多剂量注射用树突状细胞疫苗的制备及用于阻断HER2和HER3的联合治疗的制作方法

相关申请的交叉引用

本申请要求以下优先权：于2014年7月17日提交的美国临时申请序列号62/025,673的优先权，于2015年5月22日提交的美国临时申请序列号62/165,445的优先权，于2014年7月17日提交的美国临时申请序列号62/025,685的优先权，以及于2014年7月24日提交的美国临时申请序列号62/029,774的优先权，在此将每一项优先权的内容以全文引入的方式并入本文。

背景技术：

树突状细胞(dcs)是从微生物或者甚至癌细胞获得蛋白质抗原并予以显示，或将这些抗原递呈给t细胞的白细胞。因此被所述树突状细胞激活的所述t细胞之后发起系统性免疫应答来挑战威胁。传统的针对微生物的疫苗包含被称为“佐剂”的添加剂，其通过若干可能的方法在接种疫苗的个体内增强树突状细胞活性并扩大疫苗诱导的免疫应答。然而针对癌症的疫苗需求，存在许多特殊的问题。例如，传统的佐剂不会给树突状细胞提供允许其发起针对癌症的最佳免疫的适当信号。并且，肿瘤自身会产生一种影响树突状细胞适当激活的环境。

对于该问题的流行解决方案是从癌症患者中提取树突状细胞，在体外使其加载上肿瘤抗原，然后在将其重新施用于身体之前对此细胞提供独特的激活信号。这样保证了去除了肿瘤环境影响的适当的树突状细胞激活。当返回到身体时，所述树突状细胞可以与t细胞相互作用并发起强有力的抗肿瘤免疫。鉴于使用额外的有形化的树突状细胞已经解决了许多有效性问题，其历史上是以现实局限性为代价的。例如，由于树突状细胞疫苗包含活细胞，在施用治疗的医疗中心的实际位置处需要特殊的细胞加工和疫苗生产的设备。由于每个给予所述治疗的机构必须建设并维持其自身的具有该特殊用途的设施，因此，这是一种昂贵且低效的递送治疗的方式。

乳腺癌的管理目前依赖于早期诊断和积极治疗，其可以包括一种或多种治疗，例如手术，放射治疗，化学疗法和激素疗法。赫塞汀(曲妥单抗)被开发作为her2/erbb2阳性乳腺癌细胞的靶向治疗方法，常常与其他疗法联合应用，其他疗法包括有丝分裂抑制剂紫杉醇(其出售的商品名为taxol)。

赫塞汀作为单一疗法的功效被评估为小于30％；与微管稳定药物，例如紫杉醇，进行组合治疗的功效提高至约60％(burrisetal.,2000,seminoncol27:19-23)。用赫塞汀治疗导致cdk抑制剂p27的积累和随后的g1/s细胞周期停滞，并且紫杉醇停止有丝分裂的进入，其可以导致细胞死亡。尽管具有巨大前景，然而高剂量的赫塞汀或紫杉醇导致不良副作用。进一步，癌症经常对赫塞汀和/或紫杉醇产生抗性。

因此，仍然迫切需要用于生产最大化治疗的树突状细胞疫苗的组分和有效方法，以及迫切需要使用赫塞汀治疗癌症的新方法。相应地，本领域需要额外的免疫治疗途径来治疗或预防乳腺癌和其他恶性肿瘤。本发明满足了这种需求。

附图说明

当结合附图进行阅读时，如下优选实施例的具体描述将得到更好地理解。为了说明本发明，在附图中示出了目前优选的实施例。然而，应该理解，本发明不是受限于附图中示出的实施例的精确排列和手段。

图1是一个图表，其示出了冷冻保存的dc1的生活力和产率。当细胞被直接解冻和计数时，细胞的复苏平均为89％和生活力为95％。

图2是一个图表，其示出了细胞间的生活力(p＝.4807)和复苏(p＝.1220)没有显著差异。

图3是一个图表，其示出了两个种群具有相似的初始(添加lps7小时后)il-12p70的分泌(p＝.0768)。所述种群在30小时的观察期内继续展示出相当的il-12p70的分泌水平，在所述种群之间没有显著差异。

图4是一个图表，其示出了在种群之间和il-1β(p＝0.7690)，il-1α(p＝0.0841)，rantes(p＝0.902)，mdc(p＝0.1514)，il-10(p＝.1937)，mip-1α(p＝.2673)，ip-10(p＝0.7366)，il-6(p＝0.24)，il-5(p＝0.0735)，tnf-β(p＝0.9422)，il-15(p＝0.8878)，mip-1β(p＝0.9217)，tnf-α(p＝0.8972)，il-8(p＝0.7844)的生产中没有显著差异。

图5是一个图表，其示出了从冷冻保存的和非冷冻保存的树突状细胞的ifn-γ的分泌。

图6.th1细胞因子tnf-α和ifn-γ协同诱导乳腺癌细胞的衰老并且需要的剂量与her2的表达呈负相关。图6a.将sk-br-3乳腺癌细胞株与10ng/ml的tnf-α和100u/ml的ifn-α孵育5天，在无细胞因子的条件下培养2代以上，然后用于sa-β-半乳糖苷酶(sa-β-gal)表达(衰老标记)的染色并与未处理的对照细胞进行对比。只有成对的细胞因子诱导了衰老。顶部图，是来自3个独立试验中的1个代表数据。底部图，是光密度分析。数据以sa-β-gal-阳性细胞的百分比呈现和以平均值±s.d.(n＝3)呈现。图6b.在a中描述的细胞的细胞溶解物通过蛋白质印记分析用于p15inkb和p16ink4a的表达。黏着斑蛋白用作加载对照。图6c.t-47d乳腺癌细胞未经处理(1)或与如下浓度的tnf-α和inf-γ孵育5天和在无细胞因子的条件下培养2代以上：10ng/ml和100u/ml(2),50ng/ml和500u/ml(3),75ng/ml和750u/ml(5),100ng/ml和1000u/ml(5)。进而所述细胞用于sa-β-gal染色并与未经处理的对照细胞进行对比，或所述用8um的依托泊苷作为阳性对照(6)。顶部图，是来自3个独立试验的1个代表数据。底部图，是光密度分析。数据以sa-β-gal-阳性细胞的百分比呈现和以平均值±s.d.(n＝3)呈现。图6d.使用th1细胞因子ifn-γ和tnf-α联合治疗，与未处理的对照组相比，sk-br-3(10ng/mltnf-α+100u/mlifn-γ)和t-47d(100ng/mltnf-α+1000u/mlifn-γ)细胞导致更大的衰老，mda-mb-231细胞(200ng/mltnf-α+2000u/mlifn-γ)保持大部分未受双重ifn-γ+tnf-α处理的影响。数据以sa-β-gal-阳性细胞的百分比呈现和以平均值±s.d.(n＝3)呈现。

图7.her2诱导mda-mb-231乳腺癌细胞的衰老与凋亡。图7a.在使用wther2(pcdnaher2)转染或者使用列出的tnf-α和ifn-γ的浓度处理的空载体(pcdna3)转染的mda-mb-231细胞进行sa-β-gal染色5天并在缺乏细胞因子的条件下培养2代以上，左侧图，光密度分析。数据以sa-β-gal-阳性细胞的百分比呈现和以平均值±s.d.(n＝3)呈现。右侧图，是3个独立试验中的1个代表数据。图7b.在a中描述的细胞的细胞溶解物通过蛋白质印记分析用于p15inkb和裂解的半胱天冬酶-3的表达。黏着斑蛋白用作加载对照。插图。使用pcdnaher2或者通过her2特异性抗体进行探测的pcdna3稳定转染mda-mb-231细胞进行蛋白质印迹。黏着斑蛋白用作加载对照。在3个独立的试验中观察到相似的结果。

图8.组合的her2和her3阻断表达增强了在sk-br-3乳腺癌细胞中的th1细胞因子tnf-α和ifn-γ衰老诱导和细胞凋亡。图8a.在使用非靶标(nt)，her2，her3或her2和her3sirna的组合转染的sk-br-3细胞进行sa-β-gal染色5天并在缺乏细胞因子的条件下培养2代以上，左侧图，光密度分析。数据以sa-β-gal-阳性细胞的百分比呈现和以平均值±s.d.(n＝3)呈现。右侧图，是3个独立试验中的1个代表数据。图8b.在a中描述的细胞的细胞溶解物通过蛋白质印记分析用于p15inkb或裂解的caspase-3的表达。插图。使用her2和her3特异性抗体进行探测的nt,her2或her3sirna转染fsk-br-3细胞进行蛋白质印迹。黏着斑蛋白用作加载对照。在3个独立的试验中观察到相似的结果。

图9.组合的her2抑制和her2-her3二聚化抑制增强了在sk-br-3乳腺癌细胞中th1细胞因子tnf-α和ifn-γ衰老诱导和细胞凋亡。图9a.在未处理(1)或使用10ng/ml的tnf-α和100u/ml的ifn-γ(2)，或使用10ug/ml曲妥单抗(tzm)，帕妥珠单抗(per)(3)或使用二者联合处理(4)在sk-br-3细胞进行sa-β-gal染色5天并在缺乏抗体和细胞因子的条件下培养2代以上，左侧图，光密度分析。数据以sa-β-gal-阳性细胞的百分比呈现和以平均值±s.d.(n＝3)呈现。右侧图，是3个独立试验中的1个代表数据。图9b.在a中描述的细胞的细胞溶解物通过蛋白质印记分析用于p15inkb或裂解的半胱天冬酶-3的表达。黏着斑蛋白用作加载对照。在3个独立的试验中观察到相似的结果。图9c.通过染色膜联蛋白v和pi以及通过流式细胞术分析诱导未处理或如上所述处理的sk-br-3细胞的细胞凋亡顶部图，是3个独立试验中的1个代表数据的图。底部图，光密度分析。数据以从三个独立试验的膜联蛋白v⁺pi⁺细胞的平均值±sem(n＝3)呈现。

图10.与曲妥单抗和帕妥珠单抗的联合治疗增强了her2-过表达的人乳腺癌细胞的cd4⁺th1介导的衰老与凋亡。图10a.使用transwell体系，将0.5x10⁵sk-br-3细胞单独与5x10⁵cd4⁺t-细胞(仅仅cd4⁺)，cd4⁺t-细胞+0.5x10⁵每种her2二类肽(dch)-或不相关的二类braf或生存素肽(dcb或dcs)-脉冲一型分化成熟的树突状细胞，和cd4+t-细胞+her2(idch)-脉冲未成熟的树突状细胞,在使用或不使用10ug/ml的曲妥单抗(tzm)和帕妥珠单抗(per)共培养5天。然后所述细胞在缺乏封闭抗体和免疫系统细胞的条件下进行培养2代以上，并染色用于sa-β-gal的表达和与未处理的对照细胞进行对比。顶部图，光密度分析。数据以sa-β-gal-阳性细胞的百分比呈现和以平均值±s.d.(n＝3)呈现。底部图，是3个独立试验中的1个代表数据。图10b.在存在曲妥单抗和帕妥珠单抗，但不是来自dcb,dcs和idch组，分别与dch/cd4⁺t-细胞共培养时，增强的p15ink4b或裂解的半胱天冬酶-3的表达暗示了诱导的sk-br-3细胞的衰老与凋亡。黏着斑蛋白用作加载对照。结果代表3个独立试验。

图11.th1细胞因子tnf-α和inf-γ使曲妥单抗和帕妥珠单抗抗性乳腺癌细胞对衰老与凋亡的诱导变得敏感。图11a.在hcc-1419和jimt-1细胞进行sa-β-gal染色，分别未处理(1)或用50ng/mltnf-α和500u/mlifn-γ(2)处理，或用10ug/ml的曲妥单抗(tzm)处理，帕妥珠单抗(per)(3)，或用相同浓度的曲妥单抗、帕妥珠单抗和tnf-α，ifn-γ(4)的组合进行处理5天并在缺乏抗体和细胞因子的条件下培养两代以上。顶部图，光密度分析。数据以sa-β-gal-阳性细胞的百分比呈现和以平均值±s.d.(n＝3)呈现。底部图，是3个独立试验中的1个代表数据。图11b.在图11a中描述的细胞的细胞溶解物通过蛋白质印迹分析用于p15inkb或裂解的半胱天冬酶-3表达。黏着斑蛋白用作加载对照。在3个独立的试验中观察到相似的结果。

图12.独立于它们的her2水平，在乳腺细胞系中表达出相似的水平的ifngr和tnfr。由蛋白质印迹检测ifngr，tnfr和her2在无限增殖化mcf-10a乳腺上皮细胞和乳腺癌细胞系(sk-br-3，bt-474，mcf-7，t-47d和mda-mb-231)的表达。黏着斑蛋白用作加载对照。在3个独立的试验中观察到相似的结果。

图13.组合的her2和her3阻断表达增强了在mcf-7乳腺癌细胞中th1细胞因子tnf-α和ifn-γ的衰老诱导。图13a.在使用非靶标(nt)，her2，her3或her2和her3sirna的组合转染的mcf-7细胞进行sa-β-gal染色，然后使用列出的tnf-α和ifn-γ的浓度处理5天并在缺乏细胞因子的条件下培养2代以上，左侧图，光密度分析。数据以sa-β-gal-阳性细胞的百分比呈现和以平均值±s.d.(n＝3)呈现。右侧图，是3个独立试验中的1个代表数据。图13b.在a中描述的细胞的细胞溶解物通过蛋白质印记分析用于p15inkb或裂解的半胱天冬酶-3的表达。插图。使用her2和her3特异性抗体进行探测的nt,her2或her3或her2和her3sirna的组合转染mcf-7细胞进行蛋白质印迹。黏着斑蛋白用作加载对照。在3个独立的试验中观察到相似的结果。

图14.th1-细胞因子对sk-br-3衰老与凋亡的影响。图14a.使用transwell体系，将0.5x10⁵sk-br-3细胞单独与5x10⁵cd4⁺t-细胞(仅仅cd4⁺)，cd4⁺t-细胞+0.5x10⁵每种her2二类肽(dch)-或不相关的二类braf肽(dcb)-脉冲一型分化成熟的树突状细胞，和cd4⁺t-细胞+her2(idch)-或braf(idcb)脉冲未成熟的树突状细胞5天。然后所述细胞在缺乏免疫系统细胞的条件下进行培养2代以上，并染色用于sa-β-gal的表达和与未处理的对照细胞进行对比。与igg同型对照进行对比，在使用cd4⁺/dch处理的sk-br-3中诱导的衰老在使用特异性抗体中和ifn-γ和tnf-α得以部分拯救(75.27％拯救)，顶部图，光密度分析。数据以sa-β-gal-阳性细胞的百分比呈现和以平均值±s.d.(n＝3)呈现。底部图，是3个独立试验中的1个代表数据。图14b.在与dcb，idch和idcb组进行对比，当与dch/cd4⁺t-细胞进行共培养时，增强的p15ink4b或裂解的半胱天冬酶-3的表达暗示了诱导的sk-br-3细胞的衰老与凋亡。与igg同型对照进行对比，通过中和ifn-γ和tnf-α抗体使得使用cd4⁺/dch处理的sk-br-3中诱导的衰老与凋亡得以部分拯救(75.27％拯救)。黏着斑蛋白用作加载对照。结果代表3个独立试验。

