本发明涉及一种提高原核生物和/或真核生物菌株生物质合成能力的方法，以及生物质合成能力提高的改良原核生物和/或真核生物。
背景技术：
：蛋白质生物合成是所有生命领域的一个必不可少的过程。解码遗传密码使用的复杂机器涉及多个蛋白质因子和非编码RNA，如核糖体RNA(rRNA)和转移RNA(tRNA)。借助各个tRNA分子，按照信使RNA(mRNA)核苷酸规定的顺序加入氨基酸，增加蛋白质长度。蛋白质生物合成工艺经过三个不同步骤将mRNA转译为多肽：起始、延长和终止。此外还涉及一个称为核糖体循环的步骤，此步骤中，与mRNA结合的核糖体释放，分离为亚基，然后自由结合为新mRNA。增加起始、延长、终止和/或核糖体循环过程中涉及的不同因子水平，可以提高生物体的蛋白质合成能力。细胞生长取决于可用蛋白质量。因此，增加生物体蛋白质合成的起始、延长、终止和/或核糖体循环的一个或多个过程速率，从而增加蛋白质数量，应能够促进生物体的生长，从而增加生物质和提高所需产物(如生物柴油和高价值化学品)的整体产量。已知各种方法用于提高微生物，尤其是藻类的生物质合成能力。一种方法建议在存在生长调节剂的环境中培养藻类以提高生物质产量。另一种方法在碱性pH中培养藻类以增加藻类生物质。但是，已知方法成本高昂，无法扩大为商业生产规模。尚未尝试过通过调节蛋白质合成机制来提高藻类生物质合成能力的方法，即增加蛋白质合成以提高藻类生物质合成能力。因此，本发明的发明人设计一种方法，通过增加微生物(具体为藻类和/或蓝藻细菌)的蛋白质合成能力，提高生物质合成能力。本发明还涉及微生物改良菌株，如生物质合成能力提高的藻类和/或蓝藻细菌。发明目的本发明的部分目的(通过改进至少一种具体实施方式实现)如下所述：本发明的一个目的是提供一种方法，通过过度表达tRNA分子以增加蛋白质合成，从而提高微生物生物质合成能力。本发明的另一个目的是提供一种方法，通过提高蛋白质合成起始过程速率以增加蛋白质合成，从而提高微生物生物质合成能力。本发明的另一个目的是提供一种方法，通过提高微生物生物质合成能力来提高所需产物产量。本发明的另一个目的是提供蛋白质合成能力提高进而生物质合成能力提高的微生物改良菌株。配合附图阅读以下说明，本发明的其他目的和优势将得以进一步明确，但这些描述并不意图限制本发明的范围。技术实现要素：在一个方面中，本发明提供一种通过过度表达蛋白质合成基因来提高生物质合成能力的方法。方法包括以下步骤：在一个载体中克隆至少一个基因表达起始子tRNA；将含有基因的载体引入微生物；在诱导条件下，含有选择剂的介质上培养微生物，获得生物质合成能力提高的微生物。在本发明的另一个方面中，提供一种生物质合成能力提高的细长聚球藻PCC7942改良菌株，CCAP加入编号1479/16。附图说明下面将借助附图说明本发明的方法，其中：图1是提高微生物生物质合成能力的工艺示意图；图2说明pS1s-Ptrc载体，其中含有克隆在载体中的起始子tRNA-Met1gene；图3说明野生细长聚球藻PCC7942和改良细长聚球藻PCC7942(含有编码起始子tRNA-Met1的基因副本)的PCR扩增；图4A说明野生和改良细长聚球藻PCC7942在非-IPTG培养皿上以30℃培养的点培植；图4B说明野生和改良细长聚球藻PCC7942在-IPTG培养皿上以30℃培养的点培植；图5A说明野生和改良细长聚球藻PCC7942在非-IPTG培养皿上以37℃培养的点培植；图5B说明野生和改良细长聚球藻PCC7942在-IPTG培养皿上以37℃培养的点培植；图6A说明野生和改良细长聚球藻PCC7942在-IPTG培养皿上以30℃培养的生长曲线；图6B说明野生和改良细长聚球藻PCC7942在-IPTG培养皿上以37℃培养的生长曲线。