本发明提供作为SMN2基因剪接调节剂的化合物、其制备、包含其的药物组合物及它们用作用于治疗SMN缺乏相关的病症(SMN-deficiency-related conditions)，特别是用于治疗脊髓性肌萎缩(spinal muscular atrophy)(SMA)的药物的用途。
特别地，本发明涉及式(I)化合物或其药用盐，
其中X1、X2、A、R1、R2、R3和R4如本文所述。
背景
脊髓性肌萎缩(SMA)以其最广泛的含义描述了以脊髓和脑干中进行性运动神经元损伤为特征的多种遗传性和获得性中枢神经系统(CNS)疾病，其造成肌无力和肌萎缩。SMA最常见的形式是由运动神经元存活(SMN)基因中的突变所引起的，并且表现为影响从婴儿到成年人的广泛严重性(Crawford和Pardo，Neurobiol.Dis.，1996，3：97)。
婴儿SMA是这种神经退行性病症的最严重形式。症状包括肌无力、肌张力低下、哭泣无力、跛行或摔倒倾向、吮吸或吞咽困难、肺或咽喉中分泌物积累、摄食困难和对呼吸道感染敏感度提高。腿部往往比手臂更无力，并且不能达到发育标志，如抬头或坐起。一般地，症状出现得越早，寿命就越短。由于运动神经元细胞恶化，随后不久出现症状。所述疾病的严重形式是致死的，并且所有形式均无已知的治愈。患有严重形式的SMA的婴儿由于支持呼吸的肌肉无力而经常死于呼吸道疾病。患有较轻形式的SMA的个体存活时间较长，但是他们可能需要广泛的医疗支撑，尤其是那些处于病症谱的更严重末期的患者。SMA病症的临床谱已被分成下列五组。
(a)0型SMA(子宫内SMA)是最严重的疾病形式并且在出生前开始。通常，0型SMA的首次症状是可以首先在妊娠30至36周之间观察到的胎儿运动减少。出生后，这些新生儿很少运动并且吞咽和呼吸困难。
(b)1型SMA(婴儿SMA或韦-霍二氏病(Werdnig-Hoffmann disease))在0至6个月出现症状，该类型的SMA也是非常严重的。患者永远不能实现坐起，并且由于无呼吸支持，死亡通常发生在头2年。
(c)2型SMA(过渡SMA)的发病年龄在7-18个月。患者能够实现无支持坐起，但是无法独立站立或行走。该组的预后很大程度上依赖于呼吸相关的程度。
(d)3型SMA(青少年SMA或库-韦二氏病(Kugelberg-Welander disease))通常在18个月后确诊。3型SMA个体在疾病过程期间在某些时候能够独立行走，但是在青年或成年期间通常会依靠轮椅。
(e)4型SMA(成年发病的SMA)。无力通常在青春期晚期在舌、手或足中开始，然后发展至身体的其他区域。成年SMA的过程更缓慢并且对预期寿命没有或几乎没有影响。
已通过对染色体5q中复杂区域的连锁分析获得SMN基因图谱(Lefebvre S.et al.，Cell(1995)80：155)。在人类中，该区域含有约50万个碱基对(kb)倒转复制，从而导致产生了两种几乎相同的SMN基因拷贝。SMA是由两个染色体上的基因(SMN1)的端粒拷贝的失活突变或缺失，从而导致SMN1基因功能丧失所引起的。然而，所有患者保留了基因(SMN2)的着丝粒拷贝，并且SMA患者中SMN2基因的拷贝数通常与疾病严重性负相关；即SMA不太严重的患者具有更多的SMN2拷贝。SMN2 pre-mRNA经过由外显子7中翻译沉默的C向T的突变所引起的外显子7的选择性剪接。因此，由SMN2产生的大部分转录物缺乏外显子7(Δ7 SMN2)并且编码具有受损的功能并且被快速降解的截短的SMN蛋白。
SMN蛋白在RNA加工和代谢中起作用，其具有良好鉴定的介导被称为snRNP的特定种类的RNA-蛋白质复合物组装的功能。在运动神经元中，SMN可以具有其他功能，然而，它在防止运动神经元选择性退化中的作用尚未得到很好的确认。
在大多数情况下，基于临床症状并且通过SMN1基因的外显子7的完全缺乏来诊断SMA。然而，在约5％的病例中，SMA是由除SMN1失活之外的基因突变所引起的，这些基因中的一些是已知的而其他的尚未确定。在一些情况下，当SMN1基因测试不可行或者未显示任何异常时，其他测试如肌电描记术(EMG)或肌肉活组织检查可以被指示。
目前，SMA患者的医疗护理限于支持疗法，包含呼吸、营养和康复护理；尚无已知的药物能够解决该疾病的根本病因。目前对SMA的治疗由预防和控制慢性运动单元丧失的继发作用组成。1型SMA中的主要控制问题是肺部问题的预防和早期治疗，这是大部分病例中造成死亡的原因。尽管一些患有SMA的婴儿生长至成年，但是1型SMA患者的预期寿命少于两年。
已开发了几种SMA小鼠模型。具体地，SMNΔ外显子7(Δ7 SMN)模型(Le等人，Hum.Mol.Genet.，2005，14：845)携带SMN2基因和Δ7 SMN2 cDNA的几个拷贝并且再现了1型SMA的多种表型特征。Δ7 SMN模型可以用于SMN2表达研究以及运动功能和存活的评价。C/C-等位基因小鼠模型(Jackson Laboratory品系#008714，The Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)提供了不太严重的SMA疾病模型但是不具有明显的肌无力。这种小鼠模型使鼠类Smn1基因失活并且带有完全SMN2基因和经过选择性剪接的杂合mSmn1-SMN2基因。C/C-等位基因小鼠具有降低水平的SMN2全长(FL SMN2)mRNA和SMN蛋白二者。C/C-等位基因小鼠模型用于SMN2表达研究。
由于对SMA的遗传基础和病理生理学的了解增加，已开发了几种治疗策略，但是均尚未在临床中显示成功。
使用病毒递送载体的对SMN1的基因置换和使用分化的SMN1+/+干细胞的细胞置换已在SMA动物模型中显示出效力。在这些方法可以应用于人之前，需要更多研究以确定安全性和免疫应答和解决在新生儿阶段开始治疗的要求。
利用合成核酸：(i)靶向SMN2前mRNA中的序列元件并使剪接反应的结果转向产生全长SMN2 mRNA的反义寡核苷酸(Passini等人，Sci.Transl.Med.，2011，3：72ra18；以及Hua等人，Nature，2011，478：123)；和(ii)提供在剪接期间替换突变体片段的完全功能性RNA序列并产生全长SMN1 mRNA的反式剪接RNA分子(Coady和Lorson，J Neurosci.，2010，30：126)还实现了培养细胞中SMN2的选择性剪接的修正。
正在研究的其他方法包括寻找提高SMN水平、增强残余SMN功能或补偿其降低的水平的药物。氨基糖苷类已显示通过促进异常终止密码予的翻译通读来增强由Δ7 SMN2 mRNA产生的稳定的扩展Δ7 SMN蛋白的表达，但是其具有较差的中枢神经系统渗透并且在反复剂量给药后是有毒的。化疗剂如阿柔比星(aclarubicin)已显示增加细胞培养物中的SMN蛋白；然而，这些药物的毒性特征阻止在SMA患者中的长期使用。正在临床研究的用于治疗SMA的一些药物包括转录激活剂如组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂(例如，丁酸酯、丙戊酸和羟基脲)以及mRNA稳定剂(来自Pfizer的mRNA脱帽抑制剂RG3039)，其旨在增加从SMN2基因转录的总RNA的量。然而，HDAC抑制剂或mRNA稳定剂的使用不能解决造成SMA的根本原因，并且在人中可能导致转录和基因表达的全局性提高，这具有潜在的安全性问题。
在一种替代方法中，已选择神经保护剂如奥利索西(Olesoxime)进行研究。这些策略的目标不在于SMN用于治疗SMA，而是进行开发以保护SMN缺陷型运动神经元免于神经退化。
已在国际专利申请WO2009/151546A1中描述了被设计成用于鉴别提高SMN的外显子7在从SMN2基因转录的RNA中包含的化合物的系统以及由此鉴别的某些苯并唑和苯并异唑化合物。已在国际专利申请WO2010/019236A1和WO2013/119916A2中描述了被设计成用于鉴别导致核糖体移码为由Δ7 SMN2 mRNA产生稳定化SMN蛋白的化合物以及由此鉴别的某些异二氢吲哚酮化合物。
尽管对SMA遗传基础和病理生理学了解取得了进展，但仍需要鉴别改变作为最具破坏性的儿童神经学疾病之一的脊髓性肌萎缩的病程的化合物。
发明详述
除非另外限定，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域中的普通技术人员通常理解的相同的含义。虽然与本文中所述那些类似或等效的方法和材料可以用于实施或测试本发明，以下描述合适的方法和材料。
本文中提及的所有出版物、专利申请、专利和参考文献通过引用完整地结合。
除非另外指出，本申请中使用的命名法是基于IUPAC系统命名法。
除非另外指出，本文中的结构中的碳、氧、硫或氮原子上出现的任何开放价表示存在氢。
不管所讨论的术语单独出现还是组合出现，本文中所述的定义都适用。预期的是，本文中所述的定义可被附加以形成化学相关组合，如例如“杂环烷基芳基”、“卤代烷基杂芳基”、“芳基烷基杂环烷基”或“烷氧基烷基”。组合中最后的成员是与分子的其余部分连接的基团。组合中的其他成员以与文字顺序相反的次序连接至所述结合基团，例如组合C1-7-烷氧基-杂环烷基是指被C1-7-烷氧基取代的杂环烷基。
术语“部分(moiety)”是指原子或化合的原子团，其通过一个或多个化学键与另一个原子或分子连接，由此形成分子的一部分。例如，式(I)的变量A、R1、R2和R3是指通过共价键与式(I)的核心结构相连的部分。
当指示取代基的数目时，术语“一个或多个”是指从一个取代基到可能的最高取代数目的范围，即由取代基取代一个氢至由取代基取代所有氢。
术语“任选的”或“任选地”意为随后描述的事件或情况可以但不必需发生，并且该描述包括事件或情况发生的情形和其不发生的情形。
术语“取代基”是指替代母体分子上的氢原子的一个原子或原子团。
术语“取代的”表示指定基团带有一个或多个取代基。在任何基团可以带有多个取代基并且提供多种可能的取代基的情况下，取代基可以独立选择并且不需要是相同的。术语“未取代的”是指指定的基团不带有取代基。术语“任选地取代的”是指指定的基团是未取代的或被一个或多个独立地选自可能的取代基的组的取代基取代。当指示取代基的数目时，术语“一个或多个”意味着从一个取代基到可能的最大取代数，即由取代基取代一个氢至由取代基取代所有氢。
术语“此发明的化合物”和“本发明的化合物”是指如本文中所公开的化合物及其立体异构体、互变异构体、溶剂化物和盐(例如，药用盐)。
当本发明的化合物是固体时，本领域技术人员理解的是，这些化合物及其溶剂化物和盐可以以不同固体形式(特别是不同晶形)存在，所有这些形式都预期在本发明和指定式的范围内。
术语“药用盐”是指这样的盐，其在生物学或其他方面不是不合需要的。药用盐包括酸和碱加成盐。
术语“药用酸加成盐”是指这样的药用盐，所述药用盐利用无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、碳酸、磷酸以及选自脂肪族、脂环族、芳香族、芳脂肪族、杂环、羧酸和磺酸类型的有机酸的有机酸如甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、葡糖酸、乳酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、天冬氨酸、抗坏血酸、谷氨酸、邻氨基苯甲酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、双羟萘酸、苯乙酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸和水杨酸形成。特别的本发明的药用盐是利用盐酸形成的盐，产生盐酸盐、二盐酸盐或三盐酸盐，更特别地，盐酸盐。
术语“药用碱加成盐”是指这样的药用盐，所述药用盐利用有机或无机碱形成。可接受的无机碱的实例包括钠、钾、铵、钙、镁、铁、锌、铜、锰和铝盐。衍生自药用有机无毒碱的盐包括伯胺、仲胺和叔胺、取代胺(包括天然存在的取代胺)、环状胺和碱性离子交换树脂，如异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、2-二乙基氨基乙醇、三甲胺、二环己胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、海巴明(hydrabamine)、胆碱、甜菜碱、乙二胺、葡糖胺、甲基葡糖胺、可可碱、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶和聚胺树脂的盐。
本文中使用的立体化学定义和约定一般遵循S.P.Parker，Ed.，McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms(McGraw-Hill化学术语词典)(1984)McGraw-Hill Book Company，New York；以及Eliel，E.和Wilen，S.，“Stereochemistry of Organic Compounds(有机化合物的立体化学)”，John Wiley&Sons，Inc.，New York，1994。在描述具有旋光性的化合物时，前缀D和L或R和S用于指示分子关于其手性中心的绝对构型。与研究中的手性中心相连的取代基根据Cahn、Ingold和Prelog顺序法则排序。(Cahn等人Angew.Chem.Inter.Edit.1966，5，385；勘误表511)。前缀D和L或(+)和(-)被用于指明化合物的平面偏振光的旋转标志，其中(-)或L指示化合物是左旋的。具有前缀(+)或D的化合物是右旋的。
