小分子增强胰腺内分泌细胞中的MAFA表达的用途的制作方法

本申请要求2014年5月16日提交的美国临时专利申请序列号61/994,259的权益，该申请全部内容据此以引用方式并入本文以用于所有目的。

技术领域

本发明涉及用于多能干细胞的分化的方法，以及由此产生的细胞和群体。具体地讲，本发明涉及某些小分子生成胰腺内分泌细胞和此类细胞群的用途，所述细胞和细胞群表现出增加的MAFA表达。

背景技术：

用于Ⅰ型糖尿病的细胞替代疗法的进展以及可移植胰岛的缺乏已使得人们把注意力集中在开发适于移植的胰岛素分泌细胞或β细胞的来源上。一种方法是由多能干细胞诸如胚胎干细胞生成功能性β细胞。

在脊椎动物胚胎发育中，多能细胞可在称为原肠胚形成的过程中产生包括三个胚层(外胚层、中胚层和内胚层)的细胞群。组织(诸如甲状腺、胸腺、胰腺、肠和肝脏)将从内胚层经由中间阶段发育而来。该过程中的中间阶段是定形内胚层的形成。

到原肠胚形成为止，内胚层划分成可通过一组因子的表达来识别的前-后结构域，所述因子唯一地标记内胚层的前、中和后区。例如，HHEX和SOX2识别内胚层的前区，而CDX1、CDX2和CDX4识别内胚层的后区。

内胚层组织的迁移使内胚层与不同的中胚层组织紧密接近，这有助于肠管的分区。这通过多种分泌因子，诸如成纤维细胞生长因子(“FGF”)、WNTS、转化生长因子β(“TGF-β”)、视黄酸、和骨形态发生蛋白质(“BMP”)配体以及它们的拮抗剂来实现。例如，FGF4和BMP促进预定后肠内胚层中的CDX2表达并阻遏前基因HHEX和SOX2的表达(2000Development,127:1563 1567)。还证明了WNT信号转导与FGF信号转导并存，能够促进后肠发育并控制前肠命运(2007Development,134:2207 2217)。最后，由间充质分泌的视黄酸调控前肠-后肠边界(2002Curr.Biol.,12:1215-1220)。

特异性转录因子的表达水平可用于指定组织的身份。在定形内胚层转化成原肠管的过程中，肠管变得分区成广泛结构域，所述广泛结构域可通过限制性基因表达模式在分子水平上进行观察。肠管中分区的胰腺域显示出PDX1具有极高表达，但CDX2和SOX2的表达却非常低。PDX1、NKX6.1/PTFlA和NKX2.2在胰腺组织中高度表达；而CDX2在肠组织中高度表达。

胰腺形成源于定形内胚层分化成胰腺内胚层。背侧和腹侧胰腺域产生自前肠上皮。前肠还会分化成食道、气管、肺、甲状腺、胃、肝和胆管系统。

胰腺内胚层细胞表达胰十二指肠同源盒基因PDX1。在不存在PDX1时，胰腺形成腹胰芽和背胰芽后不再发育。因而，PDX1表达标志着胰腺器官发生中的一个关键步骤。成熟胰腺由胰腺内胚层分化产生的外分泌组织和内分泌组织构成。

D’Amour等人描述了在高浓度活化素和低血清的存在下，产生人胚胎干细胞衍生的定形内胚层的富集培养物(Nature Biotechnology 2005,23:1534-1541；美国专利7,704,738)。将这些细胞移植在小鼠的肾包膜下导致分化成具有内胚层组织特征的更成熟的细胞(美国专利7,704,738)。在添加FGF-10和视黄酸后，这些衍生自人胚胎干细胞的定形内胚层细胞还可进一步分化成PDX1阳性细胞(美国专利申请公布2005/0266554)。这些胰腺前体细胞在免疫缺陷小鼠的脂肪垫中的后续移植导致在3-4个月成熟期后形成功能胰腺内分泌细胞(美国专利7,534,608和7,993,920)。

Fisk等人报道用于由人胚胎干细胞产生胰岛细胞的系统(美国专利7,033,831)。在这种情况下，分化途径分成三个阶段。人胚胎干细胞首先使用丁酸钠和活化素A的组合而分化成内胚层(美国专利7,326,572)。然后将这些细胞与结合有EGF或β-细胞素的BMP拮抗物(诸如头蛋白(Noggin))一起培养，以生成PDX1阳性细胞。用烟酰胺诱导终末分化。

一直以来，还使用小分子抑制剂来诱导胰腺内分泌前体细胞。例如，已使用TGF-β受体和BMP受体的小分子抑制剂(Development 2011,138:861-871；Diabetes 2011,60:239-247)来显著增加胰腺内分泌细胞的数量。另外，小分子活化剂也已用于生成定形内胚层细胞或胰腺前体细胞(Curr.Opin.Cell Biol.2009,21:727-732；Nature Chem.Biol.2009,5:258-265)。

HB9(也称为HlXB9和MNX1)是一种在胰腺发育早期表达的碱性螺旋-环-螺旋(“bHLH”)转录活化因子蛋白，其始于大约胚胎期第八天。在胚胎期的第十天半左右，HB9在胰腺上皮中表达PDX1和NKX6.1的细胞内瞬时表达，水平达到峰值。HB9表达在第十二天半左右开始衰退，且在后期，只局限于β细胞内。在HB9的无效突变的纯合子小鼠中，胰腺的背瓣无法发育(Nat.Genet.23:67-70,1999；Nat.Genet.23:71-75,1999)。HB9-细胞/β-细胞表达低水平的葡萄糖转运蛋白GLUT2和NKX6.1。此外，HB9-/-胰腺显示胰岛素阳性细胞数目明显减少，但这种细胞数目减少并未显著影响其它胰腺激素的表达水平。时序控制HB9对于β细胞正常发育并具有正常功能是至关重要的。虽然我们不太清楚有哪些因子调节HB9在β细胞中的表达，但近期用斑马鱼作的研究揭示，视黄酸可能对HB9表达有正向调节作用(Development,138,4597-4608,2011)。

在全文以引用方式并入本文的美国专利申请序列号13/998,883中，证明了三碘化钾腺氨酸(“T3”)在朝向β细胞分化细胞中可充当HB9蛋白质表达的诱导剂。本文还公开了使用T3和T4中的一者或两者生成对NKX6.1、PDX1和HB9呈阳性的胰腺内胚层细胞的方法。另外，并且如全文以引用方式并入本文的美国专利申请序列号13/998,884所述，证明了胰腺内分泌标志物的表达可通过在空气-液体界面处培养以及使用T3和活化素受体样激酶(“ALK”)5抑制剂来显著增强。

各种转录因子调节胰腺内分泌细胞向胰岛素分泌β细胞的分化。在这些因数中存在v-maf禽类肌肉腱膜纤维肉瘤癌基因同源物A(“MAFA”)。事实上，据信MAFA可为葡萄糖刺激的胰岛素分泌的β细胞中的主调节物。

一般来讲，祖细胞分化成功能性β细胞的过程经历多个阶段，并且对从祖细胞诸如人多能干细胞生成胰腺细胞的方案的改善已经取得了显著进展。虽然有这些研究进展，但是祖细胞分化过程中的每一步骤均提出独特的挑战。因此，为了产生功能性内分泌细胞，并且具体地讲，功能性β细胞的目的，仍存在对于进一步分化方案发展的需要。具体地讲，希望开发其中胰腺内分泌细胞中的MAFA的表达增强的方法。

附图说明

图1A至图1M为示出来自以下各项的基因表达的倍数变化的实时PCR分析的数据的图表：PDX1、NKX6.1、PAX4、PAX6、NGN3、MAFA、ABCC8、嗜铬粒蛋白-A、G6PC2、IAPP、胰岛素、胰高血糖素的未分化ES细胞以及来自根据实施例1分化的干细胞系H1的PTF1a。

图2A至图2C示出根据实施例1分化并且针对以下各项进行染色的第3阶段细胞的FACS分布图：图2A中用Ki67(Y轴)共染色的PDX1(X轴)；图2B中用CDX2(Y轴)共染色的PDX1(X轴)；以及图2C中的NKX6.1。

图3A至图3D示出根据实施例1分化并且针对以下各项进行染色的第4阶段细胞的FACS分布图：图3A中用NKX6.1(Y轴)共染色的嗜铬粒蛋白(X轴)；图3B中用Ki67(Y轴)共染色的PDX1(X轴)；图3C中用胰岛素(Y轴)共染色的NKX6.1(X轴)；以及图3D中的NeuroD1。

图4A至图4E示出根据实施例1分化并且针对以下各项进行染色的第5阶段细胞的FACS分布图：图4A中用NKX6.1(Y轴)共染色的嗜铬粒蛋白(X轴)；图4B中用Ki67(Y轴)共染色的PDX1(X轴)；和图4C中用胰岛素(Y轴)共染色的NKX6.1(X轴)；图4D中的NeuroD1；以及用胰高血糖素(Y轴)共染色的胰岛素(X轴)。

图5A至图5F示出根据实施例1分化并且针对以下各项进行染色的第6阶段细胞的FACS分布图：图5A中用NKX6.1(Y轴)共染色的嗜铬粒蛋白(X轴)；图5B中用Ki67(Y轴)共染色的PDX1(X轴)；和图5C中用胰岛素(Y轴)共染色的NKX6.1(X轴)；图5D中用Oct 3/4(Y轴)共染色的PAX6(X轴)；图5E中用胰高血糖素(Y轴)共染色的胰岛素(X轴)；以及图5F中的FOXA2。

图6A至图6F示出根据实施例1分化并且针对以下各项进行染色的第7阶段细胞的FACS分布图：图6A中用NKX6.1(Y轴)共染色的嗜铬粒蛋白(X轴)；图6B中用Ki67(Y轴)共染色的PDX1(X轴)；和图6C中用胰岛素(Y轴)共染色的NKX6.1(X轴)；图6D中用Oct 3/4(Y轴)共染色的PAX6(X轴)；图6E中用胰高血糖素(Y轴)共染色的胰岛素(X轴)；以及图6F中的FOXA2。

图7为来自根据实施例1分化的第3阶段至第7阶段的细胞的多个胰腺内胚层标志物(FOXA2、PDX1、NKX6.1)、未分化ES细胞标志物(Oct3/4)、内分泌标志物(PAX6、ISl-1、NKX2.2、嗜铬粒蛋白)、和激素(胰岛素、胰高血糖素)的百分比表达的图表。

图8A至图8E为示出来自分化细胞与在第6-第7阶段中用小分子处理之后的未分化细胞相比胰岛素和MAFA表达的倍数变化的实时PCR分析的数据的图表。

图9为示出来自实施例4的分化细胞与未分化细胞相比AXL和GAS6表达的倍数变化的实时PCR分析的数据的图表。

图10A至图10F为根据实施例6的来自分化细胞与在第7阶段中用小分子处理后的未分化细胞相比MAFA、UCN3、G6PC2、NKX6.1、PDX1和胰岛素表达的倍数变化的实时PCR分析的数据的图表。

图11A至图11D为示出根据实施例7的来自分化细胞与在第7阶段中用小分子处理后的未分化细胞相比MAFA、PDX1、NKX6.1和胰岛素表达的倍数变化的实时PCR分析的数据的图表。

具体实施方式

在结合附图阅读以下对本发明的详细说明时能够更好地进行理解。出于说明本发明的目的，附图展示了本发明的实施方案。然而，本发明并不限于示出的精确布置方式、实施例和手段。为了清晰说明本公开内容，以非限制性方式将本发明的具体实施方式分成描述或阐明本发明的某些特征、实施方案或应用方式的多个小节。

本发明涉及通过用某些小分子处理较不成熟的胰腺内分泌细胞来生成更成熟表型的胰腺内分泌细胞。在本发明的某些实施方案中，胰腺内分泌细胞在一个或多个阶段中在小分子的存在下培养，所述小分子是蛋白质甲基转移酶抑制剂、极光激酶抑制剂和p90核糖体S6激酶(“RSK”)抑制剂中的一种或多种。因此，本发明提供了用于将多能干细胞分化成表现出成熟表型的胰腺内分泌细胞特征的细胞的细胞培养物，以及引发和促进这种分化的分化培养基，和由分化产生的分化细胞和细胞群。本发明的方法提供了胰腺内分泌细胞群的形成，其中至少10％，优选地至少20％，更优选地至少30％，以及最优选地至少50％的细胞表达单激素胰岛素并且是PDX1、NKX6.1和MAFA阳性的。

有利地且优选地，本发明的细胞培养物和分化培养基可与在空气-液体界面处的分化结合使用。培养可在从多能干细胞至成熟表型的胰腺内分泌细胞的分化途径中所涉及的所有阶段在空气-液体界面处发生，或培养可涉及在分化的早期阶段在浸没于培养基中的平坦培养物上培养，然后在分化的后期阶段的一个或多个期间在空气-液体界面处培养。更优选地，本发明的过程涉及早期阶段期间在浸没于培养基中的支撑表面上培养多能干细胞和随后在分化的后期阶段在空气-液体界面处培养的组合。在此类实施方案中，可将所述细胞初始接种在固体表面上以进行浸没培养，随后将细胞从所述固体支承体去除并且重新接种到多孔支承体上以进行在空气-液体界面处的培养。另选地，可将所述细胞初始接种在多孔支承体上，随后在分化的早期阶段将该支承体浸没于培养基中，并且随后在分化的后期阶段将该支承体定位在空气-液体界面处。

在又一个实施方案中，在一个或多个阶段的分化也在T3、T4、它们的类似物中的一种或多种的存在下，并且任选但优选地用活化素受体样激酶5(“ALK 5”)抑制剂进行。在优选的实施方案中，将胰腺内胚层/内分泌前体细胞的群体在含有T3、T4、其类似物中的一种或多种和ALK5抑制剂的培养基中培养成胰腺内分泌细胞。在更优选的实施方案中，所得胰腺内分泌细胞在含有T3、T4、其类似物中的一种或多种和ALK5抑制剂的培养基的存在下进一步分化。

本发明具体发现，用ALK5抑制剂和甲状腺受体激动剂中的一种或多种的组合处理胰腺内胚层细胞，随后将所得胰腺内分泌细胞与蛋白质甲基转移酶DOT1L的抑制剂，极光激酶抑制剂和RSK抑制剂中的一种或多种组合培养显着提高表达单激素胰岛素、MAFA、PDX1和NKX6.1的群体中的细胞的数量，以及增加细胞中MAFA表达的水平。本发明在与空气-液体界面处的分化结合使用时特别有用。

定义

干细胞是通过其在单细胞水平上既自我更新又分化的能力来定义的未分化细胞。干细胞可产生子代细胞，包括自我更新祖细胞、非更新祖细胞和终末分化细胞。干细胞的特征还在于其在体外分化成来自多个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的多种细胞谱系的功能细胞的能力。干细胞还在移植后产生多种胚层的组织，并且在注射到胚泡内之后，促成基本上至大部分(如果不是所有的话)组织。

干细胞是根据其发育潜能分类的。多能干细胞能够产生所有胚胎细胞类型。

分化是未特化的(“未定向的”)或特化不足的细胞获得特化细胞(例如神经细胞或肌肉细胞)的特征的过程。分化细胞是已在细胞谱系中占据更特化的(“定向的”)位置的细胞。当应用于分化过程时，术语“定向的”是指已经在分化途径中进行到一定程度的细胞，其中在正常情况下，该细胞将继续分化成特定的细胞类型或一个亚群的细胞类型，并且在正常情况下，不能分化成不同的细胞类型或回复至分化程度更低的细胞类型。“去分化”指细胞回复到细胞的谱系当中特化(或定向)程度较低的地位的过程。如本文所用，“细胞谱系”限定细胞的遗传，即它来自哪些细胞和它能产生什么细胞。细胞谱系将细胞定位于发育和分化的遗传方案内。谱系特异性标志物指与所关注谱系的细胞的表型明确相关的特征，并且可用来评估未定向细胞向所关注谱系的分化。

如本文所用，“标志物”是在所关注的细胞中差异表达的核酸或多肽分子。在该上下文中，差异表达意指与未分化细胞或在分化的另一阶段处的细胞相比阳性标志物的水平升高并且阴性标志物的水平下降。与其它细胞相比，标志物核酸或多肽在所关注细胞中的可检测水平充分地较高或较低，使得可使用本领域已知的多种方法中的任何一种将所关注细胞与其它细胞鉴别和区分开来。

如本文所用，当在细胞中充分地检测到特定标志物时，细胞“对于特定标志物是阳性的”，“阳性的”或是“+”。相似地，当在细胞中未充分检测到特定标志物时，细胞“对于特定标志物是阴性的”、“阴性的”或是“”。具体地讲，通过荧光活化细胞分选细胞术(“FACS”)检测到的阳性通常大于2％，而通过FACS检测到的阴性阈值通常小于约1％。通过聚合酶链反应细胞术(“PCR”)检测到的阳性通常小于或等于约30个循环(Cts)；而通过PCR检测到的阴性通常大于约31个循环。

尝试着在静态体外细胞培养物中将多能干细胞的分化过程复制到功能性胰腺内分泌细胞中时，通常将该分化过程视为通过多个连续阶段累进。具体地，该分化过程常被视为通过多个阶段循序累进。在这种分步进行的分化中，“第1阶段”是指分化过程的第一步骤，多能干细胞分化为表达定形内胚层的特征性标志物的细胞(“第1阶段细胞”)。“第2阶段”是指第二步骤，表达定形内胚层细胞的特征性标志物的细胞分化为表达肠管细胞的特征性标志物的细胞(“第2阶段细胞”)。“第3阶段”是指第三步骤，表达肠管细胞的特征性标志物的细胞分化为表达前肠内胚层细胞的特征性标志物的细胞(“第3阶段细胞”)。“第4阶段”是指第四步骤，表达前肠内胚层细胞的特征性标志物的细胞分化为表达胰腺前肠前体细胞的特征性标志物的细胞(“第4阶段细胞”)。“第5阶段”是指第五步骤，表达胰腺前肠前体细胞的特征性标志物的细胞分化为表达胰腺内胚层细胞和胰腺内分泌前体细胞中的一者或两者的特征性标志物的细胞(统称为“第5阶段细胞”，或者“胰腺内胚层/内分泌前体细胞”)。“第6阶段”是指第六步骤，表达胰腺内胚层/内分泌前体细胞的特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内分泌细胞(为不成熟的β细胞)的特征性标志物的细胞(“第6阶段细胞”)。第6阶段细胞表达单激素胰岛素并且是PDX1、NKX6.1和嗜铬粒蛋白阳性的。在产生本发明的细胞的群体的过程中并且为了产生本发明的细胞的群体的目的，使用第七步骤，“第7阶段”，并且其是指表达是未成熟β细胞的胰腺内分泌细胞的特征性标志物的细胞分化成表达是成熟β细胞并且与第6阶段细胞相比具有更成熟表型的胰腺内分泌细胞的特征性标志物的细胞。所谓“第7阶段细胞”或“第7阶段细胞”意指是单激素胰岛素+、MAFA+、NKX6.1+和PDX1+，但是也以比未成熟β细胞高的水平表达MAFA的胰腺内分泌细胞。另外，与第6阶段的细胞的群体相比，从进行第7阶段得到的细胞群具有更高百分比的MAFA阳性和单激素胰岛素表达细胞。

应当注意在特定群体过程中并非所有细胞都以相同的速率经历这些阶段。因此，在体外细胞培养物中检测到存在这样的细胞，其比存在于细胞群中的大多数细胞在分化途径中进程靠前或靠后的情况并不少见，尤其在处于后期分化阶段的培养物中。例如，在细胞培养物处于第5阶段期间，不时能观察到有胰腺内分泌细胞的特征性标志物出现。出于举例说明本发明的目的，本文描述了与上文定义的各阶段相关联的各种细胞类型的特征。

