用于治疗溶酶体贮积症的腺伴随病毒载体的制作方法

文档序号：11632962阅读：622来源：国知局

本发明涉及用于所关注的蛋白质的表达的载体以及它们在基因治疗中的应用。本发明还涉及有助于治疗粘多糖症(mps)、特别是用于治疗iii-b型粘多糖症或sanfilippob综合征的载体和核酸序列。

背景技术：

溶酶体是在动物细胞的细胞质中发现的细胞器，动物细胞在陈旧的细胞成分的再循环过程中或者在病毒和细菌被吞噬之后断裂生物分子的超过50种的水解酶。这种细胞器包含多种类型的水解酶，包括蛋白酶、核酸酶、糖苷酶、脂肪酶、磷脂酶、磷酸酶和硫酸酯酶。所有的酶均是酸水解酶。

溶酶体贮积症(lsd)是由影响一种或多种溶酶体酶的遗传缺陷引起的。这些遗传疾病通常是由于溶酶体中存在的特定的酶活性的缺陷而导致的。在较低的程度而言，这些疾病可能是由于与溶酶体生源论有关的蛋白质的缺陷。

lsd在个体中稀少，但是总体而言，这些疾病在总人口中是相对普遍的。lsd的总和患病率(combinedprevalence)为每5000名活产婴儿有大约1名婴儿患病。参见meiklep,etal,jama1999；281:249-254。但是，总人口中的一些群体特别受到高发生率的lsd的折磨。例如在jewishcentral和easterneuropean(ashkenazi)个体的后代中，gaucher和tay-sachs疾病的患病率分别为每600名活产婴儿有1名婴儿患病，和每3900名活产婴儿有1名婴儿患病。

已知统称为sanfilippo综合征的iii型粘多糖症(mpsiii)是由与糖胺聚糖(gag)硫酸乙酰肝素(hs)逐步降解有关的一种酶的缺陷而导致的lsd，从而引起糖胺聚糖(gag)硫酸乙酰肝素(hs)的病理学累积。根据酶的缺陷，mpsiii分成4种亚型。n-乙酰葡糖胺糖苷酶(α酶活性)的损失导致iiib亚型。所产生的疾病在临床上表征为cns的儿童期性进展性神经病变。该临床过程通常可以分成3个阶段。在该疾病的第一阶段，在跨越生命的第一个月的无症状期后，精神发育的延缓变得明显。其后在疾病的第二阶段，发生严重的行为问题和渐进性的智力下降。最后，在严重的痴呆的发作下，行为问题慢慢消失，并且所有的运动功能开始下降，从而逐渐导致吞咽困难、移动的完全丧失和椎体束损伤。除了神经性症状以外，mpsiiib患者遭受非神经学的改变，包括复发的耳、鼻、喉和胸的感染，频繁腹泻和便秘，进行性关节退变和影响移动性的骨骼异常，以及肝脏和脾肿大。参见clearyandwraith,archdischild.1993；69(3):403-6,neufeldandmuenzer,"themucopolysaccharidoses"inscriverc,etal,eds.,"themetabolicandmolecularbasisofinheriteddisease",mcgraw-hillpublishingco.,newyork,ny,us,2001,pp.3421-3452,vandekampetal,clingenet.181；20(2):152-60,moogetal,amjmedgenetcseminmedgenet.2007；145c(3):293-301。患者通常在生命的第二个十年结束和第三个十年开始时死亡。参见neufeldandmuenzer，如上。称为衰减显性的、具有较晚发作和较长生存的更缓慢进行形式的疾病在mpsiiib患者的亚组中有所描述。参见moogetal,supraandvalstaretal,annneurol.2010；68(6):876-87。

目前对mpsiiib没有可利用的治疗。因此，所述的疾病的控制是根据症状的，并且目标在于改善患者及其家人的生命的品质。这对于由cns改变而产生的那些症状而言是特别重要的。例如间歇性颅内压增高是公认的行为障碍的原因，并且其在mps中屡见不鲜。参见muenzeretal,genetmed.2006；8(8):465-73。由于粘多糖沉积而导致的脑膜增厚是脑脊液(csf)压力增加的潜在原因。因此，当行为改变是传统医学难以治愈时，考虑插入脑脊液分流术，以减轻压力。在6名插入脑脊液分流术的sanfilippo患者中，神经症状现在改善。参见robertsonetal,eurjpediatr.1998；157(8):653-5。另一方面，对于所述的疾病的睡眠障碍特征而言，认为给予退黑激素是最佳的治疗方法，但是其不是完全有效的。参见fraseretal,archdischild.2005；90(12):1239-42。对于身体病理学也没有特定的治疗，并且仅姑息性治疗可以用于各个单独的症状。

对新的mpsiiib治疗方法进行了测试，取得不同程度的成功。底物剥夺疗法(sdt)目的在于降低gag合成的速率，这样如果任何残余的酶活性得到保持，便防止gag过多的累积，或者至少累积的速率减慢。已经表明染料木黄酮(一种大豆异黄酮)通过降低表皮生长因子受体(egfr)的激酶活性而起到hs生产抑制剂的作用。参见jakobkiewicz-baneckaetal,jbiomedsci.2009；16:26,piotrowskaetal,eurjhumgenet.2006；14(7):846-52。近来的研究表明在患有不同粘多糖症(i、ii、iii-a和iii-b型)的患者的成纤维细胞中，染料木黄酮会抑制gag的合成。参见piotrowskaetal，如上。对mpsiiib小鼠模型短期和长期口服给予染料木黄酮使得贮积减少，并且在运动技巧测试中表现良好。参见malinowskaetal,molgenetmetab.2009；98(3):235-42,malinowskaetal,plosone.2010；5(12):el4192。当静脉内给予染料木黄酮时，预计其能够穿越血脑屏障(bbb)，从而允许cns病理学的治疗。支持这种概念的是，在一项开放标记初步研究中，在12个月内对5名mpsiiia和5名mpsiiib患者给予富含染料木黄酮的大豆提取物，使得身体和神经参数显著改良。参见piotrowskaetal,currenttherapeuticresearch.2008；69(2):166-179。但是，随后的研究未显示在12个月内使用染料木黄酮治疗的mpsiiia、mpsiiib或mpsiiic患者的残疾等级或行为得分有所改善。参见delgadilloetal,jinheritmetabdis.2011；34(5):1039-44；在thenetherlandsnationaltrialregister登记的研究ntpv#1826；以及deruijteretal,annneurol.2012；71(1):110-20。另一种分子若丹明b在临床前研究中被证明能够有效减少gag累积，并且具有与使用染料木黄酮所观察到的相似效力。参见在www.mpssociety.co.uk上可获得的hendrikszetal,"guidelinesfortheinvestigationandmanagementofmucopolysaccharidosistypeiii",2012。认为若丹明b会通过抑制糖前体的形成和/或糖基转移酶的活性而阻遏gag链的合成。参见robertsetal,molgenetmetab.2007；92(1-2):115-21。

正常细胞分泌大量的甘露糖-6-磷酸(m6p)-标记的溶酶体酶，其随后可以由其他细胞通过细胞质膜上的m6p受体吸收。这使得可能通过输入正确形式的缺失酶而治疗由可溶性水解酶的缺陷而引起的lsd。尽管酶替代治疗(ert)还尚未用于sanfilippob患者，但是在3月龄的mpsiiib小鼠静脉内给予重组的n-乙酰葡糖胺糖苷酶α显示该重组酶分布于多个器官中，主要分布于肝脏中。在脑中检测到了大量的酶，这是由于bbb的存在限制了对脑实质而言为外源提供的蛋白质的进入。参见yuetal,molgenetmetab.2000；71(4):573-80andhendrikszetal，如上。有针对用于治疗mpsiiib患者神经疾病的ert产物的早期研发项目。hgt-3010项目(shire)为基于重组酶的鞘内传递的ert，并且目前处于临床前阶段。在mpsiiia小鼠中直接递送ert至cns会减少神经病理学，并且目前正在mpsiiia患者中试验。参见www.clinicaltrials.gov上的hemsleyk,etal,genesbrainbehav.2008；53(2):161-8,savasp,etal,molgenetmetab.2004；82:273-285,nct01155778andncto1299727。然而，治疗需要植入永久的鞘内递送装置，这与大量的风险和缺点有关，并且治疗本身的每位患者/年的经济成本极高。

已经证明使用骨髓衍生的干细胞(骨髓移植，bmt)的造血干细胞移植(hsct)在患有其他mps的患者中能够有效治疗身体和神经病理学。参见petersetal,blood1996；87(ll):4894-902,petersandsteward,bonemarrowtransplant2003；31(4):229-39andyamadaetal,bonemarrowtransplant1998；21(6):629-34。供者衍生的骨髓细胞能够穿过bbb，进入脑实质，并分化为分泌缺失的溶酶体酶的小胶质细胞，随后这些细胞被周围的细胞吸收，从而校正脑中gag的累积。参见krivitetal,celltransplant.1995；4(4):385-92。然而，在经历bmt的sanfilippoa或b患者中，未观察到明显的益处。参见hoogerbruggeetal,lancet1995；345(8962):1398-402,vellodietal,jinheritmetabdis.1992；15(6):911-8,gtingorandtuncbilek,turkjpediatr.1995；37(2):157-63,sivakumurandwraith,jinheritmetabdis.1999；22(7):849-50andlangeetal,arqneuropsiquiatr.2006；64(l):l-4。bmt失败的主要原因似乎是与原发性疾病的快速进展相比，小胶质细胞群体被造血细胞后代替代的步调缓慢。参见rovelli,bonemarrowtransplant2008；41suppl2:s87-9。因此，使用mbt的hsct目前没有作为mpsiii患者的治疗选择。参见boelensetal,pediatrclinnortham.2010；57(1):123-145。使用脐带血-衍生的干细胞的hsct会改善mpsiiib小鼠的认知结果，但是需要重复的给予细胞。参见willingetal,celltransplantation2013；已经线上发表。近来，该方法已经用于移植患有mpsiiia和mpsiiib的多个孩子；其是否保护cns免于恶化仍尚不清楚。参见deruijteretal,currpharmbiotechnol.2011；12(6):923-30。

考虑到目前对mpsiii，特别是对mpsiiib的治疗选择的局限，需要备选的方法。体内基因治疗提供了对mpsiiib和其他遗传病进行单次治疗的可能性，以及终生有益作用的前景。已经在mpsiiib疾病的动物模型中检验了基于使用不同病毒载体并结合不同给予途径的多种基因治疗方法。

编码人类n-乙酰葡糖胺糖苷酶α基因的慢病毒载体已经静脉内给予年轻的mpsiiib小鼠，从而产生在肝脏、脾、肺和心脏中低水平的转基因表达，在这些组织中，所述酶会减少但不会使gag累积正常化。参见dinataleetal,biochemj.2005；388(2):639-46。还通过将慢病毒载体通过颅内给予直接递送至脑实质中来检验慢病毒载体的治疗潜力。参见didomenicoetal,amjmedgeneta.2009；149a(6):1209-18。在单一的脑位点给予的mpsiiib小鼠在治疗后达6个月显示n-乙酰葡糖胺糖苷酶α活性增加，这仅部分校正了溶酶体贮积损伤。