术语“手性中心”是指键接至四个非相同取代基的碳原子。术语“手性的”是指与镜像的非可叠合性的能力，而术语“非手性的”是指与其镜像可叠合的实施方案。手性分子是光学活性的，即它们具有旋转平面偏振光的平面的能力。
本发明的化合物可以具有一个或多个手性中心并且可以以光学纯对映异构体、对映异构体的混合物的形式，如例如外消旋物、光学纯非对映异构体、非对映异构体的混合物、非对映异构体外消旋物的混合物存在。无论何时在化学结构中存在手性中心，意图与该手性中心相关的所有立体异构体由本发明涵盖。
术语“卤代”、“卤素”和“卤化物”在本文中可互换地使用并且是指氟、氯、溴或碘。卤素的具体实例是氟和氯。
术语“烷基”表示1至12个碳原子的单价直链或支链饱和烃基。在特别的实施方案中，烷基具有1至7个碳原子，并且在更特别的实施方案中具有1至4个碳原子。烷基的实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基。烷基的特别实例是甲基、乙基和异丙基。
术语“卤代烷基”表示烷基，其中所述烷基的至少一个氢原子已被相同或不同的卤素原子(特别是氟原子)替代。卤代烷基的实例包括一氟-、二氟-或三氟-甲基、-乙基或-丙基，例如3，3，3-三氟丙基、2-氟乙基、2，2，2-三氟乙基、氟甲基或三氟甲基等。术语“全卤代烷基”表示这样的烷基，其中所述烷基的全部氢原子已被相同或不同的卤素原子替代。卤代烷基的特别实例是三氟甲基和二氟甲基。
术语“烷氧基”表示式-O-R’的基团，其中R’是烷基。烷氧基部分的实例包括甲氧基、乙氧基、异丙氧基和叔丁氧基。烷氧基的特别实例是甲氧基和乙氧基。
术语“二环的环体系”表示经由共同的单或双键(环状的(annelated)二环的环体系)，经由三个以上的共同原子的序列(桥连的二环的环体系)或经由单个共同原子(螺二环的环体系)彼此稠合的两个环。二环的环体系可以是饱和的、部分不饱和的、不饱和的或芳族的。二环的环体系可以包含选自N、O和S的杂原子。类似地，术语“三环的环体系”是指如对于二环的环体系所述的彼此稠合的三个环。
术语“环烷基”是指3至10个环碳原子的饱和单环或二环烃基。在特别的实施方案中，环烷基是指3至8个环碳原子的一价饱和单环烃基。二环意指由共同具有一个或多个碳原子的两个饱和碳环组成。特别的环烷基是单环的。单环环烷基的实例是环丙基、环丁基、环戊基、环己基或环庚基。二环环烷基的实例是二环[2.2.1]庚基或二环[2.2.2]辛基。环烷基的一个特别实例是环丙基。
术语“杂环烷基”表示3至9个环原子的饱和或部分不饱和单环、二环或三环的环体系，其包含1、2或3个选自N、O和S的环杂原子，其余的环原子是碳。在特别的实施方案中，杂环烷基是4至7个环原子的单价饱和单环环体系，其包含1、2或3个选自N、O和S的环杂原子，其余的环原子是碳。单环的饱和杂环烷基的实例有氮杂环丙基、氧杂环丙基、氮杂环丁基、氧杂环丁基、吡咯烷基、四氢呋喃基、四氢-噻吩基、吡唑烷基、咪唑烷基、唑烷基、异唑烷基、噻唑烷基、哌啶基、四氢吡喃基、四氢噻喃基、哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、1，1-二氧代-硫代吗啉-4-基、氮杂环庚基、二氮杂环庚基、高哌嗪基或氧杂氮杂环庚基。二环的饱和杂环烷基的实例有8-氮杂-二环[3.2.1]辛基、奎宁环基、8-氧杂-3-氮杂-二环[3.2.1]辛基、9-氮杂-二环[3.3.1]壬基、3-氧杂-9-氮杂-二环[3.3.1]壬基或3-硫杂-9-氮杂-二环[3.3.1]壬基。部分不饱和的杂环烷基的实例有二氢呋喃基，咪唑啉基、二氢-唑基、四氢-吡啶基或二氢吡喃基。杂环烷基的特别实例是1，4-二氮杂环庚基、六氢吡咯并[1，2-a]吡嗪基、哌啶基、哌嗪基和吡咯烷基。杂环烷基的更特别实例是哌嗪基和吡咯烷基。
术语“N-杂环烷基”是指杂环烷基，其含有至少一个氮环原子并且其中该杂环烷基与分子的剩余部分连接的点是通过氮环原子。N-杂环烷基的特别实例是1，4-二氮杂环庚基、六氢吡咯并[1，2-a]吡嗪基、哌啶基、哌嗪基和吡咯烷基。N-杂环烷基的更特别实例是哌嗪基和吡咯烷基。
提及化合物中的术语“碱度”在本文中通过共轭酸的酸度常数的十进制负对数(pKa＝-log Ka)表示。共轭酸的pKa越大，碱越强(pKa+pKb＝14)。在本申请中，如果原子或官能团适于接受质子并且如果其共轭酸的计算pKa至少是7，更特别地如果其共轭酸的计算pKa至少是7.8，最特别地如果其共轭酸的计算pKa至少是8，则所述原子或官能团被标为“碱性”。pKa值通过电脑(in-silico)计算，如F.Milletti等人，J.Chem.Inf.Model(2007)47：2172-2181中所述。
术语“亚烷基”表示1至7个碳原子的直链饱和二价烃基或3至7个碳原子的二价支链饱和烃基。亚烷基的实例包括亚甲基、亚乙基、亚丙基、2-甲基亚丙基、亚丁基、2-乙基亚丁基、亚戊基、亚己基。亚烷基的特别实例是亚乙基、亚丙基和亚丁基。
术语“氨基”是指式-NR’R”的基团，其中R’和R”独立地是氢、烷基、烷氧基、环烷基、杂环烷基芳基、杂芳基或如本文所述。备选地，R’和R”连同它们连接的氮一起可以形成杂环烷基。术语“伯氨基”是指其中R’和R”都是氢的基团。术语“仲氨基”是指其中R’是氢而R”是不同于氢的基团的基团。术语“叔氨基”是指其中R’和R”都不同于氢的基团。特别的仲胺和叔胺是甲胺、乙胺、丙胺、异丙胺、苯胺、苄胺、二甲胺、二乙胺、二丙胺和二异丙胺。
术语“保护基”在合成化学中与其通常相关的含义中表示这样的基团，所述基团选择性地封闭多官能团化合物中的反应性位点以致可以在另一个未保护的反应性位点选择性地进行化学反应。可以在合适的点除脱保护基。示例的保护基有氨基保护基、羧基保护基或羟基保护基。
术语“氨基保护基”表示意在保护氨基的基团并且包括苄基、苄基氧基羰基(羰苄氧基、CBZ)、Fmoc(9-芴基甲基氧基羰基)、对甲氧基苄基氧基羰基、对硝基苄基氧基羰基、叔丁氧基羰基(BOC)和三氟乙酰基。这些基团的另外的实例可见于T.W.Greene和P.G.M.Wuts，“Protective Groups in Organic Synthesis(有机合成中的保护基)”，第2版，John Wiley&Sons，Inc.，New York，NY，1991，第7章；E.Haslam，“Protective Groups in Organic Chemistry(有机化学中的保护基)”，J.G.W.McOmie，Ed.，Plenum Press，New York，NY，1973，第5章，以及T.W.Greene，“Protective Groups in Organic Synthesis(有机合成中的保护基)”，John Wiley&Sons，New York，NY，1981。术语“保护的氨基”是指被氨基保护基取代的氨基。
术语“脱保护作用”或“脱保护”表示这样的过程，通过所述过程在完成选择性反应后除脱保护基。脱保护试剂包括酸、碱或氢，特别是碳酸钾或碳酸钠、在醇溶液中的氢氧化锂、在甲醇中的锌、乙酸、三氟乙酸、钯催化剂或三溴化硼。
术语“活性药物成分”(或“API”)表示药物组合物中具有特别生物学活性的化合物或分子。
术语“药物组合物”和“药物制剂”(或“制剂”)可互换使用并且是指要给药至有需要的哺乳动物例如人的包含治疗有效量的活性药物成分连同药用赋形剂的混合物或溶液。
术语“药用”表示可用于制备药物组合物的材料的属性，即通常是安全的，无毒的，并且在生物学和其他方面不是不合需要的，并且可用于兽医以及人类药物用途。
术语“药用赋形剂”、“药用载体”和“治疗惰性赋形剂”可以互换使用并且是指用于配制药物产品的无治疗活性且对所给药的受治疗者无毒的在药物组合物中的任何药用成分，如崩解剂、粘合剂、填充剂、溶剂、缓冲剂、张力剂、稳定剂、抗氧化剂、表面活性剂、载体、稀释剂或润滑剂。
术语“个体”或“受治疗者”是指哺乳动物。哺乳动物包括但不限于，家养动物(例如，牛、绵羊、猫、狗和马)、灵长类(例如，人和非人灵长类如猴)、兔和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受治疗者是人。
术语“治疗有效量”是指这样的本发明的化合物或分子的量，即当给药至受治疗者时，(i)治疗或预防特定疾病、病症或障碍，(ii)减弱、减轻或消除特定疾病、病症或障碍的一种或多种症状或或(iii)防止或延迟本文中所述的特定疾病、病症或障碍的一种或多种症状的发作。取决于化合物、治疗的疾病状态、治疗的疾病严重度、受治疗者的年龄和相对健康、给药的途径和形式、参与医疗或兽医实践者的判断以及其他因素，治疗有效量将不同。
术语疾病的“治疗”或“处理”包括抑制疾病状态，即阻止疾病状态或其临床症状的发展，或减轻疾病状态，即引起疾病状态或其临床症状的暂时或永久减退。
术语“SMN缺乏相关的病症”包括脊髓性肌萎缩(SMA)、神经源性先天性多关节挛缩症(neutogenic congenital arthrogryposis multiplex congenital)(AMC)、肌萎缩性侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis)(ALS)。术语“脊髓性肌萎缩”(或SMA)是指由两个染色体上SMN1基因的失活突变或缺失，从而导致SMN1基因功能丧失引起的疾病。
SMA的症状包括肌无力、肌张力低下、哭泣无力、咳嗽无力、跛行或摔倒倾向、吮吸或吞咽困难、呼吸困难、肺或咽喉中分泌物积累、紧握的拳头和汗手、舌头颤动/振动、常常倾向一侧的头部(即使在躺下时)、倾向于弱于臂部的腿部、经常呈“蛙腿”位置的腿部、摄食困难、对呼吸道感染敏感度提高、肠/膀胱无力、低于正常的体重、不能无支撑坐立、不能行走、不能爬行、和张力减退、反射消失、以及与前hom细胞丧失相关的多发性先天性挛缩(关节挛缩)。
术语“治疗脊髓性肌萎缩(SMA)”或“脊髓性肌萎缩(SMA)的治疗”包括以下效果中的一个或多个：(i)减小或改善SMA的严重度；(ii)延迟SMA的发作；(iii)抑制SMA的进展；(iv)减少受治疗者入院；(v)减小受治疗者的入院长度；(vi)增加受治疗者的存活；(vii)提高受治疗者的生活质量；(viii)减少SMA相关症状的数目；(ix)减小或改善与SMA相关的一种或多种症状的严重度；(x)缩短与SMA相关的症状的持续时间；(xi)防止与SMA相关的症状的复发；(xii)抑制SMA症状的发展或发作；和/或(xiii)抑制与SMA相关的症状的进展。
更特别地，术语“治疗SMA”表示以下有益效果中的一种或多种：(i)减小肌力损伤；(ii)增加肌力；(iii)减少肌萎缩；(iv)减少运动功能丧失；(v)增加运动神经元；(vii)减少运动神经元损失；(viii)使SMN不足的运动神经元免于退化；(ix)提高运动功能；(x)提高肺功能；和/或(xi)减小肺功能丧失。
进一步详细地，术语“治疗SMA”是指人类婴儿或人类幼童无辅助坐立或人类婴儿、人类幼童、人类儿童或人类成人无辅助站立、无辅助行走、无辅助奔跑、无辅助呼吸、睡眠期间无辅助翻身或无辅助吞咽的功能性能力或保持所述功能性能力。
术语疾病状态的“预防”或“阻止”表示使得疾病状态的临床症状在可能暴露于或易患有疾病状态，但是还未经历或显示疾病状态的症状的受治疗者中不发展。
术语“产生全长SMN2小基因mRNA的EC1.5x浓度”(或“EC1.5x小基因”)被定义为有效地使全长SMN2小基因mRNA的量提高至与载体处理的细胞中的水平相比的1.5倍水平的测试化合物的浓度。
术语“SMN蛋白表达的EC1.5x浓度”(或“EC1.5x SMN蛋白”)被定义为在SMA患者成纤维细胞中有效地产生与由载体对照产生的量相比的1.5倍量的SMN蛋白的测试化合物的浓度。
详细地，本发明涉及式(I)化合物，
其中
X1是CR5或N；
X2是CR5或N；前提是X1和X2不都是N；
R1是氢或C1-7-烷基；
R2是氢、氰基、C1-7-烷基、C1-7-卤代烷基或C3-8-环烷基；
R3是氢、卤代、C1-7-烷基或C1-7-烷氧基；
R4是氢、卤代、C1-7-烷基或C1-7-烷氧基；
R5独立地选自氢、卤代、C1-7-烷基或C1-7-烷氧基；
A是N-杂环烷基或NR7R8，其中N-杂环烷基包含1或2个氮环原子并且任选地被1、2、3或4个选自R6的取代基取代；
R6独立地选自氢、C1-7-烷基、氨基、氨基-C1-7-烷基、C3-8-环烷基、杂环烷基和C1-7-烷氧基-杂环烷基，或者两个R6一起形成C1-7-亚烷基；
R7是包含1个氮环原子的杂环烷基，其中杂环烷基任选地被1、2、3或4个选自R6的取代基取代；
R8是氢、C1-7-烷基或C3-8-环烷基；
前提是如果A是仅包含1个氮环原子的N-杂环烷基，则至少一个R6取代基是氨基或氨基-C1-7-烷基；
或其药用盐。
本发明的特别的实施方案是式(I)化合物或其药用盐。
此外，要理解的是，涉及如本文中所公开的具体的X1、X2、A、R1、R2、R3或R4的每个实施方案可以与涉及如本文中所公开的另外的X1、X2、A、R1、R2、R3或R4的任何其他实施方案组合。
本发明的一个特别的实施方案涉及式(I)化合物，其中
X1是CH或N；
X2是CR5；
R1是C1-7-烷基；
R2是氢、C1-7-烷基、C1-7-卤代烷基或C3-8-环烷基；
