TCR文库的制作方法

本发明涉及颗粒文库，所述文库展示多种不同T细胞受体(TCR)，其中多种TCR基本由包含α链和β链的TCR组成，所述α链包含来自天然库的α链可变结构域，所述β链包含来自天然库的β链可变结构域，其中α链可变结构域包含TRAV12-2或TRAV21基因产物，并且β链可变结构域包含TRBV6基因产物。背景T细胞受体(TCR)介导T细胞识别特异性主要组织相容性复合物(MHC)-限制型的肽抗原并且对于免疫系统的细胞臂的功能而言是必要的。TCR仅以膜结合的形式存在，并且因此，TCR在历史上非常难以分离。大多数TCR由2条二硫键连接的多肽链，α链和β链组成。本文使用国际免疫遗传学(IMGT)TCR命名描述TCR并且连接到TCR序列的IMGT公共数据库。天然α-β异二聚体TCR具有α链和β链。广泛地，各链包含可变、连接和恒定区，并且β链通常含有可变区和连接区之间的短多变区，但是该多变区通常被认为是连接区的部分。各可变区包含包埋在框架序列中的3个高变CDR(互补决定区)；CDR3被认为是抗原识别的主要介导物。存在几种类型的α链可变区(Vα)和几种类型的β链可变区(Vβ)，它们通过它们的构架、CDR1和CDR2序列，以及通过部分限定的CDR3序列区分。Vα型在IMGT命名中由独特的TRAV数指代。因此，“TRAV21”定义具有独特构架和CDR1以及CDR2序列和CDR3序列的TCRVα，该CDR3部分被氨基酸序列限定，该氨基酸序列在TCR之间保守，但是其也包含TCR之间变化的氨基酸序列。以相同的方式，“TRBV6-5”定义了具有独特的构架与CDR1和CDR2序列，但是仅仅有部分定义的CDR3序列的TCRVβ区。出于本申请的目的，我们使用在α和β基因座内分别有54种功能性α可变基因和67种功能性β可变基因的一般假设。然而，由于功能限定或重复，这一数字可随着研究过程变化并且可能认为α和β可变基因的数量与现在的不同。因此，为了清楚起见，我们一致指在IMGT网站www.imgt.org(2013年3月10日获得)上发现的国际免疫遗传学(IMGT)TCR命名。类似地，TCR的连接区由独特IMGTTRAJ和TRBJ命名所定义，并且恒定区由IMGTTRAC和TRBC命名所定义。β链多变区在IMGT命名中以缩写TRBD提及并且如上所述，级联的TRBD/TRBJ区通常一起被认为是连接区。编码TCRα和β链的基因集合位于不同的染色体上并且含有分离的V、(D)、J和C基因区段，其通过在T细胞发育期间重排而汇聚在一起。由于在54个TCRα可变基因和61个αJ基因之间或者67个β可变基因、2个βD基因和13个βJ基因之间出现的大量潜在重组事件，这导致T细胞α和β链非常高的多样性。重组过程并不精确并且在CDR3区内引入另外的多样性。各α和β可变区也可含有等位基因变体，在IMGT命名中分别称为TRAVxx*01和*02，或TRBVx-x*01和*02，因此进一步增加的变化形式的量。通过相同的方式，TRBJ序列中的一些具有2种已知变化形式。(请注意没有限定符“*”表示相关序列仅已知一种等位基因)。已经估计通过重组和胸腺选择产生的人TCR的天然库包含由CDR3多样性所确定(Arstila,T.P.等，(1999)Science,286(5441),958-61)的大约106种独特β链序列，并且甚至可能更高(Robins,H.S.等，(2009)Blood,114(9),4099-4107)。估计各β链与至少25种不同的α链配对，因此生成另外的多态性(Arstila,T.P.等，(1999)Science,286(5441),958-61)。在本申请的说明书和权利要求中，术语“TCRα可变结构域”因此是指TRAV和TRAJ区的级联，仅TRAV区，或仅TRAV和部分TRAJ区，并且术语TCRα恒定结构域是指胞外TRAC区或者是指C-末端截短的TRAC序列。类似地，术语“TCRβ可变结构域”可指TRBV和TRBD/TRBJ区的级联，仅TRBV和TRBD区，仅TRBV和TRBJ区，或仅TRBV和部分TRBD和/或TRBJ区，并且术语TCRβ恒定结构域是指胞外TRBC区或者是指C-末端截短的TRBC序列。由IMGT命名定义的独特序列是TCR领域工作人员广泛熟知并可得的。例如，可在IMGT公共数据库中检索到它们。《T细胞受体资料手册》(TcellReceptorFactsbook)，(2001)LeFranc和LeFranc，学术出版社(AcademicPress)，ISBN0-12-441352-8也公开了由IMGT命名定义的序列，但是由于其出版日期和随后的时间延迟，其中的信息有时需要通过参考IMGT数据库来确认。长期需要鉴定基本由特异性结合至特定抗原的天然α和β链序列组成的TCR，使得能够开发出例如该TCR或其可溶性类似物以提供潜在治疗的基础。由鉴定的TCR识别的抗原可与疾病，如癌症、病毒感染、自身免疫疾病、寄生虫感染和细菌感染相关。因此，这类疗法可用于治疗所述疾病。此外，一旦已经鉴定到天然或自然TCR并确定其序列，可根据需要引入导致亲和性或半衰期增加的突变，如WO2012/013913中所述的那样。传统上，鉴定特异性结合至疾病相关抗原，如癌症、病毒、自身免疫或细菌抗原的TCR的尝试局限于使用从志愿者供体获取的血液样品。可使用这类样品来分离T细胞及其结合疾病相关抗原的相应TCR。这种方法一般需要至少20个供体。过程漫长且费力，并且无法保证鉴定到抗原结合T细胞受体。在鉴定到功能性T细胞受体的情况中，它们通常在体外对抗原有弱亲和性，低特异性，和/或不恰当折叠。能够分泌的T细胞的多样性局限于供体内的T细胞多样性。一些疾病相关抗原，包括大多数的癌症抗原是自身抗原；因为胸腺选择去除了识别自身抗原的TCR，针对疾病相关抗原有特异性的TCR可能在供体的天然库中不存在，或者可能对抗原有弱亲和性。设计新的文库来分离具有抗原结合特异性的新TCR的尝试已经持续多年。产生TCR文库远远难于相当的抗体文库，因为TCR链较不稳定并且通常不正确展示。构建TCR文库所涉及的复杂性是巨大的。优选在CDR3长度上保留变化(如天然库中发现的那样)。任何文库的大量部分一般由于终止密码子、移码、折叠问题和仅仅不能结合HLA复合物的TCR链组合而丢失。考虑到大量的可变α和可变β基因，以及J和D基因，产生并鉴定一起形成以需要的特异性结合至抗原肽的TCR的功能性折叠的α链和功能性折叠的β的几率是极低的。在构建文库上已经进行了多种尝试。本文下文中首先描述的是基于合成TCR文库；即，文库中的TCR含有突变，一般在CDR内，其已经在体外使用随机突变导入。因此，在这些文库中含有的任意单独TCR链的序列可能不对应于天然库中发现的任意。由于在合成文库中仅存在某些突变，整个文库将不对应于天然库。在之前公开的合成文库中，向单个已知TCR的α和β链的CDR区中导入随机突变，使得文库中的所有TCR都含有相同的α和β框架序列，但有随机生成的CDR序列。对文库的进一步分析证明，鉴定抗原特异性TCR是不成功的。具体地，由于多种原因，发现很大比例的TCR链是非功能性的：在许多情况中，序列是截短的或含有移码。在其他情况中，虽然鉴定到全长TCR链，但它们不能正确折叠；最后，当经过进一步测试时，从文库中分离的TCR不能特异性结合至抗原。这些合成文库中的非天然多样性被认为是文库不成功一个原因。引入非天然突变可能干扰了适当的TCR功能。此外，与天然TCR库相比，CDR3中引入的多样性可能受到限制。如天然库中CDR3序列长度所示，在T细胞中的TCR组装期间，生成了CDR3序列中的巨大多样性。基于在特定位置上突变的文库，CDR3序列的多样性可能受到非常多的限制，尤其是对于CDR3序列长度。最后，合成TCR序列将不会经过在体内发生的胸腺选择过程。这些原因在一定程度上解释了(不受理论限制)为何构建下述的希望从中鉴定到特异性结合TCR的文库的尝试是不成功的。