由于腺相关病毒(aav)载体的高的转导效率和病原性的缺乏，所以腺相关病毒载体介导的基因转移作为许多体内基因治疗用途的选择方法而快速的出现。aav载体可以转导有丝分裂后的细胞，并且多个临床前和临床研究证明aav载体-介导的基因转移高效地驱动用于多种疾病的治疗转基因的持续表达的潜力。参见bainbridgeetal,nengljmed.2008；358(21):2231-9,hauswirthetal,humgenether.2008；19(10):979-90,maguireetal,nengljmed.2008；358(21):2240-8,niemeyeretal,blood2009；113(4):797-806,riveraetal,blood2005；！05(4):1424-30,nathawanietal,nengljmed.2011；365(25):2357-65andbuchlisetal,blood2012；119(13):3038-41。

当编码人类n-乙酰葡糖胺糖苷酶α的血清型2aav载体在单一的位置被传递至mpsiiib小鼠的脑实质时，n-乙酰葡糖胺糖苷酶α的表达和活性局限于注射位点，并且仅取得疾病显性的部分减轻。参见fuetal,molther.2002；5(l):42-9,cressantetal,jneurosci.2004；24(45):10229-39。在使用甘露醇预治疗后，被静脉内传递至mpsiiib小鼠中的aav2载体得到显著延长的生存，改善的行为表现，以及减少的脑溶酶体病理学，但是仅取得身体疾病的部分校正。参见mccartyetal,genether.2009；16(11):1340-52。另一方面，通过脑池内注射将aav2载体单一给予脑脊液(csf)中使得在mpsiiib小鼠的脑子储存n-乙酰葡糖胺糖苷酶α活性和减少gag，但是在溶酶体组织中未观察到可检测的n-乙酰葡糖胺糖苷酶α活性。参见fuetal.,jgenemed.2010；12(7):624-33。涉及aav2的脑池内和静脉内传递的组合治疗证明在cns以及部分溶酶体的校正中显著的长期治疗效力。参见fuetal,genether.2007；14(14):1065-77。

其他研究利用了在脑实质内给予后对由aav血清型5载体显示的神经元细胞的高嗜性。然而，这些载体在脑实质中具有低的分布，并且所述的方法需要多次注射。将aav5载体传递至新生mpsiiib小鼠的脑的多给位点，并结合骨髓移植，显示出与使用血清型2载体所得的相似的治疗效力。参见heldermonetal,molther.2010；18(5):873-80。在脑的尺寸较大的动物模型中，在mpsiiib狗中将aav5载体立体给予4个不同的脑的位置，得以在脑的广泛区域检测到活性n-乙酰葡糖胺糖苷酶α。然而，在大部分的吻部和大部分的尾部，特别是在小脑中，酶活性保持较低或不可检测。参见ellinwoodetat,molther.2011；19(2):251-9。在治疗的mpsiiib狗中，溶酶体病理学被改善，但是不能完全校正，表明使用所述的方法取得的酶活性的水平不足以处理gag贮积。尽管具有这种部分效力，但是近来开始了基于该方法的临床试验。参见在isrctn登记的isrctnl9853672。脑越大，越难以在脑实质内注射的情况下覆盖该器官的整个体积，并且传递至人类需要在多个位点进行载体给予，使得传递在技术上具有挑战，而且需要研发特定的手术过程。参见souweidaneetal,jneurosurgpediatr.2010；6(2):115-122。

到目前位置，仅报告了一项使用血清型9的aav载体用于治疗mpsiiib的研究。该方法利用了在系统给予aav9载体时，该载体转导cns的能力。参见foustetal,natbiotechnol.2009；27(l):59-65andduque,etal,molther.2009；17(7):1187-1196。将aav9-n-乙酰葡糖胺糖苷酶α载体静脉内传递至mpsiiib小鼠使得cns和身体器官中的溶酶体贮积病理学得到校正，行为表现得到改善并且寿命被延长。参见fuetal,molther.2011；19(6):1025-33。然而，该建议的作用过程具有多个缺点。首先，所用的cmv启动子被报告为沉寂的。参见loseretal,jvirol.1998jan；72(l):180-90。第二，在极高剂量的载体(≥lx10¹³vg/kg)下取得治疗效力。由制备和安全性的观点来看，使用这种高剂量对临床转化提出了挑战。

上述方法均不能完全恢复n-乙酰葡糖胺糖苷酶α活性，在cns和身体组织中取得胞浆内包涵体的完全根除，或者校正mpsiiib的所有临床迹象。因此，需要治疗mpsiiib的具有更高效力和安全性概况的新型方法。

发明概述

本发明提供了用于治疗疾病、具体为治疗iii型粘多糖症(mpsiii)、特别是mpsiiib的新的重组载体。

在第一个方面中，本发明涉及腺相关病毒载体(aav)，其包含编码n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(naglu)seqidno:1的核苷酸序列。根据本发明的aav载体为血清型9(aav9)。这些载体证明极有效地完全恢复脑和身体组织的所有区域的病理学gag贮积。

根据本发明的aav9载体包含编码naglu的核苷酸序列，该序列与seqidno:2具有至少80％序列一致性，并且优选地与seqidno:2具有至少84％的序列一致性。

本发明的aav9载体进一步包含与编码的核苷酸序列连接的启动子，以便控制naglu的表达。合适的启动子为cag启动子seqidno:4。

本发明的另一个方面涉及质粒，其包含编码n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(naglu)的核苷酸序列，以及具体地与seqidno:2具有至少80％序列一致性或优选地与seqidno:2具有至少84％序列一致性的核苷酸序列。

本发明的另一个方面涉及药物组合物，其包含本发明的治疗有效量的aav9载体或本文所述的质粒。

本发明进一步提供了用于传递多核苷酸、特别是naglu多核苷酸的方法。

本发明的另一个方面涉及用作药剂、特别是用于治疗iii型粘多糖症(mpsiii)、特别是mpsiiib的本发明的aav9载体或本文所述的质粒。

本发明还涉及用于生产根据本发明的aav9载体的方法。

在另一个方面中，本发明涉及分离的细胞，其包含编码n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(naglu)的核苷酸序列，以及具体地与seqidno:2具有至少80％序列一致性或优选地与seqidno:2具有至少84％序列一致性的核苷酸序列。

附图简述

图1.编码人类n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(paav-cag-hnaglu)的质粒的水动力传递。使用50μg质粒paav-cag-hnaglu以水动力的方式注射2个月龄的mpsiiib小鼠。柱状图描绘了在肝脏(a)和血清(b)中，在质粒给予后的1周测量的n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(naglu)活性。注射生理盐水的wt小鼠的naglu活性设定为100％。值为每组3-4只小鼠的平均值±sem。***p<0.001与wt。

图2.编码人类n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(aav9-cag-hnaglu)的aav9载体的静脉内(iv)传递。野生型(健康)小鼠、未处理的mpsiiib小鼠以及iv注射5x10¹¹vgaav9-cag-hnaglu处理的mpsiiib小鼠的肝脏(a)和血清(b)中的n-乙酰葡糖胺糖苷酶α活性。(c)在身体器官中的糖胺聚糖(gag)的定量。值为每组5-8只小鼠的平均值±sem。***p<0.001与wt。$$$p<0.001与wt,**p<0.01,***p<0.001与未处理的mpsiiib。nd：未检测。

图3.编码人类n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(aav9-cag-hnaglu)的aav9载体的静脉内传递。(a)在野生型(健康)小鼠、未处理的mpsiiib小鼠以及iv注射5x10¹¹vgaav9-cag-hnaglu处理的mpsiiib小鼠的脑(i-iv)的不同部分中的n-乙酰葡糖胺糖苷酶α活性。(b)在脑的相同部分中的糖胺聚糖(gag)的定量。值为每组5-8只小鼠的平均值±sem。***p<0.001与未处理的mpsiiib。nd：未检测。

图4.编码优化的人类n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(aav9-cag-cohnaglu)的aav9载体的静脉内传递。在野生型(健康)小鼠、未处理的mpsiiib小鼠以及iv注射5x10¹¹vgaav9-cag-cohnaglu处理的mpsiiib小鼠的肝脏(a)和血清(b)中的n-乙酰葡糖胺糖苷酶α活性。(b)在身体器官中的糖胺聚糖(gag)的定量。值为每组5-8只小鼠的平均值±sem。$$$p<0.001与wt,**p<0.01,***p<0.001与未处理的mpsiiib。nd：未检测。

图5.编码优化的人类n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(aav9-cag-cohnaglu)的aav9载体的静脉内传递。(a)在野生型(健康)小鼠、未处理的mpsiiib小鼠以及iv注射5x10¹¹vgaav9-cag-cohnaglu处理的mpsiiib小鼠的脑(i-iv)的不同部分中的n-乙酰葡糖胺糖苷酶α活性。(b)在脑的相同部分中的糖胺聚糖(gag)的定量。值为每组5-8只小鼠的平均值±sem。***p<0.001与未处理的mpsiiib。nd：未检测。

图6.编码人类n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(aav9-cag-hnaglu)的aav9载体的脑池内(ic)传递。(a)在野生型(健康)小鼠、未处理的mpsiiib小鼠以及脑池内注射9.3x10⁹vgaav9-cag-hnaglu处理的mpsiiib小鼠的脑(i-iv)的不同部分中的n-乙酰葡糖胺糖苷酶α活性。(b)在相同的脑的区域中的糖胺聚糖(gag)的定量。值为每组5-8只小鼠的平均值±sem。***p<0.001与未处理的mpsiiib。nd：未检测。

图7.编码人类n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(aav9-cag-hnaglu)的aav9载体的脑池内传递。(a)在野生型(健康)小鼠、未处理的mpsiiib小鼠以及脑池内注射9.3x10⁹vgaav9-cag-hnaglu处理的mpsiiib小鼠的肝脏中的n-乙酰葡糖胺糖苷酶α活性。(b)在身体器官中的糖胺聚糖(gag)的定量。值为每组5-8只小鼠的平均值±sem。$$$p<0.001与wt,**p<0.01,***p<0.001与未处理的mpsiiib。nd：未检测。

图8.编码优化的人类n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(aav9-cag-cohnaglu)的aav9载体的脑池内传递。(a)在野生型(健康)小鼠、未处理的mpsiiib小鼠以及脑池内注射9.3x10⁹vgaav9-cag-cohnaglu处理的mpsiiib小鼠的脑(i-iv)的不同部分中的n-乙酰葡糖胺糖苷酶α活性。(b)在相同的脑的区域中的糖胺聚糖(gag)的定量。值为每组5-8只小鼠的平均值±sem。***p<0.001与未处理的mpsiiib。nd：未检测。

图9.编码优化的人类n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(aav9-cag-cohnaglu)的aav9载体的脑池内传递。(a)在野生型(健康)小鼠、未处理的mpsiiib小鼠以及脑池内注射9.3x10⁹vgaav9-cag-cohnaglu处理的mpsiiib小鼠的肝脏中的n-乙酰葡糖胺糖苷酶α活性。(b)在身体器官中的糖胺聚糖(gag)的定量。值为每组5-8只小鼠的平均值±sem。$$$p<0.001与wt,**p<0.01,***p<0.001与未处理的mpsiiib。nd：未检测。

