三维细胞培养系统和使用该系统的细胞培养方法与流程

本发明涉及基于可生物降解的合成生物凝胶的三维细胞培养方法，更具体地，涉及在干细胞和原代细胞的培养中使用多孔膜和可生物降解的合成生物凝胶以非接触方式在细胞培养皿中培养细胞的方法。

背景技术：

目前最广泛使用的细胞培养方法是在二维孔板或培养皿中培养细胞。然而，根据最近的论文，与三维细胞培养相比，二维(单层)细胞培养导致更低的细胞功能和形态的显著改变(proc.natl.acad.sci.usa,100:1943-1948,2003；cell,111:923-925,2002；cancercell2:205-216,2002)。为了克服这些缺点，最近开发了使用三维结构化载体的细胞培养方法，并且广泛使用电纺丝、泡沫成型、离子浓缩方法以及使用球形自组装制造反转结构作为制造这种结构的方法。近年来，已经尝试了创建类似于体内环境的细胞培养方法的新范式，这是通过开发生物-mems领域实现的，称为dna芯片、蛋白质芯片和集成芯片，其是用于生物医学领域的微机电系统(proc.natl.acad.sci.usa,96:5545-5548,1999；anal.chem.,74:1560-1564,2002；biotechnol.prog.,20:338-345,2004；biomed.microdevices,4:161-166,2002)。类似地，韩国专利no.10-0733914公开了一种三维微细胞培养系统，其特征在于细胞存在于三维凝胶中，但是该系统的缺点是，在使用细胞培养后的细胞进行传代培养或分析中难以分离存在于凝胶中的细胞，特别是，难以附着和增殖的干细胞或原代细胞在细胞分离期间受损。

干细胞是指可以在未分化状态下无限增殖以及在特定环境和条件下分化以具有特定功能和形状的细胞。人胚胎干细胞在适当的体外培养条件下能够连续自我更新，并具有多能性以分化成构成身体的所有细胞类型。因此，对人胚胎干细胞的研究结果的应用范围正在扩展到各种各样的方面，例如：了解人体发育、分化和生长的基本知识；开发用于人体各种损伤或各种疾病的基本治疗的细胞治疗产品；筛选各种新型候选药物的疗效；以及创建疾病原因，制定治疗策略。

同时，原代细胞是指直接主要从动物组织或器官培养的细胞，原代细胞是从活细胞获得的正常细胞。与肿瘤细胞不同，原代细胞在人工体外继代培养中具有限制。原代细胞用于生物药物等的生产，并且由于与实际生物反应相似的优点，也已经开发为细胞治疗剂。

技术实现要素：

技术问题

在常规的细胞培养方法中，其中细胞在粘附于细胞培养容器的表面的同时进行培养，空气的渗透和培养基营养物的供应仅通过除了其粘附部分之外的部分细胞实现，因此细胞功能恶化并且细胞形态变化，导致不利的生长和增殖。对于难以粘附、生长和增殖的细胞，例如干细胞或原代细胞，上述培养方法具有局限性，并且允许在凝胶内培养的常规三维培养方法具有缺点，细胞不能分离，因此，需要开发一种三维细胞培养系统，以利于需要细胞分离的传代培养或分析。

技术方案

因此，为了通过在所有方向上提供空气和培养基，同时允许容易地分离细胞，以提高干细胞和原代细胞的粘附、生长和增殖，本发明的一个方面是提供用于培养细胞的细胞培养方法，以非接触方式在培养容器中培养细胞，以及提供能够在细胞培养容器中以非接触方式培养细胞的细胞培养系统。

有益效果

在使用本发明的细胞培养方法和细胞培养系统培养细胞的情况下，细胞可以在所有方向上与空气和培养基接触，从而保持细胞的功能和形态，并且利于细胞的粘附、生长和增殖；并且水凝胶在36-37℃的细胞培养温度下处于凝胶相，因此细胞在凝胶内部和外部培养，并且水凝胶在低于细胞培养温度的温度下变为溶胶相，因此利于细胞增殖后的传代培养或细胞分离后的分析，特别是，改善难以培养的干细胞和原代细胞的粘附、生长和增殖。

附图说明

图1示出了根据本发明的三维细胞培养方法和细胞培养系统的示意图。

图2示出了使用现有技术的培养皿的二维细胞培养方法的示意图。

图3示出了仅使用可生物降解的合成生物凝胶的三维细胞培养方法和细胞培养系统的示意图。

图4示出了使用根据常规技术的培养皿的二维细胞培养方法、仅使用可生物降解的合成生物凝胶的三维细胞培养方法和根据本发明的三维细胞培养方法(从第三列到右边是5％、10％和15％可生物降解的合成生物凝胶)培养的人骨髓来源间充质干细胞的细胞粘附条件、细胞存活和集落形成能力。