WO2005/116646描述了一种基于已知(天然)TCR的文库，其中6个CDR经单独或组合突变，即文库中的所有TCR是合成的，但是基于天然鉴定的TCR框架区。WO2005/114215还涉及从这种文库中获得的产物。用多种其他抗原筛选文库(除了原始TCR结合的抗原以外)。然而，这导致仅分离一条复制性全长TCR序列。在其他实验中，发现这种TCR是交叉反应性的。因此，已经构建了基于体外-突变的TCR的文库，但还不能分离具有抗原结合特异性的新TCR。已经构建了基于完整天然库的文库(其中天然衍生的α和β链随机混合，如下所述)，但是没有成功鉴定特异性结合抗原的任何TCR。具体地，WO2005/116074描述了核蛋白文库，其各自在其表面上展示包含天然TCRα可变结构域序列和天然TCRβ可变结构域序列的多肽。该公开中所述的文库从多个α和β链构建；在用于生成文库的cDNA从中扩增的mRNA集合中代表了43个Vα类基因和37个Vβ类基因。该文献显示3轮噬菌体展示导致分离与测试的肽结合的克隆。这些克隆描述为在ELISA筛选期间鉴定，如通过强ELISA信号所确定。然而，当测试这些克隆结合替代的肽-HLA时也观察到强ELISA信号；因此，TCR克隆对肽无特异性。对该文库的进一步分析显示与上述合成文库类似的问题，其中它们含有大比例的非复制性TCR链以及不能正确折叠的TCR。本文所述的文库因此不能用于鉴定新的抗原结合TCR。因此，需要能够更可靠地鉴定包含天然α链可变结构域和天然β链可变结构域的功能性TCR的TCR文库，其文库可使用多种肽抗原筛选以鉴定这类有用的TCR。然后，鉴定的TCR可以其天然亲和性使用，或者可用于，例如噬菌体展示突变，以增强亲和性。因此，本发明在第一方面提供了颗粒文库，所述文库展示多种不同T细胞受体(TCR)，其中多种TCR基本由包含α链和β链的TCR组成，所述α链包含来自天然库的α链可变结构域，所述β链包含来自天然库的β链可变结构域，其中α链可变结构域包含TRAV12-2和/或TRAV21基因产物，并且β链可变结构域包含TRBV6基因产物。可变结构域如上所述，即，它们也可分别包含完整或部分TRAJ或TRBD和/或TRBJ区。本发明在第二方面还提供了颗粒文库，所述文库展示多种不同TCR，其中多种TCR基本由包含α链和β链的TCR组成，所述α链包含来自天然库的α链可变结构域，所述β链包含来自天然库的β链可变结构域，其中α链可变结构域包含TRAV12-2和/或TRAV21基因产物，并且β链可变结构域包含TRBV6基因产物，并且其中至少一部分的TCR包含具有非天然突变的β链可变结构域和/或α链可变结构域。TRBV6基因产物可以是TRBV6-1、TRBV6-2、TRBV6-3、TRBV6-5或TRBV6-6基因产物中的任意。TCRα链可变结构域包含TRAV12-2基因产物。或者，TCRα链可变结构域包含TRAV21基因产物。α链可变结构域和β链可变结构域可展示为单个多肽链。TCR在颗粒上展示并且可在α链的恒定区与β链的恒定区之间包含非天然二硫键。例如，WO03/020763中描述了这类非天然二硫键。当在文库的颗粒上展示的TCR包含恒定区1结构域时，TCR可在α链的恒定区与β链的恒定区之间包含天然二硫键。各α链和各β链可包含优选异源的二聚化结构域。这种异源结构域可以是亮氨酸拉链、5H3结构域或疏水性富脯氨酸反结构域、或其他类似方案，如本领域所知。形成文库的颗粒可以是噬菌体颗粒。或者，文库可以是核糖体文库。或者，文库可以是酵母展示文库，因此颗粒可以是酵母细胞。本发明的另一个方面提供了从本发明的第一方面的文库获得的包含含有TRAV12-2基因产物或TRAV21基因产物的TCRα链可变结构域和含有TRBV6基因产物的TCRβ链可变结构域的分离的T细胞受体(TCR)。这种TCR的TRBV6基因产物可以是TRBV6-1、TRBV6-2、TRBV6-3、TRBV6-5或TRBV6-6基因产物。TCR优选是可溶的。本发明还包括编码TCRα链可变结构域和/或TCR的β链可变结构域的核酸。在另一个方面，本发明提供了使用第一或第二方面的文库鉴定特异性结合至肽抗原的TCR。肽抗原可用于筛选本发明的文库中与其结合的TCR。在其他实施方式中，本发明涉及制备颗粒文库的方法，所述文库展示多种不同TCR，所述方法包括：i)获得编码不同TRAV12-2或TRAV21α链可变结构域的多种核酸；ii)获得编码不同TRBV6β链可变结构域的多种核酸；iii)将TRAV12-2或TRAV21α链可变结构域编码核酸克隆到表达载体中；iv)将编码TRBV6β链可变结构域的核酸克隆到相同或不同载体中；和v)在颗粒中表达载体，从而生成基本由TCR组成的文库，所述TCR包含由核酸编码的α链可变结构域和β链可变结构域。提供了本发明的另一个制备颗粒文库的方法，所述文库展示多种不同的TCR，所述方法包括：i)使用与TRAV12-2或TRAV21α链可变结构域杂交的引物获得编码不同TRAV12-2或TRAV21α链可变结构域的多种核酸；ii)使用与编码TRBV6β链可变结构域的核酸杂交的引物获得编码不同TRBV6β链可变结构域的多种核酸；iii)将TRAV12-2或TRAV21α链可变结构域编码核酸克隆到表达载体中；iv)将TRBV6β链可变结构域编码核酸克隆到相同或不同的载体中；和v)在颗粒中表达载体，从而生成基本由TCR组成的文库，该TCR包含由与所述引物杂交的核酸所编码的α链可变结构域和β链可变结构域。正向引物设计为与TRAV12-2基因座、TRAV21基因座或TRBV6基因座杂交。反相引物设计为分别至少部分与α或β恒定区杂交，使得所得的PCR产物含有可变区，至连接区和至少部分恒定区。转录、翻译或转录后事件可能导致连接和/或恒定区，在β链序列的情况中包括递送区的一些或所有的截短或删除。优选地，步骤(i)和步骤(ii)的核酸获自天然库。在一些情况中，在步骤iii)之前将非天然突变引入核酸。可在步骤i)和/或ii)之后，或步骤iii)和/或iv)之后引入突变。TRBV6β链可变结构域可以是TRBV6-1、TRBV6-2、TRBV6-3、TRBV6-5或TRBV6-6β链可变结构域。在制备本发明的文库的任一方法中，TCRα链可变结构域和TCRβ链可变结构域优选表达成单链多肽，即，编码各α链和β链可变结构域的核酸被克隆到相同载体中。本发明在另一个方面提供了获得特异性结合至肽抗原的T细胞受体，包括用肽抗原筛选本发明的第一或第二方面的文库。按照本发明在其表面显示TCR的颗粒也包括在本发明的范围内。本发明的文库是非天然产生的，因为其包含非天然产生的TCR或者在本文中使用时被认为“分离的”那些；并且因此，本发明的TCR可能是专利适格的对象，因为这类TCR不是天然产生的或者在本文中使用时被认为“分离的”那些。类似地，本发明的细胞和颗粒是专利适格的对象，因为通过在其表面上展示或表达本发明的TCR，该细胞或颗粒不是天然产生的或者本文中使用时会被认为是“分离的”。还应注意，在该公开文件以及特别在权利要求和/或段落中，诸如“包含”等的术语具有对其赋予的通常含义，例如，其可表示“包括”等；且诸如“基本由……组成”的术语具有一般对其赋予的含义，例如，其允许未明确列出的要素，但排除发现于现有技术中或影响本发明基本或新颖性的要素。公开了这些和其他实施方式，其在下述发明详述中明显并包括于其中。附图说明以下发明详述以示例的形式给出但不旨在单独将本发明限制为所述特定实施方式，其最好可连同所附附图进行理解，其中：图1列出了用于产生文库的克隆策略；图2详细描述了文库产生中使用的引物序列；图3显示了来自用4种不同的肽HLA抗原淘选的TRAV12.2/21TRBV6*集合文库的ELISA筛选的结果。CMV表示阴性对照抗原；图4显示了来自由单个HLA-A2/A24阴性供体制备并用3种肽HLA抗原淘选的TRAV12.2/21TRBV6*集合文库的ELISA筛选结果。