昆虫细胞中产生的进一步改善的AAV载体的制作方法

文档序号:12285331阅读:来源:国知局

技术特征:

1.核酸分子,其具有包含开放读框的核苷酸序列,其中所述开放读框以5’至3’的顺序包含:

(i)第一密码子,其是选自CTG、ACG、TTG和GTG的次优翻译启动密码子;

(ii)第二密码子,其编码选自丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的氨基酸残基;

(iii)任选存在的,跟随所述第二密码子之后的编码额外氨基酸残基的一或多个密码子;和,

(iv)编码腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白的序列,其中该序列仅仅缺少VP1翻译启动密码子。

2.权利要求1的核酸分子,其中所述AAV衣壳蛋白是AAV血清型5、AAV血清型8、或AAV血清型9衣壳蛋白,优选其中所述衣壳蛋白具有选自SEQ ID NO:22、28、30、71和73的氨基酸序列。

3.权利要求1或2的核酸分子,其中所述第二密码子编码丙氨酸。

4.权利要求1或2的核酸分子,其中所述第二密码子选自GCT、GCC、GCA、GCG和GGU,优选其中所述密码子为GCT。

5.核酸构建物,其包含权利要求1-4任一项的核酸分子,其中所述编码腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白的读框的核苷酸序列可操作地连接至用于在昆虫细胞中表达的表达控制序列。

6.权利要求5的核酸构建物,其中所述读框的核苷酸序列可操作地连接至选自以下组的启动子:多角体启动子、p10启动子、4xHsp27 EcRE+最小Hsp70启动子、ΔE1启动子、E1启动子。

7.权利要求5或6的核酸构建物,其中所述构建物是昆虫相容性载体,优选杆状病毒载体。

8.权利要求5-7任一项的核酸构建物,其中所述核酸分子包含选自以下组的开放读框:SEQ ID NO:51、69、42、47、48和50,优选SEQ ID NO:51。

9.昆虫细胞,其包含权利要求5-8任一项的核酸构建物。

10.权利要求9的昆虫细胞,其中所述昆虫细胞还包含:

(a)第二核苷酸序列,其包含至少一个AAV反向末端重复(ITR)核苷酸序列;

(b)第三核苷酸序列,其包含可操作地与用于在昆虫细胞中表达的表达控制序列相连接的Rep78或Rep68编码序列;

(c)任选存在的,第四核苷酸序列,其包含可操作地与用于在昆虫细胞中表达的表达控制序列相连接的Rep52或Rep40编码序列。

11.权利要求10的昆虫细胞,其中所述昆虫细胞包含:

(a)权利要求5-8任一项的核酸构建物,其中所述第一核酸构建物还包含权利要求10的(b)和(c)中所定义的第三和第四核苷酸序列;和,

(b)第二核酸构建物,其包含权利要求10的(a)中所定义的第二核苷酸序列,其中所述第二核酸构建物优选是昆虫细胞-相容性载体,更优选杆状病毒载体。

12.权利要求10-11任一项的昆虫细胞,其中第二核苷酸序列还包含编码感兴趣基因产物的至少一个核苷酸序列(用于在哺乳动物细胞中表达),并且其中所述编码感兴趣基因产物的至少一个核苷酸序列并入至昆虫细胞中产生的AAV血清型5的基因组中,优选其中第二核苷酸序列包含两个AAV ITR核苷酸序列,并且其中所述编码感兴趣基因产物的至少一个核苷酸序列位于两个AAV ITR核苷酸序列之间。

13.权利要求10的昆虫细胞,其中所述第一核苷酸序列、第二核苷酸序列、第三核苷酸序列以及任选存存的第四核苷酸序列被稳定整合至昆虫细胞的基因组中。

14.AAV病毒粒,在其基因组中包含编码感兴趣基因产物的至少一个核苷酸序列,其中所述至少一个核苷酸序列不是天然AAV核苷酸序列,并且其中所述AAV VP1衣壳蛋白从N末端到C末端包含:

(i)第一氨基酸残基,其由翻译启动密码子编码,优选是由选自CTG、ACG、TTG和GTG的次优翻译启动密码子编码;

(ii)第二氨基酸残基,其选自丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、天冬氨酸和谷氨酸;

(iii)任选存在的,跟随所述第二氨基酸残基的一或多个额外的氨基酸残基;和,

(iv)AAV VP1衣壳蛋白的氨基酸序列,其中该序列仅缺乏由VP1翻译启动密码子所编码的氨基酸残基。

15.用于在昆虫细胞中产生AAV的方法,其包括以下步骤:(a)在产生AAV的条件下培养权利要求9-13任一项所定义的昆虫细胞;和任选地(b)回收所述AAV。

16.权利要求14的AAV病毒粒,其中所述感兴趣基因产物编码因子IX或因子VIII蛋白。

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