基于杂交链式反应(HCR)的检测的邻近试验的制作方法

文档序号:11813924阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种用于检测样品中的分析物的方法,所述方法包括:

a.使所述样品与包括至少第一和第二邻近探针的一组邻近探针接触,所述探针每个包括能够直接或间接结合所述分析物的分析物结合结构域和核酸结构域,从而所述邻近探针可以同时直接或间接结合所述分析物,其中,

i.所述第一和第二邻近探针的所述核酸结构域包括能够在允许条件下介导涉及所述结构域的相互作用的区域;并且

ii.所述第一和第二探针中的一个的所述核酸结构域包括HCR起始子区域,所述HCR起始子区域包括在亚稳定的二级结构内,从而在从所述亚稳定的二级结构释放之前,所述HCR起始子区域不能起始HCR反应;

b.引入允许条件以使得当所述探针两者均已直接或间接结合所述分析物时,允许所述第一和第二探针的所述核酸结构域彼此相互作用,其中所述相互作用使得所述第一或第二探针的所述核酸结构域的所述亚稳定的二级结构解折叠,以释放单链HCR起始子区域;

c.使用至少两个HCR单体进行HCR反应,其中第一HCR单体包括所述HCR起始子区域的互补性区域,并且所述HCR起始子区域与所述第一HCR聚合物的杂交使所述HCR反应开始,以形成聚合物;

d.检测所述聚合物,由此检测所述分析物。

2.如权利要求1所述的方法,其中所述第一探针的所述核酸结构域包括与所述第二探针的所述核酸结构域中的关联第二互补性区域互补的第一互补性区域,并且保护所述第一互补性区域,从而所述第一和第二互补区域不能够彼此杂交;并且其中在步骤(b)中,使所述第一互补性区域脱保护,以使得当所述探针两者均已直接或间接结合所述分析物时,允许所述第一和第二探针的所述核酸结构域的所述第一和第二互补区域彼此杂交,其中所述杂交使得所述第二探针的所述核酸结构域的所述亚稳定的二级结构解折叠,以释放单链HCR起始子区域。

3.如权利要求1或权利要求2所述的方法,其中当所述第一邻近探针的所述核酸结构域的所述第一互补性区域与所述第二邻近探针的所述核酸结构域的所述第二互补性区域杂交时存在一个或更多个错配。

4.如权利要求2所述的方法,其中所述第一探针的所述第一互补性区域被封闭性寡核苷酸保护,其中所述寡核苷酸在所述探针与所述样品接触之前与所述探针的所述核酸结构域预杂交,并且所述封闭性寡核苷酸被除去和/或降解以使所述第一互补区域脱保护。

5.如权利要求1或权利要求2所述的方法,其中所述第一探针的所述第一互补性区域被二级结构区域保护,所述二级结构被解折叠以使所述第一互补区域脱保护。

6.如权利要求5所述的方法,其中所述二级结构是亚稳定的二级结构。

7.如权利要求1至6中任一项所述的方法,其中所述第一和/或第二邻近探针的所述核酸结构域的所述亚稳定的二级结构包括发夹结构。

8.如权利要求5至7中任一项所述的方法,其中在所述邻近探针的结合之后,引入激活寡核苷酸,所述激活寡核苷酸包括与所述第一邻近探针可用的所述核酸结构域中的关联互补性区域互补的互补性区域,并且其中所述激活寡核苷酸与所述第一邻近探针的所述核酸结构域杂交,使所述二级结构解折叠并且使所述第一互补性区域暴露。

9.如权利要求8所述的方法,其中与所述激活寡核苷酸互补的所述关联互补性区域位于所述第一核酸结构域中的发夹结构的环中。

10.如权利要求5所述的方法,其中优选地包括发夹结构的所述二级结构经可逆的共价键,优选二硫键交联,并且在所述邻近探针的结合之后,所述共价键被破坏,优选地所述二硫键被还原,使所述发夹结构解折叠并且暴露所述第一互补性区域。

11.如权利要求1或权利要求2所述的方法,其中当所述第一探针的所述分析物结合结构域未被结合时,所述第一探针的所述核酸结构域的第一相互作用区域被保护在二级结构的区域内,并且所述邻近探针的结合诱导所述核酸结构域中的构象改变,使所述第一相互作用区域暴露。