CMV表示阴性对照抗原；图5显示了用2种肽HLA抗原淘选的TRAV12.2TRBV6*/TRAV21TRBV6*单个文库的ELISA筛选的结果。CMV表示阴性对照抗原；图6显示了从市售mRNA源制备并用2种肽HLA抗原淘选的TRAV12.2TRBV6*/TRAV21TRBV6*单个文库的ELISA筛选的结果。CMV表示阴性对照抗原；图7显示了对从本发明的文库分离的TCR的其他特异性测试；和图8显示了从本发明的文库中分离的抗原特异性TCR的可溶版本的Biacore结合曲线。根据本发明，提供了颗粒文库，所述文库展示多种不同T细胞受体(TCR)，其中多种TCR基本由包含α链和β链的TCR组成，所述α链包含来自天然库的α链可变结构域，所述β链包含来自天然库的β链可变结构域，其中α链可变结构域包含TRAV12-2和/或TRAV21基因产物，并且β链可变结构域包含TRBV6基因产物。“基本由……组成”表示文库上大部分的TCR包含TRAV12-2或TRAV21和TRBV6，但是少量由于制备文库时引物的非特异性杂交，或者在α或β链可变基因座基因中的基因之间高度同源性的区域而包含不同的α或β链可变结构域。如下定义大部分的量。多种TCR可由80％的包含含有TRAV12-2或TRAV21基因产物的α链可变结构域和含有TRBV6基因产物的β链可变结构域的TCR组成。多种TCR可由85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的包含含有TRAV12-2或TRAV21基因产物的α链可变结构域和含有TRBV6基因产物的β链可变结构域的TCR组成。多种TCR中剩余的20％或更少包含与TRBV6β链可变结构域基因产物配对的不同α链可变结构域基因产物，与TRAV12-2或TRAV21可变结构域基因产物或截短/非复制型链配对的不同β链可变结构域基因产物。因此，在一些实施方式中，TCRα链可变结构域包含TRAV12-2基因产物并且在其他实施方式中，TCRα链可变结构域包含TRAV21基因产物。文库可包含多种TCR，其中TCR的一部分包含TRAV12-2基因产物并且TCR的一部分包含TRAV21基因产物。本发明的文库因此可含有多种TCR，各自具有以下的α链和β链V、J、(D)和C基因使用：α链-TRAV21/TRAJxx/TRAC；或α链-TRAV12-2/TRAJxx/TRAC；和β链-TRBV6-y/TRBDx/TRBJxx/TRBC1，TRBC2，或C1和C2的嵌合体，其中xx分别是61个αJ基因或13个βJ基因中的任意，并且Dx代表2个βD基因中的任一。TRBV6-y表示使用的TRBV6等位基因可以变化。TRBV基因产物可以是TRBV6-1、TRBV6-2、TRBV6-3、TRBV6-5或TRBV6-6基因产物。如上所述，J、D或C区可各自是完全的或部分存在或缺失。“来自天然库”表示TCRα和β链可变结构域从已经获自人供体的DNA序列表达。换而言之，文库的TCR的α和β可变结构域的多样性在体内T细胞发育期间已经天然产生。此外，这意味着文库中所有的α和β链的序列已经在胸腺选择期间被选择。与体内原始存在的相比(即，在供体中)，在文库产生期间发生的这些α和β链的随机组合可能导致αβ链组合的替代库。例如，可通过从供体mRNA产生cDNA来直接获得DNA序列。然后cDNA序列可用作模板来产生DNA序列，从中产生多种不同的TCR。基因产物表示可包括翻译后修饰的多肽，其被所示基因的核酸序列编码。如本领域技术人员已知，各TCRα或β链可变结构域基因在CDR3区中含有变化形式，如上所述，意味着基因产物也将大幅变化。本发明的文库优选包含至少1x108个展示αβTCR链组合的颗粒。文库可以是噬菌体颗粒文库。噬菌体展示描述于WO2004/044004。或者，文库是核糖体文库。核糖体展示为本领域已知。颗粒可以是完全核糖体复合物或其部分。可使用酵母展示系统，意味着文库可以是酵母细胞文库。适用于产生TCR文库的其他展示方法是哺乳动物细胞展示。该系统使用逆转录病毒载体来将TCRα和β链导入TCR-阴性T细胞杂交瘤。该方法还描述于Chervin等，(2008)JImmunolMethods,339,175-84；和Kessels等，(2000)ProcNatlAcadSciUSA,97,14578-83。本发明包括能够展示所述异二聚或单链TCR的颗粒文库。α和/或β链恒定结构域可相对于天然/自然产生的TRAV/TRBV序列截短。另外，存在时，TRAC/TRBC可含有修饰。α链胞外序列可相对于天然/自然产生的TRAC包含修饰，从而参考IMGT编号的TRAC的氨基酸T48被C48替换。类似地，β链胞外序列可包含相对于天然/自然产生的TRBC1或TRBC2的修饰，从而参考IMGT编号的TRBC1或TRBC2的S57被C57替换，并且C75被A75替换，并且N89被D89替换。这些与天然α和β链胞外序列相关的半胱氨酸取代能够形成非天然链间二硫键，其使得重折叠的可溶性TCR稳定化，即通过重折叠胞外α和β链形成的TCR。这个非天然二硫键促进了噬菌体上正确折叠的TCR的展示(Li,Y.等，NatBiotechnol2005:23(3),349-54)。另外，使用稳定的二硫键连接的可溶性TCR能够更方便地评价结合亲和性和结合半衰期。替代性取代描述于WO03/020763。或者，α和β恒定结构域可通过对应于自然中发现的那些的二硫键连接。为了进一步或另外使异二聚TCR稳定化，各α链和各β链可包含二聚化结构域，其可相对于天然TCR链序列异源。具体地，二聚化结构域可以是亮氨酸拉链。该术语描述了互相以特定方式相互作用以形成异二聚体的螺旋肽对。发生相互作用，因为在各拉链肽的一侧上有互补的疏水性残基。肽的本质是异二聚体的形成远比螺旋同二聚体的形成更为有利。亮氨酸拉链可以是合成的或天然产生的，如WO99/60120中所述的那些。替代性的二聚化结构域包括二硫键桥形成元件。或者，其可由负责参与信号转导的蛋白质之间看到的蛋白质-蛋白质相互作用的SH3结构域和疏水性/富脯氨酸反结构域提供(由Schlessinger综述(Schlessinger,J.,CurrOpinGenetDev.1994年2月；4(1):25-30))。参与信号转导级联的蛋白质之间发现的其他天然蛋白质-蛋白质相互作用依赖于翻译后修饰的氨基酸和特异性识别这类经修饰残基的蛋白质模块之间的结合。这类翻译后修饰的氨基酸和蛋白质模块可形成本发明的文库的TCR链的二聚化结构域。不受理论限制，本发明的文库大小，即其中代表的α和β链可变结构域基因相对于完全(或接近完全)的库减少的数量被认为是能够从本发明的文库中鉴定特异性功能性TCR的一个可能原因。在之前所述的更大的“天然”文库中，可能某些α链并不与某些β链配对，并且因此许多文库是非功能性的。某些链类型可能不在噬菌体表面上正确折叠。可能通常各α链不充足表达或充分展示以与“理想”β链配对，反之亦然，并且因此降低了鉴定到包含α和β链的特异性功能性TCR的几率。此外，某些α或β链序列可能不是主导的，并且因此作用是“毒害”文库。本发明还提供了颗粒文库，所述文库展示多种不同TCR，其中多种TCR基本由包含来自天然库的α链可变结构域和来自天然库的β链可变结构域的TCR组成，其中α链可变结构域包含TRAV12-2和/或TRAV21基因产物，并且β链可变结构域包含TRBV6基因产物，并且其中至少一部分的TCR包含具有非天然突变的β链可变结构域和/或α链可变结构域。可通过本领域已知的任意方法导入非天然突变。非天然突变可随机生成，或特异性限定，或同时通过两者生成。例如，随机生成的突变可使用位点饱和诱变在限定位置处纳入，其中天然氨基酸编码序列被所有其他天然产生的氨基酸的编码序列替换；从而在限定位置处产生其他文库多样性。