R3是氢、卤代、C1-7-烷基或C1-7-烷氧基；
R4是氢、卤代、C1-7-烷基或C1-7-烷氧基；
R5是氢、卤代、C1-7-烷基或C1-7-烷氧基；
A是N-杂环烷基，其中N-杂环烷基包含1或2个氮环原子并且任选地被1、2、3或4个选自R6的取代基取代；
R6独立地选自氢、C1-7-烷基、氨基、氨基-C1-7-烷基、C3-8-环烷基、杂环烷基和C1-7-烷氧基-杂环烷基，或者两个R6一起形成C1-7-亚烷基；
前提是如果A是仅包含1个氮环原子的N-杂环烷基，则至少一个R6取代基是氨基或氨基-C1-7-烷基；
或其药用盐。
本发明的一个特别的实施方案涉及式(I)化合物，其中X1是N；前提是X1和X2不都是N。
本发明的一个特别的实施方案涉及式(I)化合物，其中X1是CR5。
本发明的一个特别的实施方案涉及式(I)化合物，其中X1是CH。
本发明的一个特别的实施方案涉及式(I)化合物，其中X2是N；前提是X1和X2不都是N。
本发明的一个特别的实施方案涉及式(I)化合物，其中X2是CR5。
本发明的一个特别的实施方案涉及式(I)化合物，其中X2是CH。
本发明的一个特别的实施方案涉及式(I)化合物，其中R1是C1-7-烷基，特别地甲基。
本发明的一个特别的实施方案涉及式(I)化合物，其中R2是氢、C1-7-烷基、C1-7-卤代烷基或C3-8-环烷基；特别地氢或C1-7-卤代烷基；最特别地C1-7-卤代烷基。
本发明的一个甚至更特别的实施方案涉及式(I)化合物，其中R2是氢、甲基、乙基、二氟甲基、三氟甲基或环丙基；特别地氢、二氟甲基或三氟甲基；最特别地三氟甲基。
本发明的一个特别的实施方案涉及式(I)化合物，其中R3是氢、卤代或C1-7-烷氧基，特别地卤代。
本发明的一个甚至更特别的实施方案涉及式(I)化合物，其中R3是氢、氟、甲氧基或乙氧基，特别地氟。
本发明的一个特别的实施方案涉及式(I)化合物，其中R4是氢或卤代，特别地氢。
本发明的一个甚至更特别的实施方案涉及式(I)化合物，其中R4是氢或氟，特别地氢。
本发明的一个特别的实施方案涉及式(I)化合物，其中R5是氢、卤代或C1-7-烷氧基，特别地氢。
本发明的一个甚至更特别的实施方案涉及式(I)化合物，其中R5是氢、氟、氯或甲氧基，特别地氢。
本发明的一个特别的实施方案涉及式(I)化合物，其中R6独立地选自C1-7-烷基、杂环烷基和C1-7-烷氧基-杂环烷基，或者两个R6一起形成C1-7-亚烷基。
本发明的一个特别的实施方案涉及式(I)化合物，其中R6独立地选自甲基、乙基、异丙基、甲氧基-氮杂环丁基和吡咯烷基，或者两个R6一起形成亚乙基或亚丙基。
本发明的一个特别的实施方案涉及式(I)化合物，其中R7是任选地被1、2、3或4个选自R6的取代基取代的哌嗪基。
本发明的一个特别的实施方案涉及式(I)化合物，其中R8是氢或C1-7-烷基，特别地氢或甲基。
本发明的一个特别的实施方案涉及式(I’)的化合物，
其中A、R2、R3、R4和R5如本文所述；或其药用盐。
本发明的一个特别的实施方案涉及式(I)化合物，其中A是包含1或2个氮原子的饱和单环或二环N-杂环烷基并且任选地被1、2、3或4个选自R6的取代基取代。
本发明的一个特别的实施方案涉及式(I)化合物，其中如本文定义的在A中的N-杂环烷基或在R7中的杂环烷基被1或2个选自R6的取代基取代。
本发明的一个特别的实施方案涉及式(I)化合物，其中如本文定义的在A中的N-杂环烷基的特征还在于一个环氮原子是碱性的。
本发明的一个特别的实施方案涉及式(I)化合物，其中A是其中
Y是N或CH；
R8是氢、C1-7-烷基或C3-8-环烷基；
R9是氢、C1-7-烷基或-(CH2)m-NR14R15；
R10是氢或C1-7-烷基；
R11是氢或C1-7-烷基；
R12是氢或C1-7-烷基；
R13是氢或C1-7-烷基；
R14和R15独立地选自氢、C1-7-烷基和C3-8-环烷基；
n是0、1或2；
m是0、1、2或3；
或者R9和R10一起形成C1-7-亚烷基；
或者R9和R12一起形成C1-7-亚烷基；
或者R10和R11一起形成C2-7-亚烷基；
或者R10和R12一起形成C1-7-亚烷基；
或者R10和R14一起形成C1-7-亚烷基；
或者R12和R13一起形成C2-7-亚烷基；
或者R12和R14一起形成C1-7-亚烷基；
或者R14和R15一起形成C2-7-亚烷基，其任选地被烷氧基取代；
前提是如果Y是CH，则R9是-(CH2)m-NR14R15；并且
前提是如果Y是N并且R9是-(CH2)m-NR14R15，则m是2或3。
本发明的一个特别的实施方案涉及式(I)化合物，其中A是其中Y、n、R9、R10、R11、R12和R13如以上所定义。
已发现，当R9、R10、R11、R12和R13中的至少一个不是氢时，脑渗透得到提高。在本发明的一个特别实施方案中，R9、R10、R11、R12和R13中的至少一个不同于氢。
本发明的一个特别的实施方案涉及式(I)化合物，其中Y是N。
本发明的一个特别的实施方案涉及式(I)化合物，其中Y是CH并且R9是-(CH2)m-NR14R15。
本发明的一个特别的实施方案涉及式(I)化合物，其中Y是CH、R9是-(CH2)m-NR14R15并且m是0。
本发明的一个特别的实施方案涉及式(I)化合物，其中n是1。
本发明的一个特别的实施方案涉及式(I)化合物，其中R9是氢、吡咯烷基或甲氧基-氮杂环丁基，更特别地氢。
本发明的一个特别的实施方案涉及式(I)化合物，其中R10是氢、甲基、乙基或异丙基，更特别地甲基。
本发明的一个特别的实施方案涉及式(I)化合物，其中R11是氢或甲基，更特别地氢。
本发明的一个特别的实施方案涉及式(I)化合物，其中R12是氢或甲基，更特别地氢。
本发明的一个特别的实施方案涉及式(I)化合物，其中R13是氢。
本发明的一个特别的实施方案涉及式(I)化合物，其中R9和R10一起形成亚丙基。
本发明的一个特别的实施方案涉及式(I)化合物，其中R10和R11一起形成亚乙基。
本发明的一个特别的实施方案涉及式(I)化合物，其中R14和R15一起形成亚丙基或亚丁基。
本发明的一个特别的实施方案涉及式(I)化合物，其中R14和R15一起形成亚丙基。
本发明的一个特别的实施方案涉及式(I)化合物，其中R14和R15一起形成亚丁基。
本发明的一个特别的实施方案涉及式(I)化合物，其中A选自以下各项的组：
其中R8、R9、R10、R11、R12和R13如本文所定义，R16是氢或C1-7-烷基并且R17是C1-7-烷氧基。
本发明的一个特别的实施方案涉及式(I)化合物，其中A选自以下各项的组：
其中R8、R9、R10、R11、R12和R13如本文所定义并且R17是C1-7-烷氧基。
本发明的一个特别的实施方案涉及式(I)化合物，其中A选自以下各项的组：哌嗪基、二氮杂环庚基、吡咯烷基和六氢吡咯并[1，2-a]吡嗪基，各自任选地被1、2、3或4个选自如本文所定义的R6的取代基取代。
本发明的一个特别的实施方案涉及式(I)化合物，其中A选自以下各项的组：哌嗪-1-基、1，4-二氮杂环庚-1-基、吡咯烷-1-基和六氢吡咯并[1，2-a]吡嗪-2(1H)-基，各自任选地被1或2个选自如本文所定义的R6的取代基取代。
本发明的一个特别的实施方案涉及式(I)化合物，其中A是NR7R8，其中R7和R8如本文所述。
本发明的一个特别的实施方案涉及式(I)化合物，其中A是其中R8、R9、R10、R11、R12和R13如本文所述。
本发明的一个特别的实施方案涉及式(I)化合物，其中A是其中R8是氢或甲基。
本发明的一个特别的实施方案涉及式(I)化合物，其中A选自以下各项的组：
本发明的一个特别的实施方案涉及式(I)化合物，其中A选自以下各项的组：
本发明的特别的式(I)化合物是选自由以下各项组成的组中的那些：
2-氟-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)-4-哌嗪-1-基苯甲酰胺；
N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)-4-哌嗪-1-基苯甲酰胺；
4-[(8aS)-3，4，6，7，8，8a-六氢-1H-吡咯并[1，2-a]吡嗪-2-基]-2-乙氧基-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)苯甲酰胺；
2-乙氧基-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)-4-[(3S)-3-甲基哌嗪-1-基]苯甲酰胺；
2-乙氧基-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)-4-[(3R)-3-甲基哌嗪-1-基]苯甲酰胺；
4-[(8aR)-3，4，6，7，8，8a-六氢-1H-吡咯并[1，2-a]吡嗪-2-基]-2-乙氧基-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)苯甲酰胺；
4-[(8aR)-3，4，6，7，8，8a-六氢-1H-吡咯并[1，2-a]吡嗪-2-基]-2-氟-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)苯甲酰胺；
4-[(8aS)-3，4，6，7，8，8a-六氢-1H-吡咯并[1，2-a]吡嗪-2-基]-2-氟-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)苯甲酰胺；
4-(1，4-二氮杂环庚-1-基)-2-乙氧基-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)苯甲酰胺；
4-[(3S，5R)-3，5-二甲基哌嗪-1-基]-2-乙氧基-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)苯甲酰胺；
N-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)-2-氟-4-[(3R)-3-甲基哌嗪-1-基]苯甲酰胺；
4-[(8aS)-3，4，6，7，8，8a-六氢-1H-吡咯并[1，2-a]吡嗪-2-基]-N-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)-2-乙氧基苯甲酰胺；
4-[(8aS)-3，4，6，7，8，8a-六氢-1H-吡咯并[1，2-a]吡嗪-2-基]-N-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)-2-氟苯甲酰胺；
N-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)-2，6-二氟-4-[(3R)-3-甲基哌嗪-1-基]苯甲酰胺；
N-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)-2-乙氧基-4-[(3R)-3-甲基哌嗪-1-基]苯甲酰胺；
4-[(8aS)-3，4，6，7，8，8a-六氢-1H-吡咯并[1，2-a]吡嗪-2-基]-N-(8-乙基-2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)-2-氟苯甲酰胺；
4-[(8aS)-3，4，6，7，8，8a-六氢-1H-吡咯并[1，2-a]吡嗪-2-基]-N-(8-环丙基-2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)-2-氟苯甲酰胺；
4-[(8aS)-3，4，6，7，8，8a-六氢-1H-吡咯并[1，2-a]吡嗪-2-基]-N-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)-2，6-二氟苯甲酰胺；
N-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)-4-[(3R，5S)-3，5-二甲基哌嗪-1-基]-2-氟苯甲酰胺；
N-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)-2-氟-4-[(3S)-3-吡咯烷-1-基吡咯烷-1-基]苯甲酰胺；
N-(8-乙基-2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)-2-氟-4-[(3R)-3-甲基哌嗪-1-基]苯甲酰胺；
4-[(8aR)-3，4，6，7，8，8a-六氢-1H-吡咯并[1，2-a]吡嗪-2-基]-N-(8-环丙基-2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)-2-氟苯甲酰胺；
N-(8-环丙基-2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)-2-氟-4-[(3R)-3-甲基哌嗪-1-基]苯甲酰胺；
2-氟-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)-4-[(3S)-3-吡咯烷-1-基吡咯烷-1-基]苯甲酰胺；