图15.通过乳腺癌细胞系中的调蛋白，曲妥单抗和帕妥珠单抗对akt激活的影响。图16a.使用曲妥单抗(tzm)和帕妥珠单抗(每10ug/ml,90分钟)处理血清饥饿t-47d，hcc-1419和jimt-1细胞，然后使用hrg进行刺激(20ug/ml,5分钟)。顶部图，是3个独立试验中的1个代表数据。底部图，光密度分析。数据以sa-β-gal-阳性细胞的百分比呈现和以平均值±s.d.(n＝3)呈现。

详细说明

本发明提供了用于生产个性化治疗和预防癌症或其他失调症的、fda批准的可注射的多剂量抗原脉冲树突状细胞疫苗的组合物和方法。在一个实施例中，本发明提供了用于生产fda-批准的可注射的多剂量抗原脉冲i型极化树突状细胞疫苗(dc1)。

在一个实施例中，本发明提供了以多剂量等份的形式冷冻保存树突状细胞的方法，所述树突状细胞是处于加载有抗原的、“准备好注射的”的预活化状态，即，适合立即注射到患者体内而并不需要要求(即，通过fda规定)额外设施和质量控制/保证步骤的任何进一步的细胞处理。

在一个实施例中，本发明提供了有效生产可注射的多剂量抗原脉冲树突状细胞疫苗的方法，优选地，提供了展示出最大功效的可注射的多剂量抗原脉冲i型极化树突状细胞疫苗。

在一个实施例中，通过在单独的患者白细胞除去法中收集树突状细胞来生产fda-批准的可注射的多剂量抗原脉冲树突状细胞疫苗。优选的，白细胞除去法和树突状细胞疫苗的生产在第一位置进行，其中第一位置可以是集中的疫苗生产设施，在此生产设施中操作树突状细胞以生产包含其初始免疫剂量和多个“加强”剂量的活化的抗原加载的树突状细胞疫苗。本申请的优势在于所有的fda规定的质量控制/质量保证步骤将在中心设施进行，在完成和释放后，所有的疫苗剂量被冷冻保存和运输到远距医疗中心用于对患者的连续施用。在一个实施例中，在施用位置，本发明所述的fda-批准的可注射的多剂量抗原脉冲树突状细胞疫苗不需要任何任何规定的质量控制/质量保证步骤。

在另一方面，本发明基于发现了一种治疗癌症的有效疗法，其包括改变肿瘤中的免疫应答从而使得肿瘤位点的免疫细胞更有效的攻击肿瘤细胞。在一些实例中，有效的治疗包括提高肿瘤位点中免疫细胞的迁移和活性。相应地，本发明提供了树突状细胞疫苗与抑制一种或多种her-2和her-3的组合物(例如，曲妥单抗，帕妥珠单抗等)联合使用的方法和组合物，作为治疗癌症的治疗方案。在一个实施例中，所述治疗方案包括使用树突状细胞疫苗，her-2抑制剂，和趋化因子调节剂。

在一个实施例中，本发明提供了树突状细胞疫苗与一种或多种her-2和her-3阻断进行联合使用的方法和组合物，作为治疗癌症的治疗方案。在另一个实施例中，本发明提供了树突状细胞疫苗与her-2和her-3的阻断以及tnf-α和inf-γ的添加进行联合使用的方法和组合物。在另一个实施例中，本发明提供了tnf-α和ifn-γ的添加和一种或多种her-2和her-3的阻断的方法和化合物，作为治疗癌症的治疗方案。

在一个实施例中，本发明的治疗方案包含诱导抗-癌驱动th1免疫应答(例如，tnf-α和ifn-γ)和针对一种或多种her-2和her-3的癌驱动阻断的联合治疗。

在一个实施例中，本发明的治疗方案可以被用于治疗癌症并且从而可以被认为是一种抗癌治疗。在另一个实施例中，本发明的治疗方案可以与另一种抗癌治疗联合使用，所述另一种抗癌治疗包括但不限于的手术，化学疗法，放射治疗(例如，x射线)，基因治疗，免疫疗法，激素治疗，病毒治疗，dna治疗，rna治疗，蛋白质治疗，细胞治疗，纳米治疗等。

在一个实施例中，本发明的治疗方案用于接受其他抗癌治疗之前。在另一个实施例中，本发明的治疗方案与接受其他抗癌治疗同时使用。在另一个实施例中，本发明的治疗方案用在接受其他抗癌治疗之后。

定义

除非定义，否则这里所使用的所有技术术语和科学术语具有与本领域的普通技术人员对本发明所属的一般理解的意思相同的意思。虽然类似或等同于本文所述的任何方法和材料可用于本发明的实践或测试，但是现描述优选的方法和材料。

通常，在此使用的术语和在细胞培养，分子遗传学，有机化学，和核酸化学以及杂交中的实验室步骤是本领域公知和常规使用的。

标准技术用于核苷酸和肽的合成。所述技术和步骤一般地按照本领域常规方法和各种普遍参考文件进行(例如，sambrookandrussell,2012,molecularcloning,alaboratoryapproach,coldspringharborpress,coldspringharbor,ny,andausubeletal.,2012,currentprotocolsinmolecularbiology,johnwiley&sons,ny)，其通过这篇文献提供。

在此使用的术语和在分析化学中使用的实验室步骤以及在如下描述的有机合成是那些本领域公知和常规使用的。其标准技术或变型用于化学合成和化学分析。

如这里使用的，每个如下术语的含义与其在此部分的含义相关。

在此使用的冠词“一种”指的是冠词语法上一个或多于一个(也就是至少一个)的客体。例如，“一种元素”指的是一个元素或多于一个元素。

i.在此使用的“约”，当指的是例如数量，持续时间等可测值时，意思是包括离给定的值±20％或±10％，或±5％，或±1％，或±0.1％的变化范围，这样的变化对于实施所公开的方法是适当的。

ii.当术语“不正常的”用在生物体，组织，细胞或其成份的语境中时，指的是那些生物体，组织，细胞或其成份与显示“正常的”(预期的)各自特征的那些生物体，组织，细胞或其成份在至少一种可观察到的或可检测到的特征中(例如，年龄，治疗，时间等)存在不同之处。对于一种细胞或组织类型是正常或预期的特征，对于不同的细胞或组织类型可能是不正常的。

在此使用的术语“抗原”或“ag”被定义为引起免疫应答的分子。该免疫应答可能涉及抗体生产或者特异免疫活性细胞的激活，或者两者都包括。本领域技术人员将理解，实质上包括所有蛋白质或肽的任何大分子，可以作为抗原。进一步，抗原可以从重组的或基因组dna获得。本领域技术人员将会理解，任何dna，包括编码引发免疫应答的蛋白质的部分核苷酸序列或核苷酸序列，编码在这里使用的术语“抗原”。进一步，本领域技术人员将理解抗原不需要仅依靠基因全长核苷酸序列进行编码。很显然地，本实施例包括，并不限于，使用多于一个基因的部分核苷酸序列，并将这些核苷酸序列进行不同的组合以引发期望的免疫应答。而且，本领域技术人员将理解，抗原完全不需要“基因”的编码。很显然地，抗原可以合成产生或者从生物样本获得。这样的生物样本可以包括但不限于组织样本，肿瘤样本，细胞或生物体液。

“抗原递呈细胞”(apc)是一种能够激活t细胞的细胞，其包括，但不限于单核细胞/巨噬细胞，b细胞和树突状细胞(“dcs”)。

“抗原-加载apc”或者“抗原-脉冲apc”包括已经向抗原暴露和被抗原激活的apc。例如，在有抗原存在的培养期间，apc可以在体外加载抗原。通过向抗原暴露，apc也可以在体内被加载。“抗原加载apc”传统上通过两种方法中的一种制备：(1)小肽片段，公知作为抗原肽，被直接脉冲到抗原递呈细胞的外部；或(2)将apc与整蛋白质或蛋白质颗粒孵化，随后这些蛋白质或蛋白质颗粒被apc消化。这些蛋白质被apc消化成小的肽段并最终运输到和递呈到apc表面。另外，也可以通过将编码抗原的多聚核苷酸引入细胞来产生抗原-加载apc。

在此使用的术语“自身免疫疾病”定义为由自身免疫应答造成的失调。自身免疫疾病是对自身抗原不适当的和过度的应答的结果。自身免疫疾病的例子其中包括但不限于，艾迪森疾病，斑秃，强直性脊柱炎，自身免疫肝炎，自身免疫腮腺炎，克罗恩氏病，糖尿病(i型)，表皮松解症，附睾炎，血管球性肾炎，格雷福斯氏病，吉兰-巴雷综合症，桥本氏病，溶血性贫血，全身性红斑狼疮，多发性硬化症，重症肌无力，寻常性天胞疮，牛皮癣，风湿热，类风湿性关节炎，肉状瘤病，硬皮病，干燥综合征，脊椎关节病，甲状腺炎，血管炎，白癜风，粘液腺瘤，恶性贫血，溃肠性结肠炎。

在此使用的“自体的”指的是从与之后被引入的个体相同的个体中所获取的任何物质。

这里使用的术语“b细胞”被定义为从骨髓和/或脾脏获得的细胞。b细胞可以发展成为生产抗体的浆细胞。

这里使用的术语“癌症”被定义为细胞的过度增殖，其具有独特的特点-正常控制的损失、导致没有节制的增长、缺乏分化、局部组织浸润、和/或转移。例子包括但不限于，乳腺癌，前列腺癌，卵巢癌，宫颈癌，皮肤癌，胰腺癌，大肠癌，肾癌，和肺癌。

在此使用的术语“冷冻保存的”或“低温贮藏”指的是已经在冷冻剂中重悬并在约-70℃或更低的温度下结冰的细胞。

在此使用的术语“冷冻剂”指的是为冷冻做准备的与细胞样品混合的任何介质，这样使得至少在细胞样品中的一些细胞在解冻后可以复苏和保持活性。

术语“树突状细胞”(dc)是存在于体内，体外，离体或者在宿主或受试者内，或者可以从造血干细胞或单核细胞获得的抗原递呈细胞。树突状细胞和他们的前体可以从多种淋巴器官中分离，例如，脾脏，淋巴结，以及来自骨髓和外周血。树突状细胞具有一种形态学特点，其有向多个方向扩展远离树突状细胞体的薄片(片状伪足)。典型地，树突状细胞表达高水平mhc和共刺激分子(例如，b7-1和b7-2)。树突状细胞可以在体外诱导t细胞的抗原特异性分化，并且可以发起体内和体外的最初的t细胞应答。

在此使用的“活化的树突状细胞”是已经暴露给toll样受体激动剂的树突状细胞。活化的dc可能加载有或可能没加载有抗原。

在此使用的术语“成熟dc”定义为表达包括高水平ii类mhc，cd80(b7.1)和cd86(b7.2)分子的树突状细胞。相反地，未成熟的树突状细胞表达低水平的ii类mhc，cd80(b7.1)和cd86(b7.2)分子，然而依旧能摄取抗原。“成熟dc”也指存在于体内，体外，离体，或在宿主或者是受试者内的dc1极化的抗原递呈细胞(即，其完全能够促进细胞-介导的免疫)。

疾病是动物的一种健康状态，其中动物不能维持体内平衡，以及如果所述疾病没有得以改善，此动物的健康持续恶化。

动物的“失调”是一种健康状态，其中动物能够维持体内平衡，但是所述动物的健康状态不如没有失调时的健康状态良好。如果不经处理，失调未必引起动物健康状态的进一步降低。

如果患者经历的疾病或失调的至少一种迹象或症状的严重性或频率是缩减的，则疾病或失调是“减轻”的。

“治疗有效量”或者“有效量”在这里可交换使用，指的是这里描述的化合物，制剂，物质或组合物的数量，能够有效实现特殊的生物效果。所述效果可以包括但不限于通过本领域任何适当的方法确定的病毒感染的抑制。

在此使用的“内源的”指的是来自或在生物体，细胞，组织或系统内产生的任何物质。

在此使用的术语“外源性的”指的是从生物体，细胞，组织或系统外部引入的或在其外部产生的任何物质。

“雌激素受体(“er”)阳性”癌症是雌激素受体表达检测为阳性的癌症。相反地，“er阴性”癌症是对于此表达检测为阴性的癌症。er状态的分析可以通过本领域已知的任何方法实施。

“her受体”是受体蛋白质酪氨酸激酶，其属于her受体家族，并包括egfr(erbb1,her1)，her2(erbb2)，her3(erbb3)和her4(erbb4)受体。所述的her受体通常包含可以结合her配体和/或与另一个her受体分子二聚化的胞外结构域，亲脂性的跨膜结构域；保守的胞内酪氨酸激酶结构域；和存有几个可以被磷酸化的酪氨酸残基的羧基-末端信号结构域。所述的her受体可以是“原始序列”her受体或其“氨基酸序列变体”。优选的，所述的her受体是原始序列人类her受体。

所述的“her通路”指的是通过her受体家族介导的信号网络。

“her激活”指的是任一种或多种her受体的激活或磷酸化。通常，her激活导致信号传导(例如，由her受体或底物多肽内的her受体磷酸化酪氨酸残基的细胞内激酶结构域所导致的)。her激活可以由与包含感兴趣的her受体的her二聚体相结合的her配体所介导。与her二聚体结合的her配体可以激活二聚体中的一种或多种her受体的激酶结构域，从而导致一种或多种her受体中酪氨酸残基的磷酸化和/或在附加的基质多肽中的酪氨酸残基的磷酸化作用，例如akt或mapk细胞内激酶。

术语“过度增殖疾病”定义为由细胞的过度增殖导致的疾病。典型的过度增殖疾病包括，但不限于，癌症或自身免疫性疾病。其他的过度增殖疾病可以包括血管闭塞，再狭窄，动脉粥样硬化或炎症性肠病等。