该方法可包括使用采用简并合成寡核苷酸作为引物的PCR扩增来复制感兴趣的DNA。或者，或另外，使用例如市售试剂盒，如来自司查塔基公司(Stratagene)的快速改变定点诱变试剂盒(QuikChangeSiteDirectedMutagensisKit)可在特定位置处导入限定的突变，包括插入和删除。优选地，将非天然突变纳入CDR区。文库可展示TCR，其中10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的α链可变结构域或β链可变结构域包含非天然突变。本发明的另一个方面提供了根据本发明的第一方面的文库分离的包含含有TRAV12-2基因产物或TRAV21基因产物的TCRα链可变结构域和含有TRBV6基因产物的TCRβ链可变结构域的分离的T细胞受体(TCR)。“分离的”表示TCR从其天然环境中移出，即，不是在体内T细胞上天然展示的TCR。TCR可特异性结合至肽抗原。如通过，例如但不限于ELISA或BiaCore所测定，获自本发明的文库的这种TCR可以高亲和性和高特异性结合至肽抗原。可通过进一步亲和性成熟来获取TCR，使得结合亲和性和/或半衰期增加。TCR可以是可溶的，即其可从跨膜结构域上切下，如WO03/020763中所述。TCR可含有非天然二硫键，如上所述。TCR可与可检测的标记物融合，包括但不限于荧光标记物、放射性标记物、酶、核酸探针和造影剂，或者与治疗剂融合，包括但不限于，免疫调节剂、放射性化合物、酶(例如，穿孔蛋白)或化疗剂(例如，顺铂)(WO2010/133828)。TCr可在细胞，优选哺乳动物细胞，更优选免疫细胞，甚至更优选T细胞表面上非天然表达。可通过任意合适的方法来确定结合亲和性(与平衡常数KD呈反比)和结合半衰期(表示为T1/2)。将理解TCR的亲和性翻倍导致KD减半。T1/2计算为ln2除以解离速率(koff)。因此，T1/2翻倍导致koff减半。通常对TCR的可溶形式测量TCR的KD和koff值，即截短以去除疏水性跨膜结构域残基的那些形式。因此，应理解如果给定TCR的可溶形式满足对肽抗原的结合亲和性和/或结合半衰期的要求，则该TCR满足该要求。优选地，使用相同的试验方案多次在限定温度下测量给定的TCR的结合亲和性或结合半衰期，并且取结果的平均值。更优选地，通过在25℃的温度下的表面等离振子共振来测量结合亲和性或结合半衰期。实施例10中给出了优选的方法。出于上述目的，如上所述，TCR是具有至少一个TCRα和至少一个TCRβ可变结构域的部分。通常，其将同时包含TCRα可变结构域和TCRβ可变结构域。它们可以是αβ异二聚体，或者可以是单链形式，其表示同时含有α链和β链的单个多肽，如WO2004/033685中所述。或者，TCR可包含通过一对C-端二聚化肽，如亮氨酸拉链与TCRβ链包围结构域二聚化的TCRα链胞外结构域，如WO99/60120中所述的TCR。为了在过继性治疗中使用，αβ异二聚体TCR可以例如以具有胞质和跨膜结构域的全长链转染到细胞，如T细胞中。如果需要，相应恒定区的残基之间导入的二硫键可以存在(参见例如WO2006/000830)。或者，α和β恒定结构域可通过对应于自然中发现的那些的二硫键连接。重要的是注意到无论哪种形式，本发明第一方面的文库的TCR，就α和β可变结构域而言，来自天然产生的序列，其与作为用于生成cDNA的模板的供体mRNA相比未经修饰或突变，所述cDNA用于从中扩增TCR链。本发明包括编码本发明的TCR的TCRα链可变结构域和/或TCRβ链可变结构域的核酸。α和β链可从分开的核酸或一个核酸分子表达。如果从相同的核酸分子，α和β链可以独立的多肽，或单链表达。核酸包含TRAV12-2或TRAV21序列和/或TRBV6核酸序列。核酸也可包括TRAJ序列和/或TRBD/TRBJ序列。核酸也可包括TRAC和/或TRBC1或TRBC2核酸序列，或其部分序列。在本发明的另一个方面，提供了使用第一或第二方面的文库鉴定特异性结合至肽抗原的TCR。如上所述，由于多种原因，需要特异性结合至肽抗原的TCR。本发明的另一个方面提供了制备本发明的第一方面的文库的方法。该方法包括：i)获得编码不同TRAV12-2或TRAV21α链可变结构域的多个核酸；ii)获得编码不同TRBV6β链可变结构域的多个核酸；iii)将TRAV12-2或TRAV21α链可变结构域编码核酸克隆到表达载体中；iv)将编码TRBV6β链可变结构域的核酸克隆到相同或不同载体中；和v)在颗粒中表达载体，从而生成基本由TCR组成的文库，该TCR包含由核酸编码的α链可变结构域和β链可变结构域。可通过PCR，或合成型构建获得核酸，例如，使用固相DNA合成，如生命技术公司(LifeTechnologies)商业运营。可通过复制/扩增核苷酸序列反式cDNA来获得i)和ii)的核酸，其已经从来自供体的T细胞库的mRNA制备。获得的编码不同TRAV12-2或TRAV21α或TRBV6β链可变结构域的核酸可以是获得的唯一核酸，即，步骤i)可包括仅获得编码不同TRAV12-2或TRAV21α链可变结构域的核酸，并且步骤ii)可包括仅获得编码不同TRBV6β链可变结构域的核酸。生成的文库可以是基本由包含来自天然库的α链可变结构域和来自天然库的β链可变结构域的TCR组成的文库，其中α链可变结构域包含TRAV12-2或TRAV21基因产物并且β链可变结构域包含TRBV6基因产物。本发明还提供了制备颗粒文库的方法，所述文库展示多种不同的TCR，所述方法包括：i)使用与TRAV12-2或TRAV21α链可变结构域杂交的引物获得编码不同TRAV12-2或TRAV21α链可变结构域的多种核酸；ii)使用与编码TRBV6β链可变结构域的核酸杂交的引物获得编码不同TRBV6β链可变结构域的多种核酸；iii)将TRAV12-2或TRAV21α链可变结构域编码核酸克隆到表达载体中；iv)将TRBV6β链可变结构域编码核酸克隆到相同或不同的载体中；和v)在颗粒中表达载体，从而生成基本由TCR组成的文库，该TCR包含由与所述引物杂交的核酸所编码的α链可变结构域和β链可变结构域。根据杂交反应发生的条件以及杂交核酸序列的组成和长度，两条单链序列将互相杂交，即使两条序列之间没有100％序列相同性。一般而言，杂交温度和杂交缓冲剂的离子强度(如Mg2+浓度)将决定杂交的严谨性。高严谨性，如高杂交温度和杂交缓冲剂中低盐使得杂交仅发生在高度相似的核酸序列之间，而低严谨性，如低温和高盐，能在序列相似性较低时杂交。关于达到某些程度的严谨性的杂交条件的计算可易于由本领域技术人员进行，并且描述于Sambrook等，(1989)，《分子克隆》(MolecularCloning)，第二版，纽约州普莱恩维尤的冷泉港实验室(ColdSpringHarborLaboratory)，(第9章和第11章)。本领域技术人员能够根据敏感性和特异性测试的结果优化杂交条件。下面是用于本发明的一组示例性杂交条件：非常高严谨性(检测有至少90％相同性的序列)杂交:5xSSC，65℃下持续16小时洗涤两次:2xSSC，室温(RT)下各持续15分钟洗涤两次:0.5xSSC，65℃下各持续20分钟高严谨性(检测有至少80％相同性的序列)杂交:5x-6xSSC，65℃-70℃下持续16-20小时洗涤两次:2xSSC，室温下各持续5-20分钟洗涤两次:1xSSC，55℃-70℃下各持续30分钟低严谨性(检测有至少50％相同性的序列)杂交:6xSSC，室温至55℃下持续16-20小时洗涤至少两次:2x-3xSSC，室温至55℃下各持续20-30分钟。本文所述的引物可在低严谨性、高严谨性、和非常高严谨性条件下杂交编码Trav12或TRAV21α链可变结构域或TRBV6β链可变结构域的核酸。引物可以高严谨性结合至编码α和β链可变结构域的序列。