详细描述一些微生物的基因组中具有多个起始子tRNA副本。提高此类微生物的蛋白质合成能力将增加生物质，这对于可从此类微生物获得的有用生物技术产物(如生物燃料、高价值化学品、生物柴油等)的整体产量来说是一个重要参数。据观察，微生物中的起始子tRNA分子或起始因子蛋白质/核糖体RNA负责蛋白质合成的起始。可以通过改变基因表达(向上调节基因表达)对微生物进行基因改良以获得更多起始子tRNA分子副本，从而增加细胞起始子tRNA分子数量。这些改良微生物对于生产生物燃料和高价值化学品非常有用。因此，通过提高微生物蛋白质合成起始速率来增加蛋白质数量，可以促进微生物生长，从而提高生物质合成能力。相比野生微生物，具有起始子tRNA的改良微生物在相同条件下生长时具有更高的光学密度(OD)。这样，改良微生物生物质合成能力的提高可以提高感兴趣产物(如生物柴油和高价值化学品)的产量。因此按照本发明，设计一种提高微生物(具体为藻类和/或蓝藻细菌)蛋白质合成的方法(如图1所示)。在本发明的一个方面中，提供一种方法，通过过度表达蛋白质合成涉及的不同分子来提高蛋白质合成，从而提高微生物生物质合成能力。本发明设计一种提高蛋白质合成以提高所需微生物(具体为藻类/蓝藻细菌)产物整体产量的方法。在第一步中，获得蛋白质合成涉及的一个基因。在本发明的一个具体实施方式中，克隆基因为起始子tRNA基因。然后，将编码蛋白质合成的基因副本克隆到载体中。在本发明的一个典型具体实施方式中，载体为pS1s-Ptrc。载体(如图2所示)还包含一个有选择性标记，如耐抗生素基因。在本发明的一个具体实施方式中，抗生素包括但不局限于以下组，该组包括壮观霉素、链霉素、氨苄青霉素和羧苄青霉素。通过直接DNA摄取方法，将含有待过度表达基因的载体引入微生物。在本发明的一个具体实施方式中，通过转录将含有待过度表达基因的载体引入微生物。按照本发明的微生物为光合作用微生物，具体为藻类和/或蓝藻细菌。在本发明的一个具体实施方式中，从以下组中选择藻类，该组包括聚球藻、衣藻、杜氏藻和小球藻。在本发明的一个典型具体实施方式中，微生物为细长聚球藻PCC7942。微生物的起始子tRNA控制蛋白质合成起始速率。在本发明的一个具体实施方式中，在载体中分别克隆来自细长聚球藻PCC7942的两个起始子tRNA编码基因(tRNAMet1和tRNAMet2)。在本发明的一个典型具体实施方式中，使用的载体为包含耐抗生素基因的pS1S-pTrc(如图2所示)。载体pS1s-pTrc用于通过直接DNA摄取方法转录细长聚球藻PCC7942。然后通过PCR确认转录。培养野生菌株和转录菌株，测量合成生物质(使用光学密度)进行比较。过度表达蛋白质合成涉及的其他分子，如起始因子-3(IF-3)和肽酰-tRNA水解酶(PTH)，也可以提高微生物蛋白质合成。生物体中的IF-3控制蛋白质合成起始速率。PTH控制蛋白质合成中的延长速率。按照本发明的另一个方面，提供微生物改良菌株，尤其是生物质合成能力提高的藻类和/或蓝藻细菌改良菌株，具体来说，按照本发明的改良菌株可以是CultureCollectionofAlgaeandProtozoa(CCAP),SAMSLimited,ScottishMarineInstitute,Dunbeg,Oban,Argyll,PA371QA,UK的细长聚球藻PCC7942，CCAP加入编号1479/16。