酰胺化合物的制作方法

本发明涉及可用作药物组合物(例如用于治疗慢性肾功能衰竭和/或糖尿病肾病的药物组合物)的有效成分的4-[(1S)-1-({[4-溴-1-(异喹啉-3-基甲基)-3-甲基-1H-吡唑-5-基]羰基}氨基)乙基]苯甲酸(以下，有时称为“化合物A”。)、或其盐。

背景技术：

已知前列腺素E2(以下称为“PGE2”。)是花生四烯酸级联的代谢产物之一。PGE2显示出各种生理活性，并且参与致痛增强作用、炎症促进作用、炎症抑制作用、子宫收缩作用、消化道蠕动运动促进作用、催醒作用、胃酸分泌抑制作用、降血压作用、血小板聚集抑制作用、骨再吸收促进作用、血管新生作用等。

PGE2的受体存在EP1、EP2、EP3和EP4四种亚型，它们广泛分布在各种组织中。EP1受体的激活会引起细胞内Ca²⁺的增加。EP3受体的激活在引起细胞内Ca²⁺的增加的同时，还会引起腺苷酸环化酶的抑制，从而使细胞内的cAMP水平减少。EP2和EP4受体的激活会引起腺苷酸环化酶的激活，从而使细胞内的cAMP水平增加。特别是EP4受体被认为与平滑肌的松弛、炎症反应的促进或抑制、淋巴细胞的分化、系膜细胞的肥大或增殖、胃肠的粘液分泌等有关。(Pharmacology&Therapeutics 2013,138:485-502；Pharmacological Reviews 2013,65:1010-1052；American Journal of Physiology Renal Physiology 2004,287,F673-F681)。

PGE2受体的抑制剂，即EP受体拮抗剂对于EP受体具有结合活性，从而抑制PGE2的EP受体介导的作用。因此，EP受体拮抗剂作为治疗由PGE2所引起的疾病的药剂备受期待。其中，EP4受体拮抗剂作为针对人和动物的与EP4相关的疾病(例如肾病、炎症性疾病、各种疼痛等)的治疗药物备受期待(Journal of American Society Nephrology 2010,21:1678-1690；Proceedings of the National Academy of Sciences,2010,107:12233-12238；The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 2008,325:425-434)。此外，从能够避免基于其它的EP1、EP2和EP3的拮抗的副作用的观点出发，优选EP4受体选择性拮抗剂(Physiological Reviews 1999,79:1193-1226；Annual Reviews Physiology 2001,63:579-605)。

在专利文献1中报道了由下式(B)表示的化合物作为EP4受体拮抗剂。

[化学式1]

(式中，环D为下式(III)的基团等，在下式中，环D¹表示可被苯基取代的单环或双环的含氮杂环，R⁴¹表示-X²-B⁴，X²表示C_1-6的亚烷基等，B⁴表示可被选自R⁴的1至5个相同或不同的基团分别取代的芳基、杂环等。其它符号参照该专利文献。)

[化学式2]

在该专利文献的实施例205中公开了下述实施例化合物，作为环D¹为吡唑的具体化合物，公开了该实施例化合物。

[化学式3]

在专利文献2中报道了由下式(C)表示的化合物作为EP4受体拮抗剂。

[化学式4]

(式中，R²表示甲基、氟甲基等，R⁴表示氟甲基、甲氧基等。其它符号参照该专利文献。)

在专利文献3中报道了由下式(D)表示的化合物作为EP4受体拮抗剂。

[化学式5]

(式中，R²表示甲基、氟甲基(例如单氟甲基、二氟甲基、三氟甲基)等，R⁴表示氟甲基、甲氧基等。其它符号参照该专利文献。)

在专利文献4中报道了由下式(E)表示的化合物作为EP4受体配体。

[化学式6]

(式中的符号参照该专利文献。)

在专利文献5中报道了由下式(F)表示的化合物作为EP4受体拮抗剂。

[化学式7]

(式中，环B和环D相同或彼此不同，表示可被取代的芳基、可被取代的杂环，X表示单键、-R⁰⁰-等，R⁰⁰表示低级亚烷基，R¹表示H等。A为下式(II)的基团，下式中，Y表示CH等，R²表示R⁰等，R⁰表示低级烷基，Z表示单键等，R³表示-COOH等。其它符号参照该专利文献。)

[化学式8]

在该专利文献中，没有公开环D为吡唑的具体化合物。

从专利文献1到专利文献5中，在具体的实施例中公开的化合物与化合物A的结构不同。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2009/139373号

专利文献2：国际公开第2012/103071号

专利文献3：国际公开第2012/039972号

专利文献4：国际公开第2008/017164号

专利文献5：国际公开第2009/005076号

技术实现要素：

发明要解决的课题

提供了一种可用作药物组合物(例如用于治疗慢性肾功能衰竭和/或糖尿病肾病的药物组合物)的有效成分的化合物。解决课题的方案

本发明人对具有EP4受体拮抗作用的化合物进行了深入地研究，发现由式(1)所示的4-[(1S)-1-({[4-溴-1-(异喹啉-3-基甲基)-3-甲基-1H-吡唑-5-基]羰基}氨基)乙基]苯甲酸(化合物A)或其盐显示出优异的EP4受体拮抗作用，从而完成了本发明。

[化学式9]

即，本发明涉及化合物A或其盐、以及含有化合物A或其盐以及可药用的赋形剂的药物组合物。

另外，本发明涉及一种含有化合物A或其盐以及可药用的赋形剂的、用于预防或治疗慢性肾功能衰竭和/或糖尿病肾病的药物组合物。需要说明的是，该药物组合物包含含有化合物A或其盐以及可药用的赋形剂的、慢性肾功能衰竭和/或糖尿病肾病的预防或治疗剂。

另外，本发明涉及化合物A或其盐在制造用于预防或治疗慢性肾功能衰竭和/或糖尿病肾病的药物组合物中的应用、化合物A或其盐用于预防或治疗慢性肾功能衰竭和/或糖尿病肾病的应用、用于预防或治疗慢性肾功能衰竭和/或糖尿病肾病的化合物A或其盐、以及包括将有效量的化合物A或其盐施用至对象的慢性肾功能衰竭和/或糖尿病肾病的预防或治疗方法。需要说明的是，“对象”为需要该预防或治疗的人或其他动物，作为一个实施方式，为需要该预防或治疗的人。

本发明的效果

由于化合物A或其盐具有EP4受体拮抗作用，因此其可作为用于预防和/或治疗慢性肾功能衰竭和/或糖尿病肾病的药物组合物的有效成分使用。

具体实施方式

本发明的化合物A或其盐的某些实施方式表示如下。需要说明的是，本说明书中简记为化合物A的情况表示没有形成盐而作为游离化合物的化合物A。

(1)化合物A或其盐。

(1-1)化合物A。

(1-2)化合物A的甲磺酸盐。

(2)(1)中记载的化合物A或其盐的晶体。

(3)(1-1)中记载的化合物A的晶体。

(3-1)(3)中记载的化合物A的晶体，其在差示扫描量热分析(DSC分析)中的吸热峰的起始温度为253℃附近。

(3-2)(3)中记载的化合物A的晶体，其特征在于，在采用Cu作为管球的粉末X射线衍射中，在2θ(°)＝5.7附近、7.9附近、11.5附近、13.1附近以及17.9附近处显示出峰。