图5示出了使用根据常规技术的使用培养皿的二维细胞培养方法、仅使用可生物降解的合成生物凝胶的三维细胞培养方法和根据本发明的三维细胞培养方法(从左向右依次是5％、10％、15％、20％、25％和30％的可生物降解的合成生物凝胶)培养的人脂肪源间充质干细胞的细胞粘附条件和细胞产量。

图6示出了使用根据常规技术的培养皿的二维细胞培养方法和根据本发明的三维细胞培养方法(10％可生物降解的合成生物凝胶)培养的人脐带间充质干细胞。

图7示出了使用根据常规技术的使用培养皿的二维细胞培养方法、仅使用多孔膜的三维细胞培养方法和根据本发明的三维细胞培养方法(从左向右依次是5％、10％、15％、20％、25％和30％的可生物降解的合成生物凝胶)培养的作为人来源的原代细胞的皮肤角质形成细胞的细胞粘附条件和细胞产量。

图8示出了使用根据常规技术的培养皿的二维细胞培养方法和根据本发明的三维细胞培养方法(10％可生物降解的合成生物凝胶)培养的犬(小猎犬(beagle))脂肪来源间充质干细胞。

具体实施方式

最佳实施方式

在下文中，将参考以下实施例详细描述本发明。然而，本发明可以以各种不同的形式实现，因此不限于本文所描述的实施例。

根据本发明的一个方面，提供了一种细胞培养方法，包括：

将多孔膜以非接触方式置于细胞培养容器内；

在多孔膜的一个表面上施加可生物降解的合成生物凝胶溶液，以通过溶胶-凝胶相转变包被可生物降解的合成生物凝胶；和

将含有细胞的培养基置于包被的可生物降解的合成生物凝胶上以三维地培养细胞。

在一个实施方案中，多孔膜可以是包括穿透膜的培养容器。

在一个实施方案中，多孔膜可以以非接触方式与细胞培养容器的底部平行放置。多孔膜上的可生物降解的生物合成生物凝胶的包被顺序和以非接触方式将多孔膜置于细胞培养容器内的顺序没有特别限制。在这种情况下，多孔膜可以以非接触方式放置在细胞培养容器的底部上方，然后可以在其上包被可生物降解的合成生物凝胶；或者可以预先将可生物降解的合成生物凝胶包被在多孔膜上，然后将包被的多孔膜以非接触方式放置在细胞培养容器内部。

在一个实施方案中，在细胞在细胞培养容器内非水平培养的情况下，可以在多孔膜的一个表面上施加可生物降解的合成生物凝胶溶液，可以允许细胞粘附到可生物降解的合成生物凝胶，然后将所得的膜以非接触方式置于细胞培养容器内。

在一个实施方案中，培养基在多孔膜和细胞培养容器之间流动，使得培养基和空气可以提供到细胞的粘附部分。本发明的多孔膜和可生物降解的合成生物凝胶允许空气和培养基透过，并且培养基流入以填充多孔膜和细胞培养容器之间的空间(该空间是由多孔膜和细胞培养容器以非接触方式放置而产生的)，使得培养基和空气流入细胞的粘附部分(其粘附到可生物降解的合成生物凝胶)，从而提供细胞培养所需的营养物和空气。

本发明的细胞培养容器通常指用于细胞培养的皿或孔板，并且细胞培养容器没有特别限制，只要其用于细胞培养并且可以以非接触方式在容器中引入多孔膜。另外，具有全方向透气性的细胞培养容器，例如hyperflask(corningco.，usa)，也对应于本发明的细胞培养容器。

在一个实施方案中，可生物降解的合成生物凝胶溶液(水溶胶)向可生物降解的合成生物凝胶的溶胶-凝胶相转变可以在37℃进行1至2小时。

在一个实施方案中，可生物降解的合成生物凝胶可以包括1-40％的可生物降解的合成生物凝胶。对于浓度为40％以上的可生物降解的合成生物凝胶，细胞生长和增殖显示微不足道的变化，因此对于细胞培养是无意义的。对于间充质干细胞，可生物降解的合成生物凝胶的浓度优选为5-10％，但不限于此。