2-氟-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)-4-[(3R)-3-甲基哌嗪-1-基]苯甲酰胺；
4-(4，7-二氮杂螺[2.5]辛-7-基)-2-氟-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)苯甲酰胺；
4-[(3S，5R)-3，5-二甲基哌嗪-1-基]-2-氟-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)苯甲酰胺；
2-氯-6-氟-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)-4-哌嗪-1-基苯甲酰胺；
2，5-二氟-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)-4-(3-甲基哌嗪-1-基)苯甲酰胺；
2，3-二氟-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)-4-(3-甲基哌嗪-1-基)苯甲酰胺；
4-[(3R，5S)-3，5-二甲基哌嗪-1-基]-2-甲氧基-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)苯甲酰胺；
4-[(3R)-3-乙基哌嗪-1-基]-2-氟-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)苯甲酰胺；
2-氟-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)-4-[(3R)-3-吡咯烷-1-基吡咯烷-1-基]苯甲酰胺；
4-(4，7-二氮杂螺[2.5]辛-7-基)-2-甲氧基-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)苯甲酰胺；
4-(3，3-二甲基哌嗪-1-基)-2-氟-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)苯甲酰胺；
N-(8-环丙基-2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)-4-[(3R)-3-乙基哌嗪-1-基]-2-氟苯甲酰胺；
N-(8-环丙基-2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)-4-(3，3-二甲基哌嗪-1-基)-2-氟苯甲酰胺；
2-甲氧基-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)-4-[(3R)-3-甲基哌嗪-1-基]苯甲酰胺；
2-甲氧基-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)-4-[(3R)-3-吡咯烷-1-基吡咯烷-1-基]苯甲酰胺；
4-[(3R)-3-乙基哌嗪-1-基]-2-甲氧基-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)苯甲酰胺；
4-(3，3-二甲基哌嗪-1-基)-2-甲氧基-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)苯甲酰胺；
4-[(3S)-3-乙基哌嗪-1-基]-2-氟-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)苯甲酰胺；
2-氟-4-[(3R)-3-甲基哌嗪-1-基]-N-[2-甲基-8-(三氟甲基)咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基]苯甲酰胺；
N-[8-(二氟甲基)-2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基]-2-氟-4-[(3R)-3-甲基哌嗪-1-基]苯甲酰胺；
2-氟-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)-4-(3-丙-2-基哌嗪-1-基)苯甲酰胺；
6-[(3R)-3-乙基哌嗪-1-基]-2-甲氧基-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)吡啶-3-甲酰胺；
2-甲氧基-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)-6-哌嗪-1-基吡啶-3-甲酰胺；
N-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)-2-氟-4-(4-吡咯烷-1-基哌啶-1-基)苯甲酰胺；
N-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)-2-乙氧基-4-[4-(3-甲氧基氮杂环丁-1-基)哌啶-1-基]苯甲酰胺；
及其药用盐。
本发明的特别的式(I)化合物是选自由以下各项组成的组中的那些：
4-(4，7-二氮杂螺[2.5]辛-7-基)-2-氟-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)苯甲酰胺；
4-[(3S，5R)-3，5-二甲基哌嗪-1-基]-2-氟-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)苯甲酰胺；
4-[(3R)-3-乙基哌嗪-1-基]-2-氟-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)苯甲酰胺；
2-氟-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)-4-[(3R)-3-吡咯烷-1-基吡咯烷-1-基]苯甲酰胺；
4-[(3S)-3-乙基哌嗪-1-基]-2-氟-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)苯甲酰胺；
2-氟-4-[(3R)-3-甲基哌嗪-1-基]-N-[2-甲基-8-(三氟甲基)咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基]苯甲酰胺；
2-氟-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)-4-哌嗪-1-基苯甲酰胺；
4-[(8aS)-3，4，6，7，8，8a-六氢-1H-吡咯并[1，2-a]吡嗪-2-基]-2-乙氧基-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)苯甲酰胺；
2-乙氧基-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)-4-[(3S)-3-甲基哌嗪-1-基]苯甲酰胺；
2-乙氧基-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)-4-[(3R)-3-甲基哌嗪-1-基]苯甲酰胺；
4-[(8aR)-3，4，6，7，8，8a-六氢-1H-吡咯并[1，2-a]吡嗪-2-基]-2-乙氧基-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)苯甲酰胺；
4-[(8aR)-3，4，6，7，8，8a-六氢-1H-吡咯并[1，2-a]吡嗪-2-基]-2-氟-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)苯甲酰胺；
4-[(8aS)-3，4，6，7，8，8a-六氢-1H-吡咯并[1，2-a]吡嗪-2-基]-2-氟-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)苯甲酰胺；
4-(1，4-二氮杂环庚-1-基)-2-乙氧基-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)苯甲酰胺；
4-[(3S，5R)-3，5-二甲基哌嗪-1-基]-2-乙氧基-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)苯甲酰胺；
2-氟-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)-4-[(3S)-3-吡咯烷-1-基吡咯烷-1-基]苯甲酰胺；
2-氟-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)-4-[(3R)-3-甲基哌嗪-1-基]苯甲酰胺；
2-氯-6-氟-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)-4-哌嗪-1-基苯甲酰胺；
2，5-二氟-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)-4-(3-甲基哌嗪-1-基)苯甲酰胺；
2，3-二氟-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)-4-(3-甲基哌嗪-1-基)苯甲酰胺；
4-[(3R，5S)-3，5-二甲基哌嗪-1-基]-2-甲氧基-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)苯甲酰胺；
4-(4，7-二氮杂螺[2.5]辛-7-基)-2-甲氧基-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)苯甲酰胺；
4-(3，3-二甲基哌嗪-1-基)-2-氟-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)苯甲酰胺；
2-甲氧基-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)-4-[(3R)-3-甲基哌嗪-1-基]苯甲酰胺；
2-甲氧基-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)-4-[(3R)-3-吡咯烷-1-基吡咯烷-1-基]苯甲酰胺；
4-[(3R)-3-乙基哌嗪-1-基]-2-甲氧基-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)苯甲酰胺；
4-(3，3-二甲基哌嗪-1-基)-2-甲氧基-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)苯甲酰胺；
N-[8-(二氟甲基)-2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基]-2-氟-4-[(3R)-3-甲基哌嗪-1-基]苯甲酰胺；
2-氟-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)-4-(3-丙-2-基哌嗪-1-基)苯甲酰胺；
6-[(3R)-3-乙基哌嗪-1-基]-2-甲氧基-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)吡啶-3-甲酰胺；
2-甲氧基-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)-6-哌嗪-1-基吡啶-3-甲酰胺；
及其药用盐。
本发明的特别的式(I)化合物是选自由以下各项组成的组中的那些：
4-(4，7-二氮杂螺[2.5]辛-7-基)-2-氟-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)苯甲酰胺；
4-[(3S，5R)-3，5-二甲基哌嗪-1-基]-2-氟-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)苯甲酰胺；
4-[(3R)-3-乙基哌嗪-1-基]-2-氟-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)苯甲酰胺；
2-氟-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)-4-[(3R)-3-吡咯烷-1-基吡咯烷-1-基]苯甲酰胺；
4-[(3S)-3-乙基哌嗪-1-基]-2-氟-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)苯甲酰胺；
2-氟-4-[(3R)-3-甲基哌嗪-1-基]-N-[2-甲基-8-(三氟甲基)咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基]苯甲酰胺；
及其药用盐。
式(VIII)的化合物适合作为在制备式(I)化合物中的中间体。
本发明的另一个实施方案涉及式(VIII)的化合物，
其中X1、X2、R1、R2、R3和R4如本文所述；
Y是卤素或三氟甲磺酯基；
或其盐。
本发明的一个特别实施方案涉及式(VIII)的化合物，其中Y是氟、氯、溴、碘或三氟甲磺酯基，特别地溴。
本发明的特别的式(VIII)的化合物是选自由以下各项组成的组中的那些：