(3-3)(3)中记载的化合物A的晶体，其特征在于，在采用Cu作为管球的粉末X射线衍射中，在2θ(°)＝5.7附近、7.9附近、8.3附近、8.9附近、9.2附近、11.5附近、12.5附近、13.1附近、15.8附近、16.3附近、16.7附近、17.2附近、17.9附近、18.5附近以及19.5附近处显示出峰。

(3-4)(3)中记载的化合物A的晶体，其特征在于，在DSC分析中的吸热峰的起始温度为253℃附近，并且在采用Cu作为管球的粉末X射线衍射中，在2θ(°)＝5.7附近、7.9附近、11.5附近、13.1附近以及17.9附近处显示出峰。

(3-5)(3)中记载的化合物A的晶体，其特征在于，在DSC分析中的吸热峰的起始温度为253℃附近，并且在采用Cu作为管球的粉末X射线衍射中，在2θ(°)＝5.7附近、7.9附近、8.3附近、8.9附近、9.2附近、11.5附近、12.5附近、13.1附近、15.8附近、16.3附近、16.7附近、17.2附近、17.9附近、18.5附近以及19.5附近处显示出峰。

(4)(1-2)中记载的化合物A的甲磺酸盐的晶体。

(4-1)(4)中记载的化合物A的甲磺酸盐的晶体，其在DSC分析中的吸热峰的起始温度为192℃附近。

(4-2)(4)中记载的化合物A的甲磺酸盐的晶体，其特征在于，在采用Cu作为管球的粉末X射线衍射中，在2θ(°)＝4.7附近、9.5附近、12.0附近、13.2附近、13.7附近、15.3附近、18.8附近、20.3附近、20.9附近以及22.8附近处显示出峰。

(4-3)(4)中记载的化合物A的甲磺酸盐的晶体，其特征在于，在DSC分析中的吸热峰的起始温度为192℃附近，并且在采用Cu作为管球的粉末X射线衍射中，在2θ(°)＝4.7附近、9.5附近、12.0附近、13.2附近、13.7附近、15.3附近、18.8附近、20.3附近、20.9附近以及22.8附近处显示出峰。

(5-1)一种药物组合物，其含有在(1)至(1-2)的任一项中记载的化合物、以及可药用的赋形剂。

(5-2)一种药物组合物，其含有在(2)至(4-3)的任一项中记载的晶体、以及可药用的赋形剂。

(5-3)一种药物组合物，其含有用于预防或治疗慢性肾功能衰竭和/或糖尿病肾病的在(1)至(1-2)的任一项中记载的化合物、以及可药用的赋形剂。

(5-4)一种药物组合物，其含有用于预防或治疗慢性肾功能衰竭和/或糖尿病肾病的在(2)至(4-3)的任一项中记载的晶体、以及可药用的赋形剂。

(6-1)在(1)至(1-2)的任一项中记载的化合物在制造用于预防或治疗慢性肾功能衰竭和/或糖尿病肾病的药物组合物中的应用。

(6-2)在(2)至(4-3)的任一项中记载的晶体在制造用于预防或治疗慢性肾功能衰竭和/或糖尿病肾病的药物组合物中的应用。

(7-1)在(1)至(1-2)的任一项中记载的化合物，其用于预防或治疗慢性肾功能衰竭和/或糖尿病肾病。

(7-2)在(2)至(4-3)的任一项中记载的晶体，其用于预防或治疗慢性肾功能衰竭和/或糖尿病肾病。

(8-1)在(1)至(1-2)的任一项中记载的化合物用于预防或治疗慢性肾功能衰竭和/或糖尿病肾病的应用。

(8-2)在(2)至(4-3)的任一项中记载的晶体用于预防或治疗慢性肾功能衰竭和/或糖尿病肾病的应用。

(9-1)一种慢性肾功能衰竭和/或糖尿病肾病的预防或治疗方法，包括将有效量的(1)至(1-2)的任一项中记载的化合物施用至对象。

(9-2)一种慢性肾功能衰竭和/或糖尿病肾病的预防或治疗方法，包括将有效量的(2)至(4-3)的任一项中记载的晶体施用至对象。

此外，本发明也包含化合物A或其盐所表示的化合物的药学上可接受的前药。药学上可接受的前药是指具有通过加溶剂分解或在生理条件下可转化为羧基的基团的化合物。作为形成前药的基团，例如可以举出Prog.Med.,5,2157-2161(1985)及“医药品的开发”(广川书店，1990年)第7卷分子设计163-198中记载的基团。

在本发明中，化合物A的盐是指在药学上可接受的盐，有时形成酸加成盐或与碱形成盐。具体而言，可以举出：与盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸，或与甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、扁桃酸、酒石酸、二苯甲酰酒石酸、二甲苯酰酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、天冬氨酸、谷氨酸等有机酸的酸加成盐；与钠、钾、镁、钙、铝等无机碱，或与甲胺、乙胺、乙醇胺、赖氨酸、鸟氨酸等有机碱的盐；与乙酰亮氨酸等各种氨基酸及氨基酸衍生物的盐、或铵盐等。

此外，本发明还包含化合物A或其盐的各种水合物或溶剂合物、以及多晶态物质。另外，本发明也包含用各种放射性或非放射性同位素标记的化合物A或其盐。

本说明书中，粉末X射线衍射图中的衍射角(2θ(°))以及DSC分析中的吸热峰的起始温度(℃)的记载中所含的“附近”表示在该数据测定法中包括通常上被容许的误差范围，从而大致上表示该衍射角以及吸热峰的起始值。在粉末X射线衍射中的衍射角(2θ(°))的误差范围作为一个实施方式为±0.2°，作为另一个实施方式为±0.1°。在DSC分析中的吸热峰的起始温度(℃)的误差范围作为一个实施方式为±2℃，作为另一个实施方式为±1℃。

需要说明的是，对于粉末X射线衍射图，在数据的性质上以及晶体的同一性认定上，晶格间隔或整体的图案是重要的，衍射角以及衍射强度可根据晶粒生长方向、晶粒的大小或测定条件而略有变化。

(制造方法)

化合物A或其盐可以利用基于其基本结构或者取代基的种类的特征，并应用各种公知的合成法制造。此时，根据官能团的种类，在从原料至中间体的阶段将该官能团置换为适当的保护基(可容易地转化为该官能团的基团)有时在制造技术上很有效。作为这样的保护基，例如可以举出：ウッツ(P.G.M.Wuts)及グリーン(T.W.Greene)著的“Greene's Protective Groups in Organic Synthesis(第四版),2006年”中记载的保护基等，只要根据这些反应条件适宜选择使用即可。在这样的方法中，可通过引入该保护基并进行反应后，根据需要除去保护基，从而得到期望的化合物。

另外，化合物A的前药可通过与上述保护基同样的方式在从原料至中间体的阶段引入特定的基团、或者使用所得到的化合物A进一步进行反应来制造。反应可以通过应用通常的酯化、酰胺化、脱水等本领域技术人员公知的方法来进行。

下面，对化合物A的代表性的制造方法进行说明。各制法也可以参照该说明所附带的参考文献进行。需要说明的是，本发明的制造法不限定于以下示出的例子。另外，除非另有说明，在该制造方法的结构式中所示的符号中，同一符号表示相同的含义。