在一个实施方案中，可生物降解的合成生物凝胶在37℃的粘度可以是1.e+00至1.e+06(10⁰至10⁶)mpa·s，这取决于可生物降解的合成生物凝胶的浓度(％)。超出该范围的粘度的可生物降解的合成生物凝胶不增加细胞生长和增殖，导致不显著的细胞培养或者相反导致细胞粘附、生长和增殖的减少。

除了本发明中使用的可生物降解的合成生物凝胶之外，可以使用细胞可粘附的多孔凝胶。其实例可包括hydromatrix^tm肽细胞培养支架，由sigma-aldrich提供，d.a.narmoneva等人biomaterials26(2005)4837-4846中公开的寡肽凝胶，wo2007/029003中公开的水凝胶，us20070099840中公开的水凝胶，用于细胞粘附的寡肽基质(公开于m.zhou等人biomaterials，2009，印刷中)，肽凝胶(公开于4vjayawarna等人actabiomaterialia,2009，印刷中)，并且粘附或支持细胞的任何空气和培养基透性凝胶不受限制。

在一个实施方案中，可生物降解的合成生物凝胶可以包括聚酯聚合物、聚乳酸共聚物、聚乙醇酸、聚己内酯、聚乳酸-乙醇酸、聚羟基丁酸共聚物、聚(羟基戊酸)和聚羟基丁酸-戊酸。

在一个实施方案中，多孔膜可以具有0.1-8μm的孔径，但是孔径不受限制，只要孔径为使得培养基和空气可以通过多孔膜，而可生物降解的合成生物凝胶不能通过多孔膜。

在一个实施方案中，细胞可以是干细胞或原代细胞。干细胞可以是脐带间充质干细胞(usmsc)、脂肪来源的间充质干细胞(admsc)或骨髓来源的间充质干细胞(bmmsc)。原代细胞可以是人皮肤来源的角质形成细胞。干细胞可以来源于哺乳动物，在本发明的实施例中使用人来源和犬来源的干细胞。

如本文所用，术语“三维培养”是指将空气和培养基均匀地供应到粘附的细胞的底部，使得空气和营养物在所有方向上供应到细胞的培养方法。在本发明的实施例中，可生物降解的合成生物凝胶和细胞培养皿的底部通过多孔膜物理分离，从而改善细胞的粘附、生长和增殖。

如本文所用，术语“多孔膜”，“渗透膜”或“聚合物膜”是指培养基或空气通过但是可生物降解的合成生物凝胶不能通过的多孔膜或膜类型材料。对细胞培养基和空气可渗透的任何多孔结构没有特别限制。

如本文所用，术语“水凝胶”是指这样的材料，其中含有作为分散介质的水的液体通过溶胶-凝胶相变来固化，从而失去流动性并形成多孔结构。适合于细胞粘附和培养的任何水凝胶没有特别限制，在本发明的一个实施方案中，使用可生物降解的合成生物凝胶。本发明的可生物降解的合成生物凝胶使用聚氧乙烯-(poe)和聚氧丙烯-(pop-)制成的共聚物。可生物降解的合成生物凝胶处于凝胶相，其在36-37℃下具有1.e+00至1.e+06(10⁰至10⁶)mpa·s的粘度，从而利于细胞粘附。可生物降解的合成生物凝胶在低于细胞培养温度的温度下变成溶胶相，从而利于细胞增殖后的传代培养或细胞分离后的分析。

如本文所用，术语“干细胞”是指具有自我更新和分化能力的未分化细胞。干细胞根据其分化能力包括多能(pluripotent)干细胞、专能(multipotent)干细胞和单能(unipotent)干细胞的亚组。多能干细胞是指具有分化为构成活生物体的所有组织或细胞的能力的细胞，专能干细胞是指具有分化为多种而不是所有组织或细胞的能力的细胞。单能干细胞是指具有分化成特定组织或细胞的能力的细胞。多能干细胞可以包括胚胎干细胞(es细胞)，胚胎生殖细胞(eg细胞)，诱导多能干细胞(ips细胞)等。专能干细胞可以包括成体干细胞，例如间充质干细胞(例如，来自脂肪、骨髓、脐带血或脐带等)，造血干细胞(来自骨髓或外周血)，神经干细胞，生殖干细胞等。单能干细胞可以包括用于肝细胞的定向干细胞，其通常是具有低自我更新能力的休眠状态，但在某些条件下有力地分化成肝细胞。本发明的实施例证实，通过本发明的三维细胞培养方法，有利于作为代表性样品的骨髓来源间充质干细胞、脂肪来源间充质干细胞和脐带间充质干细胞的细胞粘附、生长和增殖。