如本文所用，“定形内胚层”是指具有在原肠胚形成过程中从上胚层产生的细胞的特性并形成胃肠道及其衍生物的细胞。定形内胚层细胞表达以下标志物中的至少一种：FOXA2(也称为肝细胞核因子3-β(“HNF3-β”))、GATA4、SOX17、CXCR4、Brachyury、Cerberus、OTX2、goosecoid、C-Kit、CD99和MIXL1。定形内胚层细胞的特征性标志物为CXCR4、FOXA2和SOX17。因此，定形内胚层细胞可通过其对CXCR4、FOXA2和SOX17的表达来表征。此外，取决于细胞能保持在第1阶段的时长，可能观察到HNF4α增多。

如本文所用，“肠管细胞”是指源于定形内胚层的细胞，并且所述细胞可产生所有的内胚层器官，诸如肺、肝、胰腺、胃和肠。肠管细胞的特征可在于其中的HNF4α表达较之定形内胚层细胞表达的HNF4α表达大幅提高。例如，在第2阶段期间，可能观察到HNF4α在mRNA中的表达增大到之前的十到四十倍。

如本文所用，“前肠内胚层细胞”是指产生食道、肺、胃、肝、胰腺、胆囊和一部分十二指肠的细胞。前肠内胚层细胞表达下列标志物中的至少一种：PDX1、FOXA2、CDX2、SOX2和HNF4α。前肠内胚层细胞的特征可在于与肠管细胞相比，PDX1表达提高。例如，超过百分之五十的第3阶段培养物的细胞通常表达PDX1。

如本文所用，“胰腺前肠前体细胞”是指表达下列标志物中的至少一种的细胞：PDX1、NKX6.1、HNF6、NGN3、SOX9、PAX4、PAX6、ISL1、胃泌素、FOXA2、PTF1a、PROX1和HNF4α。胰腺前肠前体细胞的特征可在于PDX1、NKX6.1和SOX9中的至少一种的表达为阳性。

如本文所用，“胰腺内胚层细胞”是指表达下列标志物中的至少一种的细胞：PDX1、NKX6.1、HNF1β、PTF1α、HNF6、HNF4α、SOX9、NGN3、胃泌素、HB9或PROX1。胰腺内胚层细胞的特征可在于没有CDX2和SOX2大量表达。

如本文所用，“胰腺内分泌前体细胞”是指能够变成胰腺激素表达细胞的胰腺内胚层细胞。胰腺内分泌前体细胞表达以下标志物中的至少一种：NGN3、NKX2.2、NeuroD11、ISL1、PAX4、PAX6、或ARX。胰腺内分泌前体细胞的特征可在于其表达NKX2.2和NeuroD11。

如本文所用，“胰腺内分泌细胞”指能够表达下列激素中的至少一种的细胞：胰岛素、胰高血糖素、生长抑素、生长素释放肽和胰多肽。除了这些激素以外，胰腺内分泌细胞的特征性标志物还包括以下中的一种或多种：NeuroD1、ISL1、PDX1、NKX6.1、ARX、NKX2.2、HB9和PAX6。胰腺内分泌细胞的一个亚群是“未成熟β细胞”，其是能够表达胰岛素，但不表达胰高血糖素、生长抑素、生长素释放肽和胰多肽的细胞。此外，未成熟β细胞的特征性标志物还包括以下中的一种或多种：NeuroD1、ISL1、PDX1、NKX6.1、NKX2.2、HB9和PAX6。胰腺内分泌细胞的第二亚群是“成熟β细胞”，其是能够表达胰岛素，但不表达胰高血糖素、生长抑素、生长素释放肽和胰多肽的细胞。另外，成熟β细胞的特征性标志物还包括以下中的一种或多种：NeuroD1、ISL1、PDX1、NKX6.1、NKX2.2、HB9、PAX6和MAFA。胰腺内分泌细胞的又一个亚群是表达成熟β细胞的特征性标志物的那些细胞，并且其特征在于其表达PDX1、NKX2.2、NKX6.1、NeuroD1、ISL1、HNF3β、HB9、MAFA和PAX6连同响应于与较不成熟的β细胞相比较强且增加的葡萄糖负荷的胰岛素释放。

如本文所用，“空气-液体界面”或“ALI”是指存在于开放培养容器或部分填充有培养基的培养容器中的空气-液体界面。虽然为了方便起见而在本文中称作“空气”，但是本发明不限于在周围环境中存在的气体和组合物的混合物。本发明具体地设想和包括具有与周围环境不同的组合物的气态混合物，包括例如富含特定组分或其中特定组分已经被耗尽或消除的混合物。

“d1”、“1d”和“第一天”，“d2”、“2d”和“第二天”等在本文中可互换使用。这些数字字母组合是指在本专利申请的分步分化方案过程中的不同阶段中温育的具体天数。

“LDN-193189”是指((6-(4-(2-(哌啶-1-基)乙氧基)苯基)-3-(吡啶-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶盐酸盐))，它是一种可得自Shanghai ChemPartner,Co.,LTD的BMP受体抑制剂。

多能干细胞的表征、来源、扩增和培养

A.多能干细胞的表征

多能干细胞可表达指定的TRA-1-60和TRA-1-81抗体(Thomson等人，1998，Science 282:1145-1147)中的一种或多种。多能干细胞在体外的分化导致TRA-1-60和TRA-1-81丧失表达。未分化的多能干细胞通常具有碱性磷酸酶活性，所述碱性磷酸酶活性可通过用4％多聚甲醛固定细胞，然后用以商标Red出售的碱性磷酸酶底物试剂盒显色来检测，如由制造商(Vector Laboratories,Inc.,Burlingame,California)描述的。未分化的多能干细胞通常也表达OCT4和TERT，这通过逆转录聚合酶链反应(“RT-PCR”)检测。

增殖的多能干细胞的另一期望表型具有分化成所有三个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的细胞的潜能。可以例如通过如下方式来确认干细胞的多能性：将细胞注射入重症联合免疫缺陷(“SCID”)小鼠，使用4％的多聚甲醛固定形成的畸胎瘤，然后针对来自该三个胚层的细胞类型的证据进行组织学检测。另选地，可以通过产生胚状体并评估胚状体中与三个胚层相关的标志物的存在来确定多能性。

增殖的多能干细胞系可用标准G显带技术进行核型分析并与公开的相应灵长类物种的核型相比较。期望获得具有“正常核型”(其意指细胞是整倍体的)的细胞，其中所有人染色体都存在并且无明显的改变。

B.多能干细胞的来源

任何多能干细胞均可用于本发明的方法中。可使用的多能干细胞的示例性类型包括建立的多能细胞系，包括在妊娠期间的任何时间取得的胚胎前组织(诸如胚泡)、胚胎组织或胎儿组织，所述时间通常但不一定是在约10至12周妊娠前。非限制性的示例是已确立的人胚胎干细胞(“hESCs”)系或人胚胎生殖细胞系，诸如人胚胎干细胞系H1(NIH代码：WA01)，H7(NIH代码：WA07)，H9(NIH代码：WA09)(WiCell Research Institute,Madison,WI,USA)，以及SA002(Cellartis AB Corporation,Goteburg,Sweden)。

取自在没有饲养细胞的情况下培养过的多能干细胞群的细胞也是合适的选择。还可使用诱导多能细胞(IPS)或重新编程的多能细胞，其可使用多种多能相关的转录因子的被迫表达而来源于成人体细胞，所述转录因子诸如OCT4、NANOG、SOX2、KLF4和ZFP42(Annu Rev Genomics Hum Genet 2011,12:165-185)；还参见IPS,Cell,126(4):663-676)。在本发明的方法中使用的人胚胎干细胞也可如按Thomson等人(美国专利5,843,780；Science,1998,282:1145-1147；Curr Top Dev Biol 1998,38:133-165；Proc Natl Acad Sci U.S.A.1995,92:7844-7848)所述制备。也可使用突变的人胚胎干细胞系，诸如BG01v(BresaGen,Athens,Georgia.)，或衍生自成人体细胞的那些细胞，诸如Takahashi等人在Cell 131:1-12(2007)公开的那些细胞。在某些实施方案中，适用于本发明的多能干细胞可根据以下文献中描述的方法获得：Li等人(Cell Stem Cell 4:16-19,2009)；Maherali等人(Cell Stem Cell 1:55-70,2007)；Stadtfeld等人(Cell Stem Cell 2:230-240)；Nakagawa等人(Nature Biotechnol 26:101-106,2008)；Takahashi等人(Cell 131:861-872,2007)；以及美国专利申请公布2011/0104805。在某些实施方案中，适用于本发明的多能干细胞可被认为是“初始的”并且根据以下文献中描述的方法获得：Gafni等人(Nature,504:282,2013)，以及Ware等人(PNAS,111:4484 4489,2014)。所有这些参考文献、专利和专利申请全文以引用方式并入本文，尤其是它们与多能细胞的分离、培养、扩增和分化有关的内容。

多能干细胞的其它来源包括诱导的多能干细胞(IPS,Cell,126(4):663-676)。合适细胞的又一个来源包括人脐带组织衍生的细胞、人羊水衍生的细胞、人胎盘衍生的细胞，以及人孤雌生殖体。在一个实施方案中，脐带组织衍生的细胞可通过美国专利7,510,873的方法获得。在另一个实施方案中，胎盘组织衍生的细胞可使用美国专利申请公布2005/0058631的方法获得。在另一个实施方案中，羊水衍生的细胞可使用美国专利申请公布2007/0122903获得。这些专利申请中的每个的公开内容由于涉及细胞的分离和表征而全文以引用方式并入本文。在某些实施方案中，多能干细胞可能是非胚胎来源的。

C.多能干细胞的扩增和培养

通常在饲养细胞层上培养多能干细胞，饲养细胞可以多种方式支持多能干细胞。另选地，可在培养系统中培养多能干细胞，所述培养系统基本上不含饲养细胞，但支持多能干细胞的增殖而不会经历基本的分化。通常使用通过此前用另一细胞类型培养而调理过的培养基来支持多能干细胞在无饲养细胞的培养物中生长而不分化。另选地，可用化学限定的培养基来支持多能干细胞在无饲养细胞的培养物中生长而不分化。

多能细胞在培养物中可使用多种饲养层或通过使用基质蛋白质涂覆的容器容易地扩增。另选地，与限定的培养基诸如以商标1出售的培养基(StemCell Technologies,Inc.,Vancouver,B.C.,Canada)组合的化学限定的表面可用于细胞的常规扩增。多能细胞可使用酶促消化、机械分离或使用多种钙螯合剂诸如乙二胺四乙酸(“EDTA”)容易地从培养皿中取出。另选地，多能细胞可在不存在任何基质蛋白质或饲养层的情况下悬浮扩增。

在受权利要求保护的本发明中可使用多种不同的扩增和培养多能干细胞的已知方法。例如，本发明的方法可以使用Reubinoff等人、Thompson等人、Richards等人的方法，以及美国专利申请公布2002/0072117的方法。Reubinoff等人(Nature Biotechnology 18:399-404(2000))和Thompson等人(Science 282:1145-1147(1998))公开了用小鼠胚胎成纤维细胞饲养细胞层培养来自人胚泡的多能干细胞系。Richards等人(Stem Cells 21:546-556,2003)评估了一组十一种不同的成人、胎儿和新生儿饲养细胞层在支持人多能干细胞培养方面的能力，指出“在成人皮肤成纤维细胞饲养细胞上培养的人胚胎干细胞系保持人胚胎干细胞形态并保留了多能性”。美国专利申请公布2002/0072117公开了产生支持灵长类多能干细胞在无饲养细胞的培养物中生长的培养基的细胞系。所采用的细胞系是从胚胎组织获得或从胚胎干细胞分化而来的间质细胞系和成纤维细胞样细胞系。美国专利申请公布2002/072117还公开了上述细胞系作为原代饲养细胞层的用途。

扩增和培养多能干细胞的其它合适的已知方法公开于例如Wang等人、Stojkovic等人、Miyamoo等人和Amit等人的文献中。Wang等人(Stem Cells 23:1221-1227,2005)公开了用于在源自人胚胎干细胞的饲养细胞层上长期培育人多能干细胞的方法。Stojkovic等人(Stem Cells 2005 23:306-314,2005)公开了一种源自人胚胎干细胞的自发分化的饲养细胞系统。Miyamoto等人(Stem Cells 22:433-440,2004)公开了从人胎盘获得的饲养细胞源。Amit等人(Biol.Reprod 68:2150-2156,2003)公开了源自人包皮的饲养细胞层。

扩增和培养多能干细胞的其它合适方法公开于例如Inzunza等人的文献、美国专利6,642,048、WO 2005/014799、Xu等人的文献和美国专利申请公布2007/0010011中。Inzunza等人(Stem Cells 23:544-549,2005)公开了来自人出生后包皮成纤维细胞的饲养细胞层。美国专利6,642,048公开了可支持灵长类多能干细胞在无饲养细胞的培养物中生长的培养基以及可用于产生这种培养基的细胞系。美国专利6,642,048报道了从胚胎组织获得或从胚胎干细胞分化而来的间质细胞系和成纤维细胞样细胞系，以及用于获得此类细胞系、处理培养基，和使用这种培养基使干细胞生长的方法。WO 2005/014799公开了一种用于维持哺乳动物细胞，促进哺乳动物细胞增殖和分化的经调理的培养基。WO 2005/014799报道了通过鼠细胞、尤其是那些分化并永生化的转基因肝细胞(称为MMH(Met鼠肝细胞))的细胞分泌活性对根据本发明制备的培养基进行调理。Xu等人(Stem Cells 22:972-980,2004)公开了一种从人胚胎干细胞衍生物获得的经调理的培养基，这些人胚胎干细胞衍生物已经过遗传修饰，以过表达人端粒酶逆转录酶。美国专利申请公布2007/0010011公开了一种用于维持多能干细胞的化学限定的培养基。

已知的另选培养系统采用补充有能促进胚胎干细胞增殖的生长因子的无血清培养基。此类培养系统的示例包括但不限于Cheon等人、Levenstein等人和美国专利申请公布2005/0148070中公开的那些。Cheon等人(BioReprod DOI:10.1095/biolreprod.105.046870，2005年10月19日)公开了无饲养细胞的无血清培养系统，其中胚胎干细胞维持在补充有能引发胚胎干细胞自我更新的不同生长因子的未经调理的血清替代培养基中。Levenstein等人(Stem Cells 24:568-574,2006)公开了使用补充有bFGF的培养基，在不存在成纤维细胞或经调理的培养基的情况下长期培养人胚胎干细胞的方法。美国专利申请公布2005/0148070公开了在无血清且无成纤维细胞饲养细胞的限定的培养基中培养人胚胎干细胞的方法，该方法包括：在含有白蛋白、氨基酸、维生素、矿物质、至少一种转铁蛋白或转铁蛋白替代品、至少一种胰岛素或胰岛素替代品的培养基中培养干细胞，该培养基基本上无哺乳动物胎血清且含有至少约100ng/ml的能够对成纤维细胞生长因子信号转导受体进行活化的成纤维细胞生长因子，其中该生长因子的供给来源不是仅为成纤维细胞饲养层，该培养基支持干细胞在无饲养细胞或经调理的培养基的情况下以未分化状态增殖。

培养并扩增多能干细胞的另外已知的合适方法在美国专利申请公布2005/0233446、美国专利6,800,480、美国专利申请公布2005/0244962和WO 2005/065354中有所公开美国专利申请公布2005/0233446公开了一种可用于培养干细胞的限定的培养基，所述干细胞包括未分化的灵长类原始干细胞。在溶液中，此培养基与培养的干细胞相比基本上是等渗的。在给定的培养物中，特定的培养基为基础培养基以及一定量的bFGF、胰岛素和抗坏血酸中的每一种，所述一定量的bFGF、胰岛素和抗坏血酸中的每一种为支持原始干细胞基本上以未分化状态生长所必需的。美国专利6,800,480报道称，提供了一种以大体上未分化状态培养灵长类来源的原始干细胞的细胞培养基，这种培养基包括渗透压低且内毒素含量小的基础培养基，该基础培养基可有效支持灵长类来源的原始干细胞生长。专利6,800,480的公开内容还报道，该基础培养基混合了能有效支持灵长类来源的原始干细胞生长的营养血清，和选自饲养细胞和衍生自饲养细胞的胞外基质组分的基质。还应注意，该基础培养基还包含非必需氨基酸、抗氧化剂，和选自核苷和丙酮酸盐的第一生长因子。美国专利申请公布2005/0244962报道，其公开内容的一个方面提供了一种培养灵长类胚胎干细胞的方法；这种干细胞在基本上不含哺乳动物胎儿血清(优选也基本上不含任何动物血清)的培养物中，且在存在由不只是成纤维细胞饲养层的来源提供的成纤维细胞生长因子的情况下培养。

WO 2005/065354公开了限定的等渗培养基，该培养基基本上不含饲养细胞且不含血清，其为基础培养基、bFGF、胰岛素和抗坏血酸，所述基础培养基、bFGF、胰岛素和抗坏血酸的量足以支持基本上未分化的哺乳动物干细胞的生长。此外，WO 2005/086845公开了一种用于维持未分化的干细胞的方法，所述方法包括使干细胞暴露于转化生长因子-β(“TGF-β”)蛋白家族的成员、成纤维细胞生长因子(“FGF”)蛋白家族的成员或烟酰胺，所述成员或烟酰胺的量足以维持所述细胞处于未分化状态达足以实现所需结果的一段时间。

可将多能干细胞接种到合适的培养基质上。在一个实施方案中，合适的培养基质是细胞外基质组分，诸如衍生自基底膜或可形成粘附分子受体-配体偶联物的一部分的那些。一种合适的培养基质是以商标MATRIGEL^TM(Corning Incorporated,Corning,New York)出售的重构基底膜。MATRIGEL^TM是来自Engelbreth-Holm Swarm肿瘤细胞的可溶性制剂，其在室温下胶凝形成重构的基底膜。

在本领域中已知的其它细胞外基质组分和组分混合物适合作为替代物。取决于所扩增的细胞类型，这些替代物可包括单独的层粘连蛋白、纤连蛋白、蛋白聚糖、巢蛋白、硫酸肝素等，或者这些物质的各种组合。

可在存在促进细胞存活、增殖和保持期望特性的培养基的情况下，以合适的分布将多能干细胞接种于所述基质上。所有这些特性可得益于对接种分布的认真考虑并可由本领域技术人员轻松确定。合适的培养基可用以下组分制备：杜尔贝科改良伊格尔培养基(“DMEM”)，由Life Technologies Corporation,Grand Island New York以商标(目录号11965-092)出售；敲除的杜尔贝科改良伊格尔培养基(“KO DMEM”)，由Life Technologies Corporation以商标(目录号10829-018)出售；Ham的F12/50％DMEM基础培养基；200mM的L-谷氨酰胺，由Life Technologies以商标(目录号25030-081)出售；非必需氨基酸溶液，由Life Technologies以商标(目录号11140-050)出售；β-巯基乙醇，Sigma-Aldrich Company,LLC Saint Louis,MO，(目录号M7522)；人重组碱性成纤维细胞生长因子(“bFGF”)，由Life Technologies以商标(目录号13256-029)出售。