4-溴-2-氟-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)苯甲酰胺；
4-溴-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)苯甲酰胺；和
4-溴-2-乙氧基-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)苯甲酰胺。
制备方法
如以上所定义的式(I)化合物或其药用盐可以根据本领域已知的标准方法制备。
如在方案1中所示的，式(III)的化合物可以通过以下方式获得：在催化剂(例如三(二亚苄基-丙酮)二钯(0)(Pd2(dba)3))和配体(例如2，2′-二(二苯基膦基)-1，1′-联萘)和碱(例如碳酸铯)以及溶剂(例如甲苯)存在下，式(II)的化合物和式A-H的仲胺之间的Buchwald-Hartwig胺化反应，其中A、X1、X2、R3和R4如本文所述并且R18是C1-7-烷基。在水性碱(例如LiOH、NaOH等)存在下的酯水解以形成酸衍生物(IV)之后，转化为伯酰胺(例如利用CDI和氢氧化铵水溶液)提供式(V)的化合物。最后，在催化剂(例如三(二亚苄基-丙酮)二钯(0)(Pd2(dba)3))、配体(例如(二苯基膦基)-9，9-二甲基呫吨)、碱(例如碳酸铯)和溶剂(例如二烷)存在下在升高的温度(例如100℃)，式(V)的化合物与式(VI)的化合物的Buchwald-Hartwig酰胺化反应提供最后的式(I)化合物，其中R1和R2如本文所述。
在式A-H的N-杂环烷基A包含额外的伯或仲氨基基团的情况下，这样的额外的伯或仲氨基基团使用合适的氨基保护基(如Boc或CBZ)保护，并且在式(V)的化合物与式(VI)的化合物的Buchwald-Hartwig酰胺化反应之后需要额外的脱保护步骤(例如使用在二烷中的HCl)以获得式(I)化合物的最终产物。
方案1。
在一个实施方案中，本发明涉及一种用于制备如以上所定义的式(I)化合物或其药用盐的方法，所述方法包括在催化剂(例如三(二亚苄基-丙酮)二钯(0)(Pd2(dba)3))、配体(例如(二苯基膦基)-9，9-二甲基呫吨)、碱(例如碳酸铯)和溶剂(例如二烷)存在下在升高的温度(例如100℃)，式(V)的化合物与式(VI)的化合物反应，其中A、X1、X2、R1、R2、R3和R4如本文所述。
备选地，式(I)化合物可以如方案2中所示经由以下方式制备：在催化剂(例如碘化铜(I))、配体(例如(1，10-菲咯啉)、碱(例如K3PO4)和溶剂(例如二烷)存在下在升高的温度(例如120℃)，式(VII)的化合物与式(VI)的衍生物的偶联反应以提供式(VIII)的化合物，其中X1、X2、Y、R1、R2、R3和R4如本文所述。
最后，将式(VIII)的化合物与化合物M-A反应，或者以：
a)通过在溶剂(例如二甲亚砜(DMSO)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)或二甲基甲酰胺(DMF))中在80℃至200℃的温度下加热的芳香亲核取代反应(特别地如果Y是氟，或如果Y是氯并且X1是氮)；或者
b)在催化剂(例如三(二亚苄基-丙酮)二钯(0)(Pd2(dba)3))、配体(例如2，2′-二(二苯基膦基)-1，1′-联萘)、碱(例如碳酸铯)存在下通过在溶剂(特别地甲苯)中在20℃至100℃的温度下加热的Buchwald-Hartwig胺化反应；
从而得到式(I)化合物，其中A如本文所定义，M是氢、钠或钾，特别地氢，并且其中M经由A的氮原子连接至A。
方案2。
在一个实施方案中，本发明涉及一种用于制备如以上所定义的式(I)化合物或其药用盐的方法，所述方法包括将式(VIII)的化合物与化合物M-A反应，或者以：
a)通过在溶剂(例如二甲亚砜(DMSO)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)或二甲基甲酰胺(DMF))中在80℃至200℃的温度下加热的芳香亲核取代反应(特别地如果Y是氟，或如果Y是氯并且X1是氮)；或者
b)在催化剂(例如三(二亚苄基-丙酮)二钯(0)(Pd2(dba)3))、配体(例如2，2′-二(二苯基膦基)-1，1′-联萘)、碱(例如碳酸铯)存在下通过在溶剂(特别地甲苯)中在20℃至100℃的温度下加热的Buchwald-Hartwig胺化反应；
其中A、X1、X2、Y、R1、R2、R3和R4如本文所定义，M是氢、钠或钾，特别地氢，并且其中M经由A的氮原子连接至A。
特别地，式(I)化合物或其药用盐可愿意根据在本文实施例中描述的方法制备。
药物组合物
另一个实施方案提供包含本发明的化合物和治疗惰性载体、稀释剂或药用赋形剂的药物组合物或药物，以及使用本发明的化合物制备此种组合物和药物的方法。
以与良好医学实践相一致的方式对组合物进行配制、用药和给药。关于这点要考虑的因素包括治疗的具体病症、治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床状况、病因、药物递送位点、给药方法、给药时间安排和执业医生已知的其他因素。
本发明的化合物可以通过任何合适的方式给药，所述方式包括口服给药、局部给药(包括含服和舌下给药)、直肠给药、阴道给药、透皮给药、肠胃外给药、皮下给药、腹膜内给药、肺内给药、皮内给药、鞘内给药和硬膜外给药和鼻内给药以及(如果需要用于局部治疗)病灶内给药。肠胃外注入包括肌肉内给药、静脉内给药、动脉内给药、腹膜内给药或皮下给药。
本发明的化合物可以以任何方便的给药形式给药，所述形式例如是，片剂、粉剂、胶囊剂、溶液剂、分散剂、混悬剂、糖浆、喷雾剂、栓剂、凝胶剂、乳剂、贴剂等。此种组合物可以包含药物制剂中的常规组分，例如，稀释剂、载体、pH调节剂、防腐剂、增溶剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、增甜剂、着色剂、调味剂、用于改变渗透压的盐、缓冲剂、掩蔽剂、抗氧化剂及其他活性剂。其还可以包含其他有治疗价值的物质。
典型的制剂通过将本发明的化合物与载体或赋形剂混合来制备。合适的载体和赋形剂是本领域技术人员已知的，并且被详细地描述于，例如，Ansel H.C.等人，Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems(Ansel药物剂型和药物递送系统)(2004)Lippincott，Williams&Wilkins，Philadelphia；Gennaro A.R.等人，Remington：The Science and Practice of Pharmacy(Remington：药学科学和实践)(2000)Lippincott，Williams&Wilkins，Philadelphia；和Rowe R.C，Handbook of Pharmaceutical Excipients(药物赋形剂手册)(2005)Pharmaceutical Press，Chicago。所述制剂还可以包含一种或多种缓冲剂、稳定剂、表面活性剂、湿润剂、润滑剂、乳化剂、助悬剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、助流剂、加工助剂、着色剂、增甜剂、加香剂、调味剂、稀释剂和其他已知的添加剂以提供药物(即，本发明的化合物或其药物组合物)的优雅外观或有助于药物产品(即，药品)的生产。
本发明的化合物的可给药剂量可以在很大范围内变化并且当然将适合于各具体病例中的个体需要。通常，在口服给药的情况中，约0.01至1000mg/人的通式(I)化合物的日剂量应当是合适的，但是当需要时也可以超过以上上限。
合适的口服剂型的实例是含有与约30至90mg无水乳糖、约5至40mg交联羧甲纤维素钠、约5至30mg聚乙烯吡咯烷酮(PVP)K30和约1至10mg硬脂酸镁复合的约100mg至500mg本发明的化合物的片剂。将粉末成分首先混合在一起，然后将其与PVP的溶液混合。可以使用常规设备将所得的组合物干燥、制粒、与硬脂酸镁混合并且压缩成片剂形式。
气溶胶制剂的一个实例可以通过以下方法制备：将例如10至100mg本发明的化合物溶解在合适的缓冲溶液(例如磷酸缓冲液)中，如果需要加入张力调节剂例如盐如氯化钠。可以例如使用0.2μm滤器将所述溶液过滤以除去杂质和污染物。
用途
如上所述，式(I)化合物及其药用盐具有有价值的药理学性质并且被发现增强SMN1和/或SMN2的外显子7包含到由SMN1和/或SMN2基因转录的mRNA中，由此增加SMN蛋白在有此需要的人受治疗者中的表达。
本发明的化合物可以单独地或与其他药物组合地用于治疗或预防由SMN1基因的失活突变或缺失引起的和/或与SMN1基因功能丧失或缺陷相关的疾病。这些疾病包括但不限于脊髓性肌萎缩(SMA)。
本发明的一个特别的实施方案涉及药物组合物，所述药物组合物包含如上所定义的式(I)化合物或其如上所定义的药用盐和一种或多种药用赋形剂。
本发明的一个特别的实施方案涉及药物组合物，所述药物组合物包含如上所定义的式(I)化合物或其药用盐和一种或多种药用赋形剂，其用于治疗或预防由SMN1基因的失活突变或缺失引起的和/或与SMN1基因功能丧失或缺陷相关的疾病，尤其用于治疗或预防SMA。
本发明的一个特别的实施方案涉及如上所定义的式(I)化合物或其药用盐，其用作治疗活性物质，尤其是用作用于治疗或预防由SMN1基因的失活突变或缺失引起的和/或与SMN1基因功能丧失或缺陷相关的疾病，尤其是用于治疗或预防脊髓性肌萎缩(SMA)的治疗活性物质。
本发明的一个特别的实施方案涉及如上所定义的式(I)化合物或其药用盐，其用于治疗或预防由SMN1基因的失活突变或缺失引起的和/或与SMN1基因功能丧失或缺陷相关的疾病，尤其是用于治疗或预防脊髓性肌萎缩(SMA)。
本发明的一个特别的实施方案涉及用于治疗或预防由SMN1基因的失活突变或缺失引起的和/或与SMN1基因功能丧失或缺陷相关的疾病，尤其是用于治疗或预防脊髓性肌萎缩(SMA)的方法，所述方法包括向受治疗者给药如上所定义的式(I)化合物或其药用盐。
本发明的一个特别的实施方案涉及如上所定义的式(I)化合物或其药用盐用于治疗或预防由SMN1基因的失活突变或缺失引起的和/或与SMN1基因功能丧失或缺陷相关的疾病，尤其是用于治疗或预防脊髓性肌萎缩(SMA)的用途。
本发明的一个特别的实施方案涉及如上所定义的式(I)化合物或其药用盐用于制备药物的用途，所述药物用于治疗或预防由SMN1基因的失活突变或缺失引起的和/或与SMN1基因功能丧失或缺陷相关的疾病，尤其是用于治疗或预防脊髓性肌萎缩(SMA)。此种药物包含如上所定义的式(I)化合物或其药用盐。
实施例
通过参考以下实施例将更全面地理解本发明。然而以下实施例不应被视为限制本发明的范围。
使用的缩写
ACN：乙腈；Boc：叔丁基氧基羰基；B2(pin)2：二(频那醇合)二硼；CBZ：苄氧基羰基；CDI：1，1′-羰基二咪唑；CH2Cl2：二氯甲烷；dba：二亚苄基丙酮；DIPEA：二异丙基乙胺；DMA：二甲基乙酰胺；DMF：二甲基甲酰胺；DMSO：二甲亚砜；NMP：N-甲基吡咯烷酮；Pd2(dba)3：三(二亚苄基-丙酮)二钯(0)；Pd(dppf)Cl2：(1，1′-二(二苯基膦基)二茂铁)二氯化钯(II)；PPTS：对甲苯磺酸吡啶；TEA：三乙胺；RT：室温；Xantphos：二苯基膦基)-9，9-二甲基呫吨。
中间体A.1
制备(2R)-4-(3-氟-4-甲氧基羰基苯基)-2-甲基哌嗪-1-甲酸叔丁酯
在氩气下，向4-溴-2-氟苯甲酸甲酯(1.10g，4.7mmol)、(R)-2-甲基哌嗪-1-甲酸叔丁酯(1.04g，5.2mmol)、碳酸铯(2.31g，7.1mmol)在甲苯(11ml)中的混合物中加入三(二亚苄基丙酮)二钯(0)(0.13g，0.1mmol)和(外消旋)-2，2′-二(二苯基膦基)-1，1′-联萘(0.27g，0.4mmol)并将混合物在密封管中加热至100℃达20h。然后反应物用EtOAc稀释，用水、盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并浓缩。通过在硅胶上的急骤柱色谱(EtOAc：Hept 0:1-4:6)纯化，得到标题产物，为黄色固体(0.99g，60％)。MS(m/e)：352.0(M+H+)
类似于中间体A.1，下表的中间体A.2至A.23从对应的胺和芳基溴制备。
中间体A.24
制备4-(2，5-二氟-4-甲氧基羰基苯基)-2-甲基哌嗪-1-甲酸叔丁酯
步骤A：
将2，4，5-三氟苯甲酸甲酯(1.393g，7.33mmol，Eq：1.00)和2-甲基哌嗪(2.23g，21.8mmol，Eq：2.98)在DMA(5ml)中的搅拌溶液在微波反应器中在100℃加热15min。将溶剂在真空下蒸发并将残余物溶解于CH2Cl2并用H2O洗涤。有机相用Na2SO4干燥并在真空中浓缩。
步骤B：
将粗制混合物溶解于CH2Cl2(10mL)中并加入三乙胺(1.23ml，8.79mmol，Eq：1.2)。将溶液冷却至0℃并逐滴加入二碳酸二叔丁酯(2.41g，10.9mmol，Eq：1.49)在CH2Cl2(3.75ml)中的溶液。将反应混合物在室温搅拌18h。向反应中加入水并分离各个层。有机相用Na2SO4干燥，并通过柱色谱(SiO2，庚烷/EtOAc)纯化，得到标题化合物，为白色固体(1.77g，65％)。MS(m/e)：371.1(M+H+)。