在此时用的术语“抑制”意思是抑制或阻断活性或功能，例如，相对于对照值约为10％。优选的，与对照值相比，所述活性被抑制或阻断50％，更优选的，75％，并且甚至更优选的95％。在此使用的“抑制”也表示以可测量值减少或完全阻止分子，反应，相互作用，基因，mrna，和/或蛋白质的表达，稳定性，功能或活性。抑制剂是与之结合会，例如，部分或完全阻断刺激，减少，预防，延迟激活，使失去活性，使不敏感或下调蛋白质，基因和mrna稳定性，表达，功能和活性的化合物，例如，拮抗剂。

在此使用的“教材”包括出版物，记录，图表或任何其他的可以用于传达本发明的组合物和方法的有用性的表达介质。本发明的试剂盒的教材可以，例如，贴到包含有本发明的核酸，肽，和/或组合物的容器上，或者与包含有核酸，肽，和/或组合物的容器一起运送。可选的，所述教材可以与所述容器分开运送，其目的是接收者可以协同使用所述教材和所述化合物。

“分离的”意思是从自然状态中被改变或被移除。例如，自然存在于活的动物内的核酸或肽不是“分离的”，然而被部分或者全部从其自然状态的共存物质中分离的同样的核酸或者肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以以基本上纯化的形式存在，或者可以在非天然环境存在，例如，宿主细胞。

在此使用的术语“调节”，意思为与未接受治疗或未使用化合物的受试者的应答水平相比，和/或与其他完全相同但未接受治疗的受试者的应答水平相比，调节受试者的应答水平可检测的增加或下降。所述术语包含扰乱和/或影响原始信号或应答从而在受试者内调节有益的治疗反应，优选的，人类。

在此使用的“种群”包括提及包括同质，基本上同质或异质细胞培养物的分离培养物。通常，“种群”也可以被认为是“分离的”细胞培养物。

在此使用的“重组细胞”是包含重组多核苷酸的宿主细胞。

在此使用的“样本”或“生物样本”意思是来自受试者的生物材料，包括但不限于器官，组织，外来体，血液，血浆，唾液，尿液和其他体液。样本可以是获取自受试者的任何来源的材料。

在此使用的“信号1”通常指的是从激活的树突状细胞传递到t细胞的第一生物化学信号。信号1是由树突状细胞表面表达的抗原提供的，其通过t细胞受体使得t细胞得以感知。

在此使用的“信号2”通常指的是由树突状细胞提供给t细胞的第二信号。信号2是由激活的树突状细胞上的“共刺激”分子提供的，通常为cd80和/或cd86(尽管也有其他已知的共刺激分子)，信号2通过表面受体cd28使得t细胞得以感知。

在此使用的“信号3”通常指的是由激活的树突状细胞生产的可溶性蛋白质(通常指细胞因子)产生的信号。这些是通过t淋巴细胞上的受体感知到的。信号3指导t细胞其需要哪些表型或功能特征从而最好的处理当前的威胁。

在此使用的术语“特异地结合”意思是分子，例如抗体，其识别并结合到另一个分子或特征，但在样本中其没有实质识别或结合其他分子或特征。

术语“受试者”，“患者”，“个体”等在这里可交换使用，指的是适用于在这里描述的方法的任何动物，或其无论在体外或在原位的细胞。在某种非限制实施例中，患者，受试者或者个体是人类。

在此使用的术语“t细胞”被定义为参与许多细胞介导的免疫反应的胸腺衍生细胞。

在此使用的术语“t-辅助细胞”是关于能被本领域技术人员识别的包括不同细胞类型的淋巴细胞(一种白血细胞或白血球)亚组。特别地，根据本发明所公开的t-辅助细胞包括效应器th细胞(例如th1，th2和th17)。这些th细胞分泌出刺激其他白细胞或与其他白细胞相互作用的细胞因子，蛋白质或肽类。

在此使用的“th1t细胞”指的是生产高水平的细胞因子ifn-γ并被认为高效地对抗在宿主细胞内生存的引起疾病的微生物以及癌症的t细胞。

在此使用的“th17t细胞”指的是生产高水平的细胞因子il-17和il-22并被认为高效地对抗生存在粘膜表面的引起疾病的细菌的t细胞。

这里使用的“治疗有效量”指的是当给患者施用时，改善所述疾病的症状的本发明化合物的数量。构成“治疗有效量”的本发明化合物的数量会根据化合物，疾病状态及其严重性，被治疗患者的年龄等而变化。治疗有效量通过本领域技术人员参考他/她自己的知识以及此公开可以常规确定。

这里使用的术语“治疗”指的是这里描述的治疗性的或预防性的措施。“治疗”方法采用对需要本发明中的治疗、组合物的受试者采取措施的方式，例如，受疾病或失调折磨的受试者，或最终可能获得此疾病或失调的受试者，为了预防、治疗、延期、降低严重性或改善失调或复发失调的一种或多种症状，或者延长受试者的存活使其超出不施用此治疗时的预期存活。

在此使用的术语“toll样受体”或“tlr”被定义为在先天免疫系统中起作用的蛋白质种类。tlrs是识别来源于微生物的结构保守分子的单一跨膜，非催化受体。一旦结合配体，tlrs激活免疫细胞应答。

在此使用的术语“toll样受体激动剂”或“tlr激动剂”被定义为激活免疫细胞应答的结合到tlr的配体。

在此使用的术语“疫苗”被定义为用来向动物，优选哺乳动物，更优选人类施用材料后引起免疫应答的物质。一旦引入受试者体内，疫苗可以引起免疫应答，该免疫应答包括但不限于，抗体，细胞因子的生产和/或其他细胞应答。

范围：贯穿本公开，本发明的不同方面可以通过范围形式来表示。应该理解的是范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，并不应该被解释为对本发明范围的刻板的限定。因此，范围的描述应该被认为已经明确公开所有可能的子范围以及在所述范围内的所有可能个体数值。例如，从1到6的范围的描述应该被认为已经具体公开了例如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等的子范围，以及在所述范围内的个体数值，例如1，2，2.7，3，4，5，5.3和6。无论所述范围的宽度如何，此解释都适用。

描述

本发明包括树突状细胞的制备。在一个实施例中，所述的树突状细胞制剂纯度高于90％。在另一个实施例中，所述树突状细胞制剂是被完全激活的。例如，使用细胞因子和/或toll样受体配体将所述的树突状细胞激活，通过本发明的低温贮藏技术使激活状态完全保持。本发明树突状细胞制剂的好处在于所述细胞在从单个的白细胞除去法(患者采集物)到最初的疫苗加多个“加强”剂量(例如，10或更多)的过程中被有效的冷冻保存，其可以在远端的治疗地点按需解冻并不需要任何专业的细胞处理设施或进一步必需的质量控制检测。

如本文所考虑的，本发明提供了一种用于产生和冷冻保存树突状细胞的方法，所述树突状细胞在对t细胞产生更强的信号方面具有优异功能并因此产生更有效的基于树突状细胞的疫苗。通过有效地冷冻保存所述细胞，样品可以储藏和解冻供之后使用，从而在疫苗生产期间减少重复的提取法和淘洗过程的需求。可以冻结树突状细胞然后在后期将其解冻是有优势的，因为其意味着疫苗生产的单个循环可以分成小部分，冻结，然后对患者在周疗程，月疗程或年疗程的过程中每次施用一个，从而提供加强免疫力的“加强的”疫苗接种。

在一个实施例中，本发明包括一种fda-批准的可注射的多剂量抗原脉冲树突状细胞疫苗，其通过在单一患者白细胞除去法中收集树突状细胞来生产。所述的fda-批准的可注射的多剂量抗原脉冲树突状细胞疫苗包括最初的免疫剂量和多个“加强”剂量。所述fda-批准的可注射的多剂量抗原脉冲树突状细胞疫苗是冷冻保存的并且可以被运到远程医疗中心为患者连续施用，在施用地点没有特殊要求。(例如，fda规定的qc/qa步骤)。

本发明还涉及这些激活的树突状细胞的低温贮藏，该低温贮藏的方式保留了其呈递抗原以及其在解冻后产生各种细胞因子和趋化因子的效力和功能，使得冷冻保存的和随后解冻的活化的树突状细胞像新鲜收获和激活的树突状细胞一样临床有效。

本发明还涉及通过阻断her-2和her-3中的一种或多种与活化抗her-2cd4th1细胞的联合使用来诱导细胞中的肿瘤衰老和细胞凋亡。相应地，为了促进her-2表达的乳腺癌中的肿瘤衰老，本发明包括促进抗-癌驱动th1免疫应答和针对her-2的癌驱动阻断的组合和方法。在一个实施例中，促进抗-癌驱动th1免疫应答包括tnf-α和ifn-γ。在一个实施例中，针对her-2的癌驱动阻断包括阻断her-2的任何组合物，该组合物包括但不限于曲妥单抗和帕妥珠单抗。

在一个实施例中，本发明包括一种或多种her-2和her-3的阻断与诱导her-2表达乳腺癌的衰老的tnf-α和ifn-γ一起联合的方法和组合物，tnf-α和ifn-γ从cd4th1细胞分泌。

在一个实施方案中，在乳腺癌细胞中tnf-α和ifn-γ诱导衰老和凋亡的机制需要her2。

在一个实施例中，tnf-α和ifn-γ恢复乳腺癌抗性细胞对曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的敏感性。在一个实施例中，th1细胞因子，ifn-γ和tnf-α，逆转对广泛影响癌症患者的治疗剂的抗性。

基于树突状细胞的免疫治疗

树突状细胞源自于作为抗原递呈细胞(apc)的多能性单核细胞。树突状细胞在外周组织中是普遍存在的，在外周组织中它们被制备以捕获抗原。抗原捕获一旦发生，树突状细胞将抗原加工成小肽并移向次级淋巴器官。在淋巴器官内，树突状细胞向初始t细胞呈递抗原肽，从而引发极化t细胞分化的信号级联。一旦暴露，树突状细胞递呈与mhci类或ii类结合肽结合的抗原分子，并分别激活cd8⁺或cd4⁺t细胞(steinman,1991,annu.rev.immunol.9:271–296；banchereauetal.,1998,nature392,245–252；steinman,etal.,2007,nature449:419–426；ginhouxetal.,2007,j.exp.med.204:3133–3146；banerjeeetal.,2006,blood108:2655–2661；sallustoetal.,1999,j.exp.med.189:611–614；reidetal.,2000,curr.opin.immunol.12:114–121；bykovskaiaetal.,1999,j.leukoc.biol.66:659–666；clarketal.,2000,microbesinfect.2:257–272)。

树突状细胞负责适应性免疫应答的诱导，协调和调节，并且还用于协调免疫系统的先天方式效应器和适应性方式效应器之间的沟通。这些特征使得树突状细胞成为免疫治疗的强有力的候选者。树突状细胞具有通过巨胞饮和受体介导的胞吞作用对环境进行取样的独特能力(gerneretal.,2008,j.immunol.181:155–164；stoitzneretal.,2008,cancerimmunol.immunother57:1665–1673；lanzevecchiaa.,1996,curr.opin.immunol.8:348–354；delamarreetal.,2005,science,307(5715):1630–1634)。

树突状细胞还需要成熟信号以增强其抗原递呈能力。树突状细胞通过提供额外的成熟信号例如tnf-α，cd40l或钙信号传导剂来上调表面分子的表达，例如cd80和cd86(也称为第二信号分子)(czernieckietal.,1997,.j.immunol.159:3823–3837；bedrosianetal.2000,j.immunother.23:311–320；mailliardetal.,2004,cancerres.64,5934–5937；brossartetal.,1998,blood92:4238–4247；jinetal.,2004,hum.immunol.65:93–103)。已经确定包括tnf-α，il-1β，il-6和前列腺素e2(pge2)的细胞因子的混合物具有使树突状细胞成熟的能力(jonuleit,etal.,2000,arch.derm.res.292:325–332)。在用抗原脉冲之前，树突状细胞还可以用钙离子载体使之成熟。

除了病原体识别受体，例如pkr和mda-5(kalalietal.,2008,j.immunol.181:2694–2704；nallagatlaetal.,2008,rnabiol.5(3):140–144)，树突状细胞还含有一系列受体，称为toll样受体(tlr)，其也能够感测来自病原体的危险。当这些tlr被触发时，在树突状细胞中诱导一系列激活变化，其导致t细胞的成熟和信号传导(boullartetal.2008,cancerimmunol.immunother.57(11):1589–1597；kaishoetal.,2003,curr.mol.med.3(4):373–385；pulendranetal.,2001,science293(5528):253–256；napolitanietal.,2005,nat.immunol.6(8):769–776)。树突状细胞可以激活和延长细胞介导的应答的各种方式，例如天然杀伤γ-δt和α-βt细胞，并且一旦激活，树突状细胞保持其免疫能力(steinman,1991,annu.rev.immunol.9:271–296；banchereauetal.,1998,nature392:245–252；reidetal.,2000,curr.opin.immunol.12:114–121；bykovskaiaetal.,1999,j.leukoc.biol.66:659–666；clarketal.,2000,microbesinfect.2:257–272)。

本发明包括由toll样受体激动剂激活的成熟的，抗原加载的树突状细胞，其诱导临床有效的免疫应答，优选在疾病过程中较早时使用。本发明的树突状细胞产生所需水平的细胞因子和趋化因子，并且还进一步具有诱导肿瘤细胞凋亡的能力。

在一个实施例中，本发明提供了大规模生产抗原脉冲树突状细胞疫苗的方法。在一个实施例中，所述方法包括快速使树突状细胞成熟，冷冻保存树状细胞和解冻冷冻保存的细胞，其中解冻的树突状细胞产生有效量的至少一种细胞因子以产生t细胞应答。

在一个实施例中，树突状细胞的成熟包括使细胞与ifn-γ和lps接触。

在一个实施例中，解冻的细胞维持dc1表型以驱动th1极化的免疫应答。

在一个实施例中，解冻的细胞保持了主要敏化t细胞的能力。

加载(脉冲)免疫细胞的生产

本发明包括已经向抗原暴露的细胞或另外用抗原“脉冲”的细胞。例如，apc，如：树突状细胞，可以在体外加载抗原，例如在抗原存在下通过离体培养，或通过在体内暴露于抗原的培养。