人胚胎干细胞的大规模扩增和受控分化过程也可使用悬浮生物反应器来实现。这样的系统能够在受控培养系统中生成具有更大功效的临床相关的细胞数。已知使用允许多能的鼠和hES细胞的扩增的已建立生物反应器培养系统，例如如Journal of Biotechnology，2014年5月，第178卷，第54-64页；Stem Cell Reports，2014年4月，第3卷，第6期，第1132页；以及Tissue Engineering Part C:Methods，2013年2月，第19卷，第2期，第166-180页中所公开。

多能干细胞的分化

当多能细胞向β细胞分化时，它们经多个阶段分化，每一阶段的特征可在于其中有无特定标志物存在。细胞分化至这些阶段是通过特定培养条件实现的，所述培养条件包括存在和缺乏添加至培养基中的某些因子。一般来讲，这种分化可涉及多能干细胞分化成定形内胚层谱系和定形内胚层细胞。这些细胞随后可进一步分化成肠管细胞，这些肠管细胞可继而分化成前肠内胚层细胞。前肠内胚层细胞可分化成胰腺前肠前体细胞，该胰腺前肠前体细胞然后可进一步分化成胰腺内胚层细胞、胰腺内分泌前体细胞，或胰腺内胚层细胞和胰腺内分泌前体细胞两者。这些细胞可分化成产生或分泌胰腺激素的细胞。本申请通过以下步骤提供多能干细胞向胰腺内分泌细胞的分阶段分化：优选地在部分填充有培养基的培养容器中存在的空气-液体界面处培养细胞，具体地在第5阶段至第7阶段中的一个或多个中在空气-液体界面处培养细胞。

单独或与ALK 5抑制剂进一步组合的甲状腺激素三碘甲腺原氨酸(“T3”)和甲状腺素(“T4”)及其类似物中的一种或多种可用于在分化的第1阶段至第7阶段中的一个或多个处，并且优选地在第5阶段至第7阶段中的每个处的细胞培养。另选地，ALK 5抑制剂可在分化的一个或多个阶段中，但是优选地在第5阶段至第7阶段中的每个阶段处单独使用。更优选地，甲状腺激素或其类似物和ALK 5抑制剂中的一种或多种用于一个或多个分化阶段中，优选地在第5阶段至第7阶段中的每个阶段处。合适的甲状腺激素类似物可包括但不限于：GC-1(Sobertirome)(可得自R&D Systems,Inc.Minneapolis,Minnesota)；3,5-二碘丙酸(“DIPTA”)；J.Steroid Biochem.Mol.Biol.,2008,111:262-267和Proc.Natl.Acad.Sci.US 2003,100:10067-10072中讨论的KB-141；Proc.Natl.Acad.Sci.US 2007,104:15490-15495中讨论的MB07344；J.Lipid Res.，2009年5月，第50卷，第938页和Endocr.Pract.2012,18(6):954-964中讨论的T0681，所述文献的公开内容全文以引用方式并入本文中。可用的ALK5抑制剂包括：ALK5抑制剂II(Enzo Life Sciences,Inc.,Farmingdale,New York)，其也为优选的ALK5抑制剂；ALK5i(Axxora,Inc.,San Diego,California)，SD208(R&D Systems)；TGF-β抑制剂SB431542(Xcess Biosciences,Inc.,San Diego,California)；ITD-1(Xcess Biosciences)；LY2109761(Xcess Biosciences)；A83-01(Xcess Biosciences)；LY2157299(Xcess Biosciences)；TGF-β受体抑制剂V(EMD Millipore Chemical,Gibstown,New Jersey)；TGF-β受体抑制剂I(EMD Millipore)；TGF-β受体抑制剂IV(EMD Millipore)；TGF-β受体抑制剂VII(EMD Millipore)；TGF-β受体抑制剂VIII(EMD Millipore)；TGF-β受体抑制剂II(EMD Millipore)；TGF-β受体抑制剂VI(EMD Millipore)；以及TGF-β受体抑制剂VI(EMD Millipore)。

此外，在本发明的优选实施方案中，该方法包括在一个或多个阶段处理细胞，但优选在第7阶段期间用分化培养基处理细胞，所述分化培养基包含抗氧化剂诸如维生素E、乙酰半胱氨酸、维生素C、抗氧化剂补充剂(目录号A1345，Sigma-Aldrich Company,LLC Saint Louis,Missouri)、谷胱甘肽、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶等及其组合中的一者或两者。在另外更优选的实施方案中，在进行第6阶段中，使用γ分泌酶抑制剂，其可为γ分泌酶抑制剂XX(EMD Millipore)，γ分泌酶抑制剂XXI(EMD Millipore)，γ分泌酶抑制剂XVI(EMD Millipore)，N-[(3,5-二氟苯基)乙酰基]-L-丙氨酰基-2-苯基]甘氨酸-1,1-二甲基乙酯(“DAPT”)(目录号2634，Tocris Bioscience,Bristol,United Kingdom)等，以及它们的组合。γ分泌酶抑制剂的可用量可为约50nM至5000nM，优选地为约50nM至500nM。抗氧化剂的量可为约0.1μM至100μM，或者约0.1μM至20μM，并且优选地为约1μM至10μM。另选地，抗氧化剂的可用量可为约100nM至5mM，约1000nM至2mM，并且优选地为约0.1mM至1mM。

在本发明的最优选实施方案中，某些小分子用于分化的一个或多个阶段的培养基中，优选地在第6阶段和第7阶段中的一个或两个处。感兴趣的小分子是能够抑制极光激酶、p90核糖体S6激酶或甲基转移酶DOT1L的那些，并且优选地连同减小培养细胞的氧化应激的抗氧化剂一起使用。可用的此类抑制剂包括极光激酶抑制剂II(4-(4'-苯甲酰氨基苯胺基)-6,7-二甲氧基喹唑啉)、SNS 314甲磺酸盐(N-(3-氯苯基)-N'-[5-[2-(噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基氨基)乙基]-2-噻唑基]脲甲磺酸盐)、GSK1070916(3-(4-(4-(2-(3-((二甲基氨基)甲基)苯基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)-1-乙基-1H-吡唑-3-基)苯基)-1,1-二甲基脲)、TAK-901(5-(3-(乙基磺酰基)苯基)-3,8-二甲基-N-(1-甲基哌啶-4-基)-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚-7-甲酰胺)、RSK抑制剂II(二氢蝶啶酮2-(3,5-二氟-4-羟基-苯胺基)-8-异戊基-5,7-二甲基-7H-蝶啶-6-酮的外消旋混合物)、和EPZ-5676(9H-嘌呤-6-胺,9-[5-脱氧-5-[[顺式-3-[2-[6-(1,1-二甲基乙基)-1H-苯并咪唑-2-基]乙基]环丁基](1-甲基乙基)氨基]-β-D-呋喃核糖基]-)，以及它们的组合。特别要关注的是极光激酶抑制剂II和RSK抑制剂II，以及DOT1L的抑制剂，特别是EPZ-5676。在本发明的优选实施方案中，小分子用于第6阶段和第7阶段中的一个和多个的培养基中，并且更优选地用于第7阶段中。可通过选择显示成熟标志物的最佳表达的量来确定可用的小分子的量，并且该量不产生毒性效应。通常，可用的量将为约500nM至10μM，或者约500nM至5μM，并且优选地为约500nM至2μM。

多能细胞向表达具有成熟表型的胰腺内分泌细胞的特征性标志物的细胞的分化

多能干细胞的特征是本领域技术人员熟知的，并且多能干细胞的其它特征有待继续鉴定。多能干细胞标志物包括(例如)下列标志物中的一种或多种的表达：ABCG2、cripto、FOXD3、CONNEXIN43、CONNEXIN45、OCT4、SOX2、NANOG、hTERT、UTF1、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81。这些可通过RT-PCR检测。

示例性的多能干细胞包括人胚胎干细胞系H9(NIH代码：WA09)、人胚胎干细胞系H1(NIH代码：WA01)、人胚胎干细胞系H7(NIH代码：WA07)，以及人胚胎干细胞系SA002。表达多能细胞的下列特征性标志物中的至少一种的细胞也是合适的：ABCG2、cripto、CD9、FOXD3、CONNEXIN43、CONNEXIN45、OCT4、SOX2、NANOG、hTERT、UTF1、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81。

适用于本发明的是表达定形内胚层谱系的特征性标志物中的至少一种的细胞。在本发明的一个方面，表达定形内胚层谱系的特征性标志物的细胞为原条前体细胞。在另一方面，表达定形内胚层谱系的特征性标志物的细胞是中内胚层细胞。在另一方面，表达定形内胚层谱系的特征性标计物的细胞是定形内胚层细胞。

表达胰腺内胚层谱系的特征性标志物中的至少一种的细胞也适用于本发明。在本发明的一个方面，表达胰腺内胚层谱系的特征性标志物的细胞是胰腺内胚层细胞，其中PDX1和NKX6.1的表达基本上高于CDX2和SOX2的表达。在某些实施方案中，大于30％的细胞表达PDX1和NKX6.1，并且小于30％的细胞表达CDX2或SOX2，如用FACS所测量的。其中PDX1和NKX6.1的表达是CDX2或SOX2的表达的至少两倍的细胞特别有用。

还适用于本发明的是表达胰腺内分泌谱系的特征性标志物中的至少一种的细胞。在本发明的一个方面，表达胰腺内分泌谱系的特征性标志物的细胞为胰腺内分泌细胞。胰腺内分泌细胞可为表达胰腺激素的细胞，意指能够表达以下激素中的至少一种的细胞：胰岛素、胰高血糖素、生长抑素、生长素释放肽或胰多肽。在优选的实施方案中，所述胰腺内分泌细胞是产生胰岛素的β细胞。

在本发明的某些实施方案中，为了得到表达成熟表型的胰腺内分泌β细胞的特征性标志物的细胞，采用以多能干细胞开始的方案。该方案包括：

第1阶段：将从细胞培养系获得的多能干细胞，诸如胚胎干细胞，用合适的因子处理以诱导定形内胚层细胞的形成。

第2阶段：用合适的因子处理从第1阶段得到的细胞，以诱导细胞形成为表达肠管细胞的特征的标志物。

第3阶段：用合适的因子处理从第2阶段细胞得到的细胞，以诱导其进一步分化成表达前肠内胚层细胞的特征性标志物的细胞。

第4阶段：用合适的因子处理从第3阶段得到的细胞，以诱导其进一步分化成表达胰腺前肠前体细胞的特征性标志物的细胞。将所述细胞任选地在第4阶段后期时在空气-液体界面处培养。

第5阶段：用合适的因子(在某些实施方案中包括：(i)T3、T4或其类似物中的一种或多种；(ii)ALK5抑制剂；或(iii)(i)和(ii)两者)处理从第4阶段得到的细胞，并且任选且优选地在空气-液体界面处培养，以诱导其分化成表达胰腺内胚层/内分泌前体细胞的特征性标志物的细胞。

第6阶段：用合适的因子(在某些实施方案中包括：(i)T3、T4或其类似物中的一种或多种；(ii)ALK5抑制剂；(iii)极光激酶抑制剂、RSK抑制剂和蛋白质甲基转移酶DOT1L的抑制剂中的一种或多种；(iv)(i)和(ii)两者；(v)(i)、(ii)和(iii)；(vi)(i)和(iii)；或(vii)(ii)和(iii))处理从第5阶段细胞得到的细胞，并且任选且优选地在空气-液体界面处培养，以诱导其分化成表达胰腺内分泌细胞的特征性标志物的细胞。

第7阶段：用合适的因子(在某些实施方案中包括：(i)T3、T4或其类似物中的一种或多种；(ii)ALK5抑制剂；(iii)抗氧化剂；(iv)极光激酶抑制剂、RSK抑制剂和蛋白质甲基转移酶DOT1L的抑制剂中的一种或多种；(v)(i)和(ii)；(vi)(i)和(iii)；(vii)(i)和(iv)；(viii)(ii)和(iii)；(ix)(ii)和(iv)；(x)(i)、(ii)和(iii)；(xi)(i)、(iii)和(iv)；(xii)(ii)、(iii)和(iv)；(xiii)(i)、(ii)和(iv)；(xiv)(iii)和(iv)；或(xv)(i)、(ii)、(iii)和(iv)处理从第6阶段细胞得到的细胞，并且任选且优选地在空气-液体界面处培养，以诱导形成胰腺内分泌细胞，该胰腺内分泌细胞表达单激素胰岛素并且是PDX1、NKX6.1和MAFA阳性的而且具有比第6阶段细胞更高的MAFA表达水平，并且所得细胞群具有比第6阶段细胞更高百分比的MAFA阳性和单激素胰岛素表达细胞。虽然在某些实施方案中本发明涵盖使多能干细胞(例如，第1阶段之前的细胞)分化成第7阶段细胞，但是本发明也涵盖使其它阶段的细胞向第7阶段分化。具体地，本发明涵盖第4阶段细胞至第7阶段细胞的分化。此外，虽然上文将分化过程描述为独立的阶段，但处理和经历分化过程的细胞的进程可能是依次或连续的。此外，多能干细胞向第6阶段细胞或第7阶段细胞的分化可在悬浮培养物中进行。

可通过将处理过的细胞群暴露于可特异性识别由感兴趣的分化细胞表达的蛋白质标志物的试剂，诸如抗体来确定分化效率。用于评估培养的或分离的细胞中蛋白质标志物和核酸标志物的表达的方法是本领域的标准方法。这些方法包括RT-PCR、Northern印迹、原位杂交(参见例如，Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人编辑，2001增刊)，以及免疫测定(诸如切片材料的免疫组织化学分析)、Western印迹和针对在完整细胞中可接近的标志物的流式细胞术分析(FACS)(参见，例如，Harlow和Lane，Using Antibodies:A Laboratory Manual,New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press(1998))。

还可将已分化细胞进一步纯化。例如，在用本发明方法处理多能干细胞后，可通过使处理过的细胞群暴露于特异性识别由经纯化的分化细胞特征性表达的蛋白质标志物的试剂(诸如抗体)来纯化已分化的细胞。

含有足够量的细胞分化所需的维生素、矿物质、盐、葡萄糖、氨基酸和载体蛋白的任何合适的生长培养基可用于第1阶段至第7阶段中的各个阶段。然而，优选地，使用以下各项：第1阶段-MCDB-131(可得自Life Technologies Corporation,Grand Island,NY)或RPMI(可得自available from Sigma-Aldrich)；第2阶段-MCDB-131或杜尔贝科改良伊格尔培养基F12(“DMEM F12”)；第3阶段至第5阶段-MCDB-131，BLAR(表1)或DMEM；以及第6阶段和第7阶段-BLAR或CMRL(Life Technologies)。优选地，对于第1阶段至第4阶段，培养基的葡萄糖浓度保持在或更优选地低于约10mM；并且对于第5阶段至第7阶段，培养基的葡萄糖浓度保持在大于约10mM。

第1阶段：多能细胞分化成表达定形内胚层细胞的特征性标志物的细胞。

可采用本领域已知的任何方法或本发明提出的任何方法，使多能干细胞分化成表达定形内胚层细胞的特征性标志物的细胞。据报道可用于使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系的特征性标志物的细胞的方法公开于：D’Amour等人，Nature Biotechnology 23,1534-1541(2005)；Shinozaki等人，Development 131,1651-1662(2004)；McLean等人，Stem Cells 25,29-38(2007)；D’Amour等人，Nature Biotechnology 24,1392-1401(2006)。另外的合适的分化方法公开于：美国专利申请公布2007/0254359，美国专利申请公布2009/0170198；美国专利申请公布2011/0091971；美国专利申请公布2010/0015711；美国专利申请公布2012/0190111；美国专利申请公布2012/0190112；以及美国专利申请公布2012/0196365。这些公开内容全文以引用方式并入本文中，因为它们涉及多能干细胞分化成定形内胚层细胞。

在一个实施方案中，用合适的生长培养基处理多能细胞，优选地为MCDB-131或RPMI。该培养基优选地补充有生长分化因子(诸如生长分化因子8(“GDF8”))和糖原合成酶激酶-3β(“GSK3β”)抑制剂(诸如在美国专利申请公布2010/0015711中公开的环苯胺-吡啶三嗪化合物(该专利全文以引用方式并入本文)，以诱导其分化成表达定形内胚层细胞的特征性标志物的细胞。优选的GSK3β抑制剂是14-丙-2-烯-1-基-3,5,7,14,17,23,27-七氮杂四环[19.3.1.1～2,6～.1～8,12～]二十七-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-壬-16-酮(“MCX化合物”)。处理可涉及使多能干细胞与补充有约50ng/ml至约150ng/ml、或者约75ng/ml至约125ng/ml、优选地约100ng/ml的GDF8的培养基接触。处理还可涉及使细胞与约0.1μM至约5μM、或者约0.5μM至约2.5μM，优选地约1μM的MCX化合物接触。可将多能细胞培养约二至五天，优选地约二至三天，以促进其分化成表达定形内胚层细胞的特征性标志物的细胞。

在优选的实施方案中，在GDF8和MCX化合物的存在下培养细胞一天，接着在GDF8和较低浓度的MCX化合物的存在下培养细胞一天，接着在存在GDF8并且缺乏MCX化合物的情况下培养细胞一天。具体地，将细胞在GDF8和约1μM的MCX化合物的存在下培养一天，接着在GDF8和约0.1μM的MCX化合物的存在下培养一天，接着在存在GDF8并且缺乏MCX化合物的情况下培养一天。另选地，可将细胞在GDF8和约1μM MCX化合物的存在下培养一天，然后在GDF8和约0.1μM MCX化合物的存在下培养一天。

另选地，可将多能干细胞在含有活化素A的培养基中在不存在血清的情况下培养，然后将所述细胞与活化素A和血清一起培养，然后将所述细胞与活化素A和另一浓度的血清一起培养，如D’Amour等人，Nature Biotechnology 23,1534-1541(2005)中所公开。作为另一替代方式，可通过将多能干细胞在含有活化素A的培养基中在不存在血清的情况下培养，然后将所述细胞与活化素A和血清一起培养，使多能干细胞分化成表达定形内胚层细胞的特征性标志物的细胞，如D’Amour等人，Nature Biotechnology,2005中所公开。另外，可通过将多能干细胞在含有活化素A和WNT配体的培养基中在不存在血清的情况下培养，然后去除WNT配体并将所述细胞与活化素A和血清一起培养，使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系的特征性标志物的细胞，如D’Amour等人，Nature Biotechnology 24,1392-1401(2006)中所公开。

在本发明的一个实施方案中，用活化素A和WNT3A处理多能干细胞，以导致形成表达定形内胚层细胞的特征性标志物的细胞。处理可涉及使多能干细胞与约50ng/ml至约150ng/ml、或者约75ng/ml至约125ng/ml、或者约100ng/ml的活化素A接触。处理还可涉及使所述细胞与约10ng/ml至约50ng/ml、或者约15ng/ml至约30ng/ml、或者约20ng/ml的WNT3A接触。可将多能细胞培养三天左右以获得定形内胚层细胞。在一个实施方案中，在活化素A和WNT3A的存在下培养细胞一天，接着在活化素A(不存在WNT3A)的存在下培养细胞剩余的时间。

可通过在执行特定方案前后分别检测是否存在定形内胚层细胞的特征性标志物，来确定是否形成了表达这些特征性标志物的细胞。多能干细胞通常不表达此类标志物。因此，在细胞开始表达定形内胚层的特征性标志物后，就能够检测到多能细胞的分化。