图10.编码优化的人类n-乙酰葡糖胺糖苷酶α2型(paav-cag-cohnaglu-2型)的质粒的水动力传递。使用50μg质粒paav-cag-cohnaglu-2型以水动力的方式注射2个月龄的mpsiiib小鼠。柱状图描绘了在肝脏(a)和血清(b)中，在质粒给予后的1周测量的n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(naglu)活性。注射生理盐水的wt小鼠的naglu活性设定为100％。值为每组3-4只小鼠的平均值±sem。***p<0.001与wt。

图11.编码优化的人类3型n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(paav-cag-cohnaglu-3型)的质粒的水动力传递。使用50μg质粒paav-cag-cohnaglu-3型以水动力的方式注射2个月龄的mpsiiib小鼠。柱状图描绘了在肝脏(a)和血清(b)中，在质粒给予后的1周测量的n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(naglu)活性。注射生理盐水的wt小鼠的naglu活性设定为100％。值为每组3-4只小鼠的平均值±sem。***p<0.001与wt。

图12.编码优化的鼠科n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(aav9-cag-comnaglu)的aav9载体的脑池内传递。在向mpsiiib小鼠的小脑延髓池中给予3xl0¹⁰vgaav9-cag-comnaglu后载体基因组的生物分布。通过定量pcr在脑(a)和身体组织(b)中定量载体基因组，并且指二倍体基因组中所包含的dna的量。nd为未检测。

图13.编码优化的鼠科n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(aav9-cag-comnaglu)的aav9载体的脑池内传递。(a)在野生型(健康)小鼠、未处理的mpsiiib小鼠以及小脑延髓池内给予3.9x10¹⁰vg对照载体(aav9-null)或3xl0¹⁰vgaav9-cag-comnaglu的mpsiiib小鼠的脑(i-v)的不同部分中的n-乙酰葡糖胺糖苷酶α活性。(b)在相同的脑的区域中的糖胺聚糖(gag)的定量。值为每组4只小鼠的平均值±sem。**p<0.01,***p<0.001与mpsiiib-无效的。nd：未检测。

图14.编码优化的鼠科n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(aav9-cag-comnaglu)的aav9载体的脑池内传递。(a)在野生型(健康)小鼠以及小脑延髓池给予3.9xl0¹⁰vg对照载体(aav9-无效的)或3x10¹⁰vgaav9-cag-comnaglu的mpsiiib小鼠中，在针对溶酶体标志物limp-2染色后在脑的不同区域中获得的信号强度的定量，其给出了溶酶体间隔的尺寸的指示。值为每组4只小鼠的平均值±sem。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001与mpsiiib-无效的。(b)在野生型(左侧面板)、未处理的mpsiiib(中间面板)和在小脑延髓池中给予aav9-cag-comnaglu的mpsiiib小鼠(右侧面板)的大脑皮质和小脑的电子显微镜分析。1.神经元；2.神经胶质细胞；3.浦肯野神经细胞。(c)由野生型(wt)小鼠、未处理的mpsiiib小鼠(mpsiiib)和在小脑延髓池中给予3.9x10¹⁰vg对照载体(aav9-无效的)或3xl0¹⁰vgaav9-cag-comnaglu的mpsiiib小鼠获得的脑提取物中，其他溶酶体酶的活性。sgsh为n-磺基葡萄糖胺磺基水解酶，gusb为葡萄糖苷酸酶β，hexb为氨基己糖苷酶b。wt酶活性设定为100％。值为每组4只小鼠的平均值±sem。***p<0.001与mpsiiib-无效的。

图15.编码优化的鼠科n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(aav9-cag-comnaglu)的aav9载体的脑池内传递。柱状图表示在由野生型(健康)小鼠、以及在小脑延髓池中给予3.9x10¹⁰vg对照载体(aav9-无效的)或3xl0¹⁰vgaav9-cag-comnaglu的mpsiiib小鼠得到的额极皮层、顶叶皮层、枕叶皮层、上丘和丘脑的切片中，在针对星形胶质细胞标志物gfap(a)和针对神经胶质细胞标志物bsi-b4(b)的免疫染色后测量的信号强度。值为每组2-3只小鼠的平均值±sem。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001与mpsiiib-无效的。(c)基于基因本体(go)注释的功能分类。饼图表明与各生物过程术语有关的文字部分。清楚而言，大部分的术语代表了炎症/免疫力相关的类别。(d)所有试验组的层次聚类，其是基于一组基因，cten软件分配这些基因以代表神经胶质细胞。各列代表基因，而各行代表动物。在底部所示的灰度等级中，相对于跨越所有样品的基因的平均丰度，来描绘各基因的表达水平。在矩阵上方所示的样品的系统树图代表了转录物水平的总体相似度。清楚而言，使用aav9-cag-comnaglu处理的所有mpsiiib小鼠均具有接近于健康的年龄匹配的wt同窝幼畜的基因表达概况。

图16.编码优化的鼠科n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(aav9-cag-comnaglu)的aav9载体的脑池内传递。在野生型(健康)小鼠、未处理的mpsiiib小鼠以及在小脑延髓池中给予3.9x10¹⁰vg对照载体(aav9-无效的)或3xl0¹⁰vgaav9-cag-comnaglu的mpsiiib小鼠的肝脏(a)和血清(b)中的n-乙酰葡糖胺糖苷酶α活性。(c)身体器官中的糖胺聚糖(gag)定量。值为每组4-8只小鼠的平均值±sem。$p<0.05与wt,**p<0.01,***p<0.001与未处理的mpsiiib。nd：未检测。(d)肝脏的电子显微镜分析。在由使用无效载体处理的mpsiiib小鼠得到的肝细胞的细胞质中可以观察到多个电-光亮空泡(箭头)，并且这些在使用aav9-cag-mnaglu处理的动物中，这些小泡消失。(e)在(a和b)中，由相同的一列动物得到的肝脏提取物中其他溶酶体酶的活性。ids为艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶；idua为艾杜糖苷酸酶，α-l-；sgsh为n-磺基葡萄糖胺磺基水解酶；gusb为葡萄糖苷酸酶β；hexb为氨基己糖苷酶b。wt酶的活性设定为100％。值为每组4只小鼠的平均值±sem。**p<0.01和***p<0.001与mpsiiib-无效。

图17.编码优化的鼠科n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(aav9-cag-comnaglu)的aav9载体的脑池内传递。在天然检验的野生型(健康)小时、未处理的mpsiiib小鼠和在小脑延髓池中给予3.9x10¹⁰vg对照载体(aav9-无效的)或3xl0¹⁰vgaav9-cag-comnaglu的mpsiiib小鼠中的行为评价。数据相当于在头2分钟过程中记录的运动和探索活性，并且表示为每组10-15只动物的平均值±sem。(a)向中心的潜伏，(b)在边界的时间，(c)向中心的进入，(d)休眠时间，(e)移动的总距离，(f)穿越的线的总数。*p<0.05和**p<0.01与mpsiiib无效的。(g)在wt(n＝23)，未处理的mpsiiib小鼠(n＝12)，注射3.9xl0¹⁰vgaav9-null(n＝5)或3x10⁹vgaav9-cag-comnaglu(n＝8)的mpsiiib小鼠的kaplan-meier生存分析。使用aav9-cag-comnaglu基因治疗进行的处理大幅延长了mpsiiib动物的寿命。对于aav9-cag-comnaglu-处理的mpsiiib小鼠与mpsiiib-无效的，p＝0.0007。

图18.编码优化的犬科n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(aav9-cag-cocnaglu)的aav9载体向beagle狗的脑池内传递。(a)在向健康的beagle狗csf内传递aav9-cag-cocnaglu载体之前和之后，在匹配的血清和csf样品中的抗aav9中和抗体(nab)效价的跟踪。在脑池内给予之前，通过静脉内传递1x10¹¹vg/kgaav9-无效的载体来预免疫狗3和4。(b)在csf内给予编码犬科n-乙酰葡糖胺糖苷酶α的6.5xl0¹²vgaav9载体后，在健康成年beagle狗的csf中n-乙酰葡糖胺糖苷酶α的活性的跟踪。在给予时，狗1和2(空心符号)是天然的，而狗3和4(实心符号)对aav9载体具有预存在的免疫力。在相同的图中描绘了所有狗的各时间点的csf白细胞计数(wbc)(虚线)。

图19.质粒paav-cag-hnaglu(a)的示意图和重组aav载体aav9-cag-hnaglu(b)的基因组的示意图。

图20.质粒paav-cag-cohnaglu(a)的示意图和重组aav载体aav9-cag-cohnagiu(b)的基因组的示意图。

图21.质粒paav-cag-cohnaglu-2型(a)的示意图和重组aav载体aav9-cag-cohnaglu-2型(b)的基因组的示意图。

图22.质粒paav-cag-cohnaglu-3型(a)的示意图和重组aav载体paav-cag-cohnaglu-3型(b)的基因组的示意图。

图23.质粒paav-cag-comnaglu(a)的示意图和重组aav载体aav9-cag-comnaglu(b)的基因组的示意图。

图24.质粒paav-cag-cocnaglu(a)的示意图和重组aav载体aav9-cag-cocnaglu(b)的基因组的示意图。

微生物有机体的保藏

质粒paav-cag-cohnaglu(seqidno:6)于2012年11月13日以登录号dsm26626保藏于thedsmz-deutschesammlungvonmikroorganismenundzellkulturen,inhoffenstrabe7b,d-38124braunschweig,federalrepublicofgermany。

质粒paav-cag-hnaglu(seqidno:5)于2014年3月13日以登录号dsm28568保藏于thedsmz-deutschesammlungvonmikroorganismenundzellkulturen,inhoffenstrabe7b,d-38124braunschweig,federalrepublicofgermany。

质粒paav-cag-cohnaglu-2型(seqidno:20)于2015年4月29日以登录号dsm32042保藏于thedsmz-deutschesammlungvonmikroorganismenundzellkulturen,inhoffenstrabe7b,d-38124braunschweig,federalrepublicofgermany。

质粒paav-cag-cohnaglu-3型(seqidno:23)于2015年4月29日以登录号dsm32043保藏于thedsmz-deutschesammlungvonmikroorganismenundzellkulturen,inhoffenstrabe7b,d-38124braunschweig,federalrepublicofgermany。

定义

术语“核苷酸序列”是指核酸分子，dna或rna，其分别包含脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。

核酸可以是双链的、单链的，或者包含双链的或单链的序列的部分。

术语“序列一致性％”是指在对序列进行比对以取得最大的序列一致性％之后，与参照序列中的核苷酸一致的候选序列的核苷酸的百分率。序列一致性％可以通过本领域建立的任何方法或算法测定，例如align,blast和blast2.0算法。参见altschuls,etnucacidsres.1977；25:3389-3402andaltschuls,etal,jmolbiol.1990；215:403-410。

在本文中，序列一致性％是通过将参照序列与候选序列比对后一致的核苷酸数量除以参照序列中核苷酸的总数量，并将所得的结果乘以100来计算的。

术语动词性的“编码”或动名词性的“编码”是指确定核苷酸序列翻译成多肽或蛋白质的方式的遗传密码子。序列中核苷酸的顺序决定了沿着多肽或蛋白质的氨基酸的顺序。

术语“蛋白质”是指由氨基酸或多肽的一个或多个线性链构成的大分子。蛋白质可以经历翻译后修饰，例如半胱氨酸残基转化成3-氧代丙氨酸、糖基化或金属结合。蛋白质的糖基化是加入不同的碳水化合物，其与氨基酸链共价连接。