本领域技术人员还将容易地理解，apc可以通过将apc暴露于抗原的方式被“脉冲化”，暴露的时间要足以促进该抗原在apc表面上呈递。例如，apc可以暴露于被称为抗原肽的小肽片段形式的抗原，其直接“脉冲”到apc的外部(mehta-damanietal.,1994)；或apc可以与完全蛋白质或蛋白质颗粒一起孵育，完全蛋白质或蛋白质颗粒然后被apc摄取。这些完全蛋白被apc消化成小的肽片段，最终携带至并呈递在apc表面上(cohenetal.,1994)。肽形式的抗原可通过本文所述的标准“脉冲”技术被暴露于细胞。

不希望受任何特定理论的束缚，外源或自身抗原形式的抗原由本发明的apc加工以保留抗原的免疫原性形式。抗原的免疫原性形式意味着通过片段化处理抗原以产生可被免疫细胞(例如t细胞)识别并刺激免疫细胞的抗原形式。优选地，这种外源或自身抗原是通过apc加工成肽的蛋白质。由apc产生的相关肽可以被提取和纯化以用作免疫原性组合物。由apc处理的肽也可用于诱导对由apc处理的蛋白质的耐受性。

加载抗原apc，或者称为本发明的“脉冲apc”，是通过在体外或体内将apc暴露于抗原产生的，。在apc在体外被脉冲的情况下，可以将apc铺在培养皿上并以足够的量和足够的时间暴露于抗原，以允许抗原结合至apc。实现抗原与apc结合所需的量和时间可以通过使用本领域已知的或本文另外公开的方法来确定。本领域技术人员已知的其它方法，例如免疫分析或结合测定，可用于在apc暴露于抗原后检测apc上抗原的存在。

在本发明的另一个实施例中，apc可以用允许apc表达特异性蛋白质的载体转染。然后可以将由apc表达的蛋白质加工并递呈到细胞表面上。然后可以将转染的apc用作免疫原性组合物，以产生对载体编码的蛋白质的免疫应答。

如本文其他地方所讨论的，可以制备载体使其包括特定多核苷酸，该特定多核苷酸编码和表达需要免疫原性应答的蛋白质。优选地，使用逆转录病毒载体感染细胞。更优选地，使用腺病毒载体感染细胞。

在另一个实施例中，通过修饰编码被apc上的受体识别的蛋白质或其部分的病毒载体从而使得载体能够以apc为靶向，由此载体占据apc受体将启动载体的内吞作用，从而允许由病毒载体的核酸编码的抗原的加工和递呈。由病毒递送的核酸对病毒而言可以是本来就有的，当在apc上表达时，核酸编码病毒蛋白，然后病毒蛋白被加工并被呈递至apc的mhc受体上。

如本文所考虑的，多种方法可用于将多核苷酸转染至宿主细胞中。所述方法包括但不限于磷酸钙沉淀，脂质转染，粒子轰击，显微注射，电穿孔，胶体分散系统(即大分子复合物，纳米胶囊，微球，珠和基于脂质的系统，包括水包油乳剂，胶束，混合胶束和脂质体)。这些方法在本领域中是已知的，并且在公开的文献中描述，以使得本领域技术人员能够执行这些方法。

在另一个实施例中，编码抗原的多核苷酸可以克隆到表达载体中，并且可以将载体引入apc中，另外产生加载的apc。将载体的各种类型和将核酸引入细胞的各种方法在可获得的公开文献中有所讨论。例如，表达载体可以通过物理，化学或生物手段转移到宿主细胞中。参见，例如，sambrook等人。(2001,molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratory,newyork)和ausubel等人(1997,currentprotocolsinmolecularbiology,johnwiley&sons,newyork)。容易理解，引入包含编码抗原的多核苷酸的表达载体产生脉冲细胞。

本发明包括用于脉冲apc的各种方法，包括但不限于用蛋白质，cdna或mrna形式的完整抗原加载apc。然而，本发明不应被解释为限制用于脉冲apc的抗原的特定形式。相反，本发明包括本领域已知的用于产生抗原加载apc的其它方法。优选地，用编码限定的抗原的mrna转染apc。对应的基因产物序列已知的mrna使用合适的引物和与转录反应偶联的逆转录酶-聚合酶链反应(rt-pcr)在体外可以快速产生。用mrna转染apc提供了优于其它产生脉冲apc的抗原加载技术的优点。例如，从微量组织，即微量肿瘤组织扩增rna的能力将apc在疫苗接种中的应用扩展给大量患者。

对于可用作疫苗的抗原组合物，抗原组合物必须在细胞，组织或哺乳动物(例如人)中诱导针对抗原的免疫应答。如本文所用，“免疫组合物”可包含抗原(例如肽或多肽)，编码抗原(例如抗原表达载体)的核酸或表达或递呈抗原的细胞或细胞组分。在具体实施例中，抗原组合物包含或编码本文所述的全部抗原或部分抗原，或其免疫功能等价物。在其它实施方案中，抗原组合物处于包含额外的免疫刺激剂或编码此类试剂的核酸的混合物中。免疫刺激剂包括但不限于额外的抗原，免疫调节剂，抗原呈递细胞或佐剂。在其它实施例中，一种或多种另外的试剂以任何组合与抗原或免疫刺激剂共价键合。在某些实施例中，抗原组合物结合至或包含hla锚定模序氨基酸。

如本文所考虑的，疫苗可以在其核酸和/或细胞组分的组成方面不同。在非限制性实例中，编码抗原的核酸也可以与佐剂一起配制。当然，应当理解，本文所述的各种组合物可以进一步包含另外的组分。例如，一种或多种疫苗组分可以包含在脂质或脂质体中。在另一个非限制性实例中，疫苗可包含一种或多种佐剂。根据本公开，本发明的疫苗及其各种组分可以通过本文公开的或本领域普通技术人员已知的任何方法制备和/或施用。

应当理解，本发明的抗原组合物可以通过本领域公知的方法制备，包括但不限于通过固相合成的化学合成和通过hplc从化学反应的其它产物中纯化，或通过在体外翻译系统或活细胞中表达核酸序列(例如，dna序列)产生，该核酸序列编码包含本发明抗原的肽或多肽。另外，抗原组合物可以包含从生物样本中分离的细胞组分。将抗原组合物分离并广泛透析以除去一种或多种不希望的小分子量分子，和/或将抗原组合物在所需赋形剂中冻干形成更好的制剂。还应当理解，在疫苗组分中制备的额外的氨基酸，突变，化学修饰等，如果有的话，优选基本上不干扰抗原决定基序列的抗体识别的。

对应于本发明的一个或多个抗原决定簇的肽或多肽通常长度至少为5个或6个氨基酸残基，并且可以含有高达约10，约15，约20，约25，约30，约35，约40，约45或约50个残基左右。肽序列可以通过本领域普通技术人员已知的方法合成，例如使用自动肽合成仪的肽合成，例如可从加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司获得自动肽合成仪(fostercity，ca)。

较长的肽或多肽也可以通过例如重组的方法制备。在某些实施例中，为了实现本发明的各种组合物和方法，编码本文所述的抗原组合物和/或组分的核酸可用于例如在体外或体内产生抗原组合物。例如，在某些实施例中，编码抗原的核酸包含在例如重组细胞中的载体中。可以表达核酸以产生包含抗原序列的肽或多肽。肽或多肽可以从细胞分泌，或作为细胞的一部分或在细胞内包含。

在某些实施例中，通过用编码抗原的核酸转染或接种哺乳动物可以促进免疫应答。在向哺乳动物施用核酸后，包含在靶向哺乳动物中的一种或多种细胞随后表达了由核酸编码的序列。疫苗还可以是以例如编码抗原的全部或部分的肽或多肽序列的核酸(例如，cdna或rna)的形式存在。核酸在体内的表达可以是例如通过质粒型载体，病毒载体或病毒/质粒构建载体。

在另一个实施例中，核酸包含编码适当抗原的全部或部分序列或其免疫功能等价物的编码区。当然，这些核酸可以包含和/或编码另外的序列，另外的序列包括但不限于包含一种或多种免疫调节剂或佐剂的那些。

抗原

如本文所考虑的，本发明可以包括适合加载到apc中以引发免疫应答的任何抗原的应用。在一个实施例中，可以使用肿瘤抗原。肿瘤抗原可以分为两大类：共享的肿瘤抗原；和独特的肿瘤抗原。共享抗原由许多肿瘤表达，而独特的肿瘤抗原可由物理或化学致癌物诱导的突变产生，因此仅由单个肿瘤表达。在某些实施例中，共享的肿瘤抗原被装载到本发明的树突状细胞中。在其它实施例中，将独特的肿瘤抗原装载到本发明的树突状细胞中。

在本发明的上下文中，“肿瘤抗原”是指特异性过度增殖性失调所共有的抗原。在某些方面，本发明的过度增殖性失调抗原来源于癌症，包括但不限于原发性或转移性黑素瘤，胸腺瘤，淋巴瘤，肉瘤，肺癌，肝癌，非霍奇金淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，白血病，子宫癌，子宫颈癌，膀胱癌，肾癌和腺癌如乳腺癌，前列腺癌，卵巢癌，胰腺癌等。

恶性肿瘤表达许多可以作为免疫攻击的靶抗原的蛋白质。这些分子包括但不限于组织特异性抗原，例如黑素瘤中的mart-1，酪氨酸酶和gp100，以及前列腺癌中的前列腺酸性磷酸酶(pap)和前列腺特异性抗原(psa)。其他靶分子属于与转化相关的分子的组，例如致癌基因her-2/neu/erbb-2。另一组靶抗原是癌胚抗原，例如癌胚抗原(cea)。在b细胞淋巴瘤中，肿瘤特异性独特型免疫球蛋白构成了对个体肿瘤独特的真正的肿瘤特异性免疫球蛋白抗原。b细胞分化抗原，例如cd19，cd20和cd37，是b细胞淋巴瘤中靶抗原的其它候选物。这些抗原中的一些(cea，her-2，cd19，cd20，独特型)已经用作仅有限次成功的使用单克隆抗体的被动免疫治疗的靶标。

肿瘤抗原及其抗原性癌症抗原决定基可以从天然来源例如来自初级临床分离物，细胞系等中进行纯化和分离。癌肽和它们的抗原决定基也可以通过本领域已知的化学合成或通过重组dna技术获得。化学合成的技术描述于steward等(1969)；bodansky等。(1976)；meienhofer(1983)；和schroder等(1965)。此外，如renkvist等人(2001)描述的，存在许多本领域已知的抗原。尽管没有具体描述类似物或人工修饰的抗原决定基，但是本领域技术人员知道如何通过本领域的标准方法获得或产生它们。在ludwig癌症研究所的数据库中鉴定了已通过抗体鉴定的和通过serex技术(参见sahin等人(1997)和chen等人(2000))检测的其它抗原。

在另一个实施例中，本发明可以包括由apc递呈的微生物抗原。如本文所考虑的，微生物抗原可以是病毒，细菌或真菌来源。感染性病毒的实例包括：逆转录病毒科(例如人免疫缺陷病毒，例如hiv-1(也称为htlv-iii，lav或htlv-iii/lav或hiv-iii)；和其他分离株，如hiv-lp；小核糖核酸病毒科(例如脊髓灰质炎病毒，甲型肝炎病毒；肠道病毒，人柯萨奇病毒，鼻病毒，埃可病毒)；杯状病毒科(例如引起肠胃炎的菌株)；披膜病毒科(例如马脑炎病毒，风疹病毒)；黄病毒科(例如登革热病毒，脑炎病毒，黄热病毒)；冠状病毒科(例如冠状病毒)；弹状病毒科(例如水泡性口炎病毒，狂犬病病毒)；丝状病毒科(例如埃博拉病毒)；副粘液病毒科(例如副流感病毒，腮腺炎病毒，麻疹病毒，呼吸道合胞病毒)；正粘病毒科(例如流感病毒)；布尼亚病毒科(例如汉坦病毒，布尼亚病毒，白蛉病毒和内罗病毒)；砂粒病毒科(出血热病毒)；呼肠孤病毒科(例如呼肠孤病毒，环状病毒和轮状病毒)；双核糖核酸病毒科；肝脱氧核糖核酸病毒科(乙型肝炎病毒)；细小病毒科(细小病毒)；乳多空病毒科(乳头瘤病毒，多瘤病毒)；腺病毒科(多数腺病毒)；疱疹病毒科(单纯疱疹病毒(hsv)1和2，水痘带状疱疹病毒，巨细胞病毒(cmv)，疱疹病毒)；痘病毒科(天花病毒，牛痘病毒，痘病毒)；和虹彩病毒科(例如非洲猪瘟病毒)；和未分类的病毒(例如海绵状脑病的病原体，δ型肝炎(被认为是乙型肝炎病毒的有缺陷附属物)的病原体，非甲型非乙型肝炎的病原体(1类＝内部传播；2类＝肠胃外传播(即丙型肝炎)；诺瓦克和相关病毒，和星状病毒。

感染性细菌的实例包括：幽门螺杆菌，博氏疏螺旋体，嗜肺军团杆菌，分枝杆菌(例如结核分枝杆菌，鸟分枝杆菌，胞内分枝杆菌，堪萨斯分枝杆菌，戈氏分枝杆菌)，金黄色葡萄球菌，淋病奈瑟氏球菌，脑膜炎奈瑟菌单核细胞增生李斯特菌，酿脓链球菌(a组链球菌)，无乳链球菌(b组链球菌)，链球菌(草绿色链球菌组)，粪链球菌，牛链球菌，链球菌(厌氧菌)，肺炎链球菌，致病性弯曲杆菌种，肠球菌种，流感嗜血杆菌，炭疽杆菌，白喉棒状杆菌，棒状杆菌种，红斑丹毒丝菌，产气荚膜梭菌，破伤风杆菌，产气肠杆菌，肺炎克雷伯氏菌，多杀巴斯德氏菌，拟杆菌种，核梭杆菌，念珠状链杆菌，密螺旋体病毒，极细密螺旋体病毒，钩端螺旋体和衣氏放线菌。

感染性真菌的实例包括：新型隐球菌，荚膜组织胞浆菌，粗球孢子菌，皮炎芽生菌，沙眼衣原体，白色念珠菌。其它感染性生物体(即原生生物)包括：恶性疟原虫和刚地弓形虫。

树突状细胞的激活

尽管传统的基于树突状细胞的疫苗(其具有的临床试验之前占优势)包括使用细胞因子混合物产生的成熟树突状细胞，所述细胞因子混合物包括tnf，il-6，pge2和il-1β的组合，其最终刺激无菌性炎症，但是本发明利用tlr激动剂使树突状细胞成熟并刺激信号的产生。