然而，引物可结合至与TRAV12-2、TRAV21和/或TRVB6有高度同源性的一些其他基因座。两种方法的TRBV6编码核酸可以是TRBV6-1、TRBV6-2、TRBV6-3、TRBV6-5或TRBV6-6基因产物。步骤i)和ii)的核酸可来自天然库。在步骤iii)之前或在步骤iii)之后，非天然突变可导入α或β可变结构域，即，可在克隆到载体中之前向核酸序列导入非天然突变。或者，可在iii)和/或iv)的克隆步骤之后导入非天然突变。TRAV12-2或TRAV21可变结构域的扩增可来自预制的cDNA文库，其本身来自供体mRNA，正向引物设计为特异性结合至感兴趣的基因座。反向引物可设计为特异性结合至(至少部分)TCRα恒定区，使得所得的PCR产物含有TRAV12-2或TRAV21核酸序列、连接区和至少部分恒定区。这类引物设计确保捕获α链可变结构域CDR3的变化和多态性，导致本发明的文库中代表了大量独特的TCRα链序列。优选地，供体是人。类似地，TRBV6可变结构域的扩增可来自可及的cDNA文库，用设计为特异性结合至感兴趣基因座的正向引物。反向引物可设计为特异性结合至TCRβ恒定区，使得所得的PCR产物含有TRBV6核酸序列、连接区(含有D和J基因座)和至少部分恒定区。这类引物设计确保捕获β链可变结构域CDR3的变化和多态性，导致本发明的文库中代表了大量独特的TCRβ链序列。mRNA分离自至少一个供体。“来自至少一个供体”表示α或β链可变结构域的多肽序列基本与其在获得mRNA的供体的T细胞中天然产生的相同。所得的PCR产物可直接连接至噬菌体载体，如果其含有完全恒定基因序列，前提是所需的连接和重组序列存在于载体和引物序列中。或者，α和βPCR产物可分别用含α恒定结构域基因序列和β恒定结构域基因序列的缝合在一起以获得完全TCR链序列。α链和β链可随机缝合在一起以增加噬菌体文库的多样性。然后可将完全序列克隆到噬菌体载体中，以表达成开放阅读框(如图1所示)。或者，也可使用其他颗粒展示形式来产生本发明的文库。这类方法为本领域技术人员已知并且可包括但不限于在核糖体颗粒或酵母细胞上展示。这些展示方法落入2大类，体外和体内展示。所有体内展示方法依赖于这样一个步骤，其中，将通常在可靠颗粒如质粒或噬菌体复制子的基因组核酸中编码的文库或与之一起编码的文库导入细胞以表达蛋白质或多肽(Plückthun(2001)AdvProteinChem55367-403)。有多种已经证明适于蛋白质或多肽的体内展示的复制子/宿主系统。这些包括：噬菌体/细菌细胞质粒/CHO细胞基于酵母2μm质粒/酵母细胞的载体杆状病毒/昆虫细胞质粒/细菌细胞逆转录病毒载体/哺乳动物体内展示方法包括细胞表面展示方法，其中向宿主细胞引入质粒，所述质粒编码由与细胞表面蛋白质或多肽融合的感兴趣蛋白质或多肽组成的融合蛋白。这种融合蛋白的表达导致细胞表面上展示感兴趣的蛋白质或多肽。展示这些感兴趣蛋白质或多肽的细胞然后可经过选择过程，如FACS并且可从选择的一个或多个细胞获得的质粒可经分离和测序。已经针对哺乳动物细胞(Higuschi(1997)JImmunol.Methods202193-204),yeastcells(Shusta(1999)JMolBiol292949-956)和细菌细胞(Sameulson(2002)J.Biotechnol96(2)129-154)设计了细胞表面展示系统。在酵母细胞上展示单链TCR是本领域已知的(WO01/48145)。已经公开了各种体内展示技术的多篇综述。例如，(Hudson(2002)ExpertOpinBiolTher(2001)1(5)845-55)和(Schmitz(2000)21(SuppA)S106-S112)。体外展示技术基于使用核糖体来将mRNA的文库翻译成蛋白质或多肽变体的多样化阵列。通过两种方法中的一种来维持形成的蛋白质或多肽与编码这些分子的mRNA之间的连接。常规核糖体展示采用编码短(一般40-100个氨基酸)接头序列和待展示的蛋白质或多肽的mRNA序列。接头序列给予展示的蛋白质或多肽足够的空间来重折叠而不受核糖体的空间位阻。mRNA序列缺少“终止”密码子，这确保了表达的蛋白质或多肽和RNA保持接合在核糖体颗粒上。相关的mRNA展示方法基于制备编码感兴趣的蛋白质或多肽的mRNA和携带嘌呤霉素部分的DNA接头。只要核糖体到达mRNA/DNA连接处，翻译停止并且嘌呤霉素与核糖体形成共价连接。这两种相关的体外展示方法的综述参见(Amstutz(2001)CurrOpinBiotechnol12400-405)。特别优选的是，基于噬菌体颗粒表达与其表面蛋白融合的异源肽或多肽的能力的噬菌体展示技术(Smith(1985)Science2171315-1317)。该过程非常普遍，并且为多肽单体展示领域所熟知。二聚蛋白，如异二聚TCR的展示也是本领域所中成熟的(WO04/044004)。有两种同时应用于单体和二聚体展示的主要过程：首先(方法A)，通过将与编码噬菌体外壳蛋白(例如，编码蛋白质P3或P8的DNA)融合的编码异源肽或多肽的DNA插入载体(噬菌粒)中。然后通过用噬菌粒转染细菌细胞来进行展示异源肽或多肽的噬菌体颗粒的表达，然后用“复制噬菌体”来感染转染的细胞。辅助噬菌体用作未由产生功能性噬菌体颗粒所需的噬菌粒所编码的噬菌体蛋白的来源。其次(方法B)，通过将编码异源肽或多肽的DNA插入与编码噬菌体外壳蛋白的DNA融合的完整噬菌体基因组。然后通过用噬菌体基因组感染细菌细胞来进行展示异源肽或多肽的噬菌体颗粒的表达。该方法具有第一方法的“单步骤”过程的优势。然而，可被成功包装到所得噬菌体颗粒中的异源DNA序列的尺寸降低。M13、T7和λ是适用于该方法的噬菌体的示例。方法B的变化形式包括向编码待展示异源肽的噬菌体基因组中的DNA加入编码核苷酸结合结构域的DNA序列，并且另外向噬菌体基因组加入相应的核苷酸结合位点。这导致异源肽直接结合至噬菌体基因组。然后将这种肽/基因组组合物包装成展示异源肽的噬菌体颗粒。该方法完全描述于WO99/11785。然后可回收噬菌体颗粒并用于研究异源肽或多肽的结合特性。一旦分离，可从肽或多肽展示噬菌体颗粒上回收噬菌粒或噬菌体DNA，并且该DNA可通过PCR复制。可使用PCR产物可对给定噬菌体颗粒展示的异源肽或多肽进行测序。单链抗体或其片段的噬菌体展示已经成为研究这些多肽的结合特性的常规手段。存在多本对噬菌体展示技术和噬菌体生物学的综述的书籍(参见，例如，《噬菌体展示-实验室手册》(PhageDisplay–ALaboratoryManual)，Barbas等，(2001)，冷泉港实验室出版社(ColdSpringHarbourLaboratoryPress))。第三种噬菌体展示方法(方法C)依赖于在所需的位置处有半胱氨酸残基的异源多肽可被噬菌粒或噬菌体基因组以可溶形式表达，并且导致与在表面暴露位置处也有半胱氨酸残基的修饰的噬菌体表面蛋白通过在2个半胱氨酸之间形成二硫键而结合。WO01/05950详细描述了使用这种替代性连接方法来表达单链抗体衍生的肽。如上所述，本发明的αβ异二聚TCR可在它们的恒定结构域之间有引入的(非天然)二硫键。这可在通过将扩增的核酸序列缝合到修饰的恒定基因序列来制备本发明的文库的方法期间实现。这类序列可包括具有TRAC恒定结构域序列和TRBC1或TRBC2恒定结构域序列的那些(除TRAC的Thr48和TRBC1或TRBC2的Ser57被半胱氨酸残基替换以外)，参考IMGT编号，所述半胱氨酸在文库的TCR的TRAC恒定结构域序列和TRBC1或TRBC2恒定结构域序列之间形成二硫键。在具有或没有前述段落中提及的导入的链间键的情况下，本发明的αβ异二聚TCR可能具有TRAC恒定结构域序列和TRBC1或TRBC2恒定结构域序列，并且TCR的TRAC恒定结构域序列和TRBC1或TRBC2恒定结构域序列可通过TRAC的外显子2的Cys4和TRBC1或TRBC2的外显子2的Cys2之间的天然二硫键连接。