(第一制法)

[化学式10]

(式中，Ra为碳原子数为1至6的直链或支链状的烷基，例如甲基、乙基等。)

式(I)所示的化合物A可通过通式(2)所示的化合物的水解来制造。在此，水解反应可参照前述“Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis(第4版、2006年)”而进行实施。

(原料合成)

原料制法1

[化学式11]

原料化合物(5)可通过化合物(3)和化合物(4)的酰胺化反应来制造。

该反应中，使用等量的或一方过量的化合物(3)和化合物(4)，在缩合剂的存在下，在对反应惰性的溶剂中，在从冷却至加热、优选-20℃～60℃下通常搅拌0.1小时～5天。在此，作为溶剂没有特别的限定，例如，可列举出苯、甲苯或二甲苯等的芳香族烃类；二氯甲烷(DCM)、1,2-二氯乙烷(DCE)或氯仿等的卤代烃类；二乙醚、四氢呋喃(THF)、二噁烷、二甲氧基乙烷(DME)等的醚类；N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、乙酸乙酯、乙腈或水、或者它们的混合物。作为缩合剂，有时优选使用1-[双(二甲氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶-1-鎓-3-氧化物六氟磷酸盐(HATU)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺、二环己基碳化二亚胺(DCC)、1,1’-羰基二咪唑(CDI)、叠氮磷酸二苯酯、三氯氧磷、或者诸如PS-碳化二亚胺(PS-Carbodiimide)(アルゴノートテクノロジー(Argonaut Technologies)，美国)等担载缩合剂的聚苯乙烯树脂，但并不限定于这些。另外，有时使用诸如1-羟基苯并三唑(HOBt)等的添加剂对于反应是有利的，另外，为了使反应顺利地进行，有时有利的是，在例如三乙胺(TEA)、N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)或N-甲基吗啉(NMM)等有机碱，或者碳酸钾、碳酸钠或氢氧化钾等无机碱的存在下进行反应。此外，为了除去反应结束后剩余的胺，可使用诸如PS-异氰酸酯(PS-Isocyanate)(アルゴノートテクノロジー，美国)等的担载有异氰酸酯的聚苯乙烯树脂。进而，为了除去反应结束后剩余的羧酸及前述的添加剂等，可使用诸如MP-碳酸酯(MP-Carbonate)(アルゴノートテクノロジー，美国)等的担载有季铵盐的聚苯乙烯树脂。

另外，也可使用将化合物(3)衍生为反应性衍生物后，再使其与化合物(4)反应的方法。在此，作为化合物(3)的反应性衍生物，可列举出与三氯氧磷、亚硫酰氯等的卤化剂反应而得到的酰卤化物；与氯甲酸异丁酯等反应而得到的混合酸酐、与HOBt等缩合而得到的活性酯等。这些反应性衍生物与化合物(4)的反应可在前述的卤化烃类、芳香族烃类、醚类等对反应惰性的溶剂中，在冷却～加热下(优选-20℃～60℃下)进行。

原料制法2

[化学式12]

(式中，X表示离去基团。)

原料化合物(2)可以通过化合物(5)和化合物(6)的烷基化反应来制造。

作为由X表示的离去基团的具体例子，包括卤素、甲磺酰氧基、对甲苯磺酰氧基、三氟甲磺酰氧基等。

在该反应中，使用等量的或一方过量的化合物(5)和化合物(6)，在对反应惰性的溶剂中，或者无溶剂下，在冷却至加热回流下、优选0℃～80℃下将它们的混合物通常搅拌0.1小时～10天。作为在此使用的溶剂的例子，没有特别的限定，可列举出苯、甲苯、二甲苯等的芳香族烃类；二乙醚、THF、二噁烷、DME等的醚类；DCM、DCE、氯仿等的卤代烃类；DMF、DMSO、1-甲基-2-吡咯烷酮、二甲基乙酰胺、丙酮、乙酸乙酯、乙腈以及它们的混合物。为了使反应顺利地进行，有时有利的是，在TEA、DIPEA或NMM等的有机碱，或者叔丁醇钾、碳酸铯、碳酸钾、碳酸钠或氢氧化钾等无机碱的存在下进行反应。

化合物A被分离、纯化为游离化合物、它的盐、水合物、溶剂合物、或多晶态物质。化合物A的盐可通过进行常规的成盐反应而制备。

可通过应用萃取、分步结晶、各种分级层析法等常规的化学操作进行分离、纯化。

可通过外消旋体的一般的光学拆分法(例如，诱导与光学活性的碱或酸形成非对映异构体盐以便分步晶体、使用手性柱等的色谱法等)而得到光学异构体，另外，可由适当的光学活性的原料化合物来制造光学异构体。

通过以下试验确认化合物A的药理活性。

试验例1：大鼠EP4受体亲和性评价试验

大鼠EP4受体表达载体的构建：

将大鼠EP4受体基因(GenBank登录号：NM_032076.1)导入到表达载体pcDNA3.1-V5-His-TOPO(Invitrogen)中。

大鼠EP4受体的瞬时表达：

将大鼠EP4受体的表达载体导入到HEK-293细胞(ATCC编号：CRL-1573)中。导入使用Lipofectoamine(注册商标)2000试剂(Invitrogen)，并按照附带的说明书进行。导入后通过α-MEM培养基培养20至24小时。

膜组分的制备：

吸除培养基，在每15cm的培养皿中加入10ml的冷却的磷酸缓冲生理盐水(Phosphate buffered saline(PBS))，使用细胞刮刀(Sumitomo Bakelite)将细胞刮下。回收并离心(250x g、4℃、5min)细胞后，使其悬浮于每培养皿6ml的冷却20mmol/L的Tris-HCl(pH7.4；ナカライテスク，包含5mmol/L的乙二胺四乙酸(EDTA，ナカライテスク))中，使用ポリトロン(注册商标)进行匀浆，并将该均浆物离心(69,000x g，20min，4℃)。将所得的沉淀再次悬浮在冷的20mmol/L的Tris-HCl中，再次匀浆，并将该均浆物离心(69,000x g，20min，4℃)。将所得的沉淀悬浮于每个培养皿的1ml的50mmol/L的HEPES-NaOH(Dojindo Laboratories)(pH7.5)中，然后进行匀浆，将匀浆物作为膜组分在-80℃进行冷冻保存。此时，使用一部分用于蛋白质浓度的测定。使用Bio-Rad蛋白测定试剂盒(Bio-Rad Laboratories)进行蛋白质浓度的测定，并按照附带的标准操作规程以一式两份(duplicate)进行。