中间体A.25
制备4-(4-乙氧基羰基-2，3-二氟苯基)-2-甲基哌嗪-1-甲酸叔丁酯
步骤A：
将2，3，4-三氟苯甲酸乙酯(1.51g，7.4mmol，Eq：1.00)和2-甲基哌嗪(2.27g，22.2mmol，Eq：3)在DMA(5ml)中的溶液在微波反应器中在100℃加热15min。将溶剂在真空中蒸发。将EtOAc和NaHCO3水溶液加入至残余物中。分离各个层并将水层用CH2Cl2反萃取两次。合并的有机相用Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩，得到2.15g的黄色油状物。
步骤B：
将此粗制油状物溶解于CH2Cl2(10ml)中并加入三乙胺(1.24ml，8.88mmol，Eq：1.2)。将溶液冷却至0℃并逐滴加入二碳酸二叔丁酯(2.45g，11.1mmol，Eq：1.5)在CH2Cl2(3.75ml)中的溶液。将反应混合物在室温搅拌18h。向反应中加入水并分离各个层。将水层用CH2Cl2反萃取两次。合并的有机相用Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩。产物通过急骤柱色谱(SiO2，庚烷/EtOAc)纯化，其允许分离两种区域异构体，洗脱的第二个化合物是所需的标题衍生物，作为浅黄色油状物获得(1.54g，54％)。MS(m/e)：385.3(M+H+)。
中间体B.1
制备(2R)-4-(4-氨基甲酰基-3-氟苯基)-2-甲基哌嗪-1-甲酸叔丁酯
向(2R)-4-(3-氟-4-甲氧基羰基苯基)-2-甲基哌嗪-1-甲酸叔丁酯(0.95g，2.7mmol，中间体A.1)在MeOH(6ml)中的溶液中加入氢氧化钠(1.4ml，6M，在水中，6.1mmol)并将反应物加热至55℃达7h。然后将反应物通过加入IR120+树脂酸化，过滤并浓缩，得到粗制(R)-4-(4-(叔丁氧基羰基)-3-甲基哌嗪-1-基)-2-氟苯甲酸(0.82g，90％)，为白色粉末。然后将粗制酸再溶解于DMF(6ml)中并加入1，1′-羰基二咪唑(0.51g，3.2mmol)，并将混合物搅拌1h，然后加入氢氧化铵(1.3ml，25％水溶液，8.4mmol)。在0.5h之后，将反应物倒入水中，用EtOAc萃取，合并的有机层用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并浓缩，得到标题化合物，为白色固体(0.74g，90％)。MS(m/e)：282.1(M-tBu+H+)。
类似于中间体B.1，下表的中间体B.2至B.17从对应的酯制备。
中间体B.18
制备4-[(8aR)-3，4，6，7，8，8a-六氢-1H-吡咯并[1，2-a]吡嗪-2-基]-2-氟苯甲酰胺
向(R)-2-氟-4-(六氢吡咯并[1，2-a]吡嗪-2(1H)-基)苯甲酸甲酯(0.12g，0.4mmol，中间体A.5)在MeOH(2ml)中的溶液中加入氢氧化钠(0.1ml，6M，在水中，0.6mmol)并将反应物加热至55℃达4h。然后将反应物浓缩，得到粗制((R)-2-氟-4-(六氢吡咯并[1，2-a]吡嗪-2(1H)-基)苯甲酸钠，然后将其溶解于DMF(2ml)中并加入N，N，N’，N’-四甲基-O-(苯并三唑-1-基)脲四氟硼酸盐(0.17g，0.5mmol)并将混合物搅拌1h，然后加入氢氧化铵(0.9ml，25％水溶液，22.5mmol)。在0.5h之后，将反应物倒入水中，用EtOAc萃取，合并的有机层用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并浓度。通过在硅胶上的急骤柱色谱(DCM：MeOH 95:5-9:1)纯化，得到标题产物，为白色粉末(0.2g，定量)。MS(m/e)：264.2(M+H+)
类似于中间体B.18，下表的中间体B.19至B.24从对应的酯制备。
中间体B.25
制备4-(4-氨基甲酰基-3-氯-5-氟苯基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
步骤A：
将4-溴-2-氯-6-氟苯甲酸(1.00g，3.95mmol，Eq：1.00)、哌嗪-1-甲酸叔丁酯(882mg，4.73mmol，Eq：1.2)、BINAP(491mg，0.789mmol，Eq：0.2)和碳酸铯(3.86g，11.8mmol，Eq：3)、Pd(OAc)2(177mg，0.789mmol，Eq：0.2)在二烷(15ml)中的溶液在100°加热并搅拌过夜。将反应混合物在真空中浓缩。将残余物放入EtOAc中并用柠檬酸的水溶液洗涤。粗品通过柱色谱(SiO2，CH2Cl2/MeOH 95/5至8/2)纯化，得到0.308g(22％)的4-(4-叔丁氧基羰基哌嗪-1-基)-2-氯-6-氟-苯甲酸，为浅褐色固体。
步骤B：
将4-(4-(叔丁氧基羰基)哌嗪-1-基)-2-氯-6-氟苯甲酸(190mg，530mmol，Eq：1.00)和CDI(0.112g，0.688mmol，Eq：1.3)合并在DMF(2.5ml)中，得到浅黄色溶液。将反应混合物搅拌1.5小时。加入另外的CDI(85.9mg，0.530mmol，Eq：1.00)并将反应混合物再搅拌1.5小时。加入氢氧化铵(1.03ml，26.5mmol，Eq：50)并将反应混合物搅拌1小时。将反应混合物用CH2Cl2萃取并用Na2SO4干燥，并在真空中浓缩。柱色谱(SiO2，CH2Cl2/MeOH 98/2)得到标题化合物(0.12g，62％)，为浅黄色固体。MS(m/e)：302.1(M-tBu+H+)。
中间体B.26
制备(2R)-4-(5-氨基甲酰基-6-甲氧基吡啶-2-基)-2-乙基哌嗪-1-甲酸叔丁酯
步骤A：
向(R)-2-乙基哌嗪-1-甲酸叔丁酯(0.208g，0.971mmol，Eq：1.00)和三乙胺(0.135ml，0.971mmol，Eq：1.00)在DMF(2ml)中的溶液中加入2，6-二氯烟酸甲酯(0.200g，0.971mmol，Eq：1.00)并将反应混合物在30℃搅拌4.5小时。将反应混合物用EtOAc稀释并用水和盐水洗涤，有将机相用Na2SO4干燥并蒸发溶剂。粗品通过柱色谱(SiO2，EtOAc/庚烷，1/4)纯化，得到160mg(43％)的(2R)-4-(6-氯-5-甲氧基羰基-2-吡啶基)-2-乙基-哌嗪-1-甲酸叔丁酯，为白色固体。MS(m/e)：384.2(M+H+)。
步骤B：
在密封管中，将(2R)-4-(6-氯-5-甲氧基羰基-2-吡啶基)-2-乙基-哌嗪-1-甲酸叔丁酯(161mg，0.419mmol，Eq：1.00)溶解于MeOH(2ml)中，加入甲醇钠(0.388ml，2.1mmol，Eq：5)并将混合物加热至90℃并搅拌4.5小时。反应混合物用柠檬酸水溶液酸化，用CH2Cl2萃取，用水洗涤并用Na2SO4干燥，得到6-[(3R)-4-叔丁氧基羰基-3-乙基-哌嗪-1-基]-2-甲氧基-吡啶-3-甲酸。MS(m/e)：366.2(M+H+)。该粗产物在未经进一步纯化下直接用于下一步骤。
步骤C：
将6-[(3R)-4-叔丁氧基羰基-3-乙基-哌嗪-1-基]-2-甲氧基-吡啶-3-甲酸(135mg，0.369mmol，Eq：1.00)和CDI(71.9mg，0.443mmol，Eq：1.2)在DMF(3ml)中的溶液在室温搅拌1h。加入氢氧化铵(0.719ml，18.5mmol，Eq：50)并搅拌2小时以上。将反应混合物用水稀释并用EtOAc萃取，用Na2SO4干燥并蒸发溶剂。粗品通过柱色谱纯化，得到标题产物(2R)-4-(5-氨基甲酰基-6-甲氧基吡啶-2-基)-2-乙基哌嗪-1-甲酸叔丁酯，为白色固体(20mg，15％)。MS(m/e)：365.2(M+H+)。
中间体B.27
制备4-(5-氨基甲酰基-6-甲氧基吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
类似于中间体B.26，4-(5-氨基甲酰基-6-甲氧基吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯制备自2，6-二氯烟酸甲酯和哌嗪-1-甲酸叔丁酯。MS(m/e)：337.2(M+H+)。
中间体C.1
制备6-溴-2，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪
向5-溴-3-甲基吡嗪-2-胺(4.63g，24.6mmol)在iPrOH(30ml)中的悬浮液中加入1-溴-2，2-二甲氧基丙烷(3.66ml，27.1mmol)、对甲苯磺酸吡啶(0.62g，2.5mmol)并在密封管中将混合物加热至65℃持续36h。将反应物用DCM稀释，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，干燥(Na2SO4)并浓缩。通过在硅胶上的急骤柱色谱(EtOAc：Hept 1:4-1:1)纯化，得到标题产物，为浅黄色结晶固体(3.96g，71％)。MS(m/e)：226.1(M+H+，Br)
中间体C.2
制备6-溴-8-乙基-2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪
向5-溴-3-乙基吡嗪-2-胺(0.68，3.37mmol)在iPrOH(10ml)中的悬浮液中加入1-溴-2，2-二甲氧基丙烷(0.54ml，4.04mmol)、对甲苯磺酸吡啶(0.084g，0.337mmol)并将混合物加热至90℃持续4h。将反应物用DCM稀释，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，干燥(Na2SO4)并浓缩。通过在硅胶上的急骤柱色谱(EtOAc：Hept 1:4-1:1)纯化，得到标题产物，为浅褐色固体(0.51g，63％)。MS(m/e)：240.1(M+H+，Br)。
中间体C.3
制备6-溴-8-环丙基-2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪
步骤A：
向在冰浴中冷却的3-环丙基吡嗪-2-胺(275mg，2.03mmol，Eq：1.00)在乙腈(10ml)中的溶液中分批加入N-溴代琥珀酰亚胺(362mg，2.03mmol，Eq：1.00)。在20分钟之后，将溶剂蒸发并通过柱色谱(SiO2，庚烷/EtOAc 2/1)纯化，得到(279mg，64％)的5-溴-3-环丙基-吡嗪-2-胺，为浅黄色固体。MS(m/e)：214.1(M+H+，Br)。
步骤B：
向5-溴-3-环丙基吡嗪-2-胺(0.274，1.28mmol)在iPrOH(5ml)中的悬浮液中加入1-溴-2，2-二甲氧基丙烷(0.207ml，1.54mmol)、对甲苯磺酸吡啶(0.032g，0.128mmol)并将混合物加热至90℃持续3h。将反应物用DCM稀释，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，干燥(Na2SO4)并浓缩。通过在硅胶上的急骤柱色谱(EtOAc：Hept 1:4-1:1)纯化，得到标题产物6-溴-8-环丙基-2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪，为浅褐色固体(0.158g，48％)。MS(m/e)：252.1(M+H+，Br)。
中间体C.4
制备6-氯-8-三氟甲基-2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪
步骤A：
向三氟甲亚磺酸钠(1.2g，7.7mmol)在水(12ml)中的溶液中加入5-氯吡嗪-2-胺(1.0g，7.7mmol)在DCM(30ml)中的溶液。在2h内逐滴加入氢过氧化叔丁基(1.0ml，5.5M，在壬烷中，5.5mmol)。然后加入第二部分的三氟甲亚磺酸钠(1.2g，7.7mmol)，接着在6h内逐滴加入第二部分的氢过氧化叔丁基(1.0ml，5.5M，在壬烷中，5.5mmol)。将反应物用DCM重复萃取并将合并的有机萃取物用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并浓缩。通过在硅胶上的急骤柱色谱(DCM)纯化，得到5-氯-3-(三氟甲基)吡嗪-2-胺，为黄色晶体(0.9g，57％)。MS(m/e)：198.0.(M+H+，Cl)
步骤B：
向5-氯-3-(三氟甲基)吡嗪-2-胺(0.77g，3.8mmol)在iPrOH(6ml)中的悬浮液中加入1-溴-2，2-二甲氧基丙烷(0.57ml，4.2mmol)、对甲苯磺酸吡啶(0.1g，0.4mmol)并将混合物在密封管中加热至100℃达96h。将反应物用DCM稀释，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，干燥(Na2SO4)并浓缩。通过在硅胶上的急骤柱色谱(EtOAc：Hept 3:7-1:0)纯化，得到标题产物，为褐色粉末(0.15g，17％)。MS(m/e)：236.1.(M+H+，Cl)
中间体C.5
制备6-氯-8-二氟甲基-2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪
步骤A：
向5-氯吡嗪-2-胺(1.0g，7.7mmol)在DCM(60ml)中的溶液中加入二(二氟甲基亚磺酰基氧基)锌(2.3g，7.7mmol)和Fe(NO3)3.9H2O(0.3g，0.8mmol)在水(24ml)中的悬浮液并将混合物搅拌。将氢过氧化叔丁基(2.2ml，5.5M，在壬烷中，12.1mmol)以0.2ml部分/45min加入，总反应时间为8h。将反应物用DCM稀释，用水洗涤，干燥(Na2SO4)并浓缩。通过在硅胶上的急骤柱色谱(DCM：MeOH 1:0-4:1)纯化，得到5-氯-3-(二氟甲基)吡嗪-2-胺，为黄色结晶(0.6g，40％)。MS(m/e)：180.0.(M+H+，Cl)。
步骤B：
向5-氯-3-(二氟甲基)吡嗪-2-胺(0.5g，2.8mmol)在iPrOH(10ml)中的悬浮液中加入1-溴-2，2-二甲氧基丙烷(1.1ml，8.4mmol)、对甲苯磺酸吡啶(0.1g，0.3mmol)并在密封管中将混合物加热至65℃持续18h。将反应物用DCM稀释，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，干燥(Na2SO4)并浓缩。通过在硅胶上的急骤柱色谱(EtOAc：Hept 1:4-1:0)纯化，得到标题产物，为褐色粉末(0.20g，40％)。MS(m/e)：218.1.(M+H+，Cl)
中间体D.1
4-溴-2-氟-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)苯甲酰胺
在密封管中，将在二烷(5mL)中的4-溴-2-氟苯甲酰胺(150mg，0.688mmol)、6-溴-2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪(146mg，0.688mmol)、碘化铜(I)(13.1mg，0.068mmol，0.1eq.)、K3PO4(307mg，1.44mmol，2.1eq.)和1，10-菲咯啉(14.9mg，0.138mmol，0.2eq.)在120℃加热过夜。将反应混合物在C盐上过滤，在真空下浓缩，并在柱色谱(SiO2，CH2Cl2/MeOH 99/1至98/2)上纯化，得到24mg(10％)的4-溴-2-氟-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)苯甲酰胺。MS(m/e)：349.1(M+H+，Br)。
中间体D.2
4-溴-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)苯甲酰胺
在密封管中，将在二烷(5mL)中的4-溴苯甲酰胺(94.3mg，0.472mmol)、6-溴-2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪(100mg，0.472mmol)、碘化铜(I)(8.9mg，0.047mmol，0.1eq.)、K3PO4(210mg，0.99mmol，2.1eq.)和1，10-菲咯啉(17mg，0.094mmol，0.2eq.)在120℃加热过夜。将反应混合物在C盐上过滤，在真空下浓缩，并在柱色谱(SiO2，CH2Cl2/MeOH 99/1至98/2)上纯化，得到42mg(18％)的4-溴-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)苯甲酰胺，为白色固体。MS(m/e)：331.1(M+H+，Br)。
中间体D.3
4-溴-2-乙氧基-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)苯甲酰胺
在密封管中，将在二烷(5mL)中的4-溴-2-乙氧基苯甲酰胺(288mg，0.1.18mmol)、6-溴-2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪(275mg，1.30mmol)、碘化铜(I)(22.5mg，0.118mmol，0.1eq.)、K3PO4(526mg，2.48mmol，2.1eq.)和1，10-菲咯啉(42.5mg，0.236mmol，0.2eq.)在120℃加热过夜。将反应混合物在C盐上过滤，在真空下浓缩，并在柱色谱(SiO2，CH2Cl2/MeOH 99/1至98/2)上纯化，得到159mg(36％)的标题产物，为白色固体。MS(m/e)：375.2(M+H+，Br)。
通用程序1
Buchwald胺化反应
将芳基溴衍生物(1当量)、仲胺(2当量)、三(二亚苄基-丙酮)二钯(0)(Pd2(dba)3)(0.08当量)、叔丁醇钠(1.5当量)和二苯基膦基)-9，9-二甲基呫吨(Xantphos)(0.12当量)在甲苯中的溶液在80-130℃加热过夜。将溶剂蒸发并将产物直接通过硅胶上的柱色谱纯化。
通用程序2
Boc脱保护
将Boc-保护的胺放入在MeOH-二烷的混合物中的溶液中。加入HCl在二烷中的溶液(4M，10当量)并且持续搅拌直至完成(0.2h至4小时)。所述产物通过过滤收集并在真空干燥。
实施例1
制备2-氟-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)-4-哌嗪-1-基苯甲酰胺盐酸盐
依照通用程序1(Buchwald胺化)接着通用程序2(Boc脱保护)，2-氟-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)-4-哌嗪-1-基苯甲酰胺盐酸盐制备自4-溴-2-氟-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)苯甲酰胺(实施例D.1)和哌嗪-1-甲酸叔丁酯。MS(m/e)：391.8(M+H+)。
实施例2
制备N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)-4-哌嗪-1-基苯甲酰胺盐酸盐
依照通用程序1(Buchwald胺化)接着通用程序2(Boc脱保护)，N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)-4-哌嗪-1-基苯甲酰胺盐酸盐制备自4-溴-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)苯甲酰胺(实施例D.2)和哌嗪-1-甲酸叔丁酯。MS(m/e)：337.1(M+H+)。
实施例3
制备4-[(8aS)-3，4，6，7，8，8a-六氢-1H-吡咯并[1，2-a]吡嗪-2-基]-2-乙氧基-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)苯甲酰胺
依照通用程序1(Buchwald胺化)，4-[(8aS)-3，4，6，7，8，8a-六氢-1H-吡咯并[1，2-a]吡嗪-2-基]-2-乙氧基-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)苯甲酰胺制备自4-溴-2-乙氧基-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)苯甲酰胺(实施例D.3)和(8aS)-1，2，3，4，6，7，8，8a-八氢吡咯并[1，2-a]吡嗪。MS(m/e)：421.4(M+H+)。
实施例4
制备2-乙氧基-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)-4-[(3S)-3-甲基哌嗪-1-基]苯甲酰胺
依照通用程序1(Buchwald胺化)接着通用程序2(Boc脱保护)，2-乙氧基-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)-4-[(3S)-3-甲基哌嗪-1-基]苯甲酰胺制备自4-溴-2-乙氧基-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)苯甲酰胺(实施例D.3)和(2S)-2-甲基哌嗪-1-甲酸叔丁酯。MS(m/e)：395.3(M+H+)。
实施例5
制备2-乙氧基-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)-4-[(3R)-3-甲基哌嗪-1-基]苯甲酰胺
依照通用程序1(Buchwald胺化)接着通用程序2(Boc脱保护)，2-乙氧基-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)-4-[(3R)-3-甲基哌嗪-1-基]苯甲酰胺制备自4-溴-2-乙氧基-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)苯甲酰胺(实施例D.3)和(2R)-2-甲基哌嗪-1-甲酸叔丁酯。MS(m/e)：395.3(M+H+)。
实施例6
制备4-[(8aR)-3，4，6，7，8，8a-六氢-1H-吡咯并[1，2-a]吡嗪-2-基]-2-乙氧基-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)苯甲酰胺
依照通用程序1(Buchwald胺化)，4-[(8aR)-3，4，6，7，8，8a-六氢-1H-吡咯并[1，2-a]吡嗪-2-基]-2-乙氧基-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)苯甲酰胺制备自4-溴-2-乙氧基-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)苯甲酰胺(实施例D.3)和(8aR)-1，2，3，4，6，7，8，8a-八氢吡咯并[1，2-a]吡嗪。MS(m/e)：421.4(M+H+)。
实施例7
制备4-[(8aR)-3，4，6，7，8，8a-六氢-1H-吡咯并[1，2-a]吡嗪-2-基]-2-氟-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)苯甲酰胺
依照通用程序1(Buchwald胺化)，4-[(8aR)-3，4，6，7，8，8a-六氢-1H-吡咯并[1，2-a]吡嗪-2-基]-2-氟-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)苯甲酰胺制备自4-溴-2-氟-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)苯甲酰胺(实施例D.1)和(8aR)-1，2，3，4，6，7，8，8a-八氢吡咯并[1，2-a]吡嗪。MS(m/e)：395.3(M+H+)。
实施例8
制备4-[(8aS)-3，4，6，7，8，8a-六氢-1H-吡咯并[1，2-a]吡嗪-2-基]-2-氟-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)苯甲酰胺
依照通用程序1(Buchwald胺化)，4-[(8aS)-3，4，6，7，8，8a-六氢-1H-吡咯并[1，2-a]吡嗪-2-基]-2-氟-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)苯甲酰胺制备自4-溴-2-氟-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)苯甲酰胺(实施例D.1)和(8aS)-1，2，3，4，6，7，8，8a-八氢吡咯并[1，2-a]吡嗪。MS(m/e)：395.3(M+H+)。
实施例9
制备4-(1，4-二氮杂环庚-1-基)-2-乙氧基-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)苯甲酰胺
依照通用程序1(Buchwald胺化)，4-(1，4-二氮杂环庚-1-基)-2-乙氧基-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)苯甲酰胺制备自4-溴-2-乙氧基-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)苯甲酰胺(实施例D.3)和1，4-二氮杂环庚烷。MS(m/e)：395.3(M+H+)。
实施例10
制备4-[(3S，5R)-3，5-二甲基哌嗪-1-基]-2-乙氧基-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)苯甲酰胺
依照通用程序1(Buchwald胺化)，4-(1，4-二氮杂环庚-1-基)-2-乙氧基-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)苯甲酰胺制备自4-溴-2-乙氧基-N-(2-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)苯甲酰胺(实施例D.3)和(2R，6S)-2，6-二甲基哌嗪。MS(m/e)：409.3(M+H+)。
实施例11
制备N-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)-2-氟-4-[(3R)-3-甲基哌嗪-1-基]苯甲酰胺
步骤A：