下面将通过以下实验室实验进一步说明本发明，这些实验仅用于说明，不解释为以任何方式限制本发明范围。具体实施方式实验1：细长聚球藻PCC7942的转录将从OD750为2的培养菌中取得的含有细长聚球藻PCC7942(InstitutPasteur,France)的10毫升培菌液中加入100ml锥形烧瓶中的40ml新鲜BG11(Invitrogen)介质。将10mM碳酸氢钠(Sigma)加入新培植的菌体(从0.5M母菌添加1ml)。在30℃Kuhner摇床中以100rpm并存在2％CO2的条件下培养一晚。在LuriaAgar(Fluka)培养皿上划线培养菌，并在37℃下培养24小时，检查细菌污染物。然后在室温下培养24小时检查真菌污染物。培养皿中未观察到污染物。在50mlfalcon管中收获细胞。在室温和4000rpm条件下离心培养菌10分钟。去掉上清液。小球重新悬浮在10mlBG11介质(Invitrogen)中。将10mM碳酸氢钠(Sigma)加入(从0.5M母菌添加0.2ml)BG11介质。在室温和4000rpm条件下离心培养菌10分钟。去掉上清液。小球重新悬浮在2.4ml新鲜BG11介质(Invitrogen)中。加入10mM碳酸氢钠(从0.5M母菌添加0.048ml)。300微升培养菌分布在1.5ml无菌离心管中。在制备的8个离心管中，每个离心管含有300μl培养菌。向管中加入1000毫微克DNA进行转录。其中一个管不加入DNA，作为实验对照。将离心管放在50mlfalcon管中，用铝箔包覆。然后在30℃Kuhner摇床中以100rpm培养一晚。制备含有相应抗生素的BG11(Invitrogen)介质培养皿，在生物安全柜中干燥培养皿30分钟。表-1总结制备的抗生素储存液。表-1：使用的抗生素储存液序号抗生素储存液1.羧苄青霉素(Sigma)50mg/ml，无菌蒸馏水中2.卡那霉素(Sigma)50mg/ml，无菌蒸馏水中3.链霉素(Sigma)50mg/ml，无菌蒸馏水中4.壮观霉素(Sigma)50mg/ml，无菌蒸馏水中5.氯霉素(Sigma)35mg/ml，乙醇中完成培养阶段后，使用玻璃球将每个试管的150μl和含有抗生素的选择介质制作为培养皿。在室温和低光照条件下光照12小时，然后黑暗12小时培养。培养后，观察选择培养皿上的小菌落。新鲜选择培养皿上分布130个菌落。选择四个菌落(克隆-1、克隆-2、克隆-3和克隆-4)用NeutralSite(NS)基底进行菌落PCR，检查融合。这些NS基底在融合后不会对基因组的行为造成任何影响。单个菌落悬浮在50μl无菌蒸馏水中，在100℃下培养15分钟。此菌落用作PCR模板。表-2总结用于PCR的制剂浓度表-2按照以下温度执行PCR：1–94℃5分钟，35–94℃30分钟，60℃30分钟，72℃2分钟，1–72℃5分钟。图3介绍获得的PCR扩增。使用起始子tRNA基因进行转录。从左到右，道-1：负对照，道-2：1kbplus梯状条带，道-3：克隆-1，道-4：克隆-2，道-5：克隆-3，道-6：克隆-4，道-7：质粒对照，道-8：野生菌株。克隆-1、克隆-2和克隆-3显示正转录，对应500bp和700bp的条带进行确认。克隆-4不用于进一步分析，因为获得的条带不明显。质粒对照未显示条带，因为DNA已融合到细长聚球藻PCC7942基因组中。表-3给出用于本发明使用载体的生物质合成能力研究详细信息。表-3实验2A：点板实验将三代后的3个正克隆(克隆-1、克隆-2和克隆-3)的单菌落和野生菌株培植在500μlBG11(Invitrogen)+壮观霉素/链霉素(Sigma)2μg/ml中，在30℃摇晃加持续光照(光强＝125μE/m2/s)条件下培养5天。