结合测定：

[³H]PGE2及膜组分通过测定缓冲液(50mmol/L HEPES-NaOH，10mmol/L MgCl₂，pH7.5)进行稀释，被检测化合物及未标记的PGE2(Cayman)通过DMSO及测定缓冲液进行稀释。将反应液(200μL)的组成设为50mmol/L HEPES-NaOH(pH7.5)、10mmol/L MgCl₂、0.3nmol/L[³H]PGE2(Perkin Elmer)50μL、大鼠EP4细胞膜组分(200μg蛋白质/mL)100μL、以及被检测化合物(最终浓度为0.1、0.3、1、3、10、30及100nmol/L)50μL。在非特异性结合测定中，添加未标记的PGE2(Cayman)而使其最终浓度为1μmol/L。将DMSO的最终浓度设为1％。将反应液在96孔微孔板(Sumitomo Bakelite)中于室温下孵育1小时。采用FilterMate收集器通过滤纸UniFilter-96GF/B(Perkin Elmer)将反应液进行过滤。利用300μL/孔的冷却的测定缓冲液将过滤后的滤纸洗净3次后，再通过干燥机干燥一晚，加入50μL/孔的液体闪烁体MicroScint20(Perkin Elmer)。使用TopCount(Perkin Elmer)测定放射活性。测定全部以一式两份(duplicate)实施1次。从总结合量中减去非特异性结合量从而求得特异性结合量。Ki值按照常规方法进行计算。

对于评价的结果，化合物A对大鼠EP4受体的Ki值为0.874nmol/L。需要说明的是，专利文献1的实施例205的化合物对大鼠EP4受体的Ki值为140nmol/L。

试验例2：人EP4受体亲和性评价试验

结合测定：

[³H]PGE2及人EP4细胞膜组分(Chemicon)通过测定缓冲液(50mmol/L HEPES-NaOH、5mmol/L MgCl₂，1mmol/L CaCl₂(pH7.4)、0.5％牛血清白蛋白(Bovine serum albumin(BSA))进行稀释，被检测化合物及未标记的PGE2(Sigma)通过DMSO及测定缓冲液进行稀释。将反应液(250μL)的组成设为175μL的包含[³H]PGE2(最终浓度2.9nmol/L)的测定缓冲液、50μL的膜组分(Chemicon、40μg蛋白质/mL)、以及25μL的被检测化合物(最终浓度为0.1、1、10、100及1000nmol/L)。在非特异性结合测定中，添加未标记的PGE2而使其最终浓度为10μmol/L。将DMSO的最终浓度设为1％。在25℃下将反应液进行孵育60分钟。采用细胞收集器(ブランデル)通过滤纸GF/C(Whatman)将该反应液过滤。利用1ml的包含50mmol/L HEPES-NaOH(pH7.4)、500mmol/L NaCl、0.1％BSA的溶液将过滤后的滤纸洗净3次。将滤纸GF/C置入测定小瓶中，加入5ml的液体闪烁体Atomlight。使用液体闪烁计数器(Perkin Elmer)测定放射活性。测定全部以一式两份(duplicate)实施一次。从总结合量中减去非特异性结合量从而求得特异性结合量。Ki值按照常规方法进行计算。

对于评价的结果，化合物A对人EP4受体的Ki值为1.46nmol/L。

试验例3：基于人Jurkat细胞中cAMP量测定的人EP4受体拮抗作用评价试验

细胞培养：

使用添加有10％胎牛血清(fetal bovine serum(FBS))的RPMI1640培养基(产品编号11879020，Invitrogen)，在37℃、5％CO₂的条件下对Jurkat细胞(来自于人白血病T淋巴瘤)进行培养。使细胞增殖至汇合(Confluent)前，添加最终浓度为5μmol/L的吲哚美辛，进一步培养18小时。将该细胞回收至15ml的Spitz管中，通过セルバンカー(三菱化学ヤトロン)调制为1×10⁶个/ml，然后在-80℃进行保存。

化合物处理：

利用包含0.5％BSA的测定缓冲液(1×HBSS(汉克斯缓冲盐溶液，日水制药)、20mmol/L HEPES-NaOH(ナカライ)(pH 7.4)、0.5mmol/L IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、WAKO)、0.02％CHAPS(Sigma)、0.5％BSA(Sigma)和2μmol/L吲哚美辛(Sigma))将被检测化合物稀释调整为最终浓度的3倍的浓度。利用包含0.5％BSA的测定缓冲液将PGE2调整为300nm/L。将冷冻保存的Jurkat细胞在37℃下解冻，并利用包含0.5％BSA的测定缓冲液将其调制成1×10⁶个/ml。将被检测化合物(最终浓度为0.01、0.03、0.1、0.3、1、3及10nmol/L)、细胞、PGE2以此顺序以每孔5μL添加到384孔U型底黑色微孔板(コーニング)中，利用板振荡器搅拌后，在室温下孵育30分钟。为求出PGE2非刺激状态的cAMP的量，设计PGE 2未添加组。

cAMP量的测定及分析：

在cAMP的测定中，使用cAMP HiRange试剂盒(Cisbio international)。孵育后，将通过Lysis缓冲液(50mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0)、0.8mol/L KF、1％TritonX-100、0.2％BSA)稀释为0.6倍的试剂盒的d2试剂以每孔5μL添加到各孔中，利用板振荡器搅拌。接着，将通过Lysis缓冲液稀释为0.6倍的试剂盒的铕穴状化合物试剂以每孔5μL添加到各孔中，通过板振荡器搅拌后，避光下于室温孵育60分钟。孵育后，使用ARVO1420(Perkin Elmer)测定穴状化合物在620nm下的荧光强度，d2在665nm下的荧光强度。将标准曲线制作用的280、70、17.5、4.38、1.09、0.27、0.068nmol/L的cAMP分别添加至孔中，与上述同样地测定荧光强度。测定全部以一式三份(triplicate)进行。将PGE2添加时的cAMP的量设为100％，将PGE2未添加时的cAMP的量设为0％，由化合物处理时的cAMP的量，通过Logistic回归法算出化合物的IC₅₀值。由3次的实验结果算出平均值。

对于评价的结果，在人Jurkat细胞中，化合物A对于基于PGE2(100nmol/L)的cAMP产生作用的IC₅₀值为0.16nmol/L。

试验例4：基于cAMP量测定的大鼠EP4受体拮抗作用评价试验

大鼠EP4受体表达载体的构建：

与试验例1同样地进行。

大鼠EP4受体稳定表达细胞的构建：

将大鼠EP4受体的表达载体导入到CHO-K1细胞(ATCC编号：CCL-61)中。导入使用Lipofectoamine(注册商标)2000试剂(Invitrogen)，并按照所附的说明书进行。在导入后用含有G418(ナカライテスク)的α-MEM培养基(产品编号12571063，Invitrogen)进行培养，从而取得耐药性克隆。

细胞培养及化合物处理：

将稳定表达大鼠EP4的CHO-K1细胞以0.5×10⁴个/100μL接种在96孔平板上，并进行彻夜培养。将培养基替换为2μmol/L的吲哚美辛/0.5％BSA/α-MEM培养基，再过60分钟后，替换为1mmol/L的IBMX/2μmol/L的吲哚美辛/0.5％BSA/α-MEM培养基。10分钟后，添加被检测化合物(最终浓度为0.1、0.3、1、3及10nmol/L)，再过10分钟后，以最终浓度成为100nmol/L的方式添加PGE2(最终DMSO浓度为0.1％)。为了计算出基于PGE2添加的cAMP的生成量，设计PGE2未添加组。将细胞在CO₂培养箱(37℃，5％CO₂)中培养并进行反应。在30分钟后除去培养基，添加0.2％的TritonX-PBS 100μL/孔从而裂解细胞。试验以一式两份(duplicate)实施2次。

cAMP量的测定及分析：

使用cAMP HiRange试剂盒测定细胞裂解液中所含的cAMP量。将各孔的细胞裂解液以每个10μL分别注入到384孔U型底黑色微孔板，再按d2试剂和铕穴状化合物试剂的顺序分别添加5μL后，在遮光下于室温孵育60分钟。孵育后，使用ARVO1420在620nm处测定穴状化合物的荧光强度，在665nm处测定d2的荧光强度。将标准曲线制作用的280、70、17.5、4.38、1.09、0.27及0.068nmol/L的cAMP添加至各个孔中，与上述同样地测定荧光强度。将添加最终浓度为100nmol/L的PGE2时的cAMP的量设为100％，将PGE2未添加时的cAMP的量设为0％，由被检测化合物处理时的cAMP的量，通过Logistic回归法算出被检测化合物的IC₅₀值。由2次的实验结果算出平均值。