术语“有效量”是指足以达到预期目的的物质的量。例如增加n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(naglu)活性的aav9载体的有效量为足以减少糖胺聚糖累积的量。治疗疾病或紊乱的表达载体的“治疗有效量”为足以减轻或根除疾病或紊乱的迹象或症状的表达载体的量。给定物质的有效量将随着诸如物质的本性、给药的途径、取得所述的物质的动物的尺寸和物种、以及给予所述的物质的目的之类的因素而改变。在各种个体情况下的有效量可以由技术人员根据本领域建立的方法凭经验确定。

术语“个体”是指哺乳动物，优选为人类或非人类哺乳动物，更优选为小鼠、大鼠、其他啮齿动物、兔、狗、猫、猪、牛、马或灵长动物，进一步更优选的是人类。

术语“可操作地连接”是指启动子序列相对于所关注的基因的功能关系和位置(例如如果启动子或增强子影响序列的转录，则其与编码序列可操作地连接)。通常，可操作地连接的启动子与所关注的序列是相邻的。但是，增强子不一定与所关注的序列相邻来控制它们的表达。

术语“嗜性”是指其中不同的病毒经过演化从而优选地靶向特定的宿主物种或者这些物种中特定的细胞类型的方式。

术语“基因治疗”是指所关注的遗传材料(例如dna或rna)转移至宿主中从而治疗或预防遗传性或获得性疾病或状况。所关注的遗传材料编码需要在体内生产的产物(例如蛋白质多肽、肽或功能rna)。例如所关注的遗传材料可以编码酶、激素、受体或治疗价值的多肽。

术语“重组病毒载体”、“病毒载体”、“重组载体”或“载体”是指由天然形成的病毒通过能够将所关注的遗传材料(例如dna或rna)转移至细胞中的基因改造技术而得到的试剂，其使得由所述的遗传材料编码的产物(例如蛋白质多肽、肽或功能rna)在靶细胞中生产。在本发明的内容中，“重组载体”或“载体”应该理解为用于将所述的遗传材料转移至细胞中的衣壳蛋白质以及其中所包含的遗传材料。通过核苷酸序列的“重组载体”或“载体”是指其基因组在相应的序列列表(seqid)中列出的“重组载体”或“载体”。

术语“重组质粒”或“质粒”是指通过能够将所关注的遗传材料转移至细胞中的遗传改造技术而获得的小型环状双链的自我复制dna分子，其使得由所述的遗传材料编码的产物(例如蛋白质多肽、肽或功能rna)在靶细胞中生产。此外，术语“重组质粒”或“质粒”还是指通过在病毒载体的制备过程中作为重组载体基因组的载体而使用的遗传改造技术所获得的小型环状双链的自我复制dna分子。

发明详述

本发明提供了用于治疗疾病、具体为治疗iii型粘多糖症(mpsiii)、特别是mpsiiib的新的重组载体。

除了遗传材料以外，重组载体还可以包含不同的功能元件，这些元件包括用于转录的控制元件(例如启动子或操纵子)，转录因子结合区域或增强子，以及用于起始或终止翻译的控制元件。

根据本发明的载体为用于转移所关注的基因的腺相关载体(aav)。它们证明在广泛的组织中在转导有丝分裂后的细胞中具有高的效力。在本发明的内容中，所述的载体用于传递人类n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(hnaglu)多核苷酸(seqidno:2)或密码子优化的人类n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(cohnaglu)多核苷酸(seqidno:3)。腺相关载体为衍生自微小病毒科的腺相关病毒基因组的载体。腺相关病毒的基因组形成单链脱氧核糖核酸(ssdna)。这些载体感染哺乳动物，但是为非病原性的(即，不导致疾病)。它们可以感染分裂细胞或非分裂细胞，并且它们的嗜性根据血清型而改变。血清型为根据病毒的衣壳抗原进行的病毒组分类。通过病毒衣壳蛋白质确定的腺相关病毒的血清型定义了病毒的嗜性，并允许其进入到特定类型的细胞中。在本发明的内容中，血清型9的腺相关病毒载体(aav9)显示在单次给予时将遗传材料传递至脑以及传递至外周器官的最佳能力。

本发明人惊奇地发现，aav9衣壳与编码n-乙酰葡糖胺糖苷酶α的核苷酸序列以及特定的cag启动子在相同的实体中的结合允许缺失的酶在脑的所有区域中持久地表达。结果是糖胺聚糖(gag)的溶酶体累积被校正，从而通过这种方式预防了mspiii疾病、具体为mpsmb的神经系统改变的特征。这种效果甚至在嗅球中获得，其为距给予载体位点的远端形式。此外，被传递至脑脊液中的根据本发明的aav9载体能够到达系统性循环中，从而转导至肺。肺细胞产生并分泌的酶使得血清中n-乙酰葡糖胺糖苷酶α活性增加，最终导致许多身体组织中溶酶体病理学减少。这表明根据本发明的载体超过现有方法的清晰的益处，其中所述的现有的方法仅部分校正了所述的疾病的临床迹象，并且通常在脑或者在系统性循环中发挥它们的作用，但是不能在二者中发挥作用。

因此，本发明涉及重组aav9载体，其包含与编码n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(seqidno:1)的核苷酸序列连接的cag启动子(seqidno:4)。

具体而言，本发明的重组aav9载体包含与编码n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(seqidno:1)的核苷酸序列连接的cag启动子(seqidno:4)，其中所述的核苷酸序列与seqidno:2具有至少80％的序列一致性。更优选地，本发明的aav9重组载体包含与编码n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(seqidno:1)的核苷酸序列连接的cag启动子(seqidno:4)，其中所述的核苷酸序列与seqidno:2具有至少84％的序列一致性。具体而言，编码n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(seqidno:1)的核苷酸序列与seqidno:2具有84％,87％,90％,95％,98％或99％的序列一致性。

在另一个具体的实施方案中，本发明的重组aav9载体包含与编码n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(seqidno:1)的核苷酸序列连接的cag启动子(seqidno:4)，其中所述的核苷酸序列与seqidno:3具有至少85％的序列一致性。具体而言，编码n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(seqidno:1)的核苷酸序列与seqidno:3具有85％,87％,90％,95％,98％或99％的序列一致性。

在本发明的优选的实施方案中，编码n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(seqidno:1)的核苷酸序列为seqidno:2。

在本发明的进一步优选的实施方案中，编码n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(seqidno:1)的核苷酸序列为seqidno:3。在seqidno:3中列出的序列呈现出与seqidno:2的84％的序列一致性。

在本发明的进一步优选的实施方案中，编码n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(seqidno:1)的核苷酸序列为seqidno:19。

在本发明的进一步优选的实施方案中，编码n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(seqidno:1)的核苷酸序列为seqidno:22。

根据本发明的aav载体包含控制所关注的基因翻译和转录的启动子。启动子为与所述的所关注的基因可操作地连接的核苷酸序列。在本发明中使用的启动子为cag启动子，其是指包含巨细胞病毒早期增强子元件和鸡β-肌动蛋白启动子的组合的cag启动子。其进一步包含β-球蛋白内含子的一部分，其中所述的β-球蛋白内含子赋予由所关注的基因衍生得到的mrna以稳定性。参见alexopouloua,etal,bmccellbiology2008；9(2):1-11。在本发明的aav9载体中所包含cag启动子具有序列seqidno:4。具体而言，该cag启动子证明比本领域常用的cmv启动子是更高效的。

在本发明的另一个优选的实施方案中，重组的aav9载体选自aav9-cag-hnaglu(seqidno:9),aav9-cag-cohnaglu(seqidno:10),以及aav9-cag-cohnaglu-2型(seqidno:21)和aav9-cag-cohnaglu-3型(seqidno:24)。优选地，重组aav9载体选自aav9-cag-hnaglu(seqidno:9),aav9-cag-cohnaglu(seqidno:10)。更特别地，本发明的重组aav9载体由血清型9的人类腺相关病毒的病毒衣壳，以及包含人类腺相关病毒血清型2的末端反向重复序列(itr)的修饰基因组、cag启动子、人类n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(naglu)基因的编码序列(cds)和得自兔β-球蛋白基因的polya组成。

本发明还涉及包含编码n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(seqidno:1)的核苷酸序列的质粒。具体而言，根据本发明的质粒包含编码n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(seqidno:1)的核苷酸序列，其与seqidno:2具有至少80％的序列一致性。优选地，根据本发明的质粒包含编码n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(seqidno:1)的核苷酸序列，其与seqidno:2具有至少84％的序列一致性。具体而言，编码n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(seqidno:1)的核苷酸序列具有与seqidno:2的84％,87％,90％,95％,98％或99％序列一致性。

在优选的实施方案中，根据本发明的质粒包含编码n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(seqidno:1)的核苷酸序列，其与seqidno:3具有至少85％的序列一致性。具体而言，编码n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(seqidno:1)的核苷酸序列具有与seqidno:3的85％,87％,90％,95％,98％或99％序列一致性。

这些质粒用于通过使用本领域已知的方法转染hek293细胞而生产本发明的重组aav9载体。

在本发明的优选的实施方案中，在本发明的质粒中所包含的并编码n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(seqidno:1)的核苷酸序列为seqidno:2。

在本发明的另一个优选的实施方案中，在本发明的质粒中所包含的并编码n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(seqidno:1)的核苷酸序列为seqidno:3。

在本发明的另一个优选的实施方案中，在本发明的质粒中所包含的并编码n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(seqidno:1)的核苷酸序列为seqidno:19。

在本发明的另一个优选的实施方案中，在本发明的质粒中所包含的并编码n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(seqidno:1)的核苷酸序列为seqidno:22。

在更优选的实施方案中，本发明的质粒选自paav-cag-hnaglu(seqidno:5),paav-cag-cohnaglu(seqidno:6),paav-cag-cohnaglu-2型(seqidno:20)和paav-cag-cohnaglu-3型(seqidno:23)，并且特别地选自paav-cag-hnaglu(seqidno:5)和paav-cag-cohnaglu(seqidno:6)，并且优选地，所述的质粒为paav-cag-cohnaglu(seqidno:6)。

本发明进一步提供了生产根据本发明的腺相关病毒重组载体aav9的方法。所述的工艺包含以下步骤：

i)提供第一载体，其包含设置在第一aav末端重复序列和第二aav末端重复序列之间的编码所关注的蛋白质的序列，与编码所关注的蛋白质的序列可操作地连接的cag启动子；提供第二载体，其包含得自血清型9的aavrep基因和aavcap基因；以及提供第三载体，其包含腺病毒辅助功能基因；

ii)使用步骤i)的载体共转染感受态细胞；

iii)培养步骤ii)的转染的细胞；以及

iv)纯化由步骤iii)的培养物得到的表达载体。

在优选的实施方案中，第一载体的aav第一和第二末端重复序列为得自aav血清型2的itr。在另一个优选的实施方案中，第二载体的aavrep基因得自aav血清型2。在另一个优选的实施方案中，感受态细胞为hek293细胞。