在试管中，将(R)-4-(4-氨基甲酰基-3-氟苯基)-2-甲基哌嗪-1-甲酸叔丁酯(0.10g，0.3mmol，中间体B.1)、6-溴-2，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪(0.08g，0.4mmol，中间体C.1)、(二苯基膦基)-9，9-二甲基呫吨(0.03g，0.04mmol)、碳酸铯(0.14g，0.4mmol)在二烷(2ml)中的悬浮液利用氩气鼓泡通过超声处理而脱气。然后加入三(二亚苄基丙酮)二钯(0)(0.01g，0.1mmol)，将试管密封并将混合物加热至100℃持续3h。然后将反应物用DCM稀释，用水洗涤，干燥(Na2SO4)并浓缩。通过在硅胶上的急骤柱色谱(EtOAc：Hept 1:1-7:3)纯化，得到(R)-4-(4-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基氨基甲酰基)-3-氟苯基)-2-甲基哌嗪-1-甲酸叔丁酯(0.11g，77％)，为浅褐色粉末。MS(m/e)：483.4(M+H+)。
步骤B：
将(R)-4-(4-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基氨基甲酰基)-3-氟苯基)-2-甲基哌嗪-1-甲酸叔丁酯(0.10g，0.2mmol)悬浮在二烷中的盐酸(4ml，4M)中并搅拌20分钟。然后将反应物蒸发至干，再溶解于水中，用DCM洗涤，然后通过加入饱和碳酸氢钠溶液使该水溶液呈碱性，用DCM：MeOH(95：5)再萃取并浓缩，得到标题产物(0.08g，定量)，为黄色粉末。(m/e)：383.3(M+H+)。
类似于实施例11，下表的实施例12至47制备自对应的羧酰胺和杂芳基卤，接着根据需要脱保护。
实施例48
制备N-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)-2-氟-4-(4-吡咯烷-1-基哌啶-1-基)苯甲酰胺
步骤A：
类似于实施例1，将2-氟-4-(1，4-二氧杂-8-氮杂螺[4.5]癸-8-基)苯甲酰胺(A.22)与-溴-2，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪(C.1)反应，得到N-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)-2-氟-4-(1，4-二氧杂-8-氮杂螺[4.5]癸-8-基)苯甲酰胺。MS(m/e)：426.3(M+H+)
步骤B：
将N-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)-2-氟-4-(1，4-二氧杂-8-氮杂螺[4.5]癸-8-基)苯甲酰胺(0.14g，0.3mmol)溶解于二烷(2.5ml)中并加入6M HCl水溶液(2.3ml，13.8mmol)。将混合物搅拌2h，之后将其通过加入饱和碳酸氢钠水溶液进行中和并用EtOAc萃取。将有机相用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并浓缩，得到N-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)-2-氟-4-(4-氧代哌啶-1-基)苯甲酰胺(0.13g，定量)，为黄色粉末。
步骤C：
向N-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)-2-氟-4-(4-氧代哌啶-1-基)苯甲酰胺(0.12g，0.3mmol)在DCM(2ml)中的溶液中加入吡咯烷(0.03ml，0.4mmol)，接着加入三乙酰氧基硼氢化钠(0.1g，0.5mmol)并将反应物搅拌0.5h。然后将反应物用EtOAc稀释，用饱和碳酸氢钠水溶液、盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并浓缩。通过在硅胶上的急骤柱色谱(DCM：MeOH9:1-7:3+NH4OH)纯化，得到N-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)-2-氟-4-(4-吡咯烷-1-基哌啶-1-基)苯甲酰胺(0.11g，82％)，为白色粉末。MS(m/e)：437.4(M+H+)
实施例49
N-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)-2-乙氧基-4-[4-(3-甲氧基氮杂环丁-1-基)哌啶-1-基]苯甲酰胺
似于实施例48(步骤C)，标题化合物类通过N-(2，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-基)-2-氟-4-(4-氧代哌啶-1-基)苯甲酰胺(实施例48，步骤B)与3-甲氧基氮杂环丁烷盐酸盐反应制备。MS(m/e)：479.4(M+H+)
生物学测定
为了更详细地描述并且有助于理解本说明书，提供以下非限制性生物学实施例以更全面地说明说明书的范围并且其不被视为具体地限定其范围。现在已知的或可以之后开发的本说明书的此种变化(其将在本领域技术人员确定的范围内)被认为落在本说明书的和如下文所要求保护的范围内。这些实施例举例说明了本文所述的某些化合物的体外和/体内测试并且证明了所述化合物通过增强SMN2的外显子7包括在由SMN2基因转录的mRNA中来治疗SMA的有用性。式(I)化合物增强SMN2的外显子7在由SMN2基因转录的mRNA中的包含并且提高了由SMN2基因产生的SMN蛋白的水平，并且因此可以用于治疗有此需要的人受治疗者中的SMA。这些实施例还举例说明了本文所述的某些化合物的体外和/体内测试并且证明了所述化合物增强SMNI的外显子7在由SMN1基因转录的mRNA中的包含的有用性。因此，式(I)化合物还增强了SMN1的外显子7在由SMN1基因转录的mRNA中的包含并且提高由SMN1基因产生的SMN蛋白的水平。
测定1
用于培养的细胞中的SMN2小基因pre-mRNA剪接的RT-qPCR测定
将基于反转录-定量PCR(RT-qPCR)的测定用于量化含有SMN2外显子7的全长SMN2小基因(本文中被称为术语“FL SMN2mini”)mRNA在稳定转染有所述小基因并用测试化合物处理的HEK293H细胞系中的水平。使用的材料和相应来源在以下列于表1中。
表1.在培养细胞中的SMN2小基因mRNA剪接RT-qPCR测定中使用的材料及其相应来源。
制备SMN2-A小基因构建体，如在国际专利申请WO2009/151546A1第145页第[00400]段至第147页第[00412]段中所述(包括其中的图1和图3)。
将稳定转染有SMN2-A小基因构建体的HEK293H细胞(10,000个细胞/孔)接种在96孔平底板中的200μL细胞培养基(DMEM加上10％FBS以及200μg/mL潮霉素)中，并将所述平板立即旋动以保证细胞适当的分散并且甚至形成单层的细胞。允许细胞附着达6小时。将测试化合物在100％DMSO中连续稀释3.16倍以产生7个点的浓度曲线。将测试化合物的溶液(1μL，200x，在DMSO中)添加到各个包含细胞的孔中并将平板在细胞培养箱(37℃，5％CO2，100％相对湿度)中温育24小时。为每个测试化合物浓度制备2个重复试样。然后将细胞在Cells-To-Ct裂解缓冲液中裂解并将溶解产物存储在-80℃。
使用表2中指示的引物和探针来量化全长SMN2-A小基因和GAPDH mRNA。引物SMN正向A(SEQ ID NO.1)杂交至外显子7中的核苷酸序列(核苷酸22至核苷酸40)，引物SMN反向A(SEQ ID NO.2)杂交至萤火虫荧光素酶的编码序列中的核苷酸序列，SMN探针A(SEQ ID NO.3)杂交至以下中的核苷酸序列：外显子7(核苷酸50至核苷酸54)和外显子8(核苷酸1至核苷酸21)。这三种寡核苷酸的组合只检测SMN1或SMN2小基因(RT-qPCR)而不检测内源的SMN1或SMN2基因。
表2.1由PTC Therapeutics，Inc.设计的引物和探针；2可商购自Thermo Fisher Scientific，Inc.(以前的Life Technologies，Inc.)。
以0.4μM的终浓度使用SMN正向和反向引物。以0.15μM的终浓度使用SMN探针。以0.2μM的终浓度使用GAPDH引物并且以0.15μM的终浓度使用探针。
通过将以下各项组合来制备SMN2-小基因GAPDH混合物(15μL总体积)：7.5μL的2x RT-PCR缓冲液，0.4μL的25x RT-PCR酶混合物，0.75μL的20x GAPDH引物-探针混合物，4.0075μL的水，2μL的10倍稀释的细胞溶解产物，0.06μL的100μM SMN正向引物，0.06μL的100μM SMN反向引物，和0.225μL的100μM SMN探针。
在以下温度进行PCR达指定的时间：步骤1：48℃(15min)；步骤2：95℃(10min)；步骤3：95℃(15sec)；步骤4：60℃(1min)；然后重复步骤3和4达总计40个循环。
各反应混合物包含SMN2-A小基因和GAPDH引物/探针组(多元设计)两者，允许同时测量两种转录物的水平。
使用改进的ΔΔCt方法(如在Livak和Schmittgen，Methods，2001，25：402-8中所述)，由实时PCR数据确定相对于用载体对照处理的细胞的FL SMN2mini mRNA的丰度的增加。扩增效率E计算自单独对于FL SMN2mini和GAPDH的扩增曲线的斜率。然后，FL SMN2mini和GAPDH mRNA的丰度计算为(1+E)-Ct，其中Ct是各扩增子的阈值。将FL SMN2mini mRNA的丰度相对于GAPDH mRNA丰度进行归一化。然后将来自用测试化合物处理的样品的归一化的FL SMN2mini mRNA丰度除以来自用载体处理的细胞的归一化的FL SMN2mini mRNA丰度，以确定相对于载体对照的FL SMN2mini mRNA的水平。
表3提供了针对全长SMN2小基因mRNA生产的EC1.5x浓度，其获得自根据以上用于特别的本发明的化合物的程序生成的7点浓度数据。
特别的本发明的化合物显示≤5μM的针对全长SMN2小基因mRNA生产的EC1.5x浓度。
更特别的本发明的化合物显示≤1μM的针对全长SMN2小基因mRNA生产的EC1.5x浓度。
最特别的本发明的化合物显示≤0.1μM的针对全长SMN2小基因mRNA生产的EC1.5x浓度。
表3.对于全长SMN2小基因mRNA的生产的EC1.5x浓度。
测定2
培养的细胞中的SMN蛋白测定
将SMN HTRF(均相时间分辨荧光)测定用于量化用测试化合物处理的SMA患者成纤维细胞中的SMN蛋白的水平。使用的材料和相应来源在以下列于表4中。
表4.在培养的细胞中的SMN蛋白测定中使用的材料及其相应来源。
将细胞解冻并在DMEM-10％FBS中培养72小时。将细胞胰蛋白酶化，计数并重悬在DMEM-10％FBS中至25,000个细胞/mL的浓度。将细胞悬浮液以5,000个细胞/孔铺板于96孔微滴定平板中并且温育3至5小时。将测试化合物在100％DMSO中连续稀释3.16倍以生成7个点的浓度曲线。将1μL的测试化合物溶液转移至含细胞的孔中并将细胞在细胞培养箱(37℃，5％CO2，100％相对湿度)中温育48小时。为每个测试化合物浓度设置三份重复样品。48小时后，将上清自孔中取出并将含有蛋白酶抑制剂的25μL的RIPA裂解缓冲液添加到孔中并在摇动的情况下在室温温育1小时。加入25μL的稀释剂，然后将35μL所得的溶胞产物转移至384孔板，其中每个孔含有5μL的抗体溶液(抗-SMN d2和抗-SMN穴合物(cryptate)在SMN重构缓冲液中的1∶100稀释液)。将所述平板离心1分钟以使溶液来到孔的底部，然后在室温温育过夜。在EnVision多标记平板读数计(Perkin-Elmer)上测量平板的各个孔在665nm和620nm的荧光。
通过用在665nm的信号除以在620nm的信号来计算每个样品、空白和载体对照孔的归一化的荧光信号。归一化信号解决了由于溶胞产物的基体效应所致的可能的荧光猝灭。各样品孔的ΔF值(作为百分比值的SMN蛋白丰度的量度)通过以下方式计算：从各样品孔的归一化的荧光减去空白对照孔的归一化的平均荧光，然后用该差值除以空白对照孔的归一化的平均荧光，并将所得的值乘以100。各样品孔的ΔF值表示来自用测试化合物处理的样品的SMN蛋白丰度。将各样品孔的ΔF值除以载体对照孔的ΔF值以计算相对于载体对照的SMN蛋白丰度的倍数增加。表5提供了针对SMN蛋白表达的EC1.5x浓度，其获得自根据以上用于本发明的特别的化合物的程序生成的7点浓度数据。
特别的本发明的化合物显示≤10μM的针对SMN蛋白表达的EC1.5x浓度。
更特别的本发明的化合物显示≤1000nM的针对SMN蛋白表达的EC1.5x浓度。
最特别的本发明的化合物显示≤500nM的针对SMN蛋白表达的EC1.5x浓度。
表6提供了SMN蛋白的最大倍数增加，其获得自根据以上用于本发明的特别的化合物的程序生成的7点浓度数据。
特别的本发明的化合物显示＞1.5的最大倍数增加。
更特别的本发明的化合物显示＞1.7的最大倍数增加。
最特别的本发明的化合物显示＞1.8的最大倍数增加。
表5.对于SMN蛋白表达的EC1.5x浓度。
表6.SMN蛋白的最大倍数增加。