对于评价的结果，在大鼠EP4受体表达CHO-K1细胞中，化合物A对于基于PGE2(100nmol/L)的cAMP产生作用的IC₅₀值为1.04nmol/L。

试验例5：体内大鼠EP4受体拮抗作用评价试验

将非禁食SD大鼠(雄性，6周龄)用于试验。将溶解于PEG400:20％Tween80:1mol/L NaHCO₃水溶液＝1:4:5的混合液中的被检测化合物以0.03mg/kg经口给药(po)(5mL/kg)。1小时后，将溶解于生理盐水的EP4激动剂ONO-4819的活性代谢物(ONO-AE1-437(CAS No.256382-23-7))以0.01mg/kg皮下给药(sc)到背部(5mL/kg)。30分钟后将脂多糖(LPS，0.01mg/kg)进行尾静脉内给予(2mL/kg)，60分钟后在麻醉下采集约0.5mL的血液到含有肝素的管中。通过离心操作(1000×g，10分钟，4℃)从血液样品中分离血浆。利用ELISA试剂盒(DuoSet ELISA，R&D Systems)测定血浆中的大鼠TNF-α浓度。将ONO-AE1-437未处理组(n＝5)的TNF-α的浓度设为抑制率100％，将ONO-AE1-437处理组(n＝5)的TNF-α的浓度设为抑制率0％，从而计算出被检测化合物组(n＝5)对于EP4激动剂的TNF-α产生抑制作用的抑制率。

对于评价的结果，化合物A(0.03mg/kg，po)抑制了38％的EP4激动剂ONO-AE1-437(0.01mg/kg，sc)的TNF-α产生抑制作用。

试验例6：对于大鼠血浆中肾素活性的作用评价试验

将非禁食SD大鼠(雄性，7周龄)用于试验。将溶解于PEG400:20％Tween80:1mol/L NaHCO₃水溶液＝1:4:5的混合液中的被检测化合物以0.3mg/kg经口给药(5mL/kg)。1小时后，将溶解于生理盐水的EP4激动剂ONO-4819的活性代谢物(ONO-AE1-437)以0.01mg/kg皮下投药到背部(5mL/kg)。10分钟后在无麻醉下断头并采集约2mL的血液到含有3mg的EDTA·2Na的管中。通过离心操作(1000×g，10分钟，4℃)将血浆从血液样品中分离。将10μL的测定缓冲液(用蒸馏水将20.4mL的2mol/L的NaH₂PO₄、9.3mL的1mol/L的Na₂HPO₄、15mL的0.5mol/L的EDTA·2Na、0.1g的CHAPS混合并稀释为50mL，PH 5.55)及1μL的100mmol/L的4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟盐酸盐添加到100μL的血浆中。分取一半的量在37℃下孵育90分钟。剩下的一半的量在4℃下保存并作为空白反应用。通过ELISA法测定两个样品中的血管紧张素(Angiotensin)I的浓度，将37℃孵育样品的值减去空白反应的值而得的浓度作为血浆中肾素活性(plasma renin activity(PRA))。将ONO-AE1-437未处理组(n＝5)的PRA设为抑制率100％，将ONO-AE1-437处理组(n＝4)的PRA设为抑制率0％，从而计算出被检测化合物组(n＝4)的抑制率。

对于评价的结果，化合物A(0.3mg/kg，po)抑制了102％的基于EP4激动剂ONO-AE1-437(0.01mg/kg，sc)的PRA上升。

试验例7：对于2型糖尿病db/db小鼠的尿中白蛋白的效果检验试验

在试验中使用2型糖尿病db/db小鼠(雄性，8周龄)。采集24小时尿液，通过使用抗小鼠白蛋白抗体(RAM/Alb/7S、Nordic Immunology)的ELISA法测定所得尿液样本的白蛋白浓度，并使用CRE-EN康佳诺(カイノス)测定尿液中肌酐浓度。计算出尿液中白蛋白-肌酐比(ACR)，以不偏重ACR的方式进行分组成为被检测化合物非处理组(n＝12)及被检测化合物处理组(n＝12)。1日1次并持续1周地将悬浊于0.5％的甲基纤维素(MC)溶液的被检测化合物以0.3mg/kg经口给药至被检测化合物处理组(10mL/kg)。1日1次并持续1周地将0.5％的MC溶液以10mL/kg的给药剂量经口给药至被检测化合物非处理组。在最终给药结束后实施24小时尿液采集，将计算出的ACR作为指标检验被检测化合物对于2型糖尿病小鼠的早期肾病的改善效果。求得将被检测化合物非处理组的ACR值设为100％时的被检测化合物处理组的ACR的抑制率。

对于评价的结果，化合物A(0.3mg/kg，po)通过一周时间的经口投药从而抑制了44％的2型糖尿病db/db小鼠的ACR。

试验例8：对于5/6肾脏摘除(5/6Nx)慢性肾功能衰竭大鼠的肾功能的效果检验试验

在试验中使用Wistar大鼠(雄性，8周龄)。在戊巴比妥麻醉下切除左肾的三分之二，并在一周后把整个右肾摘除(5/6Nx)。在5/6Nx的两周时间后，采集24小时尿液，使用Bio-Rad蛋白测定试剂盒测定所得尿液样本的尿蛋白浓度，并使用デタミナーL CRE(协和メデックス)测定尿液中的肌酐浓度。计算出尿液中尿蛋白-肌酐比(UPCR)，以不偏重UPCR的方式进行分组成为被检测化合物非处理组(n＝12)及被检测化合物处理组(n＝12)。其后，1日1次并持续6周地将悬浊于0.5％的MC溶液的被检测化合物以0.2mg/kg经口给药至被检测化合物处理组(5mL/kg)。1日1次并持续6周地将0.5％的MC溶液以5mL/kg的给药剂量经口给药至被检测化合物非处理组。在最终给药结束后实施24小时尿液采集，将计算出的UPCR作为指标检验被检测化合物对于慢性肾功能衰竭大鼠的肾功能的改善效果。求得将被检测化合物非处理组的UPCR设为100％时的被检测化合物处理组的UPCR的抑制率。

对于评价的结果，化合物A(0.2mg/kg，po)通过6周时间的经口投药从而抑制了47％的5/6肾脏摘除慢性肾功能衰竭大鼠的UPCR。

试验例9：对于大鼠EP1/EP2/EP3受体的受体拮抗作用评价试验(选择性试验)