12.如权利要求1至11中任一项所述的方法,其中至少一个所述邻近探针中的所述分析物结合结构域是或者包括蛋白。

13.如权利要求12所述的方法,其中所述分析物结合结构域是抗体。

14.如权利要求1至11中任一项所述的方法,其中至少一个所述邻近探针中的所述分析物结合结构域是或者包括核酸分子。

15.如权利要求14所述的方法,其中所述核酸分子是适配体。

16.如权利要求15所述的方法,其中所述核酸分子包括能够与核酸分析物杂交的互补序列。

17.如权利要求1至16中任一项所述的方法,其中所述分析物是或者包括蛋白和/或核酸。

18.如权利要求1至16中任一项所述的方法,其中所述分析物是或者包括蛋白-蛋白复合物或蛋白-核酸复合物。

19.如权利要求1至18中任一项所述的方法,其中检测两个或更多个不同的靶分析物。

20.如权利要求1至19中任一项所述的方法,其中所述HCR单体包括发夹结构。

21.如权利要求1至20中任一项所述的方法,其中在所述HCR反应中使用3个或更多个HCR单体并且获得大于线性扩增。

22.如权利要求1至21中任一项所述的方法,其中使用与所述聚合物杂交的检测探针来检测所述聚合物产物。

23.如权利要求1至22中任一项所述的方法,其中至少一个HCR单体提供有可检测的标记。

24.如权利要求23所述的方法,其中所述标记是荧光可检测的,或者比色法可检测的,或者包括能量转移对的至少一个成员。

25.如权利要求1至24中任一项所述的方法,其中所述HCR聚合物中的一条或两条链被连接。

26.如权利要求1至24中任一项所述的方法,其中所述方法包括基于HCR聚合物的进一步信号产生步骤,优选地其中所述进一步的步骤包括RCA反应。

27.一种用于使用在如权利要求1至26中任一项所限定的方法中的试剂盒,所述试剂盒包括:

a.包括至少第一和第二邻近探针的至少一组邻近探针,所述探针每个包括能够同时直接或间接结合所述分析物的分析物结合结构域和核酸结构域,其中,

i.所述第一和第二邻近探针的所述核酸结构域包括能够在允许条件下介导涉及所述结构域的相互作用的区域;

ii.所述第一和第二探针之一的所述核酸结构域包括HCR起始子区域,所述HCR起始子区域包括在亚稳定的二级结构内,从而在从所述亚稳定的二级结构释放之前,所述HCR起始子区域不能起始HCR反应;

b.任选地,用于引入允许条件以使得当所述探针两者均已直接或间接结合所述分析物时,允许所述第一和第二探针的所述核酸结构域彼此相互作用的工具,其中所述相互作用使得所述第二探针的所述核酸结构域的亚稳定的二级结构解折叠,以释放单链HCR起始子区域;

c.用于进行HCR反应的工具,所述工具包括至少两个HCR单体,其中所述第一HCR单体包括所述与HCR起始子区域互补的互补性区域;以及

d.任选地,用于检测所述聚合物的工具。

28.如权利要求27所述的试剂盒,其中在(a)中,所述第一探针的所述核酸结构域包括与所述第二探针中的所述核酸结构域中的关联第二互补性区域互补的第一互补性区域,并且保护所述第一互补性区域,从而所述第一和第二互补性区域不能够彼此杂交;并且在(b)中,用于引入允许条件的所述工具包括用于使所述第一互补性区域脱保护以在所述探针两者均已直接或间接结合所述分析物时,允许所述第一和第二探针的所述核酸结构域的所述第一和第二互补性区域彼此杂交的工具,其中所述杂交使得所述第二探针的所述核酸结构域的所述亚稳定的二级结构解折叠,以释放单链HCR起始子区域。

29.如权利要求28所述的试剂盒,其中用于所述脱保护的工具是激活寡核苷酸。

30.一种邻近探针组,其包括至少第一和第二邻近探针,所述探针每个包括能够同时直接或间接结合待检测的分析物的分析物结合结构域,和核酸结构域,其中,

i.所述第一和第二邻近探针的所述核酸结构域包括能够在允许条件下介导涉及所述结构域的相互作用的区域;并且

ii.所述第一和第二探针中的一个的所述核酸结构域包括HCR起始子区域,所述HCR起始子区域包括在亚稳定的二级结构内,从而在从所述亚稳定的二级结构释放之前,所述HCR起始子区域不能起始HCR反应。

31.如权利要求30所述的邻近探针组,其中所述两个邻近探针的所述核酸结构域均包含亚稳定的二级结构。

32.如权利要求30或31所述的邻近探针组,其中所述亚稳定的二级结构包括发夹结构。

33.如权利要求30至32中任一项所述的邻近探针组,其中所述第一和第二邻近探针的所述核酸结构域的相互作用区域是能够彼此杂交的相互互补性区域。

34.一种抗体,其能够直接或间接结合待检测的分析物,并且具有与所述抗体结合的核酸结构域,其中所述核酸结构域包括能够与另一个核酸分子相互作用(例如,杂交)的区域,并且所述相互作用的区域被包含在所述结构域的亚稳定的二级结构内,所述结构能够被解折叠以释放所述相互作用的区域,所述解折叠不被所述核酸结构域的裂解所介导。

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