根据本发明的一个方面，用tlr配体的组合刺激树突状细胞导致产生增加量的il-12。此外，用tlr激动剂的组合激活树突状细胞可产生更显著的cd4和cd8t-细胞应答(wargeretal.,2006,blood108:544–550)。因此，本发明的树突状细胞可通过暴露于触发tlr的这些配体而分泌th1驱动细胞因子，例如il-12。例如，il-1β，tnf-α和ifn-γ的tlr3激动剂聚(i：c)的加入可以产生有效的1型极化树突状细胞，其特征在于强水平的il-12产生(heifleretal.,1996,eur.j.immunol.26:659–668)。在某些实施例中，可以在暴露于tlr激动剂之前将抗原加载到树突状细胞中。在其他实施例中，可以在暴露于tlr激动剂之后将抗原加载到树突状细胞中。

根据本发明的一个方面，可注射的多剂量抗原脉冲树突状细胞疫苗通过在单个患者白细胞分离术中收集树突状细胞而产生，其中细胞被模拟细菌感染的生物分子(例如lps)激活。这种独特的激活方法使树突状细胞具有了在用tnf，il-6，pge2和il-1β的细胞因子混合物成熟(“传统成熟”)的树突状细胞中未发现的品质，所述细胞因子混合物也模拟无菌性炎症(lombardietal.,2009,j.immunol.182:3372–3379)。

在一个实施例中，本发明的树突状细胞可以用tlr4激动剂，细菌脂多糖(lps)，tlr7/8激动剂，resimiquod(r848)和/或ifn-γ的组合激活(amatietal.,2006,curr.pharm.des12:4247-4254)。通过用tlr4激动剂和细菌lps激活树突状细胞，产生的树突状细胞至少实质上与通过传统成熟方法产生的dc1相同(在表型上)。这些树突状细胞具有高表达的表面分子，包括cd83，cd80，cd86和hla-dr。在其他实施例中，可以使用tlr2激动剂，例如脂磷壁酸(lta)，tlr3激动剂，例如聚(i：c)，和/或其它tlr4激动剂，例如mpl。如本文所考虑的，任何tlr激动剂或tlr激动剂的组合可用于有活性的树突状细胞，前提是这些配体通过激活的树突状细胞刺激细胞因子和趋化因子信号的产生。许多其他本领域已知的和公开文献中找到的tlr激动剂可以用于本发明。

即使树突状细胞和传统上成熟的树突状细胞之间在表型上存在相似性，本发明的树突状细胞显示出许多显著的优点。

冷冻保存

在培养开始和激活后，收获细胞，并冷冻保存疫苗。例如，通过白细胞分离法获得外周血单核细胞。将细胞在含有gm-csf和il-4的无血清培养基中培养一段时间，然后用所需抗原脉冲细胞。在用所需抗原脉冲细胞后，将抗原脉冲的树突状细胞与ifn-γ一起孵育，然后与tlr激动剂(例如lps)一起孵育。收集活化的抗原脉冲的树突状细胞并在冷冻培养基中冷冻保存，并储存在液氮中。在一个实施例中，冷冻培养基包含55％的勃脉力(plasmalyte)，40％的人血清白蛋白和5％的dmso。

本发明的冷冻保存方面允许fda批准的可注射多剂量抗原脉冲树突状细胞疫苗的产生。本发明的优点是多剂量抗原脉冲的树突细胞保留其在解冻后产生对t细胞功能关键的信号的能力。如本文所考虑的，本发明包括如本领域技术人员将理解的多种冷冻保存技术和低温培养基。例如，在某些实施例中，冷冻培养基包含55％的勃脉力，40％的人血清白蛋白和5％的dmso。因此，本发明提供了在集中区域产生本发明的多剂量抗原脉冲的树突状细胞疫苗的能力，疫苗包括初始免疫剂量和多个“加强”剂量的。因此，多剂量抗原脉冲树突状细胞疫苗可以运送到远程医疗中心，用于对患者进行连续施用，而对施用场所不要求特殊的fda质量控制/质量保证。

在一个实施例中，本发明的树突状细胞疫苗以多个剂量的等分试样冷冻保存。例如，细胞以30×10⁶个细胞/ml的浓度冷冻保存。例如，制备一袋体积等于细胞体积的冷冻培养基。快速工作，将冷冻培养基加入到细胞袋中，并将细胞转移到标记的冷冻瓶。在一个实施例中，使用速率控制的冷冻器冷冻小瓶。例如，使用自动速率控制的冷冻器以1℃/min冷冻冷冻瓶，并储存在气相氮气中。

在一个实施例中，使用速率控制的冷冻器冷冻小瓶。将小瓶放置在冷冻室中，液氮通过电子电磁阀进入该室。由于蒸发几乎是瞬时的，控制液氮进入室的速率直接控制着从冷冻室及其内容物吸收和移除热量的速率。

如本文所考虑的，本发明包括如本领域技术人员将理解的多种冷冻保存技术和冷冻培养基。例如，在某些实施例中，用于培养细胞的冷冻培养基可以包括约55％的勃脉力，约40％的人血清白蛋白和约5％的dmso。在其他实施例中，低温培养基可以是无血清的。在某些实施例中，可以使用控制速率冷冻，而其他实施方案可以包括绝热容器的使用，绝热容器中将混合有冷冻培养基的细胞小瓶置于冷冻器中，例如在约-70℃至-80℃的温度范围内。本发明提供了以这样的方式保存激活的树突状细胞的方法，以便进一步促进这些细胞的临床应用，并且减少对广泛和重复的提取法和淘洗步骤的需要。如本文所考虑的，冷冻保存技术可用于小规模和大规模批次。

当考虑用于活化树突状细胞的广泛效用时，冷冻保存的活化树突状细胞的稳定供应的能力是可以促进这样的细胞的各种治疗用途的显著优点。例如，根据本发明的方法，能够以包含初始免疫剂量和多个“加强”剂量的适当大小的等分试样冷冻保存大规模培养的活化树突状细胞，使得单个剂量的细胞可以随后用于任何特定的免疫治疗方案。在某些实施例中，活化的树突状细胞可以在约-70℃或更低的温度下冷冻保存2-24周。在较低温度下，例如在约-120℃或更低，活化的树突状细胞可以冷冻保存至少一年或更长时间。

在一个示例性实施例中，将树突状细胞悬浮在人血清和约5％dmso(v/v)中。可选地，可以使用其他血清类型，例如胎牛血清。悬浮的细胞可以等分成更小的样品，例如在1.8ml小瓶中，并且储存在大约-70℃或更低。在其他实施例中，所述冷冻培养基可以包括约20％血清和约10％dmso，悬浮细胞可以在约-180℃下储存。另外的实施例可以包括含有约55％的勃脉力和约5％的dmso的培养基。其他示例性冷冻培养基可以包括约12％dmso和约25-40％血清。

尽管本文所述的本发明可以包括特定浓度的血清，但是本领域技术人员应当理解，冷冻培养基中血清的确切量可以变化，并且在一些实施方案中可以完全不存在，但通常为在约1％至30％的范围内。当然，使细胞生活力为约50％和/或细胞复苏为约50％的任何血清浓度以及本文所述的任何冷冻保存方法可以用于本发明的任何树突状细胞组合物中。当回收所选冷冻培养基中冷冻保存的细胞时，优选的，期望的细胞生活力和复苏为至少60％，更优选至少约70％，或甚至80％。

类似地，虽然本文所述的本发明可以包括特定浓度的dmso，但是本领域技术人员应当认识到，在一些实施例中，dmso可以完全不存在，而在其他实施例中，浓度为约5％至高达约20％的dmso可用于冷冻培养基中并被包括在本文所述的冷冻保存方法中。通常，优选较低浓度的dmso，例如约5％至约10％。然而，在解冻后，使得细胞生活力至少50％和细胞复苏至少50％，优选使得细胞活力和复苏为至少60％，更优选约70％，更多优选约80％，甚至更优选约90％和更高的任何浓度的dmso都可以被使用。

虽然本文所述的本发明可以包括速率控制冷冻相关的，但是本领域技术人员应当理解，可以常规使用以速率控制方式或非速率控制方式冷冻的方法。本领域技术人员还应当理解，本文所述的各种冷冻保存培养基可以包含血清或可以是无血清的。无血清培养基的实例可包括xvivo10，xvivo15，xvivo20，stempro，以及任何市售的无血清培养基。当使用无血清冷冻培养基时，本发明的冷冻保存方法通常不含可能是抗原性的感染剂，抗体和外源蛋白以及通常可在以血清为基本的冷冻培养基中发现的任何其它外源分子。

在用tlr激动剂激活细胞后的任何时间点，抗原加载的活化的树突状细胞的冷冻保存可在任何时间点发生。在一个实施例中，所述活化的树突状细胞在暴露于tlr激动剂后约6-8小时进行冷冻保存。优选地，选择冷冻保存活化细胞的时间点应当基于细胞的信号产生的最大化，特别是il-12产生。

本发明提供了用于产生大规模树突状细胞疫苗的组合物和方法。在一个实施例中，大规模生产树突状细胞疫苗允许产生fda批准的可注射的多剂量抗原脉冲的树突状细胞疫苗，以用于个体化治疗和预防癌症或其他失调。在一个实施例中，本发明提供了用于产生大规模抗原脉冲的i型极化树突状细胞疫苗(dc1)的组合物和方法。

在一个实施例中，本发明提供了一种冷冻保存处于大规模抗原加载的，预活化状态的树突状细胞的方法，该树突状细胞是“注射器即用”的，即，适合立即注射到患者中，而不需要要求(例如，通过fda规定)额外的设施和质量控制/保证步骤的任何进一步的细胞加工。

在一个实施例中，本发明提供了一种效率高的大规模生产可注射的多剂量抗原脉冲的树突状细胞疫苗的方法，优选显示最大功效的可注射的多剂量抗原脉冲i型极化树突状细胞疫苗的生产方法。

组合物或试剂盒组分的包装

用于本发明的组合物(或试剂盒组分)的合适容器包括小瓶，注射器(例如一次性注射器)等。这些容器应是无菌的。

当组合物/组分位于小瓶中时，小瓶优选由玻璃或塑料材料制成。小瓶优选在将组合物加入其中之前灭菌。为了避免对乳胶敏感的患者的问题，小瓶优选用无胶乳的塞子密封，并且优选在所有包装材料中不存在胶乳。小瓶可以包括单剂量的疫苗，或者其可以包括多于一个剂量(“多剂量”小瓶)例如10剂量。优选的小瓶由无色玻璃制成。

瓶子可以配一个瓶盖(例如，鲁尔锁定型的)，这样预先填充的注射器可以插入瓶盖中，使得注射器的内容物可以排出到瓶子内，瓶子的内容物也可以被转移回注射器内。在用注射器从瓶内抽取内容物后，给注射器加上针头，组合物可以被施用给病人。瓶盖最好位于密封或者盖里面，从而在接触瓶盖前必须先取下密封或者盖。瓶子可以有一个允许无菌转移内容物的瓶盖，特别是针对多剂量的瓶子。

当组合物/组分被包装到注射器中时，注射器可以具有连接到其上的针头。如果没有连接针头，可以将单独的针头与注射器一起提供进行组装和使用。这种针头可以被包覆。安全针头是优选的。1英寸23号，1英寸25号和5/8英寸25号针是典型的。注射器可以与剥离标签一起提供，其上可以打印内容物的批号，流感季节和有效期，以便于保存记录。注射器中的柱塞优选地具有塞子，以防止柱塞在抽吸期间意外地移除。注射器可以具有乳胶橡胶盖和/或柱塞。一次性注射器含有单剂量的疫苗。注射器通常具有尖端帽用来在连接针头之前密封尖端，并且尖端帽优选地由丁基橡胶制成。如果注射器和针头单独包装，则针头优选装配有丁基橡胶护罩。

容器可以被标记以显示半剂量体积，例如：为了方便给儿童注射。例如，含有0.5ml剂量的注射器可具有显示0.25ml体积的标度。

在使用玻璃容器(例如注射器或小瓶)的情况下，优选使用由硼硅酸盐玻璃制成的容器而不是钠钙玻璃制成的容器。

试剂盒或者组合物可以和说明书一起包装(比如，同一个盒子内)，说明书包含有疫苗的详细信息，比如用药说明、疫苗内抗原的详细信息等等。说明书也可包含警告，比如保留现成可用的肾上腺素溶液，预防接种后的过敏反应等。

疾病治疗方法

本发明还包括治疗和/或预防由病原微生物，自身免疫失调和/或过度增殖性疾病引起的疾病的方法。

可以通过使用本发明治疗或预防的疾病包括由病毒，细菌，酵母，寄生虫，原生动物，癌细胞等引起的疾病。本发明的药物组合物可以用作广义免疫增强剂(树突状细胞激活组合物或系统)，因此可用于治疗疾病。可以使用本发明的药物组合物治疗和/或预防的典型性疾病包括但不限于病毒病原学感染，例如艾滋病，流感，疱疹，病毒性肝炎，epsteinbar病毒，脊髓灰质炎，病毒性脑炎，麻疹，水痘，乳头瘤病毒等；或细菌病原学感染如肺炎，结核病，梅毒等；或寄生虫病原学感染，例如疟疾，锥虫病，利什曼病，滴虫病，阿米巴病等。

本发明中可以使用本发明的药物组合物(转导的树突状细胞，表达载体，表达构建体等)治疗或预防的癌前或增生状态包括但不限于例如结肠息肉，克罗恩病，溃疡性结肠炎，乳腺病变等癌前或增生状态。

本发明中可以使用本发明的组合物治疗的癌症包括但不限于原发性或转移性黑素瘤，腺癌，鳞状细胞癌，腺鳞状细胞癌，胸腺瘤，淋巴瘤，肉瘤，肺癌，肝癌，非霍奇金淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，白血病，子宫癌，乳腺癌，前列腺癌，卵巢癌，胰腺癌，结肠癌，多发性骨髓瘤，成神经细胞瘤，鼻咽癌，膀胱癌，子宫颈癌等。

可以使用本发明的树突状细胞激活系统治疗的其它过度增殖性疾病包括但不限于类风湿性关节炎，炎性肠病，骨关节炎，平滑肌瘤，腺瘤，脂肪瘤，血管瘤，纤维瘤，血管闭塞，血管再狭窄，动脉粥样硬化，癌前病变(例如腺瘤性增生和前列腺上皮内瘤变)，原位癌，口腔毛状白斑或牛皮癣。