用选择性介质先将培养菌扩大到5ml，然后扩大到50ml。使用净(未稀释)、10-1、10-2和10-3稀释物进行点板实验。将10微升每种稀释物点分别培植在100mM异丙醇β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)和非-IPTG培养皿中，在两个不同温度30℃和37℃下培养48小时。由于本发明使用基于Trc的载体，加入异丙醇β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)会引入Trc启动子。使用1mMIPTG制备培养皿进行点培植。30℃下培养的点板实验培养皿净和10-1稀释物中观察到转录菌株生长，如图4A和4B所示。37℃下培养的点板实验培养皿净和10-1稀释物中也观察到转录菌株生长，如图5A和5B所示。实验2B：生长曲线实验将初始OD为0.2-0.3(750nm)的克隆-1新鲜培菌液培植在50mlBG11+SP/SM2μg/ml中。在两个不同温度30℃和37℃，存在光照条件下以100rpm摇晃培养72小时。对野生菌和转录菌株(克隆-1)执行三份实验。监测OD72小时。取三次平均值绘制图形。图-6A说明30℃下培养野生菌和克隆172小时获得的OD图形表示。线条-4表示未诱导野生菌，线条-3表示诱导野生菌，线条-2表示未诱导克隆-1，线条-1表示诱导克隆-1。图6B说明37℃下培养野生菌和克隆1获得的OD图形表示。线条-3表示诱导野生菌，线条-4表示未诱导野生菌。线条-2表示未诱导克隆-1，线条-1表示诱导克隆-1。从图6A和6B很容易看出，转录菌(克隆-1)相比野生菌的OD更高，因此含起始子tRNA的克隆-1合成的生物质更高。本发明最重要的一个优势是使用tRNA提高蛋白质合成，从而提高转录菌的生物质合成能力。技术优势本发明提供的技术优势如下：-发明提供一种方法，通过过度表达蛋白质合成涉及的多个不同分子来提高蛋白质合成，从而提高微生物生物质合成能力。-本发明提供一种方法，通过提高微生物生物质合成能力来提高所需产物产量。-本发明提供相比野生菌株生物质合成能力更高的改良微生物。通过参照描述中的非限定性具体实施方式，对上述具体实施方式及其各种特征和有利细节进行了解释。其中省去了对已知方面、部件及分子生物技术的描述，以避免不必要的模糊实施例。上述具体实施方式的描述将充分披露本发明中具体实施方式的一般性，在没有脱离一般概念的前提下，其他人可以很容易地运用现有知识修改和/或调整此类具体实施方式的各种应用。因此，这些调整和修改应被确定为包含在与所披露的具体实施方式相当的含义和范围内。应当理解为，本文采用的措辞和术语是为了描述而非限制的目的。因此，虽然文中的具体实施方式描述的是首选具体实施方式，熟知本领域的技术人员认识到在所描述的具体实施方式的精神与范围内，可以对文中的具体实施方式进行修改。此外，应清楚理解为，上述描述主题仅解释为对发明的介绍，而非限制。在参考所述具体实施方式介绍并说明本发明原理后，应认识到，可以在不背离此类原理的范围内改动所述具体实施方式的布置和细节。虽然本发明的特点已重点强调，仍应理解为，在不背离本发明原理的条件下，可以对首选具体实施方式进行各种修改。本发明本质或首选具体实施方式的这些和其他修改对本发明领域熟练的技术人员是显而易见的，应清楚理解为，上述描述事项只是本发明说明的解释而不作为一种限制。当前第1页1 2 3