评价化合物A对于来自大鼠的PGE2受体的其它亚型(EP1、EP2、EP3)的拮抗作用。对于EP1及EP3来说以细胞内Ca²⁺的量为指标，对于EP2来说以细胞内cAMP的量为指标，从而检验被检测化合物的作用。

大鼠EP1、EP2或EP3受体表达载体的构建：

将大鼠EP1受体基因(GenBank登录编号：D88751.1)、大鼠EP2受体基因(GenBank登录编号：NM_031088.1)、或大鼠EP3受体基因(GenBank登录编号：NM_012704.1)分别导入到表达载体pcDNA3.1-V5-His-TOPO(Invitrogen)。

大鼠EP1、EP2或EP3受体稳定表达细胞的构建：

将大鼠EP1、EP2或EP3受体的表达载体导入到HEK-293细胞(大鼠EP1或EP3受体稳定表达用，ATCC编号：CRL-1573)或CHO-K1细胞(大鼠EP2受体稳定表达用，ATCC编号：CCL-61)。导入使用Lipofectoamine(注册商标)2000试剂(Invitrogen)，并按照附带的说明书进行。导入后通过含有G418(ナカライテスク)的D-MEM培养基(大鼠EP1或EP3受体稳定表达用)(产品编号11885084，Invitrogen)或含有G418的α-MEM培养基(大鼠EP2受体稳定表达用)进行细胞培养，从而取得耐药性克隆。

EP2受体稳定表达细胞的培养及化合物处理：

将稳定表达大鼠EP2的CHO-K1细胞以1×10⁴个/100μL接种在96孔平板上，使用添加有10％的FBS的α-MEM培养基在37℃及5％CO₂的条件下进行彻夜培养。将培养基替换为2μmol/L的吲哚美辛/0.1％BSA/α-MEM培养基，再过60分钟后，替换为1mmol/L的IBMX/2μmol/L的吲哚美辛/0.1％BSA/α-MEM培养基(产品编号12571063，Invitrogen)。10分钟后，添加被检测化合物(最终浓度为0.01、0.1、1及10μmol/L)，再过10分钟后，以最终浓度成为100nmol/L的方式添加PGE2(最终DMSO浓度为0.1％)。为了计算出基于PGE2添加的cAMP的生成量，设计PGE2未添加组。使细胞在CO₂培养箱(37℃，5％CO₂)中培养并反应。在30分钟后除去培养基，添加0.2％的TritonX-PBS 100μL/孔从而裂解细胞。试验一式两份(duplicate)实施1次。

EP2受体稳定表达细胞内的cAMP量的测定及分析：

与试验例4同样地，使用cAMP HiRange试剂盒测定细胞裂解液中所含的cAMP量。将最终浓度为100nmol/L的PGE2添加时的cAMP的量设为100％，将PGE2未添加时的cAMP的量设为0％，算出被检测化合物处理时的cAMP的量的比例。

对于评价的结果，对于大鼠的EP2受体介导的基于PGE2的细胞内cAMP量的增加，化合物A直到10,000nmol/L显示出了50％以上的抑制作用。

EP1及EP3受体稳定表达细胞的培养及化合物处理：

将稳定表达大鼠EP1或大鼠EP3的HEK-293细胞以1×10⁴个/100μL接种在96孔平板上，使用添加有10％的FBS的D-MEM培养基在37℃及5％CO₂的条件下进行彻夜培养。按照70:1的比例将Ca3测定试剂盒(モレキュラーデバイス)的荧光试剂染料添加到测定缓冲液(1xHBSS，20mmol/L的HEPES-NaOH(pH7.4)，0.6mg/mL的丙磺舒，0.1％BSA)中。将培养基替换为这种稀释的染料溶液，孵育3小时。向其添加溶解于DMSO及上述测定缓冲液的化合物(最终浓度为1及10μmol/L)。5分钟后以最终浓度成为100nmol/L的方式添加PGE2(最终DMSO浓度1％)。对于使用大鼠EP1或大鼠EP3受体稳定表达细胞的试验，分别以一式两份(duplicate)实施1次。

EP1或EP3受体稳定表达细胞内的Ca²⁺浓度的测定及分析：

以染料的荧光强度为指标使用FLIPR tetra(モレキュラーデバイス)测定细胞内的Ca²⁺浓度。为了测定根据PGE2添加的细胞内的Ca²⁺浓度，设计PGE2未添加组。将最终浓度100nmol/L的PGE2添加时的Ca²⁺浓度设为100％，将PGE2未添加时的Ca²⁺浓度设为0％，从而计算出化合物处理时的Ca²⁺浓度的比例。

对于评价的结果，对于大鼠的EP1或EP3受体介导的基于PGE2的细胞内Ca²⁺浓度的上升，化合物A直到10,000nmol/L显示出了50％以上的抑制作用。

试验例10：对于大鼠胃肠功能障碍的评价

使用SD大鼠(雄性，7周龄)。将溶解在PEG400:20％Tween 80:1mol/L的NaHCO₃水溶液＝1:4:5的混合液中的被检测化合物以3mg/kg经口给药7天(n＝5，5mL/kg)。再将上述混合液以5mL/kg的给药剂量经口给药到被检测药非处理组(n＝5)7天。在最终给药的第二日在彻夜禁食下采集血液学/血液化学的检查用的血液。血液采集后，立刻解剖通过放血而安乐死的动物，摘除胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠、肝脏。将摘除的器官固定在10％中性缓冲福尔马林溶液中，用于组织病理学评估。

对于评价的结果，没有确认到化合物A表现出异常。

上述试验的结果确认了：化合物A具有EP4受体亲合性，并表现出优异的EP4受体拮抗作用。确认了化合物A抑制了EP4激动剂诱发的PRA上升(试验例6)。在对于2型糖尿病db/db小鼠的尿中白蛋白的效果检验试验，以及对于5/6肾脏摘除(5/6Nx)慢性肾功能衰竭大鼠的肾功能的效果检验试验中，确认了化合物A具有改善的效果(试验例7、8)。

因此，化合物A或其盐可用于慢性肾功能衰竭和/或糖尿病肾病的预防或治疗等。

从试验例1的结果可知，相比于专利文献1的实施例205，化合物A示出了优异的EP4受体亲和性。从上述试验例10的结果进一步示出了，化合物A为引发胃肠道功能障碍的担忧较小的化合物。

上述试验的结果确认了化合物A或其盐具有EP4受体拮抗作用，可用作EP4参与的各种疾病的预防或治疗用药物组合物等的有效成分。作为EP4参与的各种疾病，例如，可列举出肾病(例如肾硬化、痛风性肾病、多囊肾、肾病综合征、急性肾炎、复发性血尿、持续性血尿、慢性肾炎、急进性肾炎、急性肾功能衰竭、慢性肾功能衰竭、糖尿病肾病、巴特综合征等)、炎症性皮肤病(例如晒伤、烧伤、湿疹、皮炎等)、由动脉硬化症所引起的缺血性心脏病(例如心肌梗塞、心绞痛等)、由动脉硬化症所引起的脑血管疾病(例如脑中风、包括腔隙性脑梗死的脑中风、脑血栓、脑出血、蛛网膜下腔出血、脑梗塞等)、消化性溃疡(例如胃溃疡、十二指肠溃疡等)、恶性肿瘤及其转移(例如结肠癌、乳腺癌等)、疼痛(例如术后急性疼痛、外伤性疼痛、拆线后疼痛、颈臂疼痛、肩周炎、变形性关节炎(OA)、腕管综合征、慢性类风湿性关节炎(RA)、术后慢性疼痛、间质性膀胱炎、膀胱疼痛综合征、非细菌性慢性前列腺炎(CP/CPPS)、脊髓损伤后疼痛、脑梗塞后疼痛、多发性硬化症(疼痛)、帕金森氏病的疼痛、糖尿病性神经性疼痛、疱疹后疼痛、HIV神经性疼痛、三叉神经痛、纤维肌痛症、腰痛症(包括伤害性、神经性在内的腰痛全体)、腰椎管狭窄症、脊椎疾病的疼痛(除腰椎管狭窄症、脊髓损伤以外)、丘脑性疼痛、偏头痛、头痛、不安腿(不宁腿)综合征、癌性疼痛、肠易激综合征)等，特别是慢性肾功能衰竭和/或糖尿病肾病等的肾病。

