-(IL-2N88D)2后，不存在处理相关的CD4+记忆型Teff细胞增加(图39A)；实际上，在第4天百分数减少可能归因于此时CD4+Treg大幅增加。CD4+CD25hi记忆型Teff细胞在30μg/kgDP47GSIgG-(IL-2N88D)2后未改变，但是在第4天升高1.6倍，在7-10天返回基线(图39B)。用DP47GSIgG-(IL-2N88D)2诱导食蟹猴中的pSTAT5a、CD25和Ki-67如较早所述的那样，IL-2处理的体内细胞特异性是关键参数并且我们显示了可以通过在给药后各种时间处所取得的血液中测量离体pSTAT5a、细胞表面CD25和胞内Ki-67监测体内细胞亚群活化。图40A和图40B中的结果显示了DP47GSIgG-(IL-2N88D)2处理后CD4+和CD8+Treg的偏好性pSTAT5a诱导和pSTAT5a信号传导反应延长；最大反应从第1天至第4天通过100μg/kg和30μg/kg来维持，在第7天返回基线。CD4+CD25hi记忆型Teff作出反应，在第1天约半数最大反应，并且截止第4天恢复正常。检测的全部其他细胞类型在处理后显示微弱pSTAT5a诱导作用或无pSTAT5a诱导作用。细胞表面CD25增加是IL-2活化的结果并且是体内活化的灵敏生物标志物。在100μg/kg和30μg/kgDP47GSIgG-(IL-2N88D)2处理后不久，CD25在CD4+记忆型和幼稚型Treg以及CD8+FOXP3+Treg中偏好地增加(图41A、图41B)。CD4+记忆型和幼稚型Treg的CD25反应在第4天达到峰值并且在第7天返回基线，而CD8+FOXP3+Treg中的CD25升高在第10-14天持续存在。在用野生型IL-2融合蛋白的试验中，我们显示Ki-67是已经在体内开始增殖的细胞的灵敏胞内标志物并且是食蟹猴中IL-2诱导的活化的灵敏生物标志物。对100μg/kgDP47GSIgG-(IL-2N88D)2的反应显示，80-90％的CD4+和CD8+Treg变成Ki-67+(图42A)，而在30μg/kg后60-90％变成Ki-67+(图42B)。如所示，与Treg相比，受测试的其他细胞亚群反应较少。为了捕获用工程化的新L-2分子增加Treg数目的体内倒数第二影响，全部食蟹猴剂量均转换成pmole/kg，从而允许直接比较，而无论分子量是多大；将剂量依赖性反应作为总CD4+T细胞％的CD4+Treg最大增加逐一比较(图43)。尽管与野生型融合蛋白相比其丧失体外效力，但是DP47GSIgG-(IL-2N88D)2诱导出乎意料大的食蟹猴Treg增加，这可能部分地归因于静脉内和皮下施用后其全身暴露增加。因体内IL-2施用所致的嗜酸性粒细胞增多症当按照剂量1x106至4.5x106IU/人每日给予时，Proleukin在人体内刺激嗜酸粒细胞增多症。在食蟹猴中，大剂量Proleukin或单次226皮摩尔/kg剂量的DP47GSIgG-IL-2反复治疗后，在100％的动物中观察到相似的嗜酸性粒细胞增加(图44)。图44中的结果代表受测试的每只动物(取得测试前动物的群体基线：n＝44和n＝30)和各种IL-2处理组(n＝5-9)，无论嗜酸性粒细胞数目是否正常或升高。与Proleukin和DP47GSIgG-IL-2的作用形成鲜明对比，采用体内剂量170和570皮摩尔/kg(分别是30和100μg/kg)的DP47GSIgG-(IL-2N88D)2时对嗜酸性粒细胞实际上无影响。鉴于这些不同处理引起的Treg扩增的程度，DP47GSIgG-(IL-2N88D)2缺乏诱导全身性嗜酸性粒细胞增多症是惊人的(图43中比较)。DP47GSIgG-IL-2体内处理抑制小鼠中的免疫反应在初步研究中，我们观察到4000IUDP47GSIgG-IL-2剂量在体内活化小鼠FOXP3+调节型T细胞；这种剂量随后用来评估其抑制小鼠中经典T依赖性免疫反应(即迟发型超敏反应(图45))和IgG抗KLH反应(图46)的能力。NOD小鼠和C57BL/6小鼠(n＝7)用绵羊红细胞(srbc)静脉内免疫并且三天后用推注量的srbc在单只后足攻击以诱导迟发型超敏反应(DTH)。攻击后1天后，将小鼠用CO2安乐死并且切除爪及称重。DTH反应的幅度显示为与未免疫的小鼠相比爪重量的变化(Δ爪重量)。在srbc免疫前3天和当日，将DP47GSIgG-IL-2按4000IU/小鼠皮下给予并且运载体是pH7.2的无菌PBS。在GraphPadPrism中从MannWhitney检验导出统计显著性。在绵羊红细胞免疫前3天和当日给予DP47GSIgG-IL-2在NOD小鼠中抑制针对绵羊血细胞攻击的后续迟发型超敏反应达51％(图45A；p＝0.0023)并且在C57BL/6小鼠中抑制达38％(图45B；p＝0.002)。作为阳性对照免疫抑制剂，小鼠CTLA-4-Ig抑制DTH反应到类似于DP47GSIgG-IL-2的水平。DP47GSIgG-IL-2还能够在C57BL/6小鼠(78％抑制，p＝0.0007，图46A)和NOD小鼠(67％抑制，p＝0.004，图46B)中抑制KLH特异性IgG反应。对于这个实验，将年青的健康C57BL/6小鼠(n＝7-10)和NOD小鼠(n＝13-14)如制造商(Stellar)推荐那样用100μg人用疫苗级KLH在无佐剂情况下腹膜内免疫。在免疫当日启动由每周1次(NOD)或2次(C57BL/6)4000IU/小鼠皮下处理组成的DP47GSIgG-IL-2处理。免疫后7天(NOD)和21天(C57BL/6)，采集血液并且通过ELISA测量血清KLH特异性IgG反应。DP47GSIgG-IL-2在体内抑制免疫反应的能力支持以下假设：由低剂量IL-2诱导的调节型T细胞活化产生介导免疫反应减弱的功能性调节型T细胞。＊＊＊虽然已经出于清晰理解的目的，以说明和举例方式某种程度地详细描述了前述发明，但是这些说明和例子不应当解释为限制本发明的范围。本文中援引的全部专利和科学文献的公开内容通过引用方式明确地完整并入本文作为参考。