可以使用本发明的组合物治疗的自身免疫性失调包括但不限于艾滋病，爱迪生氏病，成人呼吸窘迫综合征，过敏，贫血，哮喘，动脉粥样硬化，支气管炎，胆囊炎，克罗恩病，溃疡性结肠炎，特应性皮炎，皮肌炎，糖尿病，肺气肿，结节性红斑，萎缩性胃炎，肾小球性肾炎，痛风，格雷夫斯氏病，嗜酸性粒细胞增多症，肠易激综合症，红斑狼疮，多发性硬化，重症肌无力，心肌或心包炎，骨关节炎，骨质疏松症，胰腺炎，多肌炎，类风湿性关节炎，硬皮病，干燥综合症和自身免疫性甲状腺炎；癌症并发症，血液透析和体外循环；病毒性的、细菌的、真菌的、寄生的、原生动物的和蠕虫的感染；和外伤。

在治疗方法中，本发明组合物的施用可以是为了“预防疾病的”或“治疗性”目的。当为预防疾病提供时，在任何症状出现前提供本发明的组合物，虽然在某些实施例中疫苗是在一个或者多个症状发作后提供以防止发生进一步的症状或者防止现有的症状变得更加糟糕。本组合物的预防性施用用于预防或改善任何后续的感染或者疾病。当为治疗目的提供时，在感染或者疾病的症状发作时或之后提供本药物组合物。从而，本发明可以在预期暴露于引起疾病的物品或疾病状态之前、或者在感染或疾病开始之后提供。

本组合物的有效量为能够实现增强免疫应答特定效果的数量，并且该数量能够由本领域的技术人员常规确定。比如，用于治疗针对癌症或者病原体的免疫系统缺陷的有效量可以为在暴露于抗原时，引起免疫系统激活，使得具有抗原特异性的免疫应答发展所必须的数量。此术语与“足够数量”同义。

对于任何具体应用的有效量可以根据诸如所治疗的疾病或病症，所施用的特定组合物，受试者的大小和/或疾病或病症的严重性等因素而变化。本领域普通技术人员可以凭经验确定本发明的特定组合物的有效量，而不需要过度的实验。

治疗应用

本发明包括抗原加载、激活的apc的生产，当其从冷冻保存解冻时产生显著水平的细胞因子和趋化因子，其中抗原加载和激活的apc用于哺乳动物，优选人的免疫治疗。对由apc递呈的抗原的应答可以通过使用本领域熟知的方法监测针对抗原的细胞溶解性t细胞应答、辅助性t细胞应答和/或抗体应答的诱导来测量。

本发明包括增强哺乳动物免疫应答的方法，包括以下步骤：从获自哺乳动物(例如患者)的单核细胞中生产未成熟的树突状细胞；用包含抗原组合物的组合物脉冲未成熟的树突状细胞；用至少一种tlr激动剂激活抗原加载的树突状细胞；冷冻保存活化的，抗原加载的树突状细胞；解冻活化的抗原加载的树突状细胞，然后将活化的抗原加载的树突状细胞施用于对此有需要的哺乳动物。所述组合物至少包括抗原，并且还可以进一步是用于哺乳动物中的离体免疫和/或体内治疗的疫苗。优选地，哺乳动物是人类。

离体步骤在本领域是众所周知的，并且在下面更全面地讨论。简言之，从哺乳动物(优选人类)中分离细胞。可以将细胞施用于哺乳动物接受者以提供治疗益处。哺乳动物接受者可以是人类，并且细胞可以是接受者自体的。可选的，细胞可以是接受者同种异体的，同基因的或异种的。

在一个实施例中，通过白细胞分离和淘洗联合法从患者处获得外周血单核细胞。单核细胞可以在含有gm-csf和il-4的sfm中培养过夜。第二天，未成熟的树突状细胞可以用抗原脉冲，然后使树突状细胞与ifn-γ和lps接触。然后可以将激活的树突状细胞悬浮在冷冻培养基中并冷冻，直到准备好用于免疫治疗。

与新鲜激活的树突状细胞相比，在复苏百分比和细胞存活百分比可以有效形成的条件下，冷冻保存的树突状细胞可以离体培养。与新鲜制备的树突状细胞相比，从冷冻保存的样品中产生的树突状细胞可以显示出类似的稳定性。此外，将冷冻保存的成熟树突状细胞与新鲜制备的树突状细胞相比较可以显示出二者实际上相同的表型以及信号分泌性能。如本文所考虑的，在约-70℃至-80℃的温度下，在本文所述的各种冷冻培养基中，树突状细胞可以小规模和大规模的保存大约2至24周。在低于约-120℃的温度下，储存的持续时间可以无限地延长或至少超过24周，而不影响树突状细胞的细胞复苏，生活力和功能性。例如，在某些实施例中，已激活的细胞可以保存至少一年，并且在解冻后仍然可以保持产生信号的能力。本发明提供了在解冻细胞时有效的复苏和生活力，此外，如本文全文所述，本文所述的冷冻保存条件不影响树突状细胞保持其信号功能的能力。

在示例性实施例中，可以在树突状细胞激活后通过将细胞重悬浮在冷冻培养基中来进行冷冻保存，所述冷冻培养基包含约55％的勃脉力，约40％的人血清白蛋白和约5％的dmso的。然后将混合物等分在1.8ml小瓶中，并在约-80℃下在冷冻室中冷冻过夜。然后，小瓶可以在第二天转移到液氮罐。在约2至24周的冷冻保存后，可以将冷冻的树突状细胞解冻并检查其复苏和生活力。这样的树突状细胞的复苏可以大于或等于约70％，生活力大于或等于约70％。在其他实施例中，树突状细胞或甚至单核细胞可以在细胞激活之前冷冻保存。

可替换地，造血干细胞和祖细胞离体扩增的步骤在美国专利号5199942中有描述，在此将其列入本文作为参考，此步骤也适用于本发明的细胞。除了美国专利号5199942中描述的细胞生长因子之外，其他因子比如flt3-l,il-1,il-3和c-kit配体等可用于细胞的培养和扩增。

在从细胞群中识别和分离细胞方面有许多细胞选择技术。比如，单克隆抗体(或者其他的特定的细胞结合蛋白)可以被用于结合到细胞中发现的标记蛋白或者表面抗原蛋白质上。一些这样的标记蛋白和细胞表面抗体在本领域是众所周知的。

疫苗制剂

本发明还包括适用于免疫治疗应用中的疫苗制剂。在某些实施例中，疫苗制剂用于预防和/或治疗疾病，例如癌症和感染性疾病。在一个实施例中，为预防和/或治疗癌症的目的按照本发明对病人进行疫苗施用可以在以去除癌症为目的的手术前或者手术后进行，可以在以治疗癌症为目的的化疗前或者化疗后进行，可以在以治疗癌症为目的的放射治疗前或者放射治疗后进行，或其任何组合下进行。在其它实施方案中，疫苗制剂可以与另一种组合物或药物产品联合或组合施用于患者。应当理解，本发明还可以用于在没有癌症但可能处于发展癌症风险的个体中预防癌症。

根据本发明制备的癌症疫苗的施用广泛适用于预防或治疗癌症，该癌症一定程度上取决于对癌症疫苗的抗原形成部分的选择。可以根据本发明的实践适当治疗的癌症包括但不限于肺癌，乳腺癌，卵巢癌，子宫颈癌，结肠癌，头颈癌，胰腺癌，前列腺癌，胃癌，膀胱癌，肾癌，骨癌，肝癌，食道癌，脑癌，睾丸癌，子宫癌和各种白血病和淋巴瘤。

在一个实施例中，根据本发明的疫苗可以源自待治疗的肿瘤或癌细胞。例如，在肺癌的治疗中，肺癌细胞将如上文所述进行治疗以产生肺癌疫苗。类似地，乳腺癌疫苗，结肠癌疫苗，胰腺癌疫苗，胃癌疫苗，膀胱癌疫苗，肾癌疫苗等，按照实践，将作为免疫治疗试剂被生产和应用，以预防或者治疗制备这些疫苗的肿瘤或者癌细胞。

在另一个实施例中，如上所述，通过收集病原体散布在培养基中的相关抗原，按照本发明的疫苗还可以被制备以治疗影响哺乳动物的各种感染性疾病。由于引起相同疾病的不同种类的生物体表达的免疫原性和保护性抗原的类型中存在异质性，可以通过从表达不同的重要抗原的生物体库制备疫苗来制备多价疫苗。

在本发明的另一个实施例中，疫苗可以通过结节内注射施用到腹股沟结节中。或者，根据疫苗靶标，疫苗可以皮内或皮下施用于被治疗患者的四肢，手臂和腿部。尽管该方法通常对于黑素瘤和其它癌症(包括预防或治疗感染性疾病)是令人满意的，但是也可以使用其它施用途径，例如肌肉内或进入血流。

另外，疫苗可以与佐剂和/或免疫调节剂一起给予以增强疫苗的活性和患者的应答。这些佐剂和/或免疫调节剂是本领域技术人员理解的，并且在可获得的公开文献中描述。

如本文所考虑的，依据生成疫苗的类型，如果需要，可以通过在生物反应器或发酵罐或其它适于大量生长细胞的容器或装置中培养细胞来扩大疫苗的生产。在这样的装置中，会定期地，频繁地或连续地收集培养基，以便在这些材料和抗原在培养基中被降解之前从中回收所有材料或抗原。

如果需要，根据本发明生产和回收的适于持续或间歇释放的包含疫苗或抗原的装置或组合物可以有效地植入体内或局部施用于其中，用于将这些材料相对缓慢或定时的释放进入体内。

疫苗制备中的其它步骤可以个体化以满足特定疫苗的要求。这些额外的步骤将被本领域技术人员理解。例如，某些收集的抗原材料可以被浓缩并且在一些情况下用洗涤剂处理并超速离心以除去移植的同种异体抗原。

联合疗法

本发明提供了一种治疗癌症的有效疗法，其中这种疗法包括改变肿瘤的免疫应答从而使得肿瘤部位的免疫细胞能够更有效地攻击肿瘤细胞。在一些实例下，有效的治疗包括改善肿瘤部位中免疫细胞的迁移和活性。在一个实施例中，本发明提供了使用树突状细胞疫苗联合一种或多种her2和her3抑制剂的方法和组合物，作为癌症治疗的方案。在另一个实施例中，治疗方案包括使用树突状细胞疫苗、一种或者多种her2和her3的抑制剂，和趋化因子调节剂。在一个实施例中，趋化因子调节剂是趋化因子激活剂。趋化因子激活剂的实例是tlr8激动剂。

在一个实施例中，本发明提供了树突状细胞疫苗与her-2和her-3阻断一起联合使用的方法和组合物，作为治疗癌症的治疗方案。在另一个实施例中，本发明提供了树突状细胞疫苗与her-2和her-3的阻断以及tnf-α和ifn-γ一起联合使用的方法和组合物。在另一个实施方案中，本发明提供了阻断her-2和her-3二者与加入tnf-α和ifn-γ的方法和组合物，作为治疗癌症的治疗方案。

在一个实施例中，本发明的治疗方案可用于治疗癌症，因此可以被认为是一种抗癌治疗。在另一个实施例中，本发明的治疗方案可用于与另一种抗癌或抗肿瘤治疗的联合治疗，包括但不限于手术，化疗，放射治疗(例如x射线)，基因治疗，免疫治疗，激素治疗，病毒治疗，dna治疗，rna治疗，蛋白质治疗，细胞治疗和纳米治疗。

在一个实施例中，本发明涉及本发明的治疗方案与另一种用于治疗或预防受试者中的癌症的癌症药物的组合。其它癌症药物以本发明治疗方案的协同量或各种剂量或不同的时间表施用。本发明还涉及本发明的治疗方案单独的或其与所需的癌症药物组合的试剂盒和组合物。

在一个实施例中，在接受另一种抗癌治疗之前使用本发明的治疗方案。在另一个实施例中，本发明的治疗方案与接受另一种抗癌治疗同时使用。在另一个实施例中，本发明的治疗方案在接受另一种抗癌治疗后使用。

在一些实施例中，本发明提供了一种受试者中er阴性的乳腺癌的治疗方法。在一些实施例中，本发明提供了一种受试者中er阴性且her2阳性的乳腺癌的治疗方法。在一些实施例中，乳腺癌是转移性乳腺癌。在一些实施例中，乳腺癌处于阶段i、阶段ii或阶段iii。

在另一个实施例中，本发明的治疗方案可以与现有的用于治疗癌症的治疗剂联合使用。为了评估本发明的治疗方案与本文别处描述的抗肿瘤治疗剂组合使用的潜在治疗功效，可以根据本领域已知的方法测试这些组合的抗肿瘤活性。

在一个方面，本发明预期到本发明的治疗方案可以与治疗剂联合使用，所述治疗剂例如抗肿瘤剂，包括但不限于化疗剂，抗细胞增殖剂或任何组合。

本发明不应限于任何特定的化疗剂。相反，任何化疗剂可以与本发明的治疗方案一起使用。例如，本发明包括以下非限制性示例性类别的任何常规化学治疗剂：烷基化试剂、亚硝基脲、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、植物碱、紫杉烷类、激素试剂和其他试剂。

烷基化试剂被这样命名是因为它们能够在细胞中的条件下向许多电负性基团添加烷基，从而干扰dna复制以阻止癌细胞的繁殖。大多数烷基化试剂是细胞周期非特异性的。在具体的方面，它们通过在dna双螺旋链中交联鸟嘌呤碱基来阻止肿瘤的生长。非限制性实例包括白消安，卡铂，苯丁酸氮芥，顺铂，环磷酰胺，达卡巴嗪，异环磷酰胺，氮芥盐酸盐，美法仑，甲基苄肼，塞替派和乌拉莫司汀。

抗代谢物防止在细胞周期的合成(s)期期间将碱基加入dna，从而阻止正常发育和分裂。抗代谢物的非限制性实例包括诸如5-氟尿嘧啶，6-巯基嘌呤，卡培他滨，阿糖胞苷，氟尿苷，氟达拉滨，吉西他滨，甲氨蝶呤和硫鸟嘌呤的药物。

有多种抗肿瘤抗生素通常通过干扰细胞分裂所需的酶或通过改变包围细胞的细胞膜来阻止细胞分裂。该类中包括蒽环类药物，例如阿霉素，其通过扰乱dna的结构并终止其功能来阻止细胞分裂。这些试剂是细胞周期非特异性的。抗肿瘤抗生素的非限制性实例包括放线菌素d、道诺霉素、阿霉素、伊达比星、丝裂霉素c和米托蒽醌。

植物碱抑制或停止有丝分裂或抑制酶，所述酶阻止细胞产生细胞生长所需的蛋白质。常用的植物碱包括长春花碱，长春新碱，长春地辛和长春瑞滨。然而，本发明不应被解释为仅限于这些植物碱。