或者，TCRα链可变结构域和TCRβ链可变结构域可表达成单链多肽。这类构造可包括突变的氨基酸残基之间的非天然二硫键。本发明还提供了获得特异性结合肽抗原的T细胞受体的方法，包括用肽抗原筛选本发明的第一方面的文库。筛选可包括以下一个或多个步骤a)使用肽抗原作为靶标淘选文库b)重复步骤a)一次或多次c)筛选步骤a)或b)中鉴定的噬菌体克隆d)鉴定特异性结合肽抗原的TCR。按照步骤(b)，步骤(a)可重复1次、2次、3次、4次、5次或6次。其可重复高至10次。步骤(a)可重复高至20次或更多。淘选表示使噬菌体克隆接触抗原并且从未结合的噬菌体克隆中分离结合的噬菌体克隆。这可包括将抗原固定在固体支持物如管、磁珠、柱基质或BiaCore传感器芯片上。可通过非特异性吸附，或通过使用特异性接合标签如生物素化的抗原和链霉亲和素包被的表面来介导抗原接合。替代性方法可包括在完整细胞上淘选(Hoogenboom,H.R.等，(1998)Immunotechnology,4(1),1-20)。洗去未结合的噬菌体克隆(即，不展示结合至抗原的TCR的噬菌体)。然后可通过以下洗脱结合的噬菌体克隆：TCRβ链和基因III之间蛋白酶位点，如胰蛋白酶的酶切割；极端pH；或过量抗原竞争。这些噬菌体克隆可经过另外几轮淘选，或进行筛选实验以鉴定具有最优结合特性的克隆。可通过，例如使用包被的抗原或完整细胞的并且可以96-孔形式基于ELISA的方法来进行筛选，其中使用完整细胞，可使用流式细胞术进行筛选。可使用表面等离振子共振，例如在BiaCore仪器上，或使用石英晶体微天平来进行对亲和性和动力学的筛选。筛选方法描述于Pande,J.等，(2010).BiotechnolAdv28(6):849-58。如本领域技术人员所知，筛选生物分子相互作用的其他合适方法可及并包括：来自ForteBIO的Octet系统，其采用生物膜层干涉量度法(BLI)来实时测量生物膜相互作用并提供关于亲和性和动力学的信息；扩增发光接近均相测定法(例如，AlphaScreenTM)其中潜在相互作用分子接合至靠近时有特定荧光性质的“供体”或“受体”珠；闪烁迫近试验，其中通过在靠近的分子之间转移的β粒子来评价相互作用；其他合适的光学干涉试验描述于，例如，WO2004/044004。可通过测试鉴定的TCR结合至除了用于筛选文库的肽抗原以外的肽来确定特异性。如果结合发生在其他肽，则可认为TCR是非特异性的。可使用上述方法评价特异性。肽抗原可以是已知抗原，如Bridgeman,J.S.等，(2012)Immunology,135(1),9-18中所述的那些。筛选本发明的文库的方法也可与新肽抗原联用，以鉴定可用于治疗领域的特异性结合TCR。本发明的最后方面提供了在其表面上展示获自本发明的第一或第二方面的本发明的TCR的分离的细胞，即，包含含有TRAV12-2基因产物或TRAV21基因产物的TCRα链可变结构域和含有TRBV6基因产物的TCRβ链可变结构域，其中TCR特异性结合肽抗原。该细胞可以是T细胞。细胞可以是人、鼠或其他动物细胞。存在多种适用于用编码本发明的TCR的DNA或RNA转染T细胞的方法(参见例如Robbins等，(2008)JImmunol.180:6116-6131)。表达本发明的TCR的T细胞将适用于疾病如癌症、病毒感染、自身免疫疾病、寄生虫感染和细菌感染的基于过继性疗法的治疗。如本领域技术人员所知，存在多种可进行过继性疗法的合适方法(参见例如Rosenberg等，(2008)NatRevCancer8(4):299-308)。为了用于过继性疗法，本发明可包括含有TCR表达载体的细胞，其在单个开放阅读框或2个不同的开放阅读框中包含编码本发明的TCR的核酸。本发明的范围中还包括含有第一表达载体和第二表达载体的细胞，第一表达载体包含编码本发明的TCR的α链的核酸，而第二表达载体包含编码本发明的TCR的β链的核酸。或者，一个载体可同时表达本发明的TCR的α和β链。计划用于过继性疗法的本发明的TCR可在由转染的T细胞表达时经糖基化。众所周知，可通过对转染的基因的突变来控制转染的TCR的糖基化模式(KuballJ等，(2009),JExpMed206(2):463–475)。为了给予患者，在药物组合物中提供了用本发明的TCR转染的T细胞和药学上可接受的运载体。本发明的细胞通常将以无菌的药物组合物的部分提供，其通常包含药学上可接受的运载体。这种药物组合物可以是任意合适的形式(取决于将其给予患者所需的方法)。可以单位剂型提供，通常以密封的容器提供或可以试剂盒的部分提供。这种试剂盒将通常(虽然不必需)包括使用说明。其可包括多种所述的单位剂型。给药的合适组合物和方法为本领域技术人员所知，例如，参见Johnson等，Blood(114):535-46(2009)，参考临床试验号NCI-07-C-0175和NCI-07-C-0174。药物组合物可适应通过任意合适的途径给药，如通过胃肠外(包括皮下、肌内、静脉内或腹膜内)、吸入或口服途径。这类制剂可通过药学领域已知的任何方法制备，例如通过将活性成分与运载体或赋形剂在无菌条件下混合。本发明的物质的剂量可在广泛的限制之间变化，取决于待治疗的疾病或病症，如癌症、病毒感染、自身免疫疾病、细菌感染或寄生虫感染、待治疗的个体的年龄和条件等。例如，ImmTAC试剂(与抗-CD3结构域融合的可溶性TCR)的合适剂量范围可以是25ng/kg至50μg/kg。由药师最终确定使用的合适剂量。本发明的TCR也可用成像化合物标记，例如，适用于诊断目的的标记物。这类标记的高亲和性TCR可用于检测选自以下的TCR配体的方法：CD1-抗原复合物、细菌超级抗原、和MHC-肽/超抗原复合物，该方法包括将TCR配体与高亲和性TCR(或多聚高亲和性TCR复合物)接触，该TCR对TCR配体有特异性；并且检测对TCR配体的结合。在例如采用生物素化的杂二聚体形成的高亲和性TCR复合物中，可采用荧光链霉亲和素(市售)来提供可检测标记物。荧光标记的四聚体适用于FACS分析，例如，以检测携带肽的抗原呈递细胞，其中肽对于高亲和性TCR有特异性。本发明的高亲和性TCR(或其多价复合物)可以，或者或此外，与治疗剂相关联(例如通过共价或其它方式连接)，所述治疗剂可以是例如用于细胞杀伤的毒性部分或免疫刺激剂如白介素或细胞因子。本发明的多价高亲和性TCR复合物与非多聚野生型或高亲和性T细胞受体异二聚体相比可具有强化的对TCR配体的结合能力。因此，根据本发明的此类多价高亲和性TCR复合物具体用于体内或体外追踪或靶向那些呈递特定抗原的细胞，并且还可用作生产具有此类用途的其他多价TCR复合物的中间体。因此，可以药学上可接受的制剂提供高亲和性TCR或多价高亲和性TCR复合物用于体内使用。本发明的高亲和性TCR可用于产生可溶性双特异性试剂。在一个优选的实施方式中，这些是ImmTAC试剂。ImmTAC试剂包含可溶性TCR，其通过接头融合至抗-CD3特异性抗体片段。包括如何产生这类试剂的其他细节描述于WO10/133828。本发明各方面的优选或任选特征可经修改作为各其他方面。因此，尽管已经详细描述了本发明和其优势，但是应当理解，可对本文进行各种变化、替代和改变而不背离所附权利要求所定义的本发明的精神和范围。本发明将以实施例进行进一步说明，实施例仅用于说明目的，且不以任何方式限制本发明。实施例实施例1制备用于构建TRAV12.2/TRBV6*和TRAV21/TRBV6*天然TCR噬菌体展示文库的cDNA从外周血淋巴细胞(PBL)中分离mRNA从获自已知HLA类型的三个供体的大约3000万个PBL的集合中提取RNA.按照生产商推荐的方案使用TRI试剂(西格玛，目录号T9424)来进行RNA提取。