第2阶段：使表达定形内胚层细胞的特征性标志物的细胞分化成表达肠管细胞的特征性标志物的细胞。

可使表达定形内胚层细胞的特征性标志物的细胞进一步在生长培养基(诸如MCDB-131或DMEM F12)中分化成表达肠管细胞的特征性标志物的细胞。在一个实施方案中，表达肠管细胞的特征性标志物的细胞的形成包括：用包含成纤维细胞生长因子(“FGF”)，优选FGF7或FGF10的培养基来培养表达定形内胚层细胞的特征性标志物的细胞，从而分化细胞。例如，细胞培养物可包含约10ng/ml至约75ng/ml，或者约25ng/ml至约75ng/ml，又或者约30ng/ml至约60ng/ml，或者约50ng/ml的成纤维细胞生长因子，优选地为FGF7或FGF10，更优选地为FGF7，并且最优选地为约25ng/ml FGF7。可在这些条件下培养所述细胞约二至三天，优选地约两天。

在另一个实施方案中，表达肠管细胞的特征性标志物的细胞的形成包括：用成纤维细胞生长因子，优选地FGF7或FGF10，和抗坏血酸(维生素C)来培养表达定形内胚层谱系的特征性标志物的细胞。该培养基可包含约0.1mM至约0.5mM的抗坏血酸、或者约0.2mM至约0.4mM抗坏血酸、或者约0.25mM的抗坏血酸。细胞培养物还可包含约10ng/ml至约35ng/ml、或者约15ng/ml至约30ng/ml、或者约25ng/ml的成纤维细胞生长因子，优选地FGF7或FGF10，更优选地FGF7。例如，该细胞培养物可包含约0.25mM的抗坏血酸和约25ng/ml的FGF7。在一个实施方案中，用FGF7和抗坏血酸处理第1阶段细胞2天。

第3阶段：表达肠管细胞的特征性标志物的细胞分化成表达表达前肠内胚层细胞的特征性标志物的细胞。

通过在生长培养基(诸如MCDB-131、DMEM)或定制培养基(诸如BLAR)中培养这些细胞，可以将从进行第2阶段得到的肠管细胞进一步分化成第3阶段细胞或表达前肠内胚层特征性标志物的细胞(表I)。培养基可补充有：(i)成纤维细胞生长因子，优选地FGF7或FGF10，并且更优选地FGF7；(ii)视黄酸(“RA”)；(iii)音猬因子(“SHH”)信号转导途径拮抗剂(诸如Smoothened拮抗剂1(“SANT-1”)，其为1-哌嗪胺、N-[(3,5-二甲基-1-苯基-1H-吡唑-4-基)亚甲基]-4-(苯基甲基)-或((E)-4-苄基-N-((3,5-二甲基-1-苯基-1H-吡唑-4-基),亚乙基-哌嗪-1-胺)，HPI-1，其为2-甲氧基乙基1,4,5,6,7,8-六氢-4-(3羟基苯基)-7-(2-甲氧基苯基)-2-甲基-5-氧代-3-喹啉羧酸盐，并且优选地SANT-1；(iv)蛋白激酶C(“PKC”)活化剂，诸如((2S,5S)-(E,E)-8-(5-(4-(三氟甲基)苯基)-2,4-戊二烯酰氨基)苯并内酰胺)(“TPB”)，佛波醇-12,13-二丁酸酯(“PDBu”)，佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(“PMA”)或吲哚内酰胺V(“ILV”)并且优选地TPB；(v)骨形态发生蛋白质(“BMP”)抑制剂，诸如LDN-193189，头蛋白或脊索发生素并且优选地LDN-193189；以及(vi)抗坏血酸。另选地，Smoothened(“SMO”)受体抑制剂(诸如MRT10(N[[[3-苯甲酰基氨基)苯基]氨基]硫代甲基]-3,4,5-三甲氧基苯甲酰胺))或环巴胺也可使用。例如，细胞培养物可包含约100nM至约500nM，或者约100nM至约400nM，或者约200nM的PKC活化剂。可在存在这些生长因子、小分子激动剂和拮抗剂的情况下培养细胞约二至四天，优选地约二至三天，更优选地约两天。

另选地，第2阶段细胞可通过以下步骤分化成第3阶段细胞：在补充有SMO受体抑制剂、SANT-1、视黄酸、以及头蛋白的培养基中培养这些细胞。可将第2阶段细胞培养约二至四天，优选地约两天。

在一个实施方案中，培养基补充有：约10ng/ml至约35ng/ml，或者约15ng/ml至约30ng/ml，或者约25ng/ml的成纤维细胞生长因子，优选地FGF7或FGF10，更优选地FGF7；约0.1mM至约0.5mM抗坏血酸，或者约0.2mM至约0.4mM，或者约0.25mM的抗坏血酸；约0.1μM至约0.4μM的SANT-1；约100nM至约300nM的TPB；以及约50nM至约200nM，和约100nM的LDN-193189。在另一个实施方案中，该培养基补充有约25ng/ml FGF-7、约1μM视黄酸、约0.25μM SANT-1、约200nM TPB、约100nM LDN-193189和约0.25mM抗坏血酸。

在一个实施方案中，该培养基补充有约0.1μM至约0.3μM SANT-1、约0.5μM至约3μM视黄酸，和约75ng/ml至约125ng/ml头蛋白。

第4阶段至第7阶段：通过以下方式使表达前肠内胚层细胞特征性标志物的细胞分化成表达成熟表型胰腺内分泌细胞特征性标志物的细胞：用补充有甲状腺激素和ALK抑制剂中的一种或两种连同极光激酶抑制剂、RSK抑制剂和蛋白质甲基转移酶DOT1L的抑制剂中的一种或多种的培养基处理，优选地在空气-液体界面处培养。

虽然在一个实施方案中，本发明设想在从多能细胞至胰腺内分泌细胞的途径中的所有阶段中在空气-液体界面处培养，但是本发明优选地提供在平面或浸没的培养物中形成第1阶段至第4阶段细胞，以及通过在空气-液体界面处培养细胞形成第5、第6和第7阶段的细胞。在其它实施方案中，本发明涉及分化多能细胞的分步方法，包括在空气-液体界面处培养第4、第5和第6阶段的细胞。在某些实施方案中，在第4阶段至第7阶段期间培养的细胞可在空气-液体界面处培养。在其它实施方案中，仅有第4阶段后期至第6阶段的细胞、或第5阶段和第6阶段的细胞在空气-液体界面处培养。在又一个另选的实施方案中，第1阶段至第4阶段通过在浸没的平面培养物中培养细胞来进行，并且第5阶段至第7阶段通过在浸没的悬浮培养物中培养来进行。

另外，在T3、T4及其类似物中的一种或多种，ALK5抑制剂，或者T3，T4及其类似物中的一种或多种和ALK5抑制剂两者的存在下在第5、第6和第7阶段中的一个或多个，以及优选地所有阶段期间进行培养。在优选的实施方案中，在T3和ALK5抑制剂的存在下并且更新优选地在T3和ALK5抑制剂II的存在下，在第5、第6和第7阶段中的一个或多个，以及优选地所有阶段期间进行培养。甲状腺激素或其类似物的合适量为约0nM至约1000nM，或者约10nM至约900nM，或者约100nM至约800nM，或者约200nM至约700nM，或者约300nM至约600nM，或者约400nM至约500nM，或者约1nM至约500nM，或者约1nM至约100nM，或者约100nM至约1000nM，或者约500nM至约1000nM，或者约100nM至约500nM，或者约1μM，并且优选地约0.1μM至1μM。ALK5抑制剂的量为约250nM至2μM，或者约300nM至约2000nM，或者约400nM至约2000nM，或者约500nM至约2000nM，或者约600nM至约2000nM，或者约700nM至约2000nM，或者约800nM至约2000nM，或者约1000nM至约2000nM，或者约1500nM至约2000nM，或者约250nM至约1000nM，或者约250nM至约500nM，或者约300nM至约1000nM，或者约400nM至约1000nM，或者约500nM至约1000nM，或者约600nM至约1000nM，或者约700nM至约1000nM，或者约800nM至约1000nM，或者约500nM，或者约10μM，并且优选地约10μM。

当在空气-液体界面(“ALI”)处培养细胞时，可在多孔基质上培养细胞，使得所述细胞在顶侧上与空气接触，并且在底侧处与细胞培养基接触。例如，可将足够体积的培养基添加至包含所述多孔基质(例如，过滤器芯子(filter insert))的培养容器的底部，使得培养基接触存在于基质上的细胞的底表面但是不包封或浸没它们。合适的多孔基质可由将不会对细胞的生长和分化产生不利影响的任意材料形成。示例性多孔基质是由聚合物制成的，诸如聚对苯二甲酸乙二酯(“PET”)、聚酯或聚碳酸酯。合适的多孔基质可经涂覆或未经涂覆。在一个实施方案中，涂层可为MATRIGEL^TM。在本发明的一个实施方案中，多孔基质是可涂覆有MATRIGEL^TM的多孔过滤器芯子。在本发明的一个实施方案中，多孔基质是未涂覆的过滤器芯子。基质的孔隙率应当足以维持细胞活力并且促进细胞的分化。合适的基质包括具有以下孔尺寸的过滤器芯子：约0.3μm至约3.0μm，约0.3μm至约2.0μm，约0.3μm至约1.0μm，约0.3μm至约0.8μm，约0.3μm至约0.6μm，约0.3μm至约0.5μm，约0.3μm至约3.0μm，约0.6μm至约3.0μm，约0.8μm至约3.0μm，约1.0μm至约3.0μm，约2.0μm至约3.0μm，优选地约0.4μm；以及以下孔密度：约50至约120百万个孔/cm²，约60至约110百万个孔/cm²，约70至约100百万个孔/cm²，优选地约80至约100百万个孔/cm²，约90至约100百万个孔/cm²，并且更优选地约100百万个孔/cm²。

培养基可以每隔一天或优选地每天更换或更新。在多孔基质的顶部上生长的细胞一般不是单个细胞，而相反它们呈片形式或以聚集细胞簇形式存在的。相较于浸没在培养基中的细胞，在ALI处培养的细胞可经历更高的氧张力。

本发明涵盖在空气-液体界面处形成第4至第7阶段的细胞，优选地第5至第7阶段的细胞。细胞可通过使多能干细胞分化形成，或通过进一步分化第3、第4、第5或第6阶段的细胞而形成。可完全在空气-液体界面处培养第4阶段细胞，或可在第4阶段的早期部分期间在浸没的平面培养物中培养细胞，意味着约一至两天，并且随后在第4阶段的后期部分期间在空气-液体界面处培养细胞，意味着约第二天至第三天。优选地，第4阶段不在ALI处进行，而是在浸没的培养物中进行。

在一个实施方案中，本发明提供了一种用于从多能干细胞产生表达胰腺内分泌细胞特征性标志物的细胞的方法，所述方法包括培养多能干细胞，使所述多能干细胞分化成表达前肠内胚层特征性标志物的细胞；通过任选地在空气-液体界面处培养来使表达前肠内胚层的特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内分泌细胞特征性标志物的细胞。该方法可包括用补充有(i)T3、T4或其类似物中的一种或两种、(ii)ALK5抑制剂，或者(i)和(ii)两者的培养基进行处理。该方法可包括通过用补充有(i)T3、T4或其类似物中的一种或两种、(ii)ALK5抑制剂或(i)和(ii)两者的培养基处理以及在平面培养物中培养来将表达前肠内胚层细胞(第3阶段细胞)特征性标志物的细胞分化成表达胰腺前肠前体细胞(第4阶段细胞)特征性标志物的细胞。该方法还可包括通过用补充有(i)T3、T4或其类似物中的一种或两种、(ii)ALK5抑制剂或(i)和(ii)两者的培养基处理以及在平面培养物中培养并且优选地在空气-液体界面处培养来将表达胰腺前肠前体细胞(第4阶段细胞)特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内分泌细胞(第6阶段细胞)特征性标志物的细胞。该方法还包括通过用补充有(i)T3、T4或其类似物中的一种或两种、(ii)ALK5抑制剂或(i)和(ii)两者连同极光激酶抑制剂、RSK抑制剂和蛋白质甲基转移酶DOT1L的抑制剂中的一种或多种，以及任选但优选抗氧化剂诸如维生素E，或优选乙酰基半胱氨酸的培养基处理来将第6阶段细胞分化成表达胰腺内分泌细胞特征性标志物并且与第6阶段相比具有更成熟表型的细胞(第7阶段细胞)。可用的乙酰基半胱氨酸的量为约0.1mM至约2mM。维生素E的量为约0.1μM至约10μM。在又一个实施方案中，所述方法还包括通过用补充有(i)T3、T4或其类似物中的一种或两种、(ii)ALK5抑制剂或(i)和(ii)两者连同极光激酶抑制剂、RSK抑制剂和蛋白质甲基转移酶DOT1L的抑制剂中的一种或多种的培养基处理第5阶段细胞来进行第6阶段。在另外的实施方案中，通过用补充有(i)T3、T4或其类似物中的一种或两种、(ii)ALK5抑制剂或(i)和(ii)两者连同极光激酶抑制剂、RSK抑制剂和蛋白质甲基转移酶DOT1L的抑制剂中的一种或多种的培养基处理第5阶段细胞来进行第6阶段，然后通过用补充有(i)T3、T4或其类似物中的一种或两种、(ii)ALK5抑制剂或(i)和(ii)两者连同极光激酶抑制剂、RSK抑制剂和蛋白质甲基转移酶DOT1L的抑制剂中的一种或多种，以及任选但优选抗氧化剂诸如维生素E，或优选乙酰基半胱氨酸的培养基处理来进行第7阶段。

本发明的一个实施方案是形成表达成熟β细胞(第7阶段细胞)的特征性标志物的胰腺内分泌细胞的方法，所述方法包括通过优选地在空气-液体界面处培养来将表达胰腺前肠前体细胞(第4阶段细胞)的特征性标志物的细胞分化成表达第7阶段细胞的特征性标志物的细胞。在另一个实施方案中，本发明的方法导致形成第6阶段细胞，或是未成熟β细胞的细胞。优选地至少在第5至第7阶段期间，该方法包括用补充有T3、T4或其类似物、ALK5抑制剂、或两者的培养基进行处理。

在空气-液体界面处培养细胞包括将细胞接种到多孔基质诸如多孔过滤器芯子上。在某些实施方案中，基质的孔尺寸范围可为约0.3微米至约3微米。接种可通过以下方式实现：将细胞作为单细胞从单层培养物释放或作为细胞簇从单层培养物释放到悬浮液中，随后将单细胞悬浮液或悬浮的细胞培养物等分到在ALI处的多孔基质上。细胞可从悬浮液接种到多孔基质上，该悬浮液具有约1000个细胞/μl至约100,000个细胞/μl，约1000个细胞/μl至约90,000个细胞/μl，约1000个细胞/μl至约80,000个细胞/μl，约1000个细胞/μl至约70,000个细胞/μl，约1000个细胞/μl至约60,000个细胞/μl，约1000个细胞/μl至约50,000个细胞/μl，约1000个细胞/μl至约40,000个细胞/μl，约1000个细胞/μl至约30,000个细胞/μl，约1000个细胞/μl至约20,000个细胞/μl，约1000个细胞/μl至约10,000个细胞/μl，约1000个细胞/μl至约5000个细胞/μl，约5000个细胞/μl至约100,000个细胞/μl，约10,000个细胞/μl至约100,000个细胞/μl，约20,000个细胞/μl至约100,000个细胞/μl，约30,000个细胞/μl至约100,000个细胞/μl，约40,000个细胞/μl至约100,000个细胞/μl，约50,000个细胞/μl至约100,000个细胞/μl，约60,000个细胞/μl至约100,000个细胞/μl，约20,000个细胞/μl至约80,000个细胞/μl，约30,000个细胞/μl至约70,000个细胞/μl，约40,000个细胞/μl至约60,000个细胞/μl，并且优选地约50,000个细胞/μl。细胞可作为包含单个细胞或细胞聚集体或细胞簇的细胞悬浮液的液滴而接种。所得细胞沉积物可包含约5×10⁶至约5×10⁷个细胞/cm²，约6×10⁶至约5×10⁷个细胞/cm²，约7×10⁶至约5×10⁷个细胞/cm²，约8×10⁶至约5×10⁷个细胞/cm²，约9×10⁶至约5×10⁷个细胞/cm²，约1×10⁷至约5×10⁷个细胞/cm²，约2×10⁷至约5×10⁷个细胞/cm²，约3×10⁷至约5×10⁷个细胞/cm²，约4×10⁷至约5×10⁷个细胞/cm²，约5×10⁶至约4×10⁷个细胞/cm²，约5×10⁶至约3×10⁷个细胞/cm²，约5×10⁶至约2×10⁷个细胞/cm²，约5×10⁶至约1×10⁷个细胞/cm²，约5×10⁶至约9×10⁶个细胞/cm²，约5×10⁶至约8×10⁶个细胞/cm²，约5×10⁶至约7×10⁶个细胞/cm²，约5×10⁶至约6×10⁶个细胞/cm²，约7×10⁶至约4×10⁷个细胞/cm²，约8×10⁶至约3×10⁷个细胞/cm²，约9×10⁶至约2×10⁷个细胞/cm²，并且优选地约1×10⁷个细胞/cm²的量级。

在另一个实施方案中，本发明涉及通过在优选地空气-液体界面处培养和分化PDX1和NKX6.1共表达细胞的群体来增加单激素阳性细胞(例如，共表达NKX6.1和胰岛素的细胞，或共表达NKX6.1和嗜铬粒蛋白的细胞)的数目的方法。在另一个实施方案中，在空气-液体界面处培养的胰腺内胚层细胞通过用选自以下的化合物处理而进一步分化成胰腺内分泌细胞：ALK5抑制剂、BMP抑制剂、γ-分泌酶抑制剂、Ephrin配体、EphB抑制剂、PKC抑制剂、EGFr抑制剂、视黄酸、维生素C、T3/T4、葡萄糖、细胞周期调节因子、WNT调节因子、SHH抑制剂、极光抑制剂、抗氧化剂、维生素E、乙酰基半胱氨酸、或它们的组合。

在另外的实施方案中，本发明涉及分化多能细胞的分步方法，该方法包括在含有足够量的(i)T3、T4及其类似物中的一种或多种、(ii)ALK5抑制剂或(i)和(ii)两者的培养基中培养第4阶段至第6阶段细胞，以及在任选且优选地含有极光激酶抑制剂、RSK抑制剂、蛋白质甲基转移酶DOT1L的抑制剂和抗氧化剂中的一种或多种的培养基中进一步培养第6阶段细胞以生成表达胰岛素、PDX1、NKX6.1和MAFA的胰腺内分泌细胞和胰腺内分泌细胞群。

在一些实施方案中，所得细胞群的至少10％的细胞表达胰岛素、PDX1、NKX6.1和MAFA。在其它实施方案中，该群体的至少20％的细胞表达胰岛素、PDX1、NKX6.1和MAFA。在其它实施方案中，该群体的至少30％的细胞表达胰岛素、PDX1、NKX6.1和MAFA。在另外的实施方案中，该群体的至少40％的细胞表达胰岛素、PDX1、NKX6.1和MAFA。在其它实施方案中，该群体的至少50％的细胞表达胰岛素、PDX1、NKX6.1和MAFA。在另选的实施方案中，至少60％的细胞表达胰岛素、PDX1、NKX6.1和MAFA。在另外的另选的实施方案中，该群体的至少70％的细胞表达胰岛素、PDX1、NKX6.1和MAFA。在其它实施方案中，该群体的至少80％的细胞表达胰岛素、PDX1、NKX6.1和MAFA。在其它实施方案中，该群体的至少90％的细胞表达胰岛素、PDX1、NKX6.1和MAFA。在另选的实施方案中，该群体的至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的细胞表达胰岛素、PDX1、NKX6.1和MAFA。