另外，化合物A或其盐可用作治疗和/或预防以下疾病的药剂，所述疾病包括：各种的水肿(例如心源性水肿、脑水肿等)、诸如恶性高血压症等的高血压、经前期综合征、尿路结石、由急性或慢性疾病引起的尿乏症、高磷血症等。

进而，化合物A或其盐可用作治疗和/或预防以下疾病的药剂，所述疾病包括：各种的多尿症(例如中枢性尿崩症、肾性尿崩症、心因性尿崩症、糖尿病、氯化钠吸收障碍、烦渴等)。

含有化合物A或其盐作为有效成分的医药组合物可以使用本领域通常使用的赋形剂(即药用赋形剂或药用载体等)并通过通常使用的方法来制备。

给药可以为利用片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、液体制剂等的经口给药，或者利用关节内、静脉内、肌肉内等的注射剂、栓剂、滴眼剂、眼软膏、经皮用液体制剂、软膏剂、经皮贴剂、经粘膜液体制剂、经粘膜贴剂、吸入剂等的非经口给药中的任意一种形式。

作为用于经口给药的固体组合物，可使用片剂、散剂、颗粒剂等。在这样的固体组合物中，可将有效成分与至少1种惰性赋形剂混合。组合物可以根据常规方法含有惰性添加剂，例如润滑剂或崩解剂、稳定剂、溶解助剂。片剂或丸剂可以根据需要用糖衣或胃溶性或者肠溶性物质的膜进行包衣。

用于经口给药的液体组合物含有可药用的乳浊剂、溶液剂、悬浊剂、糖浆剂或酏剂等，且含有一般所用的惰性稀释剂，例如纯水或乙醇。该液体组合物除惰性稀释剂以外，也可含有如可溶化剂、湿润剂、悬浊剂之类的辅助剂、甘味剂、风味剂、芳香剂、防腐剂。

用于非经口给药的注射剂含有无菌的水性或非水性溶液剂、悬浊剂或乳浊剂。作为水性的溶剂，包含例如注射用蒸馏水或生理食盐水。作为非水性的溶剂，有例如乙醇之类的醇类。这样的组合物还可以进一步含有等渗剂、防腐剂、湿润剂、乳化剂、分散剂、稳定化剂、或溶解辅助剂。它们(例如)通过细菌保留过滤器来过滤、通过杀菌剂的配合或照射而无菌化。另外，它们也可以制造无菌固体组合物，且于使用前溶解或悬浊于无菌水或无菌的注射用溶剂来使用。

外用剂包含软膏剂、硬膏剂、霜剂、胶状剂、糊剂、喷雾剂、洗剂、点眼剂、眼软膏等。含有一般所用的软膏基剂、洗剂基剂、水性或非水性的液体制剂、悬浊剂、乳剂等。

吸入剂或经鼻剂等的经黏膜剂可使用固体、液体、或半固体状，可根据以往公知的方法来制造。也可以适当添加例如公知的赋形剂、或进一步适当添加pH调整剂、防腐剂、表面活性剂、润滑剂、稳定剂或增黏剂等。给药可使用用于适当的吸入或吹送的装置。例如，可使用计量给药吸入装置等的公知装置或喷雾器，将化合物单独地或作为配方后的混合物的粉末来给药、或者可以将化合物与可药用的载体组合后作为溶液或悬浮液来给药。干燥粉末吸入器等可为单次或多次给药用吸入器，可利用干燥粉末或含有粉末的胶囊。或可为加压气溶胶喷雾等的方式，其使用适当的抛射剂，例如氯氟烷烃或二氧化碳等的适合的气体。

通常经口给药时，1天的给药量按体重约为0.001～100mg/kg，优选为0.1～30mg/kg，更优选为0.1～10mg/kg，并将该给药量1次服用或分2次～4次服用。静脉内给药时，1天的给药量按体重约为0.0001～10mg/kg是适当的，并将该给药量每日一次或分为多次给药。而且，使用经粘膜剂时，按体重约为0.001～100mg/kg，每日一次或分多次给药。应考虑症状、年龄、性别等，根据每个患者的情况，来适当地决定给药量。

虽然根据给药路径、剂形、给药部位、赋形剂或添加剂的种类而不同，但本发明的医药组合物含有0.01～100重量％、作为某一方式含有0.01～50重量％的有效成分即1种或其以上的化合物A。

化合物A可以与认为化合物A示出有效的那些疾病的各种治疗剂或预防剂并用。在并用时，可以同时给药，或者分别连续给药、或按所希望的时间间隔给药。同时给药时的制剂可以是配合剂，也可以分别制成制剂。

实施例

以下，基于实施例，对式(1)所示的化合物A或其盐的制造方法进一步进行详细的说明。化合物A或其盐的制造方法并不只限定于以下所示的具体的实施例的制造方法(步骤)，也可通过本领域技术人员不言自明的方法进行制造。

需要说明的是，通过以下的方法进行DSC分析及粉末X射线衍射。

(1)DSC分析

使用TA Instruments制的Q1000及Q2000进行DSC分析。将约2mg试样填充到专用的铝制试样盘中，在不将试样盘盖住的状态下在氮气气氛(50mL/分钟)中，以室温至300℃为测定范围，在10℃/分钟的升温速度下连续地测定并记录在试样和参考样(空的铝制试样盘)之间发生的热量变化。需要说明的是，按照各装置所指示的方法及顺序从而操作包含数据处理的装置。

(2)粉末X射线衍射

使用RINT-TTRII，在管球为Cu、管电流为300mA、管电压为50kV、取样宽度为0.020°、扫描速度为4°/分钟、波长为测定衍射角范围(2θ)为2.5至40°的条件下进行粉末X射线衍射的测定。需要说明的是，按照各装置所指示的方法及顺序从而操作包含数据处理的装置。

另外，在实施例中使用以下缩写。ESI+：在ESI-MASS中的m/z值；NMR-DMSO-d₆：在DMSO-d₆中的¹HNMR中的峰δ(ppm)。

需要说明的是，为方便起见，浓度mol/L以M来表示。例如，1M氢氧化钠水溶液的意思是1mol/L的氢氧化钠水溶液。

实施例1

4-[(1S)-1-({[4-溴-1-(异喹啉-3-基甲基)-3-甲基-1H-吡唑-5-基]羰基}氨基)乙基]苯甲酸(I)的合成。

步骤1.