本发明还提供了用于制备根据本发明的质粒的方法，其包括以下步骤：

i)具体而言使用miui/ecori，通过消化来剪切由起始质粒得到的编码所关注的蛋白质的序列；

ii)克隆处于aav主链质粒paav-cag的2个限制性位点之间的编码所关注的蛋白质的序列，由此获得相应的质粒，其包含编码所关注的蛋白质的序列。

在另一个方面中，本发明考虑了药物组合物，其包含本文所述的治疗有效量的aav9载体，或者本文所述的治疗有效量的。

本发明的药物组合物在药物可接受的载体中包含重组aav9载体。所述的组合物还可以包含至少一种辅助物质。可以在载体、赋形剂、溶剂、稀释剂或助剂中选择辅助物质。可接受的载体、稀释剂或助剂是非毒性的，并且优选地在所使用的剂量和浓度下是惰性的，而且包含缓冲剂，例如磷酸盐,柠檬酸盐或其他有机酸；抗氧化剂；低分子量多肽、蛋白质，例如血清白蛋白,凝胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物；氨基酸；单糖,二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖,甘露糖或糊精；螯合剂；糖醇，例如甘露醇或山梨醇,成盐离子(例如钠)；和/或非离子表面活性剂，例如聚乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物(pluronic)聚乙烯醇(peg)。

在优选的实施方案中，根据本发明的药物组合物适用于肠胃外给予。肠胃外给予的实例为静脉内、皮下、脑池内和肌肉内注射。优选地，根据本发明的药物组合物适用于静脉内或脑池内给予。适用于此类肠胃外给予的组合物包括用于临时制备无菌溶液或分散液的无菌水性溶液或分散液、无菌粉末。有利地，根据本发明的药物组合物免于细菌和真菌的污染作用。

用于人类和动物的每日剂量可以根据在各种物种中具有它们的基准的多种因素或者诸如年龄、性别、重量或疾病程度等而改变。

本发明的另一个方面涉及上文所述的aav9载体或上文所述的质粒的治疗用途。如上文所提及，根据本发明的重组aav9载体取得了缺失naglu酶的表达，因此校正了gag的溶酶体累积。这允许校正iii型粘多糖症(mpsiii)、特别是mpsiiib的所有临床迹象。在这一方面中，本发明还涉及用作药剂的上文所述的重组aav9载体或上文所述的质粒。

具体而言，本发明涉及用于增加肌体中n-乙酰葡糖胺糖苷酶α活性的上文所述的重组aav9载体或上文所述的质粒。

在另一个优选的方面中，本发明设计及用于治疗iii型粘多糖症(mpsiii)、特别是mpsiiib的上文所述的重组aav9载体或上文所述的质粒。

在另一个实施方案中，本发明涉及用于制备治疗iii型粘多糖症(mpsiii)、特别是mpsiiib的药剂的上文所述的重组aav9载体或上文所述的质粒。

本发明的另一个实施方案涉及治疗iii型粘多糖症(mpsiii)、特别是mpsiiib的方法，其包括将上文所述的至少重组aav9载体或上文所述的至少质粒给予有需要的受试对象。

本发明进一步提供了分离的细胞，其包含编码n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(seqidno:1)的核苷酸序列。具体而言，根据本发明的细胞包含编码n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(seqidno:1)的核苷酸序列，其与seqidno:2具有至少80％的序列一致性。优选地，编码n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(seqidno:1)的核苷酸序列与seqidno:2具有至少84％的序列一致性。具体而言，编码n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(seqidno:1)的核苷酸序列与seqidno:2具有84％,87％,90％,95％,98％或99％的序列一致性。在另一个具体的方面中，编码n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(seqidno:1)的核苷酸序列与seqidno:3具有至少85％的序列一致性，并且优选地与seqidno:3具有至少85％,87％,90％,95％,98％或99％的序列一致性。

在优选的实施方案中，本发明的细胞包含编码n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(seqidno:1)的核苷酸序列seqidno:2。

在另一个优选的实施方案中，本发明的细胞包含编码n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(seqidno:1)的核苷酸序列seqidno:3。

在另一个优选的实施方案中，本发明的细胞包含编码n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(seqidno:1)的核苷酸序列seqidno:19。

在另一个优选的实施方案中，本发明的细胞包含编码n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(seqidno:1)的核苷酸序列seqidno:22。

一般过程

1.重组aav载体

本文所述的aav载体是通过三重转染得到的。制备载体所需的材料为：hek293细胞(表达e1基因)，提供腺病毒功能的辅助质粒，提供得自血清型2的aavre基因和得自血清型9(aav9)的cap基因的质粒，以及最后，具有aav2itr和所关注的构造的主链质粒。

为了生成表达n-乙酰葡糖胺糖苷酶α的aav载体，将人类、鼠科或犬科的非优化的或优化的cds克隆至处于普遍的杂交cag启动子控制之下的aav主链质粒中。

使用具有修饰的3种质粒通过hek293细胞的辅助无病毒转染而生成载体。参见matsushitat,etal,genether.1998；5:938-945andwrightj,etal,mol.ther.2005；12:171-178。在装有dmem(补充10％fbs)的旋转瓶(rb)(corning,corning,ny,us)中将细胞培养至70％融合，然后使用以下物质共转染：1)带有表达盒的质粒，其中所述的表达盒的侧翼具有血清型2aav的病毒itr(上文所述)；2)带有aavrep2和cap9基因的质粒；以及3)带有腺病毒辅助功能的质粒。如上文所述，使用优化的方案通过2个连续的氯化铯梯度来纯化载体。参见ayusoe,etal,genether.2010；17:503-510。将载体针对pbs透析，过滤，通过qpcr滴定，并储存在-80℃下，直至使用。

根据本领域本领域公知的分子生物学技术构建本发明的载体。

2.动物

同族突变的c57b1/6jn-乙酰葡糖胺糖苷酶α缺陷型小鼠(mpsiiib)模型购自thejacksonlaboratory(barharbor,me,usa.stock003827)。参见lietal,procnatlacadsci.1999；96(25):14505-10。感染的mpsiiib和健康对照小鼠由杂合的创始人繁殖。使用扩增涵盖靶突变的序列的pc分析，由尾部截取的样品在基因组dna上测定基因型。各个正义和反义引物的序列为：正向引物：5'-gtcgtctcctggttctggac-3'(seqidno:13)，反向引物：5'-accacttcattctggccaat-3'(seqidno:14)，反向引物突变：5'-cgctttctgggctcagag-3'(seqidno:15)。对小鼠随意喂养标准的饮食(harlan,tekland)，并保持在12h的光-暗循环下(在9:00a.m.光照)。

3.编码hnaglu的质粒向小鼠的水动力传递

就paav-cag-hnaglu,paav-cag-cohnaglu-2型和paav-cag-cohnaglu-3型质粒的水动力传递而言，使2个月龄的mpsiiib和野生型动物通过鼠尾静脉注射在<5秒内接受总剂量50μg质粒，其量等于10％的动物体重。该技术使得主要在肝脏中的质粒编码的转基因表达。参见liuetal,genether.1990；6(7):1258-66。作为对照，一组小鼠接受等量的生理盐水溶液。在水动力注射质粒后的1周处死小鼠。如以下部分所述，收获器官。

4.载体给予和样品收集

就aav9-cag-comnaglu载体向小鼠的脑池内传递而言，将总剂量3xl0¹⁰vg注射至2个月龄的mpsiiib动物的小脑延髓池中。相似的一组动物注射3.9xl0¹⁰vg对照非编码(aav9-无效的)的载体。在5个月龄时，即，在给予载体后的3个月，麻醉小鼠，然后心脏灌输10mlpbs，从而使得自组织的血液完全清澈。收集全脑和多个身体组织(包括肝脏、脾、胰腺、肾、肺、心脏、骨骼肌和睾丸)，并在液氮中冷冻，而且储存在-80摄氏度下或浸渍于福尔马林中，以用于随后的组织学分析。

就aav9-cag-hnaglu和aav9-cag-cohnaglu载体的静脉内传递而言，2个月龄的mpsiiib小鼠通过鼠尾静脉注射接受总剂量5x10¹¹vg。在4个月龄时，即，在给予载体后2个月，处死小鼠，并按照上述段落所述收获器官。

就aav9-cag-hnaglu和aav9-cag-cohnaglu载体的脑池内传递而言，在2个月龄的mpsiiib动物的小脑延髓池中注射总剂量9.3x10⁹vg。在4个月龄时，即，在给予载体后的2个月，处死小鼠，并按照上述段落所述收获器官。

就aav9-cag-cocnaglu向狗的脑池内传递而言，通过小脑延髓池注射将总剂量6.5x10¹²vg给予健康成年beagle狗。在给予naglu载体之前6周，使2种动物接受1x10¹¹vg/kgaav9-无效载体的静脉内注射，从而使动物对aav9预免疫。首先每周，然后每个月，收集csf和血清样品，并储存在-80℃下。

5.载体基因组拷贝数的定量

将组织(-100mg)在56℃下在400μl蛋白酶r溶液(0.2mg/ml)中过夜消化。使用标准的技术，通过提取由上清液分离总dna。将dna再次悬浮于蒸馏水中，并使用nanodropnd-1000(nanodrop,wilmington,de,usa)定量。使用不会扩增内源基因位点的、鼠科n-乙酰葡糖胺糖苷酶α转基因特异性的引物和探针，通过定量实时pcr来测定20ng总dna中载体基因组的拷贝数。正向引物：5'-gccgaggcccagttctac-3'(seqidno:16)；反向引物：5'-ttggcgtagtccaggatgttg-3'(seqidno:17)；探针：5'-agcagaacagcagataccagatcaccc-3'(seqidno:18)。通过与参照标准曲线比较来确定最终的值，其中所述的参照标准曲线是由用于aav载体生产的线性质粒(添加至20ng非转导的基因组dna中)的系列稀释建立的。

6.n-乙酰葡糖胺糖苷酶α活性和糖胺聚糖定量

在mili-q水中对肝脏和脑的样品进行超声处理。所分析的血清是未处理的。如上文所述，使用4-甲基伞形酮衍生的荧光底物(moscerdamsubstrates,oegstgeest,nl)来测定n-乙酰葡糖胺糖苷酶α活性。参见marshandfensom,clingenet.1985；27(3):258-262。将脑和肝脏活性水平对蛋白质总量进行归一化，使用bradford蛋白质测试进行定量(bio-rad,hercules,ca,us)。血清水平对体积进行归一化。

就糖胺聚糖(gag)定量而言，将组织样品称重，然后使用蛋白酶消化，通过离心和过滤使提取物澄清。使用软骨素4-磷酸作为对照，使用blyscan硫酸化糖胺聚糖试剂盒(biocolor,carrickfergus,countyantrim,gb)在组织提取物中测定gag水平。将gag的水平对组织湿重进行归一化。

7.其他溶酶体酶的活性

在37℃下与4-甲基伞形酮-α-n-游离酸(glycosynth)温育1h的15μg蛋白质中测量idua活性。就ids活性而言，将15μg蛋白质首先与4-甲基伞形酮基-α-l-游离酸-2-硫酸(oscerdamsubstrates)在37℃下温育4h，然后在37℃下与得自牛睾丸的一池溶酶体酶(lebt-m2,moscerdamsubstrates)温育第二个24h。按照之前所述测量sgsh。参见haurigotetal,jclininvest2013；123(8):3254-71。就gusb活性而言，将10μg蛋白质与4-甲基伞形酮基-β-d-葡糖苷酸(sigma)在37℃下温育1h。通过将0.1μg蛋白质与4-甲基伞形酮基n-乙酰基-β-d-葡糖苷酸(sigma)在37℃下温育来测试hexb活性。在通过增加h而终止反应后，使用flx800荧光剂(biotekinstruments)测量释放的荧光。针对bradford(bio-rad)定量的总蛋白质含量将所有的酶活性归一化。