随后根据生产商的指导，使用μMACSTMmRNA分离试剂盒(美天旎，目录号130-075-101)来分离mRNA。从mRNA制备cDNA按照生产商推荐的方案，使用SMARTScribeTM逆转录酶(克隆泰克实验室公司(Clontech)，639536)从mRNA合成cDNA。使用S.N.A.P.凝胶纯化试剂盒(英杰公司，45-0078)来进一步纯化cDNA。实施例2噬菌体文库构建文库构建的概览示于图1并且相应的引物序列详述于图2。通过PCR使用TRAV12.2、TRAV21或TRBV6*正向引物和反向引物从纯化的cDNA扩增TCR链，该引物在TRAC(引物YOL237)或TRBC区(引物YOL240)内退火。参考人TCR链的已知序列设计引物组(《T细胞受体资料手册》(TCellReceptorFactsBook)，Lefranc和Lefranc,Publ.AcademicPress2001)。所得的PCR产物由完全可变结构域序列和截短的恒定结构域组成(在图1中标记为A和B)。使用针对TRAC的引物YOL236和YOL238，和针对TRBC2的YOL239和YOL22通过PCR从分离的克隆载体扩增含有非天然半胱氨酸残基的TRAC和TRBC2结构域的剩余C-端区(图1中标记为C和D)。纯化的A/C和B/D片段然后在分开的反应中通过它们的重叠引物区(分别是YOL237/YOL236和YOL240/YOL239)缝合在一起。所得的A-C和B-D片段经凝胶纯化并使用TRAV12.2/21正向引物和YOL22通过重叠PCR缝合在一起，TRBV6*和YOL238引物区提供重叠序列。该最后缝合反应在α链和β链之间产生随机重组。使用Nco1/Not1限制性位点来将随机重组的链插入合适的噬菌粒载体中，称为pIM672(pIM672基于之前所述的pEX922载体(参见WO2005116074))，其然后用于转化高度转化有效的电感受态TG1大肠杆菌细胞。在30℃下将培养物接种到2xTYag(EzMix，西格玛，目录号Y2627加100μg/ml氨苄青霉素和2％葡萄糖)琼脂平板上，并且所得的细胞菌苔刮到小体积的含2％甘油和2％葡萄糖的2xTYag培养基中。将文库的甘油储液储存在-80℃下。实施例3文库繁衍和淘选噬菌体颗粒的繁衍使用足够覆盖文库多样性的等份的噬菌体文库甘油储液(TRAV12.2/TRBV6和TRAV21/TRBV6)来接种2xYTag培养基，至0.05的初始OD600。然后将培养物孵育至约0.5的OD600。然后以约20:1噬菌体的感染比例向大肠杆菌加入辅助噬菌体。培养物然后通过反转混合并在37℃下孵育30分钟。培养物经离心并且团块在2xYTak(2xYTag但没有葡萄糖并加入50μg/ml卡那霉素)中重悬，并随后在26℃下摇晃孵育16小时。噬菌体颗粒的分离培养物经汇集、离心并且收集上清并经0.45μm过滤。洗脱物与7mlPEG/NaCl(20％PEG-8000(西格玛，目录号5413)，2.5MNaCl)混合并在冰上孵育30分钟。样品然后经离心并且弃去上清。团块在10mlPBS(达氏，西格玛，目录号D8537-无Mg，无Ca)中重悬并再离心。收集所得上清，与5mlPEG/NaCl混合并在冰上储存30分钟。离心后，团块在3mlPBS中重悬，重离心，并且收集上清。使用Nanodrop分光光度仪，其中每ml的噬菌体数量＝OD260x(22.14x1010)来确定噬菌体浓度的估值。按照该方法制备的文库计算为含有6.8x1012/ml噬菌体颗粒。淘选纯化的噬菌体颗粒与3％MPBS缓冲液(PBS(达氏，西格玛，目录号D8537–无Mg，无Ca)加3％奶粉孵育，先与链霉亲和素包被的顺磁性珠孵育，然后用15mMEDTA处理，之后广泛透析，并且最终在0.22μm处过滤)混合并且在室温下孵育1小时。对于淘选2和淘选3，在前30分钟后，以2μM的终浓度加入不相关的非生物素化的肽-HLA构建体作为阴性选择并且另外孵育30分钟。然后加入10％(v/v)吐温-20，加上100nM或1μM生物素化的肽-HLA。样品在室温下混合60分钟。通过加入在3％MPBS缓冲液中预封闭的链霉亲和素包被的顺磁性珠来拯救噬菌体-生物素化-HLA复合物，并在室温下孵育7分钟。捕获后，使用磁性浓缩器(代纳公司(Dynal))分离珠并用3％MPBS(未EDTA处理的)洗涤三次并用PBS-0.1％吐温洗涤两次。噬菌体颗粒在0.5mlTBSC(10mMTris，pH7.4，137mMNaCl，1mMCaCl2和0.1mg/ml胰蛋白酶)中在室温下洗脱25分钟并且在37℃下温和旋转5分钟。使用洗脱的噬菌体颗粒来感染早对数期的TG1大肠杆菌细胞。培养物在37℃下培养30分钟，随后以1μl、0.1μl和0.01μl的连续稀释接种到YTEag(1LMQ-水中10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，8gNaCl，15g细菌用琼脂，加上100μg/ml氨苄青霉素，和2％葡萄糖)上。剩余的培养物经浓缩，并且也接种到YTEag上。平板在30℃下孵育16小时。第二天将来自平板的菌落加入2xTYag，在干冰上冷冻并在-80℃下储存用于下一轮淘选。通过PCR分析来自各选择的菌落以检查全长插入物。在第三轮选择后，将菌落从琼脂平板上刮下并用于以每孔一个克隆接种96孔Cellstar细胞培养平板中的无菌2xTYag。平板在26℃下摇晃孵育16小时。使用这些培养物来接种96孔板中的新鲜2xTYag培养基，并在37℃下摇晃孵育30分钟直至OD600＝0.5。然后以20:1噬菌体-大肠杆菌感染比例向每孔加入辅助噬菌体，并在37℃下摇晃孵育平板30分钟。通过离心收集团块并在2xYTak中重悬。平板在26℃下摇晃孵育16小时。细胞然后经离心并且收集上清用于ELISA筛选。实施例4通过ELISA筛选对含抗原结合TCR的噬菌体进行检测方法通过ELISA筛选鉴定结合至肽-HLA复合物的噬菌体克隆。使用感兴趣的生物素化肽-HLA和对照肽-HLA来制备ELISA平板。向ELISA平板一式两份加入噬菌体颗粒，使得一个样品加入含感兴趣的肽-HLA的孔中而另一个加入相邻的对照孔。使用抗-Fd抗体(西格玛，目录号B7786)，之后单克隆抗兔IgG过氧化物酶偶联物(γ链特异性克隆RG96)(西格玛，目录号A1949)来进行检测。使用KPL实验室TMB微孔过氧化物酶底物系统(目录号50-76-00)来检测结合的抗体。孔中出现蓝色表示噬菌体克隆已经结合至HLA抗原。相应对照孔中没有颜色表明结合是特异性的。结果使用实施例1、2和3所述的方法制备TRAV12.2/21TRBV6*文库，区别在于在实施例3所述的噬菌体颗粒分离和淘选步骤之前收集2个文库培养物[TRAV12.2TRBV6*和TRAV21TRBV6*]。在用于制备文库的3个供体中，一个是HLA-A2阳性，HLA-24阴性，一个是HLA-24阳性，HLA-A2阴性，并且第三个对HLA-A2和HLA-A24都是阴性。如上所述进行ELISA筛选。在包含总共16种不同肽HLA复合物的2轮淘选周期(campaign)中，获得针对12种不同HLA-A2肽和1种HLA-A24肽的阳性ELISA结果。这些数据证明可使用本发明的文库来分离抗原结合TCR。使用实施例1、2和3所述的方法制备第二TRAV12.2/21TRBV6*文库，区别在于在实施例3所述的噬菌体颗粒分离和淘选步骤之前收集2个文库培养物[TRAV12.2TRBV6*和TRAV21TRBV6*]，并且另外，所有3个用于制备文库的供体都是HLA-A2HLA-A24阳性的。使用上述方法进行ELISA筛选。在包含18种不同肽HLA复合物的一轮淘选周期中，获得针对16种不同HLA-A2肽和1HLA-A24肽的阳性ELISA结果。这些数据证明可使用本发明的文库来分离抗原结合TCR。