第4阶段：使表达前肠内胚层细胞的特征性标志物的细胞分化成表达胰腺前肠前体细胞的特征性标志物的细胞。

在一个实施方案中，本发明的方法包括用分化培养基处理第3阶段细胞，该分化培养基可为任何合适的生长培养基并且优选地为MCDB-131、DMEM或定制培养基诸如BLAR(表I)。该培养基可补充有以下中的一者或多者：(a)ALK5抑制剂，选自：TGF-β受体抑制剂V、TGF-β受体抑制剂I、TGF-β受体抑制剂IV、TGF-β受体抑制剂VII、TGF-β受体抑制剂VIII、TGF-β受体抑制剂II、TGF-β受体抑制剂VI、TGF-β受体抑制剂III、TGF-β抑制剂SB431542、SD-208、ITD-1、LY2109761、A83-01、LY2157299、ALK5i和ALK5抑制剂II；(b)甲状腺激素，选自T3、T4、T3的类似物、T4的类似物以及它们的混合物；(c)SHH信号转导途径拮抗剂，选自SANT-1或HIP-1；(d)BMP受体抑制剂，选自LDN-193189、头蛋白或脊索发生素；(e)PKC活化剂，选自TPB、PPBu、PMA和ILV；(f)成纤维细胞生长因子，选自FGF-7或FGF-10；(g)视黄酸；以及(h)抗坏血酸。例如，生长培养基，诸如MCDB131或优选地BLAR，可补充有SHH信号转导途径拮抗剂(诸如SANT-1或HPI-1)、BMP抑制剂(诸如LDN-193189、头蛋白或脊索发生素)、抗坏血酸，以及PKC活化剂(诸如TPB、PDBu、PMA或ILV)，以提供可用的分化培养基。在此类培养基中培养第3阶段细胞约二至四天，优选地约二至三天，更优选地约三天通常足以使第3阶段细胞分化成第4阶段细胞。在另一个实施方案中，培养基可补充有SMO抑制剂和SHH信号转导途径拮抗剂。在优选的实施方案中，可用补充有约0.25μM的SANT-1；约100nM的RA；约2ng/ml的FGF7；约100nM的LDN-193189；和约0.25mM的抗坏血酸；以及约200nM的培养基处理第3阶段细胞三天。

在第4阶段中，在整个阶段期间，并且优选地，在平面培养约2至3天后，细胞可以在空气-液体界面处培养。具体地讲，本发明提供了用于使衍生自多能干细胞的细胞在空气-液体界面处分化的体外细胞培养物，所述体外细胞培养物包括：(a)培养容器；(b)所述容器内一定体积的生长培养基，该体积足以填充容器的体积的仅一部分；(c)容器内的空气，该空气填充邻接培养基的容器的一部分；(d)位于培养基和空气之间的界面处的多孔基质；以及(e)衍生自设置在基质表面上以使得培养基接触细胞表面的仅一部分的多能干细胞的细胞。另选地，第4阶段可完全在平面培养物中进行。

在另外的实施方案中，在第4阶段完成时可用Rho相关激酶(“ROCK”)抑制剂处理细胞，所述抑制剂诸如Y27632((1R,4r)-4-((R)-1-氨基乙基)-N-(吡啶-4-基)环己甲酰胺)、GSK269962(N-[3-[[2-(4-氨基-1,2,5-噁二唑-3？-基)-1-乙基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-基]氧]苯基]-4-[2-(4-吗啉基)乙氧基]苯甲酰胺)、H1152((S)-(+)-2-甲基-1-[(4-甲基-5-异喹啉基)磺酰]高哌嗪二盐酸盐)和SR3677(N-[2-[2-(二甲氨基)乙氧基]-4-(1H-吡唑-4-基)苯基-2,3-二氢-1,4-苯并二氧杂苯-2-甲酰胺二盐酸盐)。在某些实施方案中，可使用约1μM至20μM，或者约1μM至15μM，或者约1μM至10μM，优选地约10μM的ROCK抑制剂。

在某些实施方案中，仅在第4阶段后期的细胞，意指已在平面培养物中培养1至2天的细胞，可随后在空气-液体界面处培养以便完成第4阶段。在一个实施方案中，仅在第4阶段的后期在空气-液体界面处培养用ROCK抑制剂处理过的细胞。在其它实施方案中，0.5至约0.75×10⁵个细胞/微升被接种为在空气-液体界面处培养，或者，约2至6×10⁶个细胞被接种为在空气-液体界面处培养。在某些实施方案中，在空气-液体界面处培养之前，可用细胞脱附溶液处理细胞，所述细胞脱附溶液为诸如包含蛋白水解酶和胶原蛋白酶(诸如TrypLE^TM、Accutase^TM或Dispase^TM)的溶液。

在另选的实施方案中，可用包含补充有ALK5抑制剂、头蛋白和PKC活化剂(诸如TPB)的生长培养基的分化培养基处理第3阶段细胞。在某些实施方案中，培养基可补充有约0.1μM的ALK5抑制剂、约100ng/ml的头蛋白、以及约500nM的TPB。细胞培养物可为单层形式。处理可持续总共约三天。在某些实施方案中，可处理细胞两天，随后在最后一天可用蛋白水解酶、胶原蛋白酶，或蛋白水解酶和胶原蛋白酶两者，诸如Dispase^TM处理细胞，使细胞分散成直径小于约100微米的细胞簇，接着在ALK5抑制剂和LDN-193189的存在下培养。在某些实施方案中，可在补充有约200nM的ALK5抑制剂和约100nM的LDN-193189的培养基中培养直径小于约100微米的细胞簇。在另选的实施方案中，在空气-液体界面处培养第4阶段细胞可显著增加胰腺内胚层标志物连同内分泌相关标志物。因此，本发明提供通过在空气-液体界面处培养第4阶段细胞来增加胰腺内胚层标志物和内分泌相关标志物的方法。

第5阶段：使表达胰腺前肠前体细胞的特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内胚层/内分泌前体细胞的特征性标志物的细胞。

在一个实施方案中，本发明的方法包括用分化培养基处理第4阶段细胞，该分化培养基可为任何合适的生长培养基并且优选地为MCDB-131、DMEM或优选地定制培养基诸如BLAR(表I)。该培养基可补充有以下中的一者或多者：(a)ALK5抑制剂，选自：TGF-β受体抑制剂V、TGF-β受体抑制剂I、TGF-β受体抑制剂IV、TGF-β受体抑制剂VII、TGF-β受体抑制剂VIII、TGF-β受体抑制剂II、TGF-β受体抑制剂VI、TGF-β受体抑制剂III、TGF-β抑制剂SB431542、SD-208、ITD-1、LY2109761、A83-01、LY2157299、ALK5i和ALK5抑制剂II；(b)甲状腺激素，选自T3、T4、T3的类似物、T4的类似物、以及它们的混合物；(c)SHH信号转导途径拮抗剂，选自SANT-1或HIP-1；(d)BMP受体抑制剂，选自LDN-193189、头蛋白或脊索发生素；(e)视黄酸；(f)抗坏血酸；(g)肝素；以及(h)硫酸锌；并且优选地在空气-液体界面处培养细胞约二至四天，优选地约三天，以使所述细胞分化成第5阶段细胞。在另一个实施方案中，生长培养基还补充有SMO抑制剂(诸如MRT10或环巴胺)和优选地选自FGF-7或FGF-10的成纤维细胞生长因子中的一者或两者。对第4阶段细胞的处理进行约二至四天，优选地约3天以将细胞分化成第5阶段细胞。

在优选的实施方案中，第4阶段细胞通过用补充有以下物质的培养基处理细胞来分化成第5阶段细胞：约0.1μM至约0.4μM的SANT-1并且优选约0.25μM的SANT-1，约50nM的RA，约0.1mM至约0.5mM的抗坏血酸、或者约0.2mM至约0.4mM并且优选地约0.25mM的抗坏血酸，约50nM至约200nM并且优选地约100nM的LDN-193189，约1μM的T3，以及约10000nM的ALK5抑制剂、更优选地ALK 5抑制剂II。在另外的实施方案中，细胞还任选且优选地用以下物质处理：约1μM至15μM、或者约1μM至10μM的ZnSO₄、或者约5μM至10μM、优选地约10μM的硫酸锌以及约1μg/ml至100μg/ml，优选地约10μg/ml的肝素。对第4阶段细胞的处理进行约二至四天，优选地约3天以将细胞分化成第5阶段细胞。

在又一个实施方案中，本发明的方法包括：用补充有肝素、SMO抑制剂或SHH信号转导途径拮抗剂、RA、BMP受体抑制剂和ALK5抑制剂的培养基处理第4阶段细胞，以及在空气-液体界面处培养细胞约3天，以使所述细胞分化成第5阶段细胞。在另选的实施方案中，培养基可补充有SMO抑制剂和SHH信号转导途径拮抗剂两者，连同RA、BMP受体抑制剂和ALK5抑制剂。因此，在一个实施方案中，可通过用补充有肝素、ZnSO₄、SMO抑制剂或SHH信号转导途径拮抗剂、RA、LDN-193189和ALK5抑制剂II的培养基处理第4阶段细胞，来使第4阶段细胞分化成第5阶段细胞。在另选的实施方案中，培养基可补充有SMO抑制剂和SHH信号转导途径拮抗剂两者。在一个实施方案中，通过用补充有约10μg/ml的肝素、约0.25μM的SANT-1、约50nM的RA、约50nM的LDN-193189、约10nM的T3和约1000nM的ALK5抑制剂的培养基处理细胞，来使第4阶段细胞分化成第5阶段细胞。合适的ALK5抑制剂包括但不限于SD-208、ALK5抑制剂II、TGF-β受体抑制剂V、TGF-β受体抑制剂I、TGF-β受体抑制剂IV、TGF-β受体抑制剂VII、TGF-β受体抑制剂VIII、TGF-β受体抑制剂II、TGF-β受体抑制剂VI、TGF-β受体抑制剂III，以及它们的组合。对第4阶段细胞的处理进行约二至四天，优选地约3天以将细胞分化成第5阶段细胞。

在优选的实施方案中，ALK5抑制剂为ALK5抑制剂II。在另一个优选实施方案中，使用约10000nM的ALK5抑制剂II。在另选的优选实施方案中，用补充有约10μg/ml的肝素、约0.25μM的SANT-1、约50nM的RA、约100nM的LDN-193189，以及约10000nM的ALK5抑制剂II的培养基处理第4阶段细胞。在又一个另选的实施方案中，本发明的方法包括：用补充有SMO抑制剂或SHH信号转导途径拮抗剂、RA以及ALK5抑制剂的培养基处理第4阶段细胞，以及优选地在空气-液体界面处培养细胞约两天至四天，优选地约3天，以使所述细胞分化成第5阶段细胞。在另选的实施方案中，培养基可补充有SMO抑制剂和SHH信号转导途径拮抗剂两者。在一个实施方案中，通过用补充有约0.25μM的SANT-1、约50nM的RA、约50nM的LDN-193189、约1μM的T3和约1000nM的ALK5抑制剂的培养基处理细胞，来使第4阶段细胞分化成第5阶段细胞。

用于在空气-液体界面处培养的接种细胞量可变化。例如，为了在空气-液体界面处培养细胞，可将含有约0.5至6×10⁵个细胞/μl的细胞悬浮液的液滴接种在多孔基质(例如，过滤器)上。悬浮液可含有约2×10⁵个细胞/μl至约6×10⁵个细胞/μl，约4×10⁵个细胞/μl至约6×10⁵个细胞/μl，约5×10⁵个细胞/μl至约6×10⁵个细胞/μl，约5×10⁵个细胞/μl至约6×10⁵个细胞/μl，约2×10⁵个细胞/μl至约5×10⁵个细胞/μl，约2×10⁵个细胞/μl至约4×10⁵个细胞/μl，或约3×10⁵个细胞/μl，其可被接种到多孔基质诸如位于空气-液体界面处的过滤器上。在一些实施方案中，将含有约0.5×10⁵个细胞/μl至约0.75×10⁵个细胞/μl，约0.6×10⁵个细胞/μl至约0.75×10⁵个细胞/μl，或约0.5×10⁵个细胞/μl至约0.6×10⁵个细胞/μl的细胞悬浮液的液滴接种到多孔支承体上以在ALI处培养。

在另一个实施方案中，本发明的方法包括：用补充有BMP受体抑制剂(例如，LDN-193189、头蛋白或脊索发生素)和ALK5抑制剂的培养基处理第4阶段细胞约1天，以使第4阶段细胞分化成第5阶段细胞。例如，培养基可补充有约100nM的LDN-193189和约100nM的ALK5抑制剂以及约1μM的T3。所述细胞可为细胞簇形式。在某些实施方案中，在空气-液体界面处培养之前，可用细胞脱附溶液处理细胞，所述细胞脱附溶液为诸如包含蛋白水解酶和胶原蛋白酶的溶液。

根据前述方法，本发明还提供了用于使表达胰腺前肠前体的特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内胚层/胰腺内分泌前体细胞的特征性标志物的细胞的细胞培养物，所述细胞培养物包括：(a)培养容器；(b)所述容器内一定体积的生长培养基，该体积足以填充所述容器的体积的仅一部分；(c)所述容器内的空气，该空气填充邻接所述培养基的所述容器的一部分；(d)位于所述培养基和所述空气之间的界面处的多孔基质；以及(e)表达衍生自设置在所述基质表面上以使得所述培养基接触所述细胞表面的仅一部分的多能干细胞的胰腺前肠前体细胞的特征性标志物的细胞。

第6阶段：使表达胰腺内胚层/内分泌前体细胞的特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内分泌细胞的特征性标志物的细胞。

在一个实施方案中，本发明的方法包括用分化培养基处理第5阶段细胞，该分化培养基可为任何合适的生长培养基，优选地诸如MCDB-131或CMRL，并且更优选定制培养基诸如BLAR(表I)。该培养基可补充有以下中的一者或多者：(a)ALK5抑制剂，选自：TGF-β受体抑制剂V、TGF-β受体抑制剂I、TGF-β受体抑制剂IV、TGF-β受体抑制剂VII、TGF-β受体抑制剂VIII、TGF-β受体抑制剂II、TGF-β受体抑制剂VI、TGF-β受体抑制剂III、TGF-β抑制剂SB431542、SD-208、ITD-1、LY2109761、A83-01、LY2157299、ALK5i和ALK5抑制剂II；(b)甲状腺激素，选自T3、T4、它们的类似物和它们的混合物；(c)BMP受体抑制剂，优选地选自LDN-193189、头蛋白或脊索发生素；(d)γ分泌酶抑制剂，诸如γ分泌酶抑制剂XX、γ分泌酶抑制剂XXI、γ分泌酶抑制剂XVI或DAPT；(e)抗坏血酸；(f)肝素；以及(g)硫酸锌，并且优选地在空气-液体界面处培养约二至四天，优选地约三天，以使第5阶段细胞分化成第6阶段细胞。任选地，培养基可另外地补充有SHH信号转导途径拮抗剂、smoothened受体抑制剂、成纤维细胞生长因子和视黄酸中的一种或多种。

在优选的实施方案中，可通过用补充有约50nM的RA、约0.25mM的抗坏血酸、约100nM的LDN-193189、约10000nM的ALK5抑制剂并且优选地ALK 5抑制剂II、1μM的T3、约100nM的γ分泌酶抑制剂的培养基处理约七天来使第5阶段细胞分化成第6阶段细胞。另选地，可通过用补充有约0.25μM的SANT-1、约50nM的RA、约0.25mM的抗坏血酸、约1000nM的ALK5抑制剂和1μM的T3的培养基处理第5阶段细胞约三天，使其分化成第6阶段细胞。可根据需要，将细胞在此类培养基中再培养两天或以上。

另选地，可通过用补充有肝素、SMO抑制剂或SHH信号转导途径拮抗剂、BMP抑制剂、T3、T4、其类似物及其混合物，以及ALK5抑制剂的培养基处理并且优选地在空气-液体界面处培养约一至七天，或者约六天，或者约七天来使第5阶段细胞分化成第6阶段细胞。在另选的实施方案中，培养基可补充有SMO抑制剂和SHH信号转导途径拮抗剂两者。例如，细胞可在补充有约10μg/ml的肝素、约0.25μM的SANT-1、约100nM的LDN-193189、约1000nM的T3、以及约500nM至约10,000nM，或者约500nM，或者约1000mM，并且或者约10,000nM的ALK5抑制剂的培养基中培养。合适的ALK5抑制剂包括但不限于SD-208、ALK5抑制剂II、TGF-β受体抑制剂V、TGF-β受体抑制剂I、TGF-β受体抑制剂IV、TGF-β受体抑制剂VII、TGF-β受体抑制剂VIII、TGF-β受体抑制剂II、TGF-β受体抑制剂VI、TGF-β受体抑制剂III，以及它们的组合。

在优选的实施方案中，ALK5抑制剂为ALK5抑制剂II。在更优选的实施方案中，使用约10000nM的ALK5抑制剂II。因此，在一个实施方案中，可通过用补充有肝素、SMO抑制剂或SHH信号转导途径拮抗剂、BMP抑制剂、T3、T4、其类似物及其混合物，以及ALK5抑制剂的培养基处理并且优选地在空气-液体界面处优选地培养约七天来使第5阶段细胞分化成第6阶段细胞。在另选的实施方案中，培养基可补充有SMO抑制剂和SHH信号转导途径拮抗剂两者。在某些实施方案中，在空气-液体界面处培养之前，可用细胞脱附溶液处理细胞，所述细胞脱附溶液为诸如包含蛋白水解酶和胶原蛋白酶的溶液。

在另一个实施方案中，可通过用补充有肝素、SMO抑制剂或SHH信号转导途径拮抗剂、BMP抑制剂、T3和ALK5抑制剂II的培养基处理并且在空气-液体界面处培养约5天至约7天，或者约5天，或者约6天，或者约7天来使第5阶段细胞分化成第6阶段细胞。在这些实施方案中，培养基可补充有约10μg/ml的肝素、约0.25μM的SANT-1、约100nM的LDN-193189、约1000nM的T3以及约10,000nM的ALK5抑制剂II。在某些实施方案中，培养基还可补充有硫酸锌(ZnSO₄)。例如，培养基可进一步补充有约10mM的ZnSO₄。在另选的实施方案中，培养基可补充有SMO抑制剂和SHH信号转导途径拮抗剂两者。

在本发明的特别优选的实施方案中，将极光激酶抑制剂优选地极光激酶抑制剂II、RSK抑制剂优选地RSK抑制剂II、以及蛋白质甲基转移酶DOT1L的抑制剂优选地EPZ 5676中的一者或多者添加到培养基中。对于极光激酶和RSK抑制剂，所添加的量可为约100nM至5000nM，或者约1000nM至5000nM，或者约2000nM至5000nM，或者约3000nM至5000nM，并且优选地约1000nM至2000nM，并且对于DOT1L抑制剂，所添加的量为约100nM至1000nM，并且更优选地1μM至约10nM。

根据前述方法，本发明还提供了一种用于使表达胰腺内胚层/内分泌前体细胞的特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内分泌细胞的特征性标志物的细胞的细胞培养物，所述细胞培养物包括：(a)培养容器；(b)所述容器内一定体积的生长培养基，该体积足以填充所述容器的体积的仅一部分；(c)所述容器内的空气，该空气填充邻接所述培养基的所述容器的一部分；(d)位于所述培养基和所述空气之间的界面处的多孔基质；以及(d)表达衍生自设置在所述基质表面上以使得所述培养基接触所述细胞表面的仅一部分的多能干细胞的胰腺内胚层/内分泌前体细胞的特征性标志物的细胞。