4-[(1S)-1-{[(4-溴-3-甲基-1H-吡唑-5-基)羰基]氨基}乙基]苯甲酸甲酯(5a)的合成

[化学式13]

将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺(1.2mL)添加到4-溴-3-甲基-1H-吡唑-5-羧酸(3)(1.00g)、DMF(20mL)、4-[(1S)-1-氨基乙基]苯甲酸甲酯盐酸盐(1.26g)、HOBT(0.99g)的混合物中，在室温下彻夜搅拌。向混合物中添加乙酸乙酯，在冰冷下搅拌。向混合物中添加10％柠檬酸水溶液，分离为有机层及水层，采用乙酸乙酯萃取水层。将所得的有机层合并，并依次采用饱和碳酸氢钠水溶液、水、饱和食盐水进行洗净，采用无水硫酸镁干燥，并过滤。将滤液减压浓缩，得到4-[(1S)-1-{[(4-溴-3-甲基-1H-吡唑-5-基)羰基]氨基}乙基]苯甲酸甲酯(5a)(1.75g)。

ESI+：366，368

步骤2.

4-[(1S)-1-({[4-溴-1-(异喹啉-3-基甲基)-3-甲基-1H-吡唑-5-基]羰基}氨基)乙基]苯甲酸甲酯(2a)的合成

[化学式14]

将4-[(1S)-1-{[(4-溴-3-甲基-1H-吡唑-5-基)羰基]氨基}乙基]苯甲酸甲酯(5a)(1.72g)和DMF(20.0mL)的混合物在冰冷下搅拌。向混合物中添加叔丁醇钾(580mg)，搅拌0.5小时。向混合物中添加3-(溴甲基)异喹啉(1.10g)和DMF(14mL)的混合物，升温至室温并搅拌10天。将所得的混合物在冰冷下搅拌，添加乙酸乙酯、10％柠檬酸水溶液，过段时间后搅拌，采用乙酸乙酯进行萃取。将所得的有机层依次采用饱和碳酸氢钠水溶液、水、饱和食盐水进行洗净，采用无水硫酸镁干燥，并过滤。将滤液减压浓缩，采用硅胶柱色谱法(正己烷:乙酸乙酯＝6:4)精制残渣，得到4-[(1S)-1-({[4-溴-1-(异喹啉-3-基甲基)-3-甲基-1H-吡唑-5-基]羰基}氨基)乙基]苯甲酸甲酯(2a)(518mg)。

NMR-DMSO-d₆：9.28(1H,d,J＝7.8Hz),9.23(1H,s),8.13(1H,d,J＝7.8Hz),7.89(1H,d,J＝7.8Hz),7.81-7.76(1H,m),7.72-7.64(3H,m),7.50(1H,s),7.38(2H,d,J＝8.3Hz),5.65-5.54(2H,m),5.12-5.04(1H,m),3.83(3H,s),2.17(3H,s),1.37(3H,d,J＝7.0Hz)。

步骤3.

4-[(1S)-1-({[4-溴-1-(异喹啉-3-基甲基)-3-甲基-1H-吡唑-5-基]羰基}氨基)乙基]苯甲酸(I)的合成

[化学式15]

在冰冷下将2M氢氧化钠水溶液(5.0mL)添加到4-[(1S)-1-({[4-溴-1-(异喹啉-3-基甲基)-3-甲基-1H-吡唑-5-基]羰基}氨基)乙基]苯甲酸甲酯(2a)(486mg)、THF(10.0mL)、甲醇(10.0mL)的混合物中，在室温下搅拌17小时。在冰冷下将1M盐酸(10.0mL)添加到混合物中，升温至室温，并搅拌2小时。滤取析出的固体，用水洗净从而得到了作为晶体的4-[(1S)-1-({[4-溴-1-(异喹啉-3-基甲基)-3-甲基-1H-吡唑-5-基]羰基}氨基)乙基]苯甲酸(I)(411mg)。

ESI+：493，495

NMR-DMSO-d₆：12.9-12.7(1H,m),9.30(1H,d,J＝7.8Hz),9.24(1H,s),8.13(1H,d,J＝8.1Hz),7.91(1H,d,J＝8.1Hz),7.81-7.76(1H,m),7.74-7.66(3H,m),7.53(1H,s),7.40(2H,d,J＝8.2Hz),5.60(2H,s),5.14-5.03(1H,m),2.16(3H,s),1.37(3H,d,J＝7.0Hz)。

元素分析：C24H21BrN4O3的计算值：C，58.43；H，4.29；N，11.36；Br，16.20。

实测值：C，58.33；H，4.38；N，11.24；Br，16.07。

采用Cu作为管球对实施例1的步骤3中所得的晶体进行粉末X射线衍射测定，其结果为得到了包含2θ(°)＝5.7、7.9、8.3、8.9、9.2、11.5、12.5、13.1、15.8、16.3、16.7、17.2、17.9、18.5及19.5的峰的衍射图。

从实施例1的步骤3中所得的晶体的DSC分析的结果可知，吸热峰的起始温度为253℃。

实施例2

4-[(1S)-1-({[4-溴-1-(异喹啉-3-基甲基)-3-甲基-1H-吡唑-5-基]羰基}氨基)乙基]苯甲酸甲磺酸盐(Ia)的合成

[化学式16]

在冰冷下将甲磺酸(140μL)添加到4-[(1S)-1-({[4-溴-1-(异喹啉-3-基甲基)-3-甲基-1H-吡唑-5-基]羰基}氨基)乙基]苯甲酸(I)(1000.0mg)、二噁烷(30mL)的混合物中。将所得的混合物升温至90℃，搅拌1小时。放置冷却至室温后，滤取析出的固体，得到了作为晶体的4-[(1S)-1-({[4-溴-1-(异喹啉-3-基甲基)-3-甲基-1H-吡唑-5-基]羰基}氨基)乙基]苯甲酸甲磺酸盐(Ia)(1030mg)。

ESI+：493，495

NMR-DMSO-d₆：9.32(1H,s),9.27(1H,d,J＝7.7Hz),8.17(1H,d,J＝7.9Hz),7.95(1H,d,J＝7.9Hz),7.90-7.79(1H,m),7.77-7.66(3H,m),7.59(1H,s),7.40(2H,d,J＝7.8Hz),5.71-5.54(2H,m),5.16-5.00(1H,m),2.33(3H,s),2.17(3H,s),1.37(3H,d,J＝7.1Hz)。

元素分析：C24H21BrN4O3.CH4O3S的计算值：C，50.94；H，4.27；N，9.50；S，5.44；Br，13.56。

实测值：C，50.65；H，4.25；N，9.36；S，5.41；Br，13.42。

采用Cu作为管球对实施例2中所得的晶体进行粉末X射线衍射测定，其结果为得到了包含2θ(°)＝4.7、9.5、12.0、13.2、13.7、15.3、18.8、20.3、20.9及22.8的峰的衍射图。

从实施例2中所得的晶体的DSC分析的结果可知，吸热峰的起始温度为192℃。

工业实用性

化合物A或其盐具有EP4受体拮抗作用，可以作为预防和/或治疗慢性肾功能衰竭和/或糖尿病肾病的药物组合物的有效成分而使用。