如本文所用，术语“原代细胞”是指从没有任何遗传操作等的个体组织中分离的细胞，并且代表活生物体的器官/组织的功能。原代细胞从皮肤或血管内皮、骨髓、脂肪、软骨等中分离，并用于研究相应组织和细胞的功能或用于恢复丧失组织的细胞治疗剂。在本发明的实施例中，使用来自人皮肤的角质形成细胞。

干细胞或原代细胞的来源没有特别限制，只要可以通过本发明的细胞培养方法和细胞培养箱来培养细胞即可，其实例可以是来自人、猴、猪、马、牛、绵羊、狗、猫、小鼠或兔。优选地，干细胞或原代细胞是人源性干细胞或原代细胞，但不限于此。

根据本发明的一个方面，提供了一种细胞培养系统，包括：

细胞培养容器；和

多孔膜，其一个表面附着有水凝胶，细胞粘附到水凝胶上，

其中附着有水凝胶的多孔膜以非接触方式设置在细胞培养容器的内部。

在一个实施方案中，多孔膜和可生物降解的合成生物凝胶对培养基和空气是可透性的，并且对细胞培养基是可透性的，从而提供细胞培养所需的营养物和空气。

如本文所用，术语“细胞培养系统”是指用于培养细胞的容器、装置或设备。

具体实施例

通过以下实施例更详细地描述本发明。然而，提供以下实施例仅用于说明本发明而不限制本发明的范围。

实施例

实施例：三维状态下的干细胞培养法

将可生物降解的合成生物凝胶(basf，德国)以5％的浓度梯度按照5％至30％的浓度溶解于无菌蒸馏水中，制备具有各种％值的凝胶，然后以250μl/cm²将制备的凝胶包被在0.4μm至1μm聚合物膜(corning，usa)上，并在37℃下固化1小时30分钟，由此制备细胞培养容器。然后，将人脂肪来源的间充质干细胞、人骨髓来源的间充质干细胞、人脐带间充质干细胞、人皮肤来源的角质形成细胞或犬来源的间充质干细胞(canineadmsc)接种在细胞培养容器的可生物降解的合成生物凝胶上，然后在co2培养箱中在37℃下针对各种细胞优化的培养基中培养3-4天。人脂肪来源的间充质干细胞在cefogroadmsc培养基(cb-admsc-gm，cefo，韩国)中培养；人骨髓来源的间充质干细胞在cefogrobmmsc培养基(cb-bmmsc-gm，cefo，韩国)中培养；人脐带间充质干细胞在cefogroucmsc培养基(cb-ucmsc-gm，cefo，韩国)中培养；人皮肤来源的角质形成细胞在cefogrohk培养基(cb-hk-gm，cefo，韩国)中培养；犬来源的间充质干细胞(canineadmsc)在cefogromsgm培养基(cb-ms-gm，cefo，韩国)中培养(图1)。