在一个实施方案中，利用根据本发明的实施方案培养的第5阶段细胞并且使所述细胞分化成第6阶段细胞，而在其它实施方案中可利用根据其它方案培养的第5阶段细胞。

在另一个实施方案中，本发明的方法导致第6阶段细胞的形成，所述第6阶段细胞是单激素阳性的。因此，在一个实施方案中，本发明的方法产生共表达NKX6.1、胰岛素、嗜铬粒蛋白和PDX1的第6阶段细胞。在另一个实施方案中，本发明的方法产生共表达NKX6.1和胰岛素的第6阶段细胞。在本发明的某些实施方案中，该方法在第4至第6阶段或第4节段后期至第6阶段，或第5和第6阶段采用BLAR定制培养基(参见表I)。培养基可以并且优选地每天更换或另选地每隔一天更换。

在另一个实施方案中，本发明涉及形成共表达NKX6.1和嗜铬粒蛋白的第6阶段细胞的方法，所述方法包括在空气-液体界面处培养第4阶段，优选地第4阶段后期细胞到第6阶段细胞。在又一个实施方案中，本发明涉及通过在空气-液体界面处培养第4阶段，优选地第4阶段后期细胞到第6阶段细胞来形成表达NKX6.1的第6阶段细胞的单激素胰岛素阳性的细胞的方法。

第7阶段：使表达胰腺内分泌细胞的特征性标志物的细胞分化成表达具有更成熟表型的胰腺内分泌细胞的特征性标志物的细胞。

在一个实施方案中，本发明的方法包括用分化培养基处理第6阶段细胞，该分化培养基可为任何合适的生长培养基，优选地诸如MCDB-131或CMRL，并且更优选地定制培养基诸如BLAR(表I)。该培养基补充有以下物质中的一者或多者：(a)ALK5抑制剂，选自：TGF-β受体抑制剂V、TGF-β受体抑制剂I、TGF-β受体抑制剂IV、TGF-β受体抑制剂VII、TGF-β受体抑制剂VIII、TGF-β受体抑制剂II、TGF-β受体抑制剂VI、TGF-β受体抑制剂III、TGF-β抑制剂SB431542、SD-208、ITD-1、LY2109761、A83-01、LY2157299、ALK5i和ALK5抑制剂II；(b)甲状腺激素，选自T3、T4、它们的类似物和它们的混合物；(c)肝素；(d)硫酸锌；(e)抗氧化剂，选自维生素E、维生素C、乙酰基半胱氨酸、抗氧化剂补充剂A1345、谷胱甘肽、过氧化物歧化酶、过氧化氢酶以及它们的组合；(f)优选地为极光激酶抑制剂II的极光激酶抑制剂、优选地为RSK抑制剂II的RSK抑制剂、以及优选地为EPZ 5676的蛋白质甲基转移酶DOT1L抑制剂中的一种或多种，并且优选地在空气-液体界面处培养约七至二十一天，优选地约七至十天，更优选地约七天以使第6阶段细胞分化成第7阶段细胞。在一个实施方案中，生长培养基补充有T3、T4、其类似物及其混合物，ALK5抑制剂，抗氧化剂和极光激酶抑制剂优选极光激酶抑制剂II，或RSK抑制剂优选RSK抑制剂II。可通过用补充有约10000nM的ALK5抑制剂II、约1000nM的T3、约10μM的6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸(“Trolox”)，以及约1μM至约1μM的极光激酶抑制剂II或RSK抑制剂II的培养基处理约七天，来使第6阶段细胞分化成第7阶段细胞。

在一个实施方案中，可通过用补充有约10000nM的ALK5抑制剂、约1μM的T3、约2μM的极光激酶抑制剂II、RSK抑制剂II和EPZ 5676中的一种或多种，以及约1mM的N-乙酰基半胱氨酸的培养基处理，来使第6阶段细胞分化成第7阶段细胞。另选地，还可添加约0.25μM的SANT-1、约50nM的RA、约0.25mM的抗坏血酸、以及约100nM的LDN-193189中的一种或多种。

另选地，可通过用补充有肝素、T3、T4、其类似物或其混合物、ALK5抑制剂、抗氧化剂、和极光激酶抑制剂、RSK抑制剂、DOT1L的蛋白甲基转移酶抑制剂或它们的混合物的培养基处理，并且优选地在空气-液体界面处培养约七至二十一天、或者约七至十天、优选地约七天，来使第6阶段细胞分化成第7阶段细胞。在另选的实施方案中，培养基可补充有视黄酸、SMO抑制剂、SHH信号转导途径拮抗剂、BMP受体抑制剂和N-乙酰基半胱氨酸中的一种或多种。

在优选的实施方案中，ALK5抑制剂为ALK5抑制剂II。在更优选的实施方案中，使用约10000nM的ALK5抑制剂II。因此，在一个实施方案中，可通过用补充有肝素、T3、T4、其类似物及其混合物、和ALK5抑制剂、抗氧化剂、以及极光激酶抑制剂、RSK抑制剂、或蛋白甲基转移酶DOT1L的抑制剂的培养基处理，并且优选地在空气-液体界面处培养约七天，来使第6阶段细胞分化成第7阶段细胞。在某些实施方案中，在空气-液体界面处培养之前，可用细胞脱附溶液处理细胞，所述细胞脱附溶液为诸如包含蛋白水解酶和胶原蛋白酶的溶液。在本发明的特别优选的实施方案中，将极光激酶抑制剂优选极光激酶抑制剂II、RSK抑制剂优选RSK抑制剂II、以及蛋白质甲基转移酶DOT1L的抑制剂优选EPZ 5676中的一种或多种添加到培养基中。所添加的量可为约100nM至5000nM，或者约1000nM至5000nM，或者约2000nM至5000nM，或者约3000nM至5000nM，并且优选地约1000nM至2000nM的极光激酶抑制剂，更优选地约2000nM的极光激酶或RSK抑制剂，或约100nM至500nM的DOT1L抑制剂，并且更优选地约1μM至约10nM的DOT1L抑制剂。

根据前述方法，本发明还提供了一种用于使表达胰腺内胚层/内分泌前体细胞的特征性标志物的细胞分化成表达成熟胰腺内分泌细胞的特征性标志物的细胞的细胞培养物，所述细胞培养物包括：(a)培养容器；(b)所述容器内一定体积的生长培养基，该体积足以填充所述容器的体积的仅一部分；(c)所述容器内的空气，该空气填充邻接所述培养基的所述容器的一部分；(d)位于所述培养基和所述空气之间的界面处的多孔基质；以及(d)表达衍生自设置在所述基质表面上以使得所述培养基接触所述细胞表面的仅一部分的多能干细胞的胰腺内胚层/内分泌前体细胞的特征性标志物的细胞。

在一个实施方案中，利用根据本发明的实施方案培养的第6阶段细胞并且使所述细胞分化成第7阶段细胞，而在其它实施方案中可利用根据其它方案培养的第6阶段细胞。

在另一个实施方案中，本发明的方法导致第7阶段细胞的形成，所述第7阶段细胞是单激素阳性的。因此，在一个实施方案中，本发明的方法产生共表达NKX6.1、胰岛素、PDX1和MAFA的第7阶段细胞。在另一个实施方案中，本发明的方法产生共表达NKX6.1、PDX1、胰岛素和MAFA的第7阶段细胞。在另外的实施方案中，产生细胞群，其中至少约10％，或者至少约20％，或者至少约30％，或者至少约40％，或者至少约50％，或者至少约60％，或者至少约70％，或者至少约80％，或者至少约90％的细胞群的细胞中的每个表达胰岛素、PDX1、NKX6.1和MAFA。

在本发明的某些优选实施方案和优选实施方案中，该方法在第4至第7阶段或第4阶段后期至第7阶段，或第5、第6和第7阶段采用BLAR定制培养基(表I)。培养基可优选地每天更换或另选地每隔一天更换。在另一个实施方案中，本发明涉及形成共表达NKX6.1、PDX1、MAFA和胰岛素的第7阶段细胞的方法，该方法包括在空气-液体界面处培养第4阶段细胞，优选地第4阶段后期细胞至第7阶段细胞。在又一个实施方案中，本发明涉及通过在空气-液体界面处培养第4阶段细胞，优选地第4阶段后期细胞至第7阶段细胞来形成表达NKX6.1、PDX1和MAFA的第7阶段细胞的单激素胰岛素阳性的细胞的方法。

根据本文所述的方法生成的第6阶段细胞和第7阶段细胞还适用于根据化合物对胰腺激素和内分泌标志物的分泌的影响来筛选化合物。具体地讲，在ALI处培养的第4阶段细胞至第7阶段细胞可以来自384至6孔形式的不同培养形式进行测试。这样的形式允许在随后表达的胰腺内胚层、胰腺内分泌前体、胰腺内分泌和胰腺β细胞标志物上以各种剂量和时间间隔来评估各种小分子或生物制剂。此类评估可通过以下方式实现：用PCR测量基因表达，用FACS、或免疫染色测量蛋白质表达，或用ELISA来测量受到小分子/生物制剂的添加影响的细胞的细胞因子分泌。

可通过本发明的方法获得的细胞

本发明提供可通过本发明的方法获得的细胞或细胞群。本发明还提供优选地表达成熟表型的胰腺内分泌细胞的特征性标志物的细胞或细胞群。本发明还提供了胰岛素阳性细胞或胰岛素阳性细胞群，其优选地表达由NKX6.1表达(优选地大于约30％)、PDX1表达(优选地大于约30％)和MAFA表达(优选地大于约10％)表征的成熟表型的胰腺内分泌细胞特征性标志物。

治疗方法

本发明提供了治疗方法，特别是用于治疗患有糖尿病或具有发展糖尿病风险的患者。本发明还提供可通过本发明的方法获得或已通过本发明的方法获得以用于治疗方法的细胞群。具体地讲，本发明提供可通过本发明的方法获得或已通过本发明的方法获得以用于治疗患有糖尿病，或具有发展糖尿病风险的人的方法的细胞或细胞群。糖尿病可为1型糖尿病或2型糖尿病。

在一个实施方案中，治疗方法包括将已通过本发明的方法获得或可通过本发明的方法获得的细胞植入患者体内。在一个实施方案中，治疗方法包括使多能细胞在体外分化成第1阶段、第2阶段、第3阶段、第4阶段、第5阶段、第6阶段或第7阶段细胞，例如如本文所述，以及将分化的细胞植入患者体内。在另一个实施方案中，该方法还包括在使多能干细胞分化的步骤之前，例如如本文所述的培养多能干细胞的步骤。在又一个实施方案中，该方法还包括植入步骤之后的在体内分化细胞的步骤。在一个实施方案中，通过任意方法治疗的患者是哺乳动物，并且优选地是人。

在一个实施方案中，可将这些细胞作为分散的细胞植入，或可使这些细胞形成簇，可将这些细胞簇输注到血管系统，例如肝门静脉内。另选地，可将细胞设置在生物相容性的可降解聚合物型支持物中、多孔的非可降解性装置中或可进行封装以保护其免受宿主的免疫系统的破坏。在一个实施方案中，治疗方法还包括在移植前将所述细胞结合到三维支承体中。这些细胞在被移植到病患体内前，在体外时可一直维持在该支承体上。另选地，无需另外的体外培养，包含这些细胞的支承体能够直接植入病患体内。可任选地将至少一种有利于移植细胞存活并发挥功能的药剂掺入该支承体。细胞可植入到接收者的适当部位中，包括例如肝脏、天然的胰腺、肾包膜下空间、网膜、腹膜、浆膜下空间、肠、胃或皮下袋。

为了促进植入细胞在体内进一步分化，并保证其体内存活率或活性，可在施加细胞前、施加细胞的同时或在施加细胞后向受体施加另外的因子，诸如生长因子、抗氧化剂或抗炎剂。这些因子可由内源性细胞分泌，并原位暴露于施加的细胞。可通过本领域已知的内源施加生长因子和外源施加生长因子的任意组合诱导植入细胞分化。

用于植入的细胞量取决于多种因素(包括植入受检者的状况和对植入疗法的响应度)，并可由本领域技术人员确定。

本发明将通过以下非限制性实施例进一步阐明。

实施例

实施例1

在空气-液体界面处培养的胰腺内胚层细胞-从第5阶段到第7阶段MAFA的表达逐渐增加

该实施例示出在第5至第7阶段期间在空气-液体界面(“ALI”)处培养并且从第5阶段至第7阶段用T3和ALK5抑制剂II处理的胰腺内胚层细胞中MAFA表达的动力学。将第42代的人胚胎干细胞系H1的细胞(WA01细胞，WiCell Research Institute,Madison,Wisconsin)在以下所述的培养基中作为单细胞以1×10⁵个细胞/cm²接种在以1:30稀释的MATRIGEL^TM(Corning Incorporated,Corning New York，目录号354230)涂覆的培养皿上：杜尔贝科改良伊格尔培养基；营养混合物F-12(“DMEM-F12”)(Life Technologies Corporation,Carlsbad,California，目录号11330-032)，以1:100稀释的GlutaMAX^TM(Life Technologies，目录号35050-079)(“1X浓度”)，0.25mM抗坏血酸(Sigma Aldrich Co.LLC,St.Louis Missouri，目录号A4544)，100ng/ml的成纤维细胞生长因子2(“FGF2”)(R&D Systems,Minneapolis,Minnesota，目录号233-FB-025)，1ng/ml的转化生长因子β(“TGF-β”)(R&D Systems Inc.，目录号240-B-002)，以1:100稀释的胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺(“ITS-X”)(Life Technologies，目录号51500056)，2％不含脂肪酸的牛血清白蛋白(“FAF-BSA”)(Proliant,Inc.,Boone,Idaho，目录号68700)，以及20ng/ml的胰岛素样生长因子-1(“IGF-1”)(R&D Systems，目录号291-G1-200)，该培养基补充有10μM的Rock抑制剂Y-27632(目录号Y0503，Sigma-Aldrich)。接种后四十八小时，将培养物在不完全PBS(不含镁或钙的磷酸盐缓冲盐水)中洗涤，然后用1x的TrypLE^TMExpress Enzyme(Life Science，目录号14190)在37℃下温育3至5分钟。释放的细胞用DMEM-F12冲洗并以1000rpm旋转5分钟。将所得细胞沉淀物重悬于补充有以下物质的DMEM-F12中：10μM的Y-27632、以1:100稀释的GlutaMAX^TM(“1X浓度”)、0.25mM抗坏血酸、100ng/ml的FGF2、1ng/ml的TGF-β、以1:100稀释的ITS-X、2％的FAF-BSA和20ng/ml的IGF-1，并且将单细胞悬浮液以大约1.3至1.5×10⁵个细胞/cm²接种。每天用培养基向培养物进料，并且根据以下方案，分化在接种后48小时引发，从而导致约90％的起始汇合度。在所使用的分化方案的第1至第4阶段期间，培养物在平面贴壁培养物上并且在空气-液体界面处维持第5至第7阶段。

第1阶段(3天)：

将细胞铺在MATRIGEL^TM(1:30稀释)涂覆的培养皿上，首先用1X不完全DPBS冲洗所述细胞，然后在该阶段和所使用以下阶段中在以下第1阶段培养基中培养一天：MCDB-131培养基(Life Technologies，目录号10372-019)，其补充有0.5％的FAF-BSA、1.2g/1000ml的碳酸氢钠(Sigma-Aldrich，目录号S3187)、浓度为1X的GlutaMAX^TM、4.5mM的D-葡萄糖(Sigma-Aldrich，目录号G8769)，以获得浓度为10mM的葡萄糖(Sigma-Aldrich，目录号G8769)、100ng/ml生长/分化因子8(“GDF8”)(Peprotech,Rocky Hill,New Jersey，目录号120-00)，以及1μM的14-丙-2-烯-1-基-3,5,7,14,17,23,27-七氮杂四环[19.3.1.1～2,6～.1～8,12～]二十七烷酸甲酯-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-壬烷-16-酮(“MCX化合物”)。细胞随后在补充有以下物质的MCDB-131培养基中再培养一天：0.5％的FAF-BSA、0.0012g/ml的碳酸氢钠、1X浓度的GlutaMAX^TM、4.5mM的D--葡萄糖、100ng/ml的GDF8和0.1μM的MCX化合物。细胞随后在补充有以下物质的MCDB-131培养基中再培养一天：0.5％的无脂肪酸BSA、1.2g/1000ml的碳酸氢钠、1X的GlutaMAX^TM、4.5mM的D--葡萄糖和100ng/ml的GDF8。

第2阶段(2天)：

首先用1X的不完全DPBS冲洗细胞，然后用补充有以下物质的MCDB-131培养基处理两天：0.5％的FAF-BSA、1.2g/1000ml的碳酸氢钠、1X的GlutaMAX^TM、4.5mM的D-葡萄糖、0.25mM的抗坏血酸和25ng/ml的FGF7(R&D Systems,Inc.，目录号251-KG.)。

第3阶段(2天)：

用补充有以下物质的BLAR定制培养基(由Life Technologies制造，表I上列出的组分)将细胞处理两天：1:200稀释的ITS-X，4.5mM的葡萄糖，1X的GlutaMAX^TM，2.5g/1000ml的碳酸氢钠，2％的FAF-BSA，0.25μM的SANT-1(N-[(3,5-二甲基-1-苯基-1H-吡唑-4-基)亚甲基]-4-(苯基甲基)-1-哌嗪胺)(Sigma Aldrich，目录号S4572)，1μM的视黄酸(“RA”)(Sigma Aldrich，目录号R2625)，25ng/ml的FGF7，0.25mM的抗坏血酸，200nM的PKC活化剂((2S,5S-(E,E)-8-(5-(4-三氟甲基)苯基-2,4,-戊二烯基氨基)苯并内酰胺(“TPB”)(EMD Millipore Corporation,Gibbstown,New Jersey，目录号565740)，以及100nM的骨形态发生蛋白质(“BMP”)受体抑制剂LDN-193189(Shanghai ChemPartners Co Ltd.,Shanghai,China)。

第4阶段(3天)：

将细胞用补充有以下物质的BLAR培养基处理三天：1:200稀释的ITS-X、4.5mM的葡萄糖、1X浓度的GlutaMAX^TM、2.5g/1000ml的碳酸氢钠、2％的FAF-BSA、0.25μM的SANT-1、100nM的RA、2ng/ml的FGF7、100nM的LDN-193189、0.25mM的抗坏血酸、以及200nM的TPB。在第4阶段(3天)结束时，在平皿上培养的细胞用10μM的Y27632处理4小时，用PBS冲洗，然后在室温下用1X浓度的酶TrypLE^TMExpress Enzyme(LifeTechnologies Corporation，目录号12604-013)处理5分钟，之后去除所述酶，用BLAR培养基冲洗，然后用细胞刮棒刮擦所述细胞。将所得的细胞悬浮液以0.5-0.75×10⁶个细胞的密度(在5-10l的等分试样中)接种到6孔板中的0.4微米多孔细胞培养物过滤器芯子(Corning，目录号353493)上。将1.5ml的培养基添加至每一滤芯的底部，并且不另外添加培养基至过滤器的顶上侧或顶侧。在第5、第6和第7阶段的持续时间每天更换培养基。