紫杉烷类影响细胞结构中对细胞功能很重要的微管。在正常的细胞生长中，当细胞开始分裂时形成微管，但是一旦细胞停止分裂，则微管被分解或破坏。紫杉烷类抑制微管分解，使得癌细胞被微管变得如此堵塞以至于不能生长和分裂。非限制性的示例性紫杉烷类包括紫杉醇和多西他赛。

激素试剂和类激素药品用于某些类型的癌症，包括例如白血病，淋巴瘤和多发性骨髓瘤。他们经常与其他类型的化疗药物一起使用以增强其有效性。性激素用于改变雌性或雄性激素的作用或产生，并用于减缓乳腺癌、前列腺癌和子宫内膜癌的生长。抑制这些激素的产生(芳香酶抑制剂)或作用(它莫西芬)通常可用作治疗的辅助。一些其他肿瘤也是激素依赖性的。它莫西芬是激素试剂的非限制性实例，其干扰促进乳腺癌细胞生长的雌激素的活性。

其它药剂包括也可用于本发明的化疗剂，例如博来霉素，羟基脲，l-天冬酰胺酶和丙卡巴肼。

抗细胞增殖剂可以进一步定义为细胞凋亡诱导剂或细胞毒性剂。细胞凋亡诱导剂可以是颗粒酶，一种bcl-2家族成员，细胞色素c，一种半胱天冬酶，或其组合。示例性颗粒酶包括颗粒酶a，颗粒酶b，颗粒酶c，颗粒酶d，颗粒酶e，颗粒酶f，颗粒酶g，颗粒酶h，颗粒酶i，颗粒酶j，颗粒酶k，颗粒酶l，颗粒酶m，颗粒酶n，或其组合。在其他具体方面，bcl-2家族成员是例如bax，bak，bcl-xs，bad，bid，bik，hrk，bok，或其组合。

在另外的方面，半胱天冬酶为半胱天冬酶-1，半胱天冬酶-2，半胱天冬酶-3，半胱天冬酶-4，半胱天冬酶-5，半胱天冬酶-6，半胱天冬酶-7，半胱天冬酶-8，半胱天冬酶-9，半胱天冬酶-10，半胱天冬酶11，半胱天冬酶12，半胱天冬酶-13，半胱天冬酶-14，或其组合。在具体方面，细胞毒性剂是tnf-α，白树毒素，灵菌红素，核糖体抑制蛋白(rip)，假单胞菌外毒素，艰难梭菌毒素b，幽门螺杆菌vaca，小肠结肠炎耶尔森菌yopt，青紫色素杆菌素、二亚乙基三胺五乙酸、伊洛福芬、白喉毒素、米托洁林、蓖麻毒素、肉毒杆菌毒素，霍乱毒素，皂草素6，或其组合。

在一个实施例中，本发明的治疗方案与抗肿瘤剂组合使用，其中抗肿瘤剂是抗肿瘤烷基化试剂，抗肿瘤抗代谢物，抗肿瘤抗生素，植物来源的抗肿瘤剂，抗肿瘤铂络合物，抗肿瘤喜树碱类衍生物，抗肿瘤酪氨酸激酶抑制剂，单克隆抗体，干扰素，生物反应调节剂，激素抗肿瘤剂，抗肿瘤病毒剂，血管生成抑制剂，分化剂，pi3k/mtor/akt抑制剂，细胞周期抑制剂，细胞凋亡抑制剂、hsp90抑制剂，微管蛋白抑制剂，dna修复抑制剂，抗血管生成剂，受体酪氨酸激酶抑制剂，拓扑异构酶抑制剂，紫杉烷，her-2靶向药剂，激素拮抗剂，生长因子受体靶向的药剂，或其药学上可接受的盐。在一些实施例中，抗肿瘤剂是西他滨，卡培他滨，瓦洛他滨或吉西他滨。在一些实施例中，抗肿瘤剂选自由阿瓦斯丁，索坦、索拉非尼、西地尼布、abt-869、阿西替尼、伊立替康、拓扑替康、紫杉醇、多西他赛、拉帕替尼、赫赛汀、拉帕替尼、它莫西芬、甾体芳香酶抑制剂、非甾体芳香酶抑制剂、氟维司群、表皮生长因子受体(egfr)抑制剂、西妥昔单抗、帕尼单抗、类胰岛素生长因子1受体(igf1r)抑制剂和cp-751871所组成的组。

在一个实施例中，抗肿瘤剂是化疗剂。本文所用的化疗剂是在治疗癌症中有效的化合物。化疗剂的实例包括烷基化试剂，例如噻替派和环磷酰胺(癌得星)；烷基磺酸盐，例如白消安，英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶类，例如苯佐替哌，卡波醌，美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa)；乙烯亚胺和甲基蜜胺(methylamelamines)包括六甲蜜胺，三乙撑蜜胺，三乙烯磷酸胺，三乙烯硫代磷酰胺和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；多聚乙酰类(尤其是布拉它辛和布拉它辛酮(bullatacinone))；δ-9-四氢大麻酚(屈大麻酚，marinol)；β-拉帕锟；拉帕醇，秋水仙碱，桦木酸；喜树碱(包括合成类似物拓扑替康(hycamtin)，cpt-11(伊立替康，camptosar)，乙酰喜树碱(acetylcamptothecin)，莨菪亭(scopolectin)和9-氨基喜树碱(aminocamptothecin))；藓苔抑制素；多烯酮(callystatin)；cc-1065(包括其阿多来新，卡折来新和比折来新合成类似物)；足叶草毒素；足叶草酸(podophyllinicacid)；替尼泊苷；念珠藻素(cryptophycin)(特别是念珠藻素1(cryptophycin1)和念珠藻素8(cryptophycin8))；多拉司他汀；倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成类似物，kw-2189和cb1-tm1)；软珊瑚醇(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；sarcodictyum；海绵抑制素(spongistain)；氮芥例如瘤可宁、萘氮芥、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀、异环磷酰胺、二氯甲基二乙胺、盐酸氧氮芥、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、松龙苯芥(prednimustine)、曲磷胺、乌拉莫司丁；亚硝基脲类例如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素类，例如烯二炔类抗生素(例如卡奇霉素，尤其是卡奇霉素γ1和卡奇霉素ω1(参见例如发表在agnew,chemintl.ed.engl.，33：183-186(1994)的报道)；达内霉素(dynemicin)，包括达内霉素a；埃斯佩拉霉素；新制癌菌素发色团和相关有色蛋白烯二炔类抗生素发色团)，阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素、安曲霉素、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素c(cactinomycin)、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素、嗜癌素、色霉素、放线菌素d、柔红霉素、地托比星、6-重氮-5-氧代-l-正亮氨酸、阿霉素(包括adriamycin、吗啉代阿霉素、氰基吗啉代阿霉素，2-吡咯啉-阿霉素、阿霉素hcl脂质体注射(doxil)、脂质体阿霉素tlcd-99(myocet)、聚乙二醇化(peglylated)脂质体阿霉素(caelyx)和脱氧阿霉素)、表柔比星、依索比星、依达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素类例如丝裂霉素c、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链脲霉素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢物，例如甲氨蝶呤、吉西他滨(gemzar)、替加氟(uftoral)、卡培他滨(xeloda)、埃博霉素和5-氟尿嘧啶(5-fu)；叶酸类似物，例如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，例如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫代鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如安息他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷；抗肾上腺药，例如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，例如亚叶酸、醋葡醛内酯、醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；思尿嘧啶；安吖啶；比曲比新(bestrabucil)；比生群；依达曲沙(edatraxate)；地佛法明(defofamine)；秋水仙胺；地吖醌；依氟鸟氨酸(elfornithine)；依利醋铵(elliptiniumacetate)；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明(lonidainine)；美登素类例如美登素和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；2-乙肼(2-ethylhydrazide)；甲基苄肼；psk多糖复合物(jhs天然产品，eugene，oreg.)；雷佐生；根霉素；西佐喃；螺旋锗；细交链孢菌酮酸(tenuazoinicacid)；三乙撑亚胺苯醌(triaziquone)；2,2’,2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯族毒素(尤其是t-2毒素、疣孢菌素a(verracurina)，杆孢菌素a和蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦；达卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；加西托新(gacytosine)；阿拉伯糖苷(ara-c)；噻替派；紫杉烷，例如紫杉醇(taxol)、紫杉醇白蛋白工程纳米颗粒制剂(abraxane)和多西他赛(taxotere)；苯丁酸氮芥；6-硫鸟嘌呤；6-巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类药物，例如顺铂、奥沙利铂和卡铂；能够阻止微管蛋白聚合形成微管的长春花，包括长春花碱(velban)，长春新碱(oncovin)，去乙酰长春酰胺(eldisine，fildesin)和长春瑞滨(navelbine)；依托泊苷(vp-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；亚叶酸(leucovovin)；诺消灵；依达曲沙；道诺霉素；氨喋呤；伊班膦酸盐；拓扑异构酶抑制剂rfs2000；二氟甲基鸟氨酸(dfmo)；类维生素a，例如视黄酸，包括贝沙罗汀(targretin)；二膦酸盐，例如氯膦酸盐(例如，骨膦或者氯屈瞵酸)，依膦(依替膦酸钠双膦酸盐)、ne-58095、唑来膦酸/唑来膦酸二钠新型二膦酸盐制剂(择泰)、阿仑唑奈(福善美)、氨羟二磷酸二钠(阿可达)、二膦酸盐(替鲁膦酸钠片)或者利塞膦酸盐(利塞膦酸盐)；曲沙他滨(a1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，尤其是那些能够阻止牵涉到畸形细胞增殖信号通路中的基因表达的，例如，pkc-α，raf，h-ras，和表皮生长因子受体(egf-r)；疫苗，例如theratope.rtm.疫苗和基因治疗疫苗，例如allovectin疫苗、leuvectin疫苗和vaxid疫苗；拓扑异构酶1抑制剂(例如，勒托替康)；rmrh(例如，阿巴瑞克)；bay439006(索拉非尼；拜耳)；su-11248(辉瑞)；哌立福辛，cox-2抑制剂(例如，塞来考昔和依托考昔)，蛋白体抑制剂(比如，ps341)；硼替佐米(velcade)；cci-779；替吡法尼(r11577)；索拉非尼,abt510；bcl-2抑制剂，例如反义核苷酸钠(genasense)；匹克生琼；egfr抑制剂；酪氨酸激酶抑制剂；和药物学可接受的盐，酸或者以上任何一种的衍生物；一起以上两种或者多种的组合，例如chop，环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和泼尼松龙的混合疗法的缩写，和folfox，奥沙利铂(eloxatin)联合5-fu和亚叶酸治疗方案的缩写。

本文描述的这些方法绝不是全部包括的，并且适合于具体应用的其它方法对于普通技术人员是显而易见的。此外，组合物的有效量可以通过类似于已知发挥所需效果的化合物进一步近似。

示例性实施例

通过参考以下示例性实施例进一步详细描述本发明。提供这些实施例仅仅是为了说明的目的，并且不旨在是限制性的，除非另有规定。因此，本发明决不应被解释为限于以下实施例，而是应被解释为包括作为本文提供的教导的结果变得显而易见的任何和所有的变化。

无需进一步描述，相信本领域普通技术人员可以使用前述说明和以下说明性实施例来制造和利用本发明并实践要求保护的方法。因此，以下实施例具体指出了本发明的优选实施方案，并且不应被解释为以任何方式限制本公开的其余部分。

实施例1：冷冻保存的、预活化的、多剂量的树突状细胞疫苗

为了能够生产这些大规模疫苗，开发了使用肿瘤抗原脉冲的完全激活的dc1疫苗的生产过程，由此将完全激活的dc1疫苗冷冻保存为多剂量的注射器即用的6包装dc1疫苗。dc1如本文别处所述的那样被冷冻保存和激活。例如，它们在具有40％人血清白蛋白和5％dmso的55％勃脉力培养基中冷冻保存。这些疫苗已经生成并在实验室中广泛测试，并且始终满足由fda设定的向患者施用的质量标准。

现在描述本文公开的实验和实施例中使用的材料和方法。

制备用于冷冻保存的完全激活的树突状细胞

新鲜淘洗的骨髓单核细胞在6孔微量培养板(12×10⁶个细胞/孔)中培养。培养基由无血清培养基(sfminvitrogencarlsbadca)组成。加入的gmcsf的终浓度为50ng/ml，加入的il4的终浓度为1000u/ml。将细胞在37℃，5％co2中培养过夜。在一些批次中，在16-20小时后用适当的肽脉冲细胞，并再培养6-8小时，之后加入1000u/ml的ifn-γ。用tlr激动剂lps(tlr4,10ng/ml)或r848(tlr8,1μg/ml)使树突状细胞成熟。成熟期为至少约6小时。之后，tlr激动剂激活的树突状细胞已经准备好用于冷冻保存或立即使用。

为了诱导th1极化细胞因子il-12的产生，用细胞因子ifn-γ或tlr激动剂细菌lps和/或r848的组合激活树突状细胞。这应该是产生ifn-γ的诱导的t细胞。可选地，树突状细胞可以用atp，细菌lta，lps和前列腺素e2(pge2)的组合激活。这可以导致il-23，il-6和il-1β被扩增，引起由分泌il-17和il-22的th17细胞支配的免疫应答。

树突状细胞的低温贮藏

通过温和刮擦收获树突状细胞。所有培养基和细胞一直保持在湿冰中。通过约800rpm离心10分钟轻轻洗涤细胞。将细胞(例如，10×10⁶个细胞)冷冻保存在含55％的勃脉力，5％dmso和40％的人血清白蛋白的冷冻培养基中并储存在液氮中。

现在描述本文提供的实验的结果。

多剂量的dc1疫苗

进行实验以评估细胞的复苏，生活力和无菌性。简言之，通过组合的白细胞提取逆流淘析获得外周血单核细胞，并将其在含有gm-csf和il-4的无血清培养基中培养过夜。第二天，它们用her-2肽，然后用ifn-γ，随后用lps脉冲。在40小时收集dc1，并在含55％的勃脉力，5％dmso和40％的人血清白蛋白的冷冻培养基中冷冻保存，并储存在液氮中。1周后，解冻并通过检测包括生活力、产量、内毒素和无菌培养获得发布标准。所有12个培养物中没有细菌生长和内毒素<0.1eu。图1说明了冷冻保存的dc1的生活力和产量。如图1所示，当细胞直接解冻和计数时，细胞的复苏平均为89％，生活力为95％。这些数据表明，在低于fda允许的7.5％dmso的培养基中dc1疫苗的冷冻保存和生活力可以维持。