8.组织学分析

将组织在福尔马林中固定12-24h，包埋在石蜡中，并切片。就身体组织中lamp1的免疫组织化学检测而言，使石蜡切片在柠檬酸盐缓冲剂ph6中经历热诱导的抗原表位的修复，然后与以1:100稀释的大鼠抗lamp1抗体(1d4b；santacruzbiotechnology,santacruz,ca,us)在4℃下温育过夜，随后与以1:300稀释的生物素化的兔抗大鼠抗体(dako,glostrup,dk)温育。就limp2在脑中的免疫组织化学检测而言，将石蜡切片与以1:100稀释的兔抗limp2抗体(nb400；novusbiologicals,littleton,co,usa)在4℃下过夜温育，随后与以1:300稀释的生物素化的山羊抗兔抗体(31820；vectorlaboratories,burlingame,ca,usa)温育。就脑样品中的gfap免疫染色而言，将石蜡切片与以1:1000稀释的兔抗gfap抗体(ab6673；abeam,cambridge,uk)在4℃下温育过夜，随后与1:300稀释的生物素化的山羊抗兔抗体(31820；vectorlaboratories,burlingame,ca,usa)温育。通过使用abc-peroxidase染色试剂盒(thermoscientific,waltham,ma,us)在1:100稀释下插入切片来扩增lamp1、limp2和gfap信号，并使用3,3-二氨基联苯(sigma-aldrich,st.louis,mo,us)作为色原体进行观察。使用光学显微镜(eclipse90i；nikon,tokyo,jp)获得明视野图像。

为了将脑样品中的小胶质细胞染色，将石蜡切片与以1:100稀释的bsi-b4凝集素(l5391；sigma-aldrich,st.louis,mo,usa)在4℃下温育过夜。使用3,3-二氨基联苯(sigma-aldrich,st.louis,mo,us)作为色原体观察bsi-b4信号。使用光学显微镜(eclipse90i；nikon,tokyo,jp)获得明视野图像。

使用theniselementsadvancedresearch2.20软件，使用用于所有动物的相同的信号阈值环境，在每只动物的各个脑区的3-5个图像(原始放大,x20)中定量limp2、gfap和bsi-b4信号。然后，计算阳性区域的百分率，即，图像中总组织区域上具有阳性信号的区域(以像素计)。

9.透射电子显微镜分析

通过超剂量的异氟烷处死小鼠(isofluo,labs.esteve,barcelona,es)，并通过下腔静脉灌输1ml25％戊二醛和2％多聚甲醛。将肺侧叶(大约1mm³)和大脑皮层的一小部分切片，并在相同的固定剂中在4℃下温育2小时。在冷的甲申酸盐缓冲剂中洗涤后，将样本在1％四氧化锇中进行后期固定，在水性乙酸双氧铀中染色，然后通过梯度乙醇系列脱水，并包埋于环氧树脂中。使用柠檬酸铅染色由树脂块得到的超薄切片并在透射电子显微镜(h-7000；hitachi,tokyo,jp)中检查。

10.转录组学分析

将半个小鼠的脑(～250mg)进行机械均化，并使用mirvanatm(ambion,lifetechnolo-gies)分离总的rna。合成cdna，随后通过progenikabiopharma(spain)在thegenechipmousegene2.1st16阵列平板(affymetrix)中杂交；根据affymetrix推荐的方案和设备进行样品处理、杂交和扫描。使用expressionconsoletm工具，通过rma(robustmultiarray求平均值)方法进行数据归一化，从而获得log2转换的归一化值。过滤数据，从而使分析集中于已知的编码序列上，从而得到26688改变的基因的原始列表，其随后再次过滤，从而除去方差低于第75个百分点。该过程生成了6672个基因的工作列表。就差异化表达的基因而言，fdr(错误发现率)标准<0.1，并且建立80％的置信度。就聚类分析而言，将数据标准化并使用thej-expresspro软件(jexpress.bioinfo.no)表示成热点图。使用genecodistool2.0(genecodis2.dacya.ucm.es)进行功能分析。将阵列数据提交给arrayexpress数据库(http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/；登陆密码e-mtab-2984)。

11.行为评估

通过开场试验来评估行为变化。将动物置于亮灯室(41x41x30cm)的左下角。在3个同心正方形中分割竞技场的表面：中心(14x14cm)，外周(27x27cm)和边缘(41x41cm)。使用视频跟踪系统(smartjunior,panlab)，在最初的2分钟内记录试验行为和一般活性。总是在一天的同时(9:00am至1:00pm)进行检验，从而减小日周期的影响。

12.统计学分析

所有的结果表示为平均值±sem。使用单因素anova进行统计学比较，并且使用dunnett后检验进行对照组和处理组之间的多重比较。如果p<0.05，则考虑具有统计学意义。使用kaplan-meier方法来分析生存以及用于比较的log-rank检验。

实施例

实施例1：

实施例1：paav-cag-hnaglu的构建

人类n-乙酰葡糖胺糖苷酶α编码序列(cds)用作起始材料(ncbi参照序列：nm000263)，并进行化学合成以用于所述的目的(geneart；lifetechnologies)。接受在质粒pma(ampr)内克隆的cds，其中所述的质粒pma在5'和3'的侧翼分别为mlul和ecori限制性位点。通过mlui/ecori消化来切割n-乙酰葡糖胺糖苷酶αcds，然后克隆至aav主链质粒paav-cag(ampr)的mlul和ecori限制性位点之间。所得的质粒称为paav-cag-hnaglu(登录号dsm28568)。参见seqidno:5和图19a。

之前已经生成paav-cag质粒，并包含得自aav2基因组的itr、cag启动子和得自兔β-球蛋白的polya信号、以及用于克隆所关注的cds的多克隆位点。cag启动子为杂交启动子，其由cmv早期/中期增强子和鸡β-肌动蛋白启动子构成。该启动子能够普遍地驱动有效的表达。参见sawickijetal,expercellres.1998；244:367-369,huangjetal,jgenemed.2003；5:900-908,liuyeial,expmolmed.2007；39(2):170-175。

实施例2：aav9-cag-hnaglu的生产

使用具有修饰的3种质粒，通过hek293细胞的辅助无病毒转染来生成载体aav9-cag-hnaglu(seqidno:9和图19b)。参见matsushita,1998(如上)和wright,2005,如上。在装有dmem(补充10％fbs)的旋转瓶(rb)(corning,corning,ny,us)中将细胞培养至70％融合，然后使用以下物质共转染：1)带有表达盒的质粒，其中所述的表达盒的侧翼具有aav2itr(paav-cag-hnaglu)；2)带有aav2rep和aav9cap基因的质粒(prep2cap9)；以及3)带有腺病毒辅助功能的质粒。如上文所述，使用标准的方案或优化的方案通过2个连续的氯化铯梯度来纯化载体。参见ayuso,2010,如上。将载体针对pbs透析，过滤，通过qpcr滴定，并储存在-80℃下，直至使用。

实施例3：paav-cag-cohnaglu的构建

设计并获得包含优化形式的人类n-乙酰葡糖胺糖苷酶αcds(cohnaglu)的表达盒。通过以下过程优化序列从而使人类中n-乙酰葡糖胺糖苷酶α蛋白质的生产效力最大：删除隐蔽剪切位点和rna不稳定序列元件，以便增加rna的稳定性；加入rna稳定序列元件；密码子优化和g/c含量调试；避免稳定的rna二级结构，等其他变化。将所接受的优化的cds克隆于pma-rq(ampr)质粒中，其中所述的质粒的5'和3'侧翼分别为mlul和ecori限制性位点。

使用mlul和ecori消化pma-rq-cohnaglu质粒，从而切割优化的n-乙酰葡糖胺糖苷酶αcds。随后，将该片段克隆至paav-cag主链质粒的相同的限制性位点之间，从而生成paav-cag-cohnaglu质粒(登录号dsm26626)。参见seqidno:6和图20a。

实施例4：aav9-cag-cohnaglu的生产

使用具有修饰的3种质粒，通过hek293细胞的辅助无病毒转染来生成载体aav9-cag-cohnaglu(seqidno:10和图20b)。参见matsushita,1998(如上)和wright,2005(如上)。在装有dmem(补充10％fbs)的旋转瓶(rb)(corning,corning,ny,us)中将细胞培养至70％融合，然后使用以下物质共转染：1)带有表达盒的质粒，其中所述的表达盒的侧翼具有aav2itr(paav-cag-cohnaglu)；2)带有aav2rep和aav9cap基因的质粒(prep2cap9)；以及3)带有腺病毒辅助功能的质粒。如上文所述，使用标准的方案或优化的方案通过2个连续的氯化铯梯度来纯化载体。参见ayuso,2010,如上。将载体针对pbs透析，过滤，通过qpcr滴定，并储存在-80℃下，直至使用。

实施例5：paav-cag-cohnaglu-2型的构建

设计并获得包含人类n-乙酰葡糖胺糖苷酶αcds的第二优化形式(cohnaglu-2型)的表达盒。接受在质粒pj208(ampr)中克隆的优化的cds(dna2.0@)，其中所述的质粒分别在5'和3'的侧翼具有mlul和ecori限制性位点。

使用mlui和ecori消化pj208-cohnaglu-2型质粒，从而切除优化的n-乙酰葡糖胺糖苷酶α-2型cds。随后，将该片段克隆至paav-cag主链质粒的相同的限制性位点之间，从而生成paav-cag-cohnaglu-2型质粒(登陆号dsm32042)。参见seqidno:20和图21a。

实施例6：aav9-cag-cohnagiu-2型的生产

使用具有修饰的3种质粒，通过hek293细胞的辅助无病毒转染来生成载体aav9-cag-cohnaglu-2型(seqidno:21和图21b)。参见matsushita,1998(如上)和wright,2005(如上)。参见matsushita,1998,如上,和wright,2005,如上。在装有dmem(补充10％fbs)的旋转瓶(rb)(corning,corning,ny,us)中将细胞培养至70％融合，然后使用以下物质共转染：1)带有表达盒的质粒，其中所述的表达盒的侧翼具有aav2itr(paav-cag-cohnaglu-2型)；2)带有aav2rep和aav9cap基因的质粒(prep2cap9)；以及3)带有腺病毒辅助功能的质粒。如上文所述，使用标准的方案或优化的方案通过2个连续的氯化铯梯度来纯化载体。参见ayuso,2010,如上。将载体针对pbs透析，过滤，通过qpcr滴定，并储存在-80℃下，直至使用。

实施例7：paav-cag-cohnaghi-3型的构建

设计并获得包含人类n-乙酰葡糖胺糖苷酶αcds的第三优化形式(cohnaglu-3型)的表达盒。接受在质粒puc57(ampr)中克隆的优化的cds(genscript,inc)，其中所述的质粒分别在5'和3'的侧翼具有mlul和ecori限制性位点。