第5阶段(3天)：

将在空气-液体界面处培养的细胞用补充有以下物质的BLAR培养基处理三天：1:200稀释的ITS-X、用以实现最终浓度为20mM的葡萄糖的葡萄糖，1X的GlutaMAX^TM，1.5g/1000ml的碳酸氢钠，2％的FAF-BSA，0.25mM的抗坏血酸，10μg/ml的肝素(Sigma Aldrich，目录号H3149)，10μM的ZnSO₄(Sigma Aldrich，目录号Z0251)，0.25μM的SANT-1，50nM的RA，100nM的LDN-193189，1μM的呈3,3',5-三碘-L-甲腺原氨酸钠盐形式的T3(Sigma Aldrich，目录号T6397)，10000nM的2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)-1,5-萘啶(“ALK5抑制剂II”)(Enzo Life Sciences,Inc.,Farmingdale,New York，目录号ALX-270-445)。

第6阶段(7天)：

将第5阶段细胞用补充有以下物质的BLAR培养基处理7天：1:200稀释的ITS-X，用以实现最终浓度为20mM的葡萄糖的葡萄糖，1X浓度的GlutaMAX^TM，1.5g/ml的碳酸氢钠，2％的FAF-BSA，0.25mM的抗坏血酸，10μg/ml的肝素，10μM的ZnSO₄，100nM的LDN-193189，1μM的T3，100nM的(S,S)-2-[2-(3,5-二氟苯基)乙酰基氨基]-N-(5-甲基-6-氧代-6,7-二氢-5H-二苯并[b,d]氮杂卓-7-基)丙酰胺(“γ分泌酶抑制剂XX”)(EMD Millipore，目录号565789)，以及10000nM的ALK5抑制剂II。

第7阶段(7天)：

将第6阶段细胞用补充有以下物质的BLAR培养基处理7-15天：1:200稀释的ITS-X，用以实现最终浓度为20mM的葡萄糖的葡萄糖，1X的GlutaMAX^TM，1.5g/1000ml的碳酸氢钠，2％的FAF-BSA，10μg/ml的肝素，10μM的ZnSO₄，1μM的T3，10000nM的ALK5抑制剂II，10μM的维生素E类似物Trolox(EMD Millipore，目录号648471)。

图1A至图1M示出了来自如实施例1中所概述分化的人胚胎干细胞系H1的细胞中下列基因的实时PCR分析的数据：PDX1(图1A)，NKX6.1(图1B)，PAX4(图1C)，PAX6(图1D)，NGN3(图1E)，MAFA(图1F)，ABCC8(图1G)，嗜铬粒蛋白-A(图1H)，G6PC2(图1I)，IAPP(图1J)，胰岛素(图1K)，胰高血糖素(图1L)，以及PTF1a(图1M)。如图1F所示，将第4阶段和第5阶段与第6阶段和第7阶段比较，在MAFA中存在明显增加或上调，这表明细胞朝向β细胞谱系提高的成熟。然而，在第6阶段和第7阶段处，对于MAFA的mRNA表达低于成人胰岛。

对于各个阶段的另外表征，在第3、第4、第5、第6和第7阶段处收获细胞，并通过荧光激活流式细胞术(“FACS”)分析。如Diabetes,61,2016,2012中所述并且使用表III中列出的抗体进行FACS染色。简言之，将细胞在37℃下在TrypLE^TMExpress(Life Technologies，目录号12604)中温育3-5分钟，并释放到单细胞悬浮液中，此后用含有0.2％的BSA的PBS的染色缓冲液(BD Sciences，目录号554657)将所述细胞洗涤两次。将细胞(1×10⁵至1×10⁶)重悬于用于表面标记的染色缓冲液中以1:4稀释的0.5％人γ球蛋白的100μl封闭缓冲液中。以1:20的最终稀释度向细胞中加入直接缀合的一抗，然后在4℃下温育30分钟。将染色的细胞在染色缓冲液中洗涤两次，随后在200μl染色缓冲液中再悬浮，然后在15μl的7AAD中温育以进行活/死鉴别，之后在BD Canto II上进行FACS分析。通过首先在4℃下用绿色荧光LIVE/DEAD细胞染料(Life Technologies，目录号L23101)温育20分钟，随后在冷PBS中单次洗涤来完成细胞内抗体染色。细胞的固定在250μl的Cytofix/Cytoperm缓冲液(BD目录号554723)中，随后将细胞重悬于具有2％正常山羊血清的100μl的Perm洗涤缓冲液染色/封闭溶液中。细胞在4℃下与以凭经验预先确定的稀释度的一抗一起温育30分钟，随后在Perm/洗涤缓冲液中洗涤两次。然后将细胞与合适的抗体在4℃下一起温育30分钟，随后洗涤两次，之后在BD FACS Canto II上进行分析。所用的抗体的浓度示于表III。使用人胰岛或未分化的H1细胞作为阳性对照测试胰腺标志物的抗体的特异性。对于二抗，加入以下物质并在4℃下温育30分钟：1:500的抗小鼠647(Life Technologies)，1:200(体积)的山羊抗兔PE或1:800的驴抗山羊Alexa 647Alexa(Life Technologies)，随后在Perm/洗涤缓冲液中最后洗涤，并且使用BD FACS Diva软件在BD FACS Canto II上进行分析，获得至少30,000个事件。

图2至图6分别描绘了在第3、第4、第5、第6和第7阶段收集的细胞的FACS分布图。如图4所示，在第5阶段，大约15％的细胞共表达胰岛素和NKX6.1，并且大约21％的PDX1阳性细胞在活跃细胞周期中，如通过PDX1和KI-67的共表达所测量的(约23％；KI-67指示细胞处于活跃细胞周期中)。然而，到第6阶段和第7阶段(图5和图6)，存在显著的PDX1+细胞增殖下降(1-2％)，同时存在共表达胰岛素的NKX6.1+细胞的数目的显著增长(在第6阶段约39％，并且在第7阶段约50％)。此外，存在表达内分泌前体标志物ISL-1、NeuroD1和NKX2.2的细胞的显著增多。这些结果表明第6阶段和第7阶段的培养物允许细胞从增殖祖细胞命运脱离而快速成熟为早熟内分泌细胞。此外，通过从第6阶段延长到第7阶段，观察到共表达胰岛素和NXK6.1的细胞的百分比的增长(33％)(图5相比于图6)。图7总结了来自第3阶段至第7阶段的多个胰腺内胚层(FOXA2、PDX-1、NKX6.1)、未分化的ES细胞(Oct3/4)、内分泌物(Pax6、ISl-1、NKX2.2、嗜铬粒蛋白)、和激素(胰岛素、胰高血糖素)的百分比表达。

实施例2

用以识别可显著上调MAFA和胰岛素表达中的一者或两者的小分子的筛选

该实施例涉及识别可以显着增强细胞朝向胰腺β细胞的成熟的小分子。将第42代人胚胎干细胞系H1的细胞(WA01)作为单细胞以1×10⁵个细胞/cm²接种在MATRIGEL^TM(1:30稀释)涂覆的培养皿上的培养基中，所述培养基包含DMEM-F12、GlutaMax^TM(1:100稀释)、0.25mM的抗坏血酸、100ng/ml的FGF2(R&D systems,MN)、1ng/ml的TGF-β、ITS-X(1:100稀释)、2％的FAF-BSA，以及20ng/ml的IGF-1，所述培养基补充有10μM的Y-27632。接种后四十八小时，将培养物在不完全PBS(不含Mg或Ca的磷酸盐缓冲盐水)中洗涤，然后用1x的TrypLE^TMExpress Enzyme(Life Science，目录号14190)在37℃下温育3至5分钟。释放的细胞用DMEM-F12冲洗并以1000rpm旋转5分钟。将所得细胞沉淀物重悬于补充有以下物质的DMEM-F12中：10μM的Y-27632、1X的GlutaMAX^TM、0.25mM的抗坏血酸、100ng/ml的FGF2、1ng/ml的TGF-β、以1:100稀释的ITS-X、2％的FAF-BSA和20ng/ml的IGF-1，并且将单细胞悬浮液以大约1.3至1.5×10⁵个细胞/cm²接种。每天用培养基向培养物进料，并且根据以下方案，分化在接种后48小时引发，从而导致约90％的起始汇合度。除非另有说明，否则该实施例中使用的培养基、试剂、分子等的来源如实施例1中所述。

第1阶段(3天)：

将细胞铺在MATRIGEL^TM(1:30稀释)涂覆的培养皿上，首先用1X不完全DPBS冲洗所述细胞，然后在第1阶段培养基中培养一天：补充有0.5％的FAF-BSA、0.0012g/ml的碳酸氢钠、1X浓度的GlutaMAX^TM、4.5mM的D--葡萄糖、100ng/ml的GDF8和1μM的MCX化合物的MCDB-131培养基。细胞随后在补充有以下物质的MCDB-131培养基中再培养一天：0.5％的FAF-BSA、0.0012g/ml的碳酸氢钠、1X浓度的GlutaMAX^TM、4.5mM的D--葡萄糖、100ng/ml的GDF8和0.1μM的MCX化合物。细胞随后在补充有以下物质的MCDB-131培养基中再培养一天：0.5％的FAF-BSA、0.0012g/ml的碳酸氢钠、1X浓度的GlutaMAX^TM、4.5mM的D--葡萄糖、以及100ng/ml的GDF8。

第2阶段(2天)：

首先用1X的不完全DPBS冲洗细胞，然后用补充有以下物质的MCDB-131培养基处理两天：0.5％的FAF-BSA、0.0012g/ml的碳酸氢钠、1X浓度的GlutaMAX^TM、4.5mM的D-葡萄糖、0.25mM的抗坏血酸和25ng/ml的FGF7。

第3阶段(2天)：

将细胞用补充有以下物质的BLAR定制培养基处理两天：1:200稀释的ITS-X、4.5mM的葡萄糖、1X浓度的GlutaMAX^TM、0.0025g/ml的碳酸氢钠、2％的FAF-BSA、0.25μM的SANT-1、1μM的RA、25ng/ml的FGF7、0.25mM的抗坏血酸、200nM的TPB，以及100nM的LDN-193189。

第4阶段(3天)：

将细胞用补充有以下物质的BLAR培养基处理三天：1:200稀释的ITS-X、4.5mM的葡萄糖、1X浓度的GlutaMAX^TM、0.0025g/ml的碳酸氢钠、2％的FAF-BSA、0.25μM的SANT-1、100nM的RA、2ng/ml的FGF7、100nM的LDN-193189、0.25mM的抗坏血酸、以及200nM的TPB，随后在第4阶段结束时，在平皿上培养的细胞用10μM的Y-27632处理4小时，用PBS冲洗，然后在室温下用1X浓度的TrypLE^TM处理5分钟，之后去除所述酶，用BLAR基础培养基冲洗，然后用细胞刮棒刮擦所述细胞。将所得的细胞悬浮液以0.5-0.75×10⁶个细胞的密度(在5-10l的等分试样中)接种到6孔板中的0.4微米多孔细胞培养物过滤器芯子上。将1.5ml的培养基添加至每一滤芯的底部，并且不另外添加培养基至过滤器的顶上侧。在第5、第6和第7阶段的持续时间每天更换培养基。

第5阶段(3天)：

将在空气-液体界面处培养的细胞用补充有以下物质的BLAR培养基处理三天：1:200稀释的ITS-X、20mM的葡萄糖、1X的GlutaMAX^TM、0.0015g/ml的碳酸氢钠、2％的FAF-BSA、0.25mM的抗坏血酸、10μg/ml的肝素、10μM的ZnSO₄、0.25μM的SANT-1、50nM的RA、100nM的LDN-193189、1μM为3,3',5-三碘-L-甲腺原氨酸钠盐的T3，以及10000nM的ALK5抑制剂II。

第6阶段(7天)：

将在空气-液体界面处培养的第5阶段细胞用补充有以下物质的BLAR培养基处理7天：1:200稀释的ITS-X、20mM的葡萄糖、1X浓度的GlutaMAX^TM、0.0015g/ml的碳酸氢钠、2％的FAF-BSA、0.25mM的抗坏血酸、10μg/ml的肝素、10μM的ZnSO₄、100nM的LDN-193189、1μM为3,3',5-三碘-L-甲腺原氨酸钠盐的T3、100nM的γ分泌酶抑制剂XX，以及10000nM的ALK5抑制剂II。

第7阶段(7天)：

在空气-液体界面处培养第6阶段细胞并且用补充有以下物质的BLAR培养基处理7天：1:200稀释的ITS-X、20mM的葡萄糖、1X浓度的GlutaMAX^TM、0.0015g/ml的碳酸氢钠、2％的FAF-BSA、10μg/ml的肝素、10μM的ZnSO₄、1000nM为3,3',5-三碘-L-甲腺原氨酸钠盐的T3、10000nM的ALK5抑制剂II、10μM的Trolox。

在第6阶段或第7阶段，添加各种小分子，并通过实时PCR评估它们的效果。表III列出所评估的小分子及其添加时间。

如图8A至图8E所示，其为示出来自分别与在第6阶段和第7阶段的未处理培养物相比在用小分子处理，添加EPZ-5676(蛋白质甲基转移酶DOT1L的抑制剂)和AXL抑制剂(R428)之后，显著上调MAFA的表达的胰岛素和MAFA表达的实时PCR分析的数据的图表。

实施例3(假想例)

在悬浮培养物中共表达胰岛素、PDX-1、NKX6.1和MAFA的内分泌细胞的生成

将人胚胎干细胞系H1的细胞(WA01)作为单细胞以1×10⁵个细胞/cm²接种在MATRIGEL^TM(1:30稀释)涂覆的培养皿上的培养基中，所述培养基包含DMEM-F12、GlutaMax^TM(1:100稀释)、0.25mM的抗坏血酸、100ng/ml的FGF2(R&D systems,MN)、1ng/ml的TGF-β、ITS-X(1:100稀释)、2％的FAF-BSA，以及20ng/ml的IGF-1，所述培养基补充有10μM的Y-27632。接种后四十八小时，将培养物在不完全PBS(不含Mg或Ca的磷酸盐缓冲盐水)中洗涤，然后用1x的TrypLE^TMExpress Enzyme在37℃下温育3至5分钟。释放的细胞用DMEM-F12冲洗并以1000rpm旋转5分钟。将所得细胞沉淀物重悬于补充有以下物质的DMEM-F12中：10μM的Y-27632、1X的GlutaMAX^TM、0.25mM的抗坏血酸、100ng/ml的FGF2、1ng/ml的TGF-β、以:100稀释的ITS-X、2％的FAF-BSA和20ng/ml的IGF-1，并且将单细胞悬浮液以大约1.3至1.5×10⁵个细胞/cm²接种。每天用培养基向培养物进料，并且根据以下方案，分化在接种后48小时引发，从而导致约90％的起始汇合度。第1阶段至第4阶段维持在平面贴壁培养物上，而第5阶段至第7阶段维持在悬浮培养物中。

第1阶段(3天)：

将细胞铺在MATRIGEL^TM(1:30稀释)涂覆的培养皿上，首先用1X不完全DPBS冲洗所述细胞，然后在第1阶段培养基中培养一天：补充有0.5％的FAF-BSA、1.2g/1000ml的碳酸氢钠、1X浓度的GlutaMAX^TM、4.5mM的D--葡萄糖、100ng/ml的GDF8和1μM的MCX化合物的MCDB-131培养基。细胞随后在补充有以下物质的MCDB-131培养基中再培养一天：0.5％的FAF-BSA、1.2g/1000ml的碳酸氢钠、1X浓度的GlutaMAX^TM、4.5mM的D--葡萄糖、100ng/ml的GDF8和0.1μM的MCX化合物。细胞随后在补充有以下物质的MCDB-131培养基中再培养一天：0.5％的FAF-BSA、1.2g/1000ml的碳酸氢钠、1X浓度的GlutaMAX^TM、4.5mM的D--葡萄糖、以及100ng/ml的GDF8。

第2阶段(2天)：

首先用1X的不完全DPBS冲洗细胞，然后用补充有以下物质的MCDB-131培养基处理两天：0.5％的FAF-BSA、1.2g/1000ml的碳酸氢钠、1X浓度的GlutaMAX^TM、4.5mM的D-葡萄糖、0.25mM的抗坏血酸和25ng/ml的FGF7。

第3阶段(2天)：

将细胞用补充有以下物质的BLAR定制培养基处理两天：1:200稀释的ITS-X、4.5mM的葡萄糖、1X浓度的GlutaMAX^TM、2.5g/1000ml的碳酸氢钠、2％的FAF-BSA、0.25μM的SANT-1、1μM的RA、25ng/ml的FGF7、0.25mM的抗坏血酸、200nM的TPB，以及100nM的LDN-193189。

第4阶段(3天)：

将细胞用补充有以下物质的BLAR培养基处理三天：1:200稀释的ITS-X、4.5mM的葡萄糖、1X浓度的GlutaMAX^TM、2.5g/1000ml的碳酸氢钠、2％的FAF-BSA、0.25μM的SANT-1、100nM的RA、2ng/ml的FGF7、100nM的LDN-193189、0.25mM的抗坏血酸、以及200nM的TPB，随后在第4阶段结束时，在平皿上培养的细胞用10μM的Y-27632处理4小时，用PBS冲洗，然后在室温下用1X浓度的酶(Life Technologies，#A11105-01)处理5分钟，之后去除所述酶，并且用BLAR基础培养基冲洗，然后使用细胞刮棒刮擦所述细胞并且使其破碎成细胞簇(<100微米)。将细胞簇转移到125ml的一次性聚苯乙烯转瓶(Corning)中，并且在具有下文指定的第5阶段培养基的悬浮液中以80至100rpm旋转。

第5阶段(3天)：

将制备为簇的第4阶段细胞在补充有以下物质的BLAR培养基中的悬浮液中培养三天：1:200稀释的ITS-X、20mM的葡萄糖(最终)、1X的GlutaMAX^TM、1.5g/1000ml的碳酸氢钠、2％的FAF-BSA、0.25mM的抗坏血酸、10μg/ml的肝素、10μM的ZnSO₄、0.25μM的SANT-1、50nM的RA、100nM的LDN-193189、1μM为3,3',5-三碘-L-甲腺原氨酸钠盐的T3，以及10000nM的ALK5抑制剂II。

第6阶段(7天)：

第5阶段细胞在悬浮液中培养并且用补充有以下物质的BLAR培养基处理7天：1:200稀释的ITS-X、20mM的葡萄糖(最终)、1X浓度的GlutaMAX^TM、1.5g/1000ml的碳酸氢钠、2％的FAF-BSA、0.25mM的抗坏血酸、10μg/ml的肝素、10μM的ZnSO₄、100nM的LDN-193189、1μM为3,3',5-三碘-L-甲腺原氨酸钠盐的T3、100nM的γ分泌酶抑制剂XX，以及10000nM的ALK5抑制剂II。

第7阶段(15天)：

第6阶段细胞在悬浮液中培养并且用补充有以下物质的BLAR培养基处理至多15天：1:200稀释的ITS-X、20mM的葡萄糖(最终)、1X浓度的GlutaMAX^TM、0.0015g/ml的碳酸氢钠、2％的FAF-BSA、10μg/ml的肝素、10μM的ZnSO₄、1μM为3,3',5-三碘-L-甲腺原氨酸钠盐的T3、10000nM的ALK5抑制剂II、10μM的Trolox、1mM的N-乙酰基半胱氨酸，以及2μM的AXL抑制剂(R428)。

在第5-第7阶段，去除细胞簇的等分试样，并通过PCR、FACS和免疫组织化学表征胰岛素、NKX6.1、PDX-1和MAFA的共表达。预期这样的测试的结果将显示在相同细胞和细胞群中的胰岛素、PDX1、NKX6.1和MAFA的共表达，其中至少约10％的细胞群显示这样的表达。