图3显示了在用四种不同HLA-A2肽淘选后从ELISA筛选获得的结果。实施例5来自淘选由HLA-A2/HLA-A24阴性供体制备的TRAV12.2/21TRBV6*文库的ELISA筛选为了确认可从HLA-A2/HLA-A24阴性供体制备的文库中分离抗原结合TCR，使用与实施例1、2和3所述相同的方法产生第三TRAV12-2/21/TRBV6*文库，区别在于在实施例3所述的噬菌体颗粒分离和淘选步骤之前收集2个文库培养物[TRAV12.2TRBV6*和TRAV21TRBV6*]，并且另外，从单个HLA-A2和HLA-A24阴性供体产生cDNA。使用实施例4所述方法进行ELISA筛选。从包括8种抗原的单个淘选周期中(包括三轮淘选)，获得了针对4种不同HLA-A2肽和4种不同HLA-A24肽的ELISA结果。图4显示了在用3种不同抗原淘选后ELISA筛选的结果。实施例6来自淘选单个TRAV12.2TRBV6*和TRAV21TRBV6*文库的ELISA筛选使用实施例1、2和3所述的方法来制备单个TRAV12.2TRBV6*和TRAV21TRBV6*文库。文库在噬菌体分离前不汇集并单独淘选。TRAV12.2TRBV6*和TRAV21TRBV6*文库都获得阳性ELISA结果。图5显示了在用2种不同抗原淘选后ELISA筛选的结果。实施例7来自淘选由市售mRNA源产生的单个TRAV12.2TRBV6*和TRAV21TRBV6*的ELISA筛选使用与实施例1、2和3相同的方法产生合并的TRAV12-2/21/TRBV6*文库，区别在于从市售来源获得的mRNA集合制备cDNA(基因泰克，目录号636170；批号：1304103A。供体是380名男性(年龄18-40)和170名女性(年龄18-40)。测试所有供体的HIV-I,II，乙型肝炎和梅毒)。使用50ugmRNA来产生cDNA。文库在噬菌体分离前不汇集并单独淘选。使用实施例4所述方法进行ELISA筛选。TRAV12.2TRBV6*和TRAV21TRBV6*文库都获得阳性ELISA结果。图6显示了在用一种抗原淘选后ELISA筛选的结果。实施例8TCR序列的分析可通过使用本领域技术人员已知的方法测序来获得来自ELISA阳性噬菌体克隆的TCR的DNA序列。在一些情况中，TCR在单一序列中汇聚，在其他情况中，鉴定到超过一个TCR序列。例如，从图3所述的ELISA平板中，抗原1获得3种不同TCR序列，并且抗原2获得4种不同TCR序列。这些结果证明，在单次淘选周期中可从本发明的文库中分离针对HLA限制型抗原有特异性的多种TCR。实施例9文库TCR的特异性进一步测试TCR以确定它们对淘选期间选择它们的肽-HLA复合物的特异性。这可使用与上述相同的ELISA方法，和一组不同的肽-HLA复合物来实现。图7显示了来自用从ELISA筛选分离的TCR的其他特异性测试的结果，其针对结合抗原1、抗原3和抗原5选择。这证明可从文库中分离针对抗原有高亲和性的TCR。实施例10对获自文库的TCR的Biacore分析方法通过使用BIAcore3000设备的表面等离振子共振确定从文库中分离的TCR对抗原的亲和性并且以平衡解离常数(KD)报告。获自噬菌体克隆的TCR序列用于使用Boulter等，ProteinEng,2003.16:707-711中所述的方法产生TCR的可溶版本。如Garboczi等，ProcNatlAcadSciUSA1992.89:3429-3433和O'Callaghan等，AnalBiochem1999.266:9-15所述制备生物素特异性和对照pMHC单体，并且固定在链霉亲和素偶联的CM-5传感器芯片上。所有测量以恒定流速在25℃下在补充0.005％吐温(西格玛)的PBS缓冲液(西格玛)中进行。为了测量亲和性，可溶TCR的连续稀释物流过固定的pMHC并且测定各浓度的平衡响应值。通过将具体平衡结合针对蛋白质浓度作图，之后最小二乘法拟合至朗格缪尔结合等式，假设1:1相互作用来确定平衡解离常数(KD)。结果图8显示了针对抗原2获得的4个TCR和针对抗原3获得的2个TCR的平衡解离常数(KD)。这证明从文库中分离的TCR对相应抗原有可用的亲和性。实施例11从文库中获得的TCR可具有增强的亲和性如通过实施例10所述的表面等离振子共振方法所测定，从TRAV12.2/21TRBV6*文库分离的特异性肽-HLATCR具有25μM的亲和性(KD)。为了获得这种TCR的更高亲和性变体，对α和β链的可变结构域序列进行突变。用于产生突变的高亲和性TCR变体的方法，如噬菌体展示和定点诱变为本领域技术人员已知(例如，参见WO04044004和Li等，(2005)NatureBiotech23(3):349-354)。通过使用BIAcore3000的单循环动力学来分析TCR变体针对抗原的亲和性和半衰期。将特异性和对照pHLA固定在不同流动池并且注射浓度增加的TCR。使用BIAevaluation软件来进行总体拟合以同时获得kon、koff、KD和半衰期值。结果分离了多种在α(A)或β(B)链有突变并且对抗原有更高亲和性的变体几条β链变体与抗-CD3抗体融合并且与选择的α链变体重折叠以产生溶解性TCR融合蛋白，其适用于免疫治疗应用。描述这类TCR融合蛋白产生的其他详细内容见WO10133828。如上所述进行亲和性和半衰期测量。TCR融和蛋白KD(pM)半衰期(小时)A2B12420A2B52024A2B33915A10B11820A10B32513A10B51916比较例从新鲜血液分离抗原结合TCR在构建本发明的文库之前，在用感兴趣的肽-HLA抗原刺激后，从分离自新鲜供体血液的T细胞获得抗原-特异性TCR。将实验分成克隆周期，涉及高至20种不同的抗原和从12-20个单个供体获得的新鲜血液。从相应T细胞扩增TCR链并用于产生可溶性TCR。由实施例10的Biacore方法来证明抗原结合。方法从200ml新鲜供体血液中获得T细胞、B细胞和树突细胞。进行三轮刺激，首先用自体同源DC，然后用由一组感兴趣的抗原肽脉冲处理的自体同源B细胞。通过ELISpot试验(BD生命科学公司(BDBiosciences))检测活化的T细胞并且用感兴趣的抗原肽，或不相关的对照抗原来脉冲处理T2细胞。相应细胞用干扰素γ(IFNγ)染色并由IFNγ或CD8表达分选。通过ELISpot试验和四聚体染色来确认抗原结合细胞系。来自验证的克隆的TCR链通过cDNA末端的快速扩增(RACE)来扩增并且克隆到大肠杆菌表达载体中。TCR从包涵体中纯化并再折叠。通过在Biacore上的结合确认抗原结合。结果从多年中进行的5次克隆周期中，鉴定到少于10种特异性抗原结合TCR。因此，本发明的文库在获得TCR上比该实施例中使用的方法高效得多。参考上述示例性的抗原，抗原1和2包括在2次周期中(分别是4+5和3+4)，并且抗原3和4包括在一次周期中(分别是4和5)。使用该方法没有获得针对抗原1、2和3有特异性的TCR。已经获得了结合抗原4的单个TCR。这证明，即使针对相同抗原，本发明的文库在获得TCR上比该实施例中使用的方法高效得多。用于产生上述实施例4的第二文库的三种HLA-A2/HLA-A24血液供体已经用于克隆周期中的一些。一种用于周期1、2、4和5；第二种用于周期4和5；并且第三种用于周期5。这证明，即使使用相同供体，本发明的文库在获得TCR上比该实施例中使用的方法高效得多。正如证明的那样，已经进行了许多克隆周期来尝试分离特异性抗原结合TCR，有非常有限的成功。周期是费力的、不可靠的并且包括收集来自许多供体的多次献血。本文所示的结果显示本发明能够快速、有效并可靠鉴定多种抗原结合TCR，这通过先前已知的技术无法鉴定或难以鉴定。***如上详细地描述了优选实施方式后，应理解，上文所定义的本发明不限于说明书中所列的特定细节，能够在不偏离本发明的精神和范围的情况下进行各种明显的变化。当前第1页1 2 3