比较例1：二维状态的干细胞培养法

通过作为常规干细胞培养方法的二维培养方法培养干细胞。具体地，将干细胞接种在如上述实施例的细胞培养容器(皿)中，然后培养干细胞(图2)。

比较例2：在没有聚合物膜的三维状态下的干细胞培养方法

与上述实施例相比，将可生物降解的合成生物凝胶包被在没有聚合物膜的细胞培养皿的底部，然后以与上述实施例相同的方式将干细胞接种在其上(图3)。

与图2(二维法)和图3(仅使用可生物降解的合成生物凝胶的三维法)相比，本发明的三维细胞培养方法(图1)的特征在于，向所有方向上的细胞提供空气和培养基。

试验例1：人骨髓来源间充质干细胞的三维培养的验证

为了研究人骨髓来源间充质干细胞培养后的细胞培养度，通过比较例1的二维培养法、比较例3的培养方法和上述实施例的培养方法(5％、10％或15％可生物降解的合成生物凝胶)培养人骨髓来源间充质干细胞。细胞培养后，在相差显微镜下观察细胞，结果证实通过比较例2的方法干细胞粘附不良；并且通过上述实施例的方法而不是常规技术的二维培养方法(比较例1)(图4)细胞生长良好。此外，为了确认人骨髓来源间充质干细胞的存活，进行活/死测定，死细胞被染成红色而活细胞被染成绿色。对于该测定，按照如上方法培养细胞，然后除去培养基，不进行洗涤，以孔加入活/死测定溶液(invitrogen，usa)，随后在室温下反应20分钟。在反应后立即在荧光显微镜(leica，德国)上进行图像分析而不洗涤，并且所有这些程序都遵循制造商的方案。结果表明，与通过相差显微镜的上述观察结果相同，通过实施例的方法而不是比较例的方法(图4)，细胞良好地粘附和生长。此外，为了间接地研究干细胞效能，进行cfu分析以确认一个细胞分裂成多个细胞以形成集落。具体地，通过实施例、比较例1和比较例2的方法，将人骨髓来源间充质干细胞以每孔200个细胞接种到6孔板(corning，usa)中。培养约8天后，用福尔马林固定细胞并用结晶紫溶液(1％)染色。染色后，用三级蒸馏水或磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗涤细胞，并在倒置显微镜(leica，德国)上进行图像分析。结果显示与上述其他测试结果类似的模式，并且表明通过本发明实施例的方法培养的干细胞在1-20％可生物降解的合成生物凝胶中显示细胞分裂(增殖)效能，特别是在5％可生物降解的合成生物凝胶和10％可生物降解的合成生物凝胶(图4)。由此，认为当在直接包被在培养皿上的可生物降解的合成生物凝胶(比较例2)上培养细胞时，细胞粘附是不利的，因此，这种培养不适合作为细胞培养方法，推测其原因在于空气的透性和培养基的供给有问题。

试验例2：人脂肪来源间充质干细胞的三维培养的验证

为了研究人脂肪来源间充质干细胞培养后的细胞培养程度，通过实施例的方法(5％、10％、15％、20％、25％或30％的生物可降解生物凝胶)、比较例1和比较例2的方法培养人脂肪来源的间充质干细胞。在培养细胞后，通过相位恒定显微镜观察细胞。结果，与骨髓来源的间充质干细胞一样，在比较例的方法中细胞粘附不利，并且当通过实施例的方法培养干细胞时，大多数干细胞生长良好(1至30％可生物降解的合成生物凝胶)。另外，为了计数培养的人脂肪源间充质干细胞，通过每种方法培养细胞，用pbs洗涤两次，用胰蛋白酶(invitrogen，usa)处理，并在37℃的co2培养箱中反应7分钟。然后，收集细胞，用培养基洗涤两次，并使用自动细胞计数器(adam；nano&tech，韩国)计数。结果与通过上述显微镜观察的结果相同，特别地，通过实施例的方法培养的干细胞在5-15％的可生物降解的合成生物凝胶中显示出优异的细胞生长(图5)。

试验例3：对人脐带间充质干细胞的三维培养的验证

作为另一种类型的干细胞的人脐带间充质干细胞通过实施例(10％可生物降解的合成生物凝胶)和比较例1的方法培养，然后通过相差显微镜观察。结果表明，当通过使用本发明的聚合物膜和可降解生物的合成生物凝胶的方法培养脐带间充质干细胞时，促进了细胞的生长(图6)。

试验例4：人源原代细胞的三维培养的验证

通过实施例的方法(5％、10％、15％、20％、25％或30％可生物降解的生物凝胶)、比较例1和比较例2的方法培养作为人来源的原代细胞的人皮肤来源的角质形成细胞，然后研究细胞培养度。具体地，通过实施例的方法(5％、10％、15％、20％、25％或30％可生物降解的生物凝胶)、比较例1和比较例2的方法培养来自人皮肤角质形成细胞，通过相差显微镜观察，然后收集细胞并计数。结果，当通过实施例的方法使用在聚合物膜上固化的1-20％可生物降解的合成生物凝胶培养细胞时，皮肤角质形成细胞通常生长。随着生物可降解的合成生物凝胶％的增加，细胞产量增加。在20-30％的可生物降解的合成生物凝胶中，根据可生物降解的合成生物凝胶的含量(％)几乎没有差别。特别地，与在普通培养皿中培养细胞时相比，含有15-30％可生物降解的合成生物凝胶的细胞培养容器中的细胞产量更高(图7)。

试验例5：犬来源的间充质干细胞的三维培养的验证

通过实施例(10％可生物降解的合成生物凝胶)和比较例1的方法培养犬脂肪来源间充质干细胞作为来源于另一物种的间充质干细胞，并使用显微镜观察。结果表明，与二维培养方法相比，细胞被良好地培养(图8)。

从上述结果可以看出，当在细胞培养皿内以非接触方式形成聚合物膜，在其上形成可生物降解的合成生物凝胶，并且细胞在可生物降解的合成生物凝胶上培养时，细胞粘附容易并且利于细胞生长和增殖。因此，使用本发明的细胞培养方法和细胞培养系统具有以下优点：难以粘附、生长和增殖的干细胞和原代细胞可以容易地培养；并且由于水凝胶变为溶胶相，因此可以容易地分离细胞用于传代培养或培养后的分析。