使用mlui和ecori消化puc57-cohnaglu-3型质粒，从而切除优化的n-乙酰葡糖胺糖苷酶α-3型cds。随后，将该片段克隆至paav-cag主链质粒的相同的限制性位点之间，从而生成paav-cag-cohnaglu-3型质粒(登陆号dsm32043)。参见seqidno:23和图22a。

实施例8：aav9-cag-cohnagiu-3型的生产

使用具有修饰的3种质粒，通过hek293细胞的辅助无病毒转染来生成载体aav9-cag-cohnaglu-3型(seqidno:24和图22b)。参见matsushita,1998(如上)和wright,2005(如上)。在装有dmem(补充10％fbs)的旋转瓶(rb)(corning,corning,ny,us)中将细胞培养至70％融合，然后使用以下物质共转染：1)带有表达盒的质粒，其中所述的表达盒的侧翼具有aav2itr(paav-cag-cohnaglu-3型)；2)带有aav2rep和aav9cap基因的质粒(prep2cap9)；以及3)带有腺病毒辅助功能的质粒。如上文所述，使用标准的方案或优化的方案通过2个连续的氯化铯梯度来纯化载体。参见ayuso,2010,如上。将载体针对pbs透析，过滤，通过qpcr滴定，并储存在-80℃下，直至使用。

实施例9：paav-cag-comnaglu的构建

用于鼠科n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(ncbi参照序列：nm_013792)的cds经历序列优化(geneart；lifetechnologies)。接受在质粒pma-rq(ampr)中克隆的优化的cds，其中所述的质粒分别在5'和3'的侧翼具有mlul和ecori限制性位点。

由pma-rq质粒上切除mlui/ecori优化的鼠科n-乙酰葡糖胺糖苷酶αcds片段，并随后克隆至aav主链质粒paav-cag的mlui和ecori限制性位点之间。所得的质粒称为paav-cag-comnaglu。参见seqidno:7和图23a。

实施例10：aav9-cag-comnagiu的生产

使用具有修饰的3种质粒，通过hek293细胞的辅助无病毒转染来生成载体aav9-cag-comnaglu(seqidno:11和图23b)。参见matsushita,1998(如上)和wright,2005(如上)。在装有dmem(补充10％fbs)的旋转瓶(rb)(corning,corning,ny,us)中将细胞培养至70％融合，然后使用以下物质共转染：1)带有表达盒的质粒，其中所述的表达盒的侧翼具有aav2itr(paav-cag-comnaglu)；2)带有aav2rep和aav9cap基因的质粒(prep2cap9)；以及3)带有腺病毒辅助功能的质粒。如上文所述，使用标准的方案或优化的方案通过2个连续的氯化铯梯度来纯化载体。参见ayuso,2010,如上。将载体针对pbs透析，过滤，通过qpcr滴定，并储存在-80℃下，直至使用。

实施例11：paav-cag-cocnaglu的构建

用于鼠科n-乙酰葡糖胺糖苷酶α(ncbi参照序列：xm_548088.4)的cds经历序列优化(geneart；lifetechnologies)。接受在质粒pma-rq(ampr)中克隆的优化的cds，其中所述的质粒分别在5'和3'的侧翼具有mlul和ecori限制性位点。

由pma-rq质粒上切除mlui/ecori优化的鼠科n-乙酰葡糖胺糖苷酶αcds片段，并随后克隆至aav主链质粒paav-cag的mlui和ecori限制性位点之间。所得的质粒称为paav-cag-cocnaglu。参见seqidno:8和图24a。

实施例12：aav9-cag-cocnaglu的生产

使用具有修饰的3种质粒，通过hek293细胞的辅助无病毒转染来生成载体aav9-cag-cocnaglu(seqidno:12和图24b)。参见matsushita,1998(如上)和wright,2005(如上)。在装有dmem(补充10％fbs)的旋转瓶(rb)(corning,corning,ny,us)中将细胞培养至70％融合，然后使用以下物质共转染：1)带有表达盒的质粒，其中所述的表达盒的侧翼具有aav2itr(paav-cag-cocnaglu)；2)带有aav2rep和aav9cap基因的质粒(prep2cap9)；以及3)带有腺病毒辅助功能的质粒。如上文所述，使用标准的方案或优化的方案通过2个连续的氯化铯梯度来纯化载体。参见ayuso,2010,如上。将载体针对pbs透析，过滤，通过qpcr滴定，并储存在-80℃下，直至使用。

实施例13：质粒paav9-cag-hnaglu的水动力传递

通过水动力鼠尾静脉(hdtv)注射将总剂量为50μg的包含野生型人类n-乙酰葡糖胺糖苷酶α表达盒的质粒paav9-cag-hnaglu给予2个月龄的mpsiiib小鼠。该技术靶向传递至肝脏的质粒的表达。参见liuetal,genether.1990；6(7):1258-66。

在质粒传递后一周，在给予野生型人类n-乙酰葡糖胺糖苷酶α编码质粒的所有动物的肝脏和血清中，记录n-乙酰葡糖胺糖苷酶α活性大幅高出处理前的水平。参见图1a和1b。在注射生理盐水溶液的mpsiiib动物中未检测到活性。在处理动物的肝脏和血清中观察到的n-乙酰葡糖胺糖苷酶α活性的水平分别相当于wt动物的肝脏和血清中测量的平均活性值(设定为100％)的150％和1700％。参见图1a和1b。

实施例14：aav9-cag-hnaglu的静脉内传递

通过鼠尾静脉注射，将总剂量为5x10¹¹的aav9-cag-hnaglu载体的载体基因组给予2个月龄的mpsiiib小鼠。

与aav9载体对肝脏的高嗜性一致，在给予后的2个月，经处理的动物显示该器官中高水平的n-乙酰葡糖胺糖苷酶α活性(其为健康动物中所观察的活性的700％)，这完全消除或大幅减少在未处理的mpsiiib小鼠的身体组织中所观察到的gag的病理学累积。参见图2a-c。此外，考虑到血清型9的aav载体在系统性给予时转导至脑中的高效率，经处理的动物显示在所分析的所有脑区，都具有显著水平的n-乙酰葡糖胺糖苷酶α活性(健康小鼠的20-30％)。参见图3a。n-乙酰葡糖胺糖苷酶α活性的这种部分恢复足以清除脑的所有区域的gag贮积。参见图3b。

实施例15：aav9-cag-cohnaglu的静脉内传递

通过鼠尾静脉注射，将总剂量为5x10¹¹的aav9-cag-hnaglu载体的载体基因组给予2个月龄的mpsiiib小鼠。

在给予后的2个月，经处理的小鼠显示肝脏中高水平的n-乙酰葡糖胺糖苷酶α活性(健康水平的600％)，并且在血清中活性水平适度增加。参见图4a和4b。n-乙酰葡糖胺糖苷酶α的生产完全消除或大幅减少在未处理的mpsiiib小鼠的身体组织中所观察的gag的病理学累积。参见图4c。此外，经处理的小鼠显示在所分析的所有脑区中，n-乙酰葡糖胺糖苷酶α的活性显著增加(健康小鼠的18-27％)。参见图5a。n-乙酰葡糖胺糖苷酶α活性的这种部分恢复足以清除所有脑区的gag贮积。参见图5b。

实施例16：aav9-cag-hnaglu的脑池内传递

将总剂量为9.3x10⁹的aav9-cag-hnaglu载体的载体基因组注射至2个月龄的mpsiiib动物的小脑延髓池中，总量为5μl。

csf内给予aav9-cag-hnaglu载体导致所分析的所有脑区中高水平的n-乙酰葡糖胺糖苷酶α水性(健康小鼠的50-100％)；在脑的最前部，活性达到健康动物中所观察到的水平。参见图6a。在经处理的mpsiiib小鼠的脑中，完全消除gag的过量贮积。参见图6b。当血清型9的aav载体被传递至csf中时，其渗漏至血流中，并转导至肝脏。参见haurigotetal,jclininvest2013；123(8):3254-71。与此一致的是，在经处理的mpsiiib小鼠的肝脏中检测到n-乙酰葡糖胺糖苷酶α的活性，其水平为健康动物的32％。参见图7a。n-乙酰葡糖胺糖苷酶α的活性的这种增加介导了肝脏、脾、心脏、肺、睾丸和膀胱中gag累积的校正，并且还显著地减少肾中gag的贮积。参见图7b。

实施例17：aav9-cag-cohnaglu的脑池内传递

将总剂量为9.3x10⁹的aav9-cag-cohnaglu载体的载体基因组注射至2个月龄的mpsiiib动物的小脑延髓池中，总量为5μl。

脑池内给予aav9-cag-cohnaglu载体导致所分析的所有脑区中的n-乙酰葡糖胺糖苷酶α活性水性(为健康值的22-45％)大幅升高。参见图8a。因此，在经处理的mpsiiib小鼠的所有脑区中，gag的病理学累积完全恢复。参见图8b。在经处理的mpsiiib小鼠的肝脏中，n-乙酰葡糖胺糖苷酶α活性也升高，达到健康动物的25％。参见图9a。n-乙酰葡糖胺糖苷酶α活性的这种升高介导了肝脏、心脏、肺和膀胱中gag累积的校正，并且还显著减少gag在脾、睾丸和肾中的贮积。参见图9b。

实施例18：质粒paav9-cag-cohnaglu-2型的水动力传递

将总剂量为50μg的带有表达盒的质粒paav9-cag-cohnaglu-2型通过鼠尾静脉的水动力注射给予2个月龄的mpsiiib小鼠，其中所述的表达盒包含人类n-乙酰葡糖胺糖苷酶α的优化形式(2型)。如上文提及，该技术将传递质粒的表达靶向于肝脏。参见liuetal，如上。

在质粒传递后一周，在接受水动力注射质粒的所有动物的肝脏和血清中，n-乙酰葡糖胺糖苷酶α活性增高超过处理前的水平，其中所述的质粒包含n-乙酰葡糖胺糖苷酶α编码序列的优化形式2型。参见图10a和10b。在注射生理盐水溶液的mpsiiib动物中，未检测到活性。在经处理的动物中，肝脏和血清的n-乙酰葡糖胺糖苷酶α活性分别达到在wt动物中所观察到的平均活性值(设定为100％)的150％和1500％。参见图10a和10b。

实施例19：质粒paav9-cag-cohnaglu-3型的水动力传递

将总剂量为50μg的质粒plasmidpaav9-cag-cohnaglu-3型通过鼠尾静脉的水动力注射给予2个月龄的mpsiiib小鼠，其中所述的质粒包含密码子优化形式(3型)的人类n-乙酰葡糖胺糖苷酶α表达盒。如上文提及，该技术将传递质粒的表达靶向于肝脏。参见liuetal，如上。

在质粒传递后一周，在给予带有表达盒的质粒的所有动物的肝脏和血清中，记录到n-乙酰葡糖胺糖苷酶α活性大幅升高，超过处理前的水平，其中所述的表达盒包含密码子优化的人类n-乙酰葡糖胺糖苷酶α编码序列的3型。参见图11a和11b。在注射生理盐水溶液的mpsiiib动物中，未检测到活性。在经处理的动物的肝脏和血清中所观察到的n-乙酰葡糖胺糖苷酶α活性水平分别相当于在wt动物的肝脏和血清中所测定的平均活性值(设定为100％)的170％和1100％。参见图11a和11b。