实施例4

AXL和共配体GAS6的mRNA表达对于第7阶段或人胰岛细胞非常低。

将人胚胎干细胞系H1的细胞(WA01)作为单细胞以1×10⁵个细胞/cm²接种在MATRIGEL^TM(1:30稀释)涂覆的培养皿上的培养基中，所述培养基包含Essential 8^TM(“E8”)(BD Biosciences，目录号356231)。接种后48小时，将培养物在1x的不完全PBS中洗涤，然后用1x TrypLE^TMExpress Enzyme(Life Science，目录号14190)在37℃下温育3至5分钟。释放的细胞用E8冲洗并以1000rpm旋转5分钟。将所得细胞沉淀物重悬于补充有10μM的Y-27632的E8中，并且将单细胞悬浮液以大约1.3至1.5×10⁵个细胞/cm²接种。每天用E8培养基向培养物进料，并且根据以下方案，分化在接种后48小时引发，从而导致约90％的起始汇合度。

第1阶段(3天)：

将细胞铺在MATRIGEL^TM(1:30稀释)涂覆的培养皿上，首先用1X不完全DPBS冲洗所述细胞，然后在第1阶段培养基中培养一天：补充有0.5％的FAF-BSA、1.5g/1000ml的碳酸氢钠、1X浓度的Glutamax^TM、4.5mM的D--葡萄糖、100ng/ml的GDF8和1.5μM的MCX化合物的MCDB-131培养基。细胞随后在补充有以下物质的MCDB-131培养基中再培养一天：0.5％的FAF-BSA、1.5g/1000ml的碳酸氢钠、1X浓度的Glutamax^TM、4.5mM的D--葡萄糖、100ng/ml的GDF8和0.1μM的MCX化合物。细胞随后在补充有以下物质的MCDB-131培养基中再培养一天：0.5％的FAF-BSA、1.5g/1000ml的碳酸氢钠、1X浓度的Glutamax^TM、4.5mM的D--葡萄糖、以及100ng/ml的GDF8。

第2阶段(2天)：

首先用1X的不完全DPBS冲洗细胞，然后用补充有以下物质的MCDB-131培养基培养两天：0.5％的FAF-BSA、1.5g/1000ml的碳酸氢钠、1X浓度的Glutamax^TM、4.5mM的D-葡萄糖、0.25mM的抗坏血酸和50ng/ml的FGF7。

第3阶段(2天)：

将细胞在补充有以下物质的BLAR定制培养基中培养两天：1:100稀释的ITS-X、1X浓度的Glutamax^TM、4.5mM的D-葡萄糖、2.5g/1000ml的碳酸氢钠、2％的FAF-BSA、0.25μM的SANT-1、1μM的RA、25ng/ml的FGF7、0.25mM的抗坏血酸、300nM的TPB，以及100nM的LDN-193189。

第4阶段(3天)：

将细胞在补充有以下物质的BLAR培养基中培养三天：1:100稀释的ITS-X、1X浓度的Glutamax^TM、4.5mM的D-葡萄糖、2.5g/1000ml的碳酸氢钠、2％的FAF-BSA、0.25μM的SANT-1、0.1μM的RA、2ng/ml的FGF7、100nM的LDN-193189、0.25mM的抗坏血酸、以及200nM的TPB，随后在第4阶段结束时，在平皿上培养的细胞用10μM的Y-27632处理4小时，用1X的不完全PBS冲洗，然后在室温下用1X的TrypLE^TM处理3至5分钟。将酶去除，释放细胞并用BLAR培养基冲洗，并且将所述细胞转移到125ml的一次性聚苯乙烯转瓶中，并以1000rpm旋转3分钟。将所得细胞沉淀物作为单细胞以大约0.5×10⁵个细胞/cm²的密度重悬在过滤器芯子(BD Biosciences，目录号3420)上，(每个斑点5至10μL，总计0.25至0.5百万个细胞/斑点)。每个斑点区域的直径被测量为大约1mm至2mm，这取决于添加的细胞的体积。对于6孔芯子，将1.5mL/孔添加到每一滤芯的底部，而对于10cm过滤器芯子添加8mL。通常，6孔芯子的每个孔使用20至15个斑点，而对于10cm芯子使用80至90个斑点。

第5阶段(3天)：

将第4阶段细胞在补充有以下物质的BLAR培养基中培养三天：1:100稀释的ITS-X、20mM的葡萄糖(最终)、1.5g/1000ml的碳酸氢钠、2％的FAF-BSA、10μg/ml的肝素、10μM的ZnSO₄、0.25μM的SANT-1、0.05μM的RA、100nM的LDN-193189、1μM为3,3',5-三碘-L-甲腺原氨酸钠盐的T3，以及10μM的ALK5抑制剂II。

第6阶段(7天)：

将第5阶段细胞在补充有以下物质的BLAR培养基中培养7天：1:100稀释的ITS-X、20mM的葡萄糖(最终)、1.5g/1000ml的碳酸氢钠、2％的FAF-BSA、10μg/ml的肝素、10μM的ZnSO₄、100nM的LDN-193189、1μM为3,3',5-三碘-L-甲腺原氨酸钠盐的T3、100nM的γ分泌酶抑制剂XX，以及10μM的ALK5抑制剂II。

第7阶段(7天)：

将第6阶段细胞在补充有以下物质的BLAR培养基中培养7天：1:100稀释的ITS-X、20mM的葡萄糖(最终)、1.5g/L的碳酸氢钠、2％的FAF-BSA、10μg/ml的肝素、10μM的ZnSO₄、1μM为3,3',5-三碘-L-甲腺原氨酸钠盐的T3、10μM的ALK5抑制剂II、1mM的N-乙酰基半胱氨酸、以及2μM的AXL抑制剂(R428)。

在第4阶段第3天、第5阶段第3天、第6阶段第3天和第7阶段第7天，收集mRNA，并且与未分化的人干细胞和人尸体胰岛相比，评估AXL和GAS 6的表达(Prodo Labs,California)。如图9所示，AXL的表达在未分化干细胞中以高水平存在。然而，干细胞向胰腺内胚层、胰腺内分泌和未成熟β细胞的分化导致AXL表达急剧下降。此外，在第4至第7阶段维持了低水平的GAS6表达。与未分化的干细胞相比，AXL的表达在人胰岛中也显着降低。结果显示，第6阶段和第7阶段的细胞具有非常低的AXL表达。

实施例5

R428抑制AXL和许多另外的激酶

通过激酶简档服务(Kinase Profiling Services)使用100μM ATP浓度(EMD Millipore)评估AXL抑制剂R428靶向不同激酶的效率。在1μM和10μM下测试R428。表IV列出了激酶，所述激酶连同靶向具有较低数量的激酶的效率一起简档化，表明对特定激酶的更强抑制。

表IV-R428的激酶简档

激酶简档结果指示R428如预期地抑制AXL。然而，R428另外以1μM和10μM高效地抑制RSK3、Ret、Flt、FGFr1、AuroraA和AuroraB激酶。这表示R428在MAFA诱导中的作用机制可能不是通过AXL受体抑制。事实上，本文的实施例显示，在第7阶段AXL的mRNA表达非常低，从而突出显示R428在诱导MAFA表达中的作用机制不是通过抑制AXL，而是通过抑制其它激酶，诸如RSK3和极光激酶。

实施例6

在不存在R428的情况下在第7阶段抑制极光激酶表达增强的MAFA表达

将人胚胎干细胞系H1的细胞(WA01)作为单细胞以1×10⁵个细胞/cm²接种在MATRIGEL^TM(1:30稀释)涂覆的培养皿上的E8培养基中。在约70％至80％的汇合度下，将培养物在1x的不完全DPBS中洗涤，然后用1x的TrypLE^TMExpress Enzyme在37℃下温育3至5分钟。释放的细胞用E8冲洗并以1000rpm旋转5分钟。将所得细胞沉淀物重悬于补充有10μM的Y-27632的E8中，并且将单细胞悬浮液以大约1.3至1.5×10⁵个细胞/cm²接种。每天用E8培养基向培养物进料，并且根据以下方案，分化在接种后48小时引发，从而导致约90％的起始汇合度。

第1阶段(3天)：

将细胞铺在MATRIGEL^TM(1:30稀释)涂覆的培养皿上，首先用1X不完全DPBS冲洗所述细胞，然后在第1阶段培养基中培养一天：补充有0.5％的FAF-BSA、1.5g/1000ml的碳酸氢钠、10mM最终浓度的葡萄糖、100ng/ml的GDF8、以及1.5μM的MCX化合物的MCDB-131培养基。细胞随后在补充有以下物质的MCDB-131培养基中再培养一天：0.5％的FAF-BSA、1.5g/1000ml的碳酸氢钠、10mM最终浓度的葡萄糖、100ng/ml的GDF8和0.1μM的MCX化合物。细胞随后在补充有以下物质的MCDB-131培养基中再培养一天：0.5％的FAF-BSA、1.5g/1000ml的碳酸氢钠、10mM最终浓度的葡萄糖和100ng/ml的GDF8。

第2阶段(2天)：

用1X的不完全DPBS冲洗细胞，然后用补充有以下物质的MCDB-131培养基培养两天：0.5％的FAF-BSA、1.5g/1000ml的碳酸氢钠、10mM最终浓度的葡萄糖、0.25mM的抗坏血酸和50ng/ml的FGF7。

第3阶段(2天)：

将细胞在补充有以下物质的BLAR定制培养基中培养两天：1:100稀释的ITS-X、10mM最终浓度的葡萄糖、2.5g/1000ml的碳酸氢钠、2％的FAF-BSA、0.25μM的SANT-1、1μM的RA、25ng/ml的FGF7、0.25mM的抗坏血酸、300nM的TPB，以及100nM的LDN-193189。

第4阶段(3天)：

将细胞在补充有以下物质的BLAR培养基中培养三天：1:100稀释的ITS-X、10mM最终浓度的葡萄糖、2.5g/1000ml的碳酸氢钠、2％的FAF-BSA、0.25μM的SANT-1、0.1μM的RA、2ng/ml的FGF7、100nM的LDN-193189、0.25mM的抗坏血酸、以及200nM的TPB，随后在第4阶段结束时，在平皿上培养的细胞用10μM的Y-27632处理4小时，用1X的不完全PBS冲洗，然后在室温下用1X的TrypLE^TM处理3至5分钟。将酶去除，释放细胞并用BLAR培养基冲洗，并且将所述细胞转移到125ml的一次性聚苯乙烯转瓶中，并以1000rpm旋转3分钟。将所得细胞沉淀物作为单细胞以大约0.5×10⁵个细胞/cm²的密度重悬在过滤器芯子上，(每个斑点5至10μl，总计0.25至0.5百万个细胞/斑点)。每个斑点区域的直径被测量为大约1mm至2mm，这取决于添加的细胞的体积。对于6孔芯子，将1.5mL/孔添加到每一滤芯的底部，而对于10cm过滤器芯子添加8mL。通常，6孔芯子的每个孔使用20至15个斑点，而对于10cm芯子使用80至90个斑点。

第5阶段(3天)：

将第4阶段细胞在补充有以下物质的BLAR培养基中培养三天：1:100稀释的ITS-X、20mM的葡萄糖(最终)、1.5g/1000ml的碳酸氢钠、2％的FAF-BSA、10μg/ml的肝素、10μM的ZnSO₄、0.25μM的SANT-1、0.05μM的RA、100nM的LDN-193189、1μM为3,3',5-三碘-L-甲腺原氨酸钠盐的T3，以及10μM的ALK5抑制剂II。

第6阶段(7天)：

将第5阶段细胞在补充有以下物质的BLAR培养基中培养7天：1:100稀释的ITS-X、20mM的葡萄糖(最终)、1.5g/1000ml的碳酸氢钠、2％的FAF-BSA、10μg/ml的肝素、10μM的ZnSO₄、100nM的LDN-193189、1μM为3,3',5-三碘-L-甲腺原氨酸钠盐的T3、100nM的γ分泌酶抑制剂XX，以及10μM的ALK5抑制剂II。

第7阶段(7天)：

将第6阶段细胞在补充有以下物质的BLAR培养基中培养七天：1:100稀释的ITS-X、20mM的葡萄糖(最终)、1.5g/L的碳酸氢钠、2％的FAF-BSA、10μg/ml的肝素、10μM的ZnSO₄、1μM为3,3',5-三碘-L-甲腺原氨酸钠盐的T3、10μM的ALK5抑制剂II、1mM的N-乙酰基半胱氨酸。一些培养物还包含以下物质中的一者：2μM的R428、2μM的极光激酶抑制剂VI(4-(4-(N-苯甲酰基氨基)苯胺基)-6-甲氧基-7-(3-(1-吗啉基)丙氧基)喹唑啉)(EMD Millipore，目录号18941)、或2μM的极光激酶抑制剂II(4-(4'-苯甲酰氨基苯胺基)-6,7-二甲氧基喹唑啉)(EMD Millipore，目录号189404)。

在第7阶段第7天，收集mRNA，并且与未分化的人干细胞相比，评估MAFA、UCN3、PDX1、NKX6.1、胰岛素和G6PC2的表达。如图10所示，去除R428导致MAFA表达的显着降低。注意到未用R428处理的培养物的UCN3和G6PC2(这两种标志物是成熟β细胞)表达显著升高，这表明虽然R428增加MAFA表达，但是该化合物降低了其它β细胞成熟标志物。极光激酶抑制剂对R428的取代恢复MAFA表达而不降低G6PC2水平。因此，在第7阶段通过R428诱导MAFA表达可能不是通过AXL抑制，而是通过极光激酶的抑制。极光激酶抑制剂II的使用导致MAFA表达的增加以及UCN3和G6PC2表达的维持。

实施例7

在不存在R428的情况下在第7阶段抑制极光激酶或RSK增强MAFA表达

将人胚胎干细胞系H1(WA01)的细胞作为单细胞以1×10⁵个细胞/cm²接种在MATRIGEL^TM(1:30稀释)涂覆的培养皿上的E8培养基中。在约70％至80％的汇合度下，将培养物在1x的不完全DPBS中洗涤，然后用1x的TrypLE^TMExpress Enzyme在37℃下温育3至5分钟。释放的细胞用E8冲洗并以1000rpm旋转5分钟。将所得细胞沉淀物重悬于补充有10μM的Y-27632的E8中，并且将单细胞悬浮液以大约1.3至1.5×10⁵个细胞/cm²接种。每天用E8培养基向培养物进料，并且根据以下方案，分化在接种后48小时引发，从而导致约90％的起始汇合度。

第1阶段(3天)：

将细胞铺在MATRIGEL^TM(1:30稀释)涂覆的培养皿上，首先用1X不完全DPBS冲洗所述细胞，然后在第1阶段培养基中培养一天：补充有0.5％的FAF-BSA、1.5g/1000ml的碳酸氢钠、10mM最终浓度的葡萄糖、100ng/ml的GDF8、以及1.5μM的MCX化合物的MCDB-131培养基。细胞随后在补充有以下物质的MCDB-131培养基中再培养一天：0.5％的FAF-BSA、1.5g/1000ml的碳酸氢钠、10mM最终浓度的葡萄糖、100ng/ml的GDF8和0.1μM的MCX化合物。细胞随后在补充有以下物质的MCDB-131培养基中再培养一天：0.5％的FAF-BSA、1.5g/1000ml的碳酸氢钠、10mM最终浓度的葡萄糖和100ng/ml的GDF8。

第2阶段(2天)：

用1X的不完全DPBS冲洗细胞，然后用补充有以下物质的MCDB-131培养基培养两天：0.5％的FAF-BSA、1.5g/1000ml的碳酸氢钠、10mM最终浓度的葡萄糖、0.25mM的抗坏血酸和50ng/ml的FGF7。

第3阶段(2天)：

将细胞在补充有以下物质的BLAR定制培养基中培养两天：1:100稀释的ITS-X、10mM最终浓度的葡萄糖、2.5g/1000ml的碳酸氢钠、2％的FAF-BSA、0.25μM的SANT-1、1μM的RA、25ng/ml的FGF7、0.25mM的抗坏血酸、300nM的TPB，以及100nM的LDN-193189。

第4阶段(3天)：

将细胞在补充有以下物质的BLAR培养基中培养三天：1:100稀释的ITS-X、10mM最终浓度的葡萄糖、2.5g/1000ml的碳酸氢钠、2％的FAF-BSA、0.25μM的SANT-1、0.1μM的RA、2ng/ml的FGF7、100nM的LDN-193189、0.25mM的抗坏血酸、以及200nM的TPB，随后在第4阶段结束时，在平皿上培养的细胞用10μM的Y-27632处理4小时，用1X的不完全PBS冲洗，然后在室温下用1X的TrypLE^TM处理3至5分钟。将酶去除，释放细胞并用BLAR培养基冲洗，并且将所述细胞转移到125ml的一次性聚苯乙烯转瓶中，并以1000rpm旋转3分钟。将所得细胞沉淀物作为单细胞以大约0.5×10⁵个细胞/cm²的密度重悬在过滤器芯子上，(每个斑点5至10μl，总计0.25至0.5百万个细胞/斑点)。每个斑点区域的直径被测量为大约1mm至2mm，这取决于添加的细胞的体积。对于6孔芯子，将1.5mL/孔添加到每一滤芯的底部，而对于10cm过滤器芯子添加8mL。通常，6孔芯子的每个孔使用20至15个斑点，而对于10cm芯子使用80至90个斑点。

第5阶段(3天)：

将第4阶段细胞在补充有以下物质的BLAR培养基中培养三天：1:100稀释的ITS-X、20mM的葡萄糖(最终)、1.5g/1000ml的碳酸氢钠、2％的FAF-BSA、10μg/ml的肝素、10μM的ZnSO₄、0.25μM的SANT-1、0.05μM的RA、100nM的LDN-193189、1μM为3,3',5-三碘-L-甲腺原氨酸钠盐的T3，以及10μM的ALK5抑制剂II。

第6阶段(7天)：

将第5阶段细胞在补充有以下物质的BLAR培养基中培养7天：1:100稀释的ITS-X、20mM的葡萄糖(最终)、1.5g/1000ml的碳酸氢钠、2％的FAF-BSA、10μg/ml的肝素、10μM的ZnSO₄、100nM的LDN-193189、1μM为3,3',5-三碘-L-甲腺原氨酸钠盐的T3、100nM的γ分泌酶抑制剂XX，以及10μM的ALK5抑制剂II。

第7阶段(7天)：

将第6阶段细胞在补充有以下物质的BLAR培养基中培养十四天：1:100稀释的ITS-X、20mM的葡萄糖(最终)、1.5g/L的碳酸氢钠、2％的FAF-BSA、10μg/ml的肝素、10μM的ZnSO₄、1μM为3,3',5-三碘-L-甲腺原氨酸钠盐的T3、10μM的ALK5抑制剂II、1mM的N-乙酰基半胱氨酸。一些培养物还包含以下物质中的一者：2μM的R428、2-5μM的RSK抑制剂II(2-(3,5-二氟-4-羟基-苯胺基)-8-异戊基-5,7-二甲基-7H-蝶啶-6-酮)(EMD Millipore，目录号559286-5MG)，2-5μM的极光激酶抑制剂II(EMD Millipore)，或2-5μM的RSK抑制剂II和2-5μM的极光激酶II抑制剂的组合。

在第7阶段，第14天，收集mRNA并且与未分化的人干细胞相比。如图11所示，去除R428导致MAFA表达的显着降低。用极光激酶抑制剂II取代R428恢复MAFA表达。类似地，用RSK抑制剂取代R428恢复MAFA表达。用极光激酶抑制剂II和RSK抑制剂取代R428进一步增强MAFA表达。该数据表明，R428对MAFA表达的诱导可能不是通过AXL抑制，而是通过极光激酶、RSK或其组合的抑制。