实施例20：aav9-cag-comnaglu的脑池内传递

将总剂量为3x10¹⁰的aav9-cag-comnaglu载体的载体基因组注射至2个月龄的mpsiiib动物的小脑延髓池中，总量为10μl。

在所分析的所有脑区中以及在骨髓中可以检测aav9载体基因组。在外周组织中，仅在肝脏中可以检测到相当大的基因拷贝数的载体基因组，而在其中头部切开引流(drain)的淋巴结(下颌淋巴结)中检测到较低的基因拷贝数。参见图12a-b。

csf内给予aav9-cag-comnaglu载体导致所分析的所有脑区中极高水平的n-乙酰葡糖胺糖苷酶α水性；达到比健康动物的所有区域中所观察到的活性水平高几倍的水平。参见图13a。在载体传递后3个月，在经处理的mpsiiib小鼠的脑中，如gag累积的归一化以及所分析的所有脑区中溶酶体标志物limp-2+的信号强度所示，疾病的溶酶体病理学特征得到恢复。参见图13b和14a。通过透射电子显微镜对枕叶皮质和小脑进行超微结构分析证明溶酶体病理学减少，其在皮质神经胶质细胞中是极明显的，所述的细胞在接受对照载体的mpsiiib动物中显示肿胀的且充满较大的贮积小泡，而所述的细胞在使用aav9-cag-comnaglu处理的动物中具有正常的外观。参见图14b。在lsd中，继发于正常溶酶体动态平衡的微扰，可以改变多种溶酶体酶(除了直接受到遗传突变影响的那些以外)的活性。参见sardielloetal,science.2009；325:473-477。在5个月龄的未处理的或无效处理的雄性mpsiiib小鼠的脑中，艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(ids),n-磺基葡萄糖胺磺基水解酶(sgsh),β-葡萄糖苷酸酶(gusb),andβ-氨基己糖苷酶(hexb)的活性显著升高。参见图14c。与在csf内传递aav9-cag-comnaglu载体后3个月所观察到的gag贮积减少一致的是，在经处理的动物中，脑sgsh、gusb和hexb的活性返回至健康野生型水平。参见图14c。

与溶酶体病理学校正一致的是，在经处理的mpsiiib小鼠的脑中，所有的炎症的迹象消失。用于检测星形细胞增生(gfap)和胶质细胞增生(bsi-b4)的染色的信号强度类似于经处理的mpsiiib小鼠和健康动物中的情况，这与未处理的mpsiiib小鼠中记录的信号相反，其中所述的未处理的mpsiiib小鼠显示神经性炎症的这些标志物的明显的上调节。参见图15a和15b。为了进一步评估csf内aav9-cag-comnaglu基因治疗对cns炎症的效力，使用微阵列平台进行对总rna(分离自wt以及aav9-cag-comnaglu或aav9-null-处理的mpsiiib脑髓)的基因表达概况的研究。在数据处理和过滤后，在所述的3组中，发现94个基因差异性的表达。当geneontology(go)富集分析用于分类由生物过程产生的差异性表达的基因时，使用相应的本体论注释94个基因中的67个基因。参见图15c。其中，绝大多数与以下方面有关：炎症和先天免疫力或可以有助于与这些过程有关的细胞的功能。参见图15c。为了证明这种观察，我们使用celltypeenrichment(cten)分析来评估不同细胞类型对所观察到的转录物水平的变化的帮助。该软件考虑如果软件定义的得分大于2，则特异性细胞类型富集。对小胶质细胞而言，得到我们数据组的最高得分(得分＝60)，其结果与有助于神经退行性疾病和mpsiii中的神经胶质细胞的重要作用一致。参见ohmietal,procnatlacadsciusa.2003；100:1902-1907,mcgeeretalalzheimerdisassocdisord.1998；12(suppl.2):s1-e16,dereckietal,nature.2012；484:105-109,dirosarioetal,jneuroscires.2009；87:978-990,archer,etal,jinheritmetabdis.2014；37:1-12。当评价aav9-cag-comnaglu载体的csf内传递的作用时，观察到基因表达概况相对于注射aav9-无效的动物的显著的改变。在载体给予后3个月，在经处理的mpsiiib小鼠中，绝大多数的基因具有类似于健康的同窝幼畜的转录物水平。在未处理的mpsiiib小鼠中差异性表达的几乎90％的基因均显示在aav9-cag-comnaglu处理后，它们的转录物水平校正至少50％，并且60％的基因校正为75％。当单独分析cten软件将其指定为神经胶质细胞的一组基因时，观察到转录物水平相似的或稍微高的归一化程度。参见图15d。该观察支持以下想法：神经胶质细胞很大程度形成了mpsiiib中所观察到的基因表达的概况，并且与经处理的动物中所记录的胶质细胞增生的完全逆转一致。

给予csf的aav载体渗漏至外周并转导至肝脏。参见图9和haurigotetal，如上。因此，在使用aav9-cag-comnaglu处理的mpsiiib小鼠的肝脏和血清中记录n-乙酰葡糖胺糖苷酶α活性增加，达到了在健康动物中所观察到的水平的大约800％。参见图16a和16b。血清中酶活性的水平与经处理的小鼠的肝脏中的活性水平良好地相关，表明肝脏是循环酶的主要来源。当通过不同器官中的gag含量的定量来评价治疗的身体效力时，在大部分的组织中观察到完全的归一化，包括肝脏、脾、心脏和肺(其中观察到gag减少>50％)，但是除了肾以外。参见图16c。在不同的试验组中，肝脏的超微结构分析显示贮积空泡完全消失，这是使用aav9-cag-comnaglu处理的mpsiiib小鼠的肝细胞得到的mpsiiib疾病的特征。参见图16d。如cns中所观察的那样，贮积材料由溶酶体间隔的清除导致其他溶酶体酶的活性的恢复。在未处理的或无效-处理的mpsiiib小鼠的肝脏中，α-艾杜糖苷酸酶(idua),艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(ids),sgsh,gusb和hexb的活性改变。参见图16e。在aav介导的naglu基因转移后3个月，所有这些酶的活性返回至正常水平，进一步支持以下概念：通过aav9-cag-comnaglu的naglu的csf基因转移还可以逆转外周器官中的疾病显型。参见图16e。

通过开场试验来评估csf内给予aav9-cag-comnaglu对行为的影响，其评价在未知环境中小鼠的一般运动和探索活性。在进入中心的潜力、时间、在边界的消耗、进入中心的数量、停留的时间、移动的总距离、穿越的线的数量，未处理的和aav-无效处理的mpsiiib小鼠展现处比健康小鼠降低的探索活性。脑池内给予aav9-cag-comnaglu完全校正行为缺陷。参见图17a-f。

此外，使用aav9-cag-comnaglu的处理会显著地延长mpsiiib小鼠的寿命。到15个月龄，所有的未处理的mpsiiib小鼠均死亡，而接受脑池内aav9-cag-comnaglu的100％的动物在18个月龄时仍存活。参见图17g。与aav9-无效的mpsiiib雄鼠的13.8个月的中位生存期相比，处理的mpsiiib雄鼠显示21个月的中位生存期，p＝0.0007。健康雄鼠的中位生存期为26.6个月。行为应答的归一化和经处理的mpsiiib小鼠的更长的生存期进一步证明aav9-gag-comnaglu的治疗效力。

实施例21：aav9-cag-cocnaglu向狗的脑池内传递

迈向基因治疗方法的临床应用的第一步需要证明其在大型动物模型中的可行性。我们之前证明在脑脊液内给予beagle狗(脑的尺寸接近人类脑尺寸的动物模型)时aav载体的分布与通过相同途径接受等剂量载体的小鼠中所观察的分布相似。参见haurigotetal，如上。简言之，给予编码报告蛋白质gfp的2x10¹³vgaav9载体证明细胞在脑、小脑、脑膜、脊髓和背根神经节中的广泛转导。与在小鼠中形成的观察类似，在beagle狗的肝脏中还检测到gfp，其中平均3.7％的肝细胞被转导。参见haurigotetal，如上。重要的是，csf内给予编码溶酶体酶硫酸胺酶(其缺陷导致mpsiiia)的aav9载体使得经处理的狗的csf的酶保持持续的水平。csf浸渍cns，使得所述的酶可以利用于不同的cns结构。事实上，重组酶周期性地传递至csf为目前临床研究下用于mpsiiia的治疗策略。参见nct01155778和ncto1299727,clinicaltrials.gov。

相同的方法已经用于说明根据本发明的aav9载体的潜在效力。

将总剂量6.5x10¹²vg的aav9-cag-cocnaglu载体给予4只beagle狗(狗1-4)的小脑延髓池中。为了评价现有的免疫力对n-乙酰葡糖胺糖苷酶α活性(可以通过所述的处理取得)的csf水平的影响，在csf传递前6周，通过系统性给予1x10¹¹vg/kg非编码的aav9-无效载体来免疫这些狗中的2只(狗3和狗4)。在进行脑池内给予载体时，天然的狗在循环和csf中具有较低效价的抗-aav9中和抗体(nab)，这可以由事先未暴露于野生型或重组病毒的动物而预计。相反，预免疫的狗在循环中具有较高的nab效价，但是在csf中具有低水平的效价，该观察与穿越血-脑屏障的nab的非系统性分布一致。参见图18a和haurigotetal，如上。向小脑延髓池给予aav9-cag-cocnaglu载体使得在得自所有4只狗的csf样品中测量的酶活性显著升高，并且与现有免疫力的存在或缺如不具有显著性差异。参加图18b。酶活性水平在第2周和第3周达到峰值，并且此后达到稳定状态的水平。重要的是，csf中n-乙酰葡糖胺糖苷酶α的活性的这种升高是长期的(>4个月)。参见图18b。

序列表

<110>埃斯蒂维实验室股份有限公司

巴塞罗那自治大学

<120>用于治疗溶酶体贮积症的腺伴随病毒载体

<130>pct2212.5

<150>ep14382171

<151>2014-05-14

<160>24

<170>patentin版本3.5

<210>1

<211>743

<212>prt

<213>智人

<400>1

metglualavalalavalalaalaalavalglyvalleuleuleuala

151015

glyalaglyglyalaalaglyaspglualaargglualaalaalaval

202530

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354045

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505560

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65707580

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115120125

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195200205

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210215220

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225230235240

valleuproalaphealaglyhisvalproglualavalthrargval

245250255

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290295300

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325330335

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340345350

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355360365

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435440445

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500505510

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530535540

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610615620

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705710715720

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725730735

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740

<210>2

<211>2232

<212>dna

<213>智人

<400>2

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tctttcgtgtggtgggactgggcccgctgggagcgagagatagactggatggcgctgaat480

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ctggctccggaagaccccatattccccatcatcgggagcctcttcctgcgagagctgatc900

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<210>3

<211>2232

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>cohnaglu核苷酸序列

<400>3

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<213>人工序列

<220>

<223>cag核苷酸序列

<400>4

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cggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgg646

<210>5

<211>8461

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<213>人工序列

<220>

<223>paav-cag-hnaglu核苷酸序列

<400>5

attacgccagctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcg60

ggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaa120

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