观察到在冷冻保存之后细胞功能维持着。多剂量dc1疫苗解冻后36小时产生il-12和th1趋化因子。解冻的细胞从解冻后约6小时至36小时产生高水平的il-12。这些il-12水平与由冷冻保存的单核细胞制备的dc1疫苗是相当的。

本文提供的结果表明，对乳腺癌上her-2肿瘤靶向抗原敏感的冷冻保存的，预活化的多剂量树突状细胞疫苗是治疗性的。然而，本发明可应用于多种其他的病理生理状况。

多剂量的注射器即用的包装dc1疫苗可用于her-2非表达性乳腺癌。her-2在所有乳腺癌的约25％中表达。不产生可检测水平的her-2的乳腺癌可能不易受接种疫苗的影响。为了解决这个限制，可以向疫苗中加入另外的靶蛋白。例如，许多不产生高水平her-2的乳腺癌产生其它相关蛋白，包括her-1和her-3。不希望受任何特定理论的束缚，人们认为将这些其它蛋白加入疫苗将允许以这些其它乳腺癌表型为靶向。

多剂量的注射器即用的包装dc1疫苗可用于除乳腺癌以外的其他癌症类型。预期的靶蛋白如her-1，her-2和her-3也可以存在于其他类型的癌症，包括卵巢癌，前列腺癌，胰腺癌，结肠直肠癌，胃癌，头颈癌和非小细胞肺癌，及其他常见癌症。

多剂量的注射器即用的包装dc1疫苗可用于治疗慢性感染性疾病，包括但不限于慢性感染如hiv或丙型肝炎病毒。这里，对这些病毒特异性的蛋白质将取代her-2或其他癌症蛋白质以调动患者对这些持续性感染的免疫应答。增强的免疫力将有可能大大降低病毒载量和伴随的疾病症状和进展，或可能有助于完全清除感染。

多剂量的注射器即用的包装dc1疫苗可用于治疗自身免疫性疾病。当免疫系统错误地攻击身体自身正常组织时，会发生类风湿性关节炎和狼疮等疾病。虽然目前的疫苗/免疫治疗制剂被设计为启动和加强免疫应答，但不希望受任何特定理论的束缚，人们相信在疫苗生产期间可以向树突状细胞提供体外信号，诱导这些细胞关闭病理性免疫应答。

实施例2：冷冻保存活化的dc1使大规模树突状细胞疫苗可用于癌症治疗

基于树突状细胞的疫苗疗法是针对多种癌症的很有前途的定向疗法。虽然已经采用多种策略使得树突状细胞成熟为一定表型，该表型优化了cd4⁺和cd8⁺t细胞对于识别肿瘤抗原决定基的和引起抗肿瘤免疫的敏化，但是仍设计实验以利用某方法，该方法使用干扰素γ(ifn-γ)、脂多糖(lps)和toll样受体(tlr)4激动剂在无血清培养基中应用了单核细胞的快速成熟方法，该方法产生成熟的树突状细胞，其能够通过il-12依赖机制引发致敏作用和使针对th1型应答的免疫应答极化。结果表明这种疫苗策略用作早期乳腺癌的辅助治疗的潜力。成熟状态下树突细胞(dc)的冷冻保存允许更容易地生产和可接近个性化治疗。

树突状细胞的快速成熟

将新鲜成熟的树突状细胞(dc1)和在成熟状态(cryodcs)冷冻保存并随后解冻的树突状细胞在细胞表面标记物表达确定的表型成熟度、生活力和复苏方面通过流式细胞术进行比较。通过测量各种细胞因子，特别是白介素12p70(il-12p70)的产量来测定树突状细胞的功能。还评估了这些细胞刺激原始cd4⁺和cd8⁺细胞的能力。

在生活力(p＝0.4807)和复苏(p＝.1220)方面没有显著差异(图2)。

两个种群具有相似的初始(lps加入后7小时)il-12p70分泌(p＝.0768)。在30小时观察期内，种群继续表现出相当的il-12p70的分泌水平，并在种群之间没有显著差异。(图3)。

在种群和il-1β(p＝0.7690)，il-1α(p＝0.0841)，rantes(p＝0.902)，mdc(p＝0.1514)，il-10(p＝0.1937)，mip-1α(p＝0.2673)，ip-10(p＝0.7366)，il-6(p＝0.24)，il-5(p＝0.0735)，tnf-β(p＝0.9422)，il-15(p＝0.8878)，mip-1β(p＝0.9217)，tnf-α(p＝0.8972)，il-8(p＝0.7844)的产生之间没有显著差异。(图4)。

在dc1和冷冻保存的dcs之间，表示树突状细胞成熟度的细胞表面标记物在表达中没有表现出显著差异。两个种群均通过th1极化应答引起抗原特异性cd8+t细胞识别以及非特异性同种抗原cd4+t细胞应答。cd80,83和86在树突状细胞成熟度、表达方面没有显示出显著差异。使用来自每个种群共培养的不同供体的cd4+t细胞诱导功能性能力，引起非特异性同种异体抗原应答和分泌inf-γ(dc1s107.40ng/ml和冷冻保存的dc1s129.23ng/ml)的cd4⁺t细胞。两个种群与肿瘤抗原特异性cd8+t细胞共培养引发的抗原特异性敏化作用引起了两个种群的相当的ifn-γ分泌并导致th1极化反应。(图5)。

本文提供的结果表明dc1的快速成熟方法可以冷冻保存功能上的成熟和维持表型和功能，因此可以用于制造方便注射器即用的dc1以在世界范围的癌症治疗中使用。

与维持dc1表型以驱动th1极化的免疫应答相结合，本文提供的结果证明冷冻保存的dcs保持了主要致敏t细胞的能力。这也可能涉及成熟策略，因为与使用细胞因子使其成熟的树突状细胞相比，使用ifn-γ和lps使其成熟的树突状细胞显示出增强的主要致敏cd4+t细胞的能力。

涉及冷冻保存的成熟树突状细胞制剂的本方案可以容易地适应当前的良好生产实践指南，从而增加新兴疗法的可用性。

实施例3：来自cd4t细胞和赫赛汀的细胞因子使高表达her-2的乳腺细胞容易受cd8t细胞的杀伤的影响

已经证明高表达her-2的乳腺癌细胞下调细胞表面上的分子，使得这些癌细胞对cd8t细胞“可见”，并允许它们被这些免疫细胞杀死。已经显示，当与赫赛汀组合时，cd4细胞产生的细胞因子干扰素-γ(ifn-γ)和肿瘤坏死因子-α(tnf-α)引起中度表达和高表达her-2的乳腺癌细胞增加其i类分子表达。作为其结果，cd8t细胞能够更好地看到乳腺癌细胞并杀死它们或产生细胞因子以将其杀死。

设计试验以评估赫赛汀与树突状细胞疫苗(例如dc1疫苗)联合使用的治疗效果。

设计了将赫赛汀与dc1疫苗联合使用的i期dcis疫苗试验。例如，针对具有高her-2表达dcis的患者设计i期试验使其接受dc1疫苗，dc1疫苗在第1周和第4周与2剂量的赫赛汀联合使用。不希望受任何特定理论束缚，人们相信，该组合将在具有her-2表达dcis的患者中将完全应答率从30％增加至大于50％。

此外，设计了iii期dcis疫苗试验。例如，开发了一种疫苗试验以防止乳腺癌在具有雌激素非依赖性(er阴性)，her-2阳性dcis的患者中复发。在研究中有三个治疗方式：1)标准治疗(手术和放射)，2)在手术前接受dc1疫苗，和3)在手术前接受dc1疫苗加赫赛汀。不希望受任何特定理论的束缚，对治疗具有完全应答的那些患者可以避免手术后的放射。还认为该试验用于证明使用疫苗预防具有dcis的患者的复发。

此外，设计了在早期浸润性her-2阳性乳腺癌患者中赫赛汀与i期新辅助dc1疫苗的联合使用。例如，设计i期试验以测试赫赛汀和疫苗以及趋化因子调节剂(例如，趋化因子激活剂)的组合是否可以在手术前消除小的her-2表达性浸润性乳腺癌，并避免化疗的必要。不希望受任何特定理论的束缚，人们相信这种新辅助(手术前)策略，具有添加免疫抗体从而消除免疫应答阻碍的可能性，其可消除对用于治疗乳腺癌的有毒化疗的需要，因此使免疫治疗成为这种疾病的护理标准。也就是说，本文公开的治疗方案提供了在使用天然免疫应答根除乳腺癌中前进的一步，该天然免疫应答可以用本发明的疫苗方案修复。本文讨论的方案可以通过改变肿瘤中的免疫应答而将免疫细胞驱动到肿瘤中，并且通过去除细胞的限制使免疫细胞工作更长时间。人们，将dc1疫苗与赫赛汀组合并且还添加趋化因子调节剂改善乳腺中肿瘤内的免疫细胞的迁移和活性。

不希望受任何特定理论束缚，人们相信在许多癌症中，如果存在大量良好的免疫抗争细胞，那些患者在任何类型的治疗中都做得更好。这意味着，如果在肿瘤被移除之前在肿瘤中获得免疫细胞以抵抗肿瘤，那么患者可能会更好，并更好地响应其他疗法，包括手术，化疗和放射。

不希望受任何具体的限制，治疗癌症的有效疗法将包括药剂，该药剂在手术之前快速改变肿瘤中的免疫应答以改善乳腺癌和其他类型癌症患者的结果。该策略可以应用于多种癌症，包括但不限于结肠癌，黑素瘤，肺癌，脑癌，胰腺癌，前列腺癌，食道癌等。

设计实验开发免疫荧光测定，以测量和定量检测在接种疫苗后迁移到乳房中的免疫细胞的类型，产生的能引来细胞的趋化因子的类型，以及这些细胞表达的用于帮助消除癌细胞的分子。这些测定允许多个细胞类型在同一时间可视化并显示它们在肿瘤微环境中的位置。已经观察到，至少在一些接种疫苗的患者中，其肿瘤产生趋化因子将细胞募集到环境中以杀死肿瘤细胞。

实施例4：her-2和her-3的阻断的组合

本文提供的结果证明对her-2和her-3的组合阻断与抗her-2cd4th1细胞对于引起表达her-2的乳腺癌的永久肿瘤衰老是极其有效的。

观察到，her-2和her-3的组合阻断以及来自cd4th1细胞的tnf-α和ifn-γ的加入导致表达her-2的乳腺癌几乎完全衰老。这一点已经在高度表达和中度表达her-2+的乳腺癌细胞的几种不同的细胞系中证实。结果证明这种组合对预防和预防复发有功效。

现在描述这些实验中使用的材料和方法。

细胞培养和处理

从美国典型培养物保藏中心(manassas，va)获得人类乳腺癌细胞系sk-br-3，bt-474，mcf-7，t-47d，hcc-1419和mda-mb-231，这些人类乳腺癌细胞系在补充有10％fbs(cellgro，herndon，va)的rpmi-1640(lifetechnologies，grandisland，ny)中生长。jimt-1细胞获自俄亥俄州立大学(俄亥俄州，哥伦布)，并在相同的完全培养基中生长。从karmanoscancerinstitute(detroit，mi)获得正常无限增殖化mcf-10细胞，其在补充有10mmhepes，10μg/ml胰岛素，20ng/mlegf，100ng/ml霍乱毒素，30mm碳酸氢钠，0.5μg/ml氢化可的松和5％胎马血清的rpmi-1640中生长。所有细胞在37℃，湿润的5％co2培养箱中生长。

将30万个乳腺癌细胞用指定浓度的人重组tnf-α(r&dsystems，明尼阿波利斯，mn)和人重组ifn-γ(r&dsystems)处理5天，然后在不存在细胞因子的条件下培养两代以上。将细胞进行衰老相关的β-半乳糖苷酶(sa-β-gal)检测或裂解，并进行p15ink4b和p16ink4a的蛋白质印迹分析。

在一些情况下，将细胞用10ug/ml的曲妥珠单抗和帕妥珠单抗(基因科技，旧金山，加利福尼亚州)处理指定的时间。将该处理与细胞因子或与人重组调节蛋白(r&dsystems)组合。

在transwell系统(bd生物科学，圣何塞，加利福尼亚州)的下面的腔室中培养相同量的细胞，与之共同培养的是上面腔室中的10x10⁵个人类cd4⁺t细胞和10⁵个成熟(即1型极化)或未成熟的人树突状细胞。树突状细胞和cd4⁺t细胞获自选择的试验受试者(sharmaetal.,2012cancer118:4354-4362)。在37℃下用来自ii类的her2或对照无关(braf和存活)肽(20μg/ml)将成熟和未成熟的树突状细胞脉冲5天。对照孔仅含有cd4⁺t细胞。此外，将0.5×10⁵个细胞在树突状细胞/cd4⁺t细胞共培养上清液存在的条件下在37℃下孵育5天。在两种方法中，然后在不存在细胞因子的情况下将细胞培养2代以上，并进行衰老研究(sa-β-gal活性在ph6和p15ink4b和p16ink4a蛋白质印迹)或凋亡研究(裂解的半胱天冬酶-3蛋白质印迹)。在与树突状细胞和cd4⁺t细胞的共培养物孵育之前的60分钟，将以下抗体加入细胞，以中和th1涉及的细胞因子：多克隆山羊igg抗人tnf-α(0.06μg/ml每0.75ng/ml的tnfα)和ifn-γ(0.3μg/ml每5ng/ml的ifn-γ)和山羊igg同种型作为相应的阴性对照(均来自r&dsystems)。

质粒转染

用2μg的野生型her2表达载体(pcdnaher2)瞬时转染mda-mb-231细胞48小时。作为对照，用2μg空载体(pcdna3)转染细胞。两种载体都由markgreene博士(宾夕法尼亚大学，费城，宾夕法尼亚州)友情提供。在不含抗生素的完全培养基中用turbofect(thermoscientific，waltham，ma)转染细胞。转染后48小时通过蛋白质印迹评价转染效率。

rna干扰(rnai)转染

小干扰rna(sirna)smart库：靶向加her2sirnasmart库，靶向加her3sirnasmart库；靶向加非靶向库均购自dharmacon-thermoscientific。使用以下靶序列：her2:uggaagagaucacagguua(seqidno.1),gagacccgcugaacaauac(seqidno.2),ggaggaaugccgaguacug(seqidno.3),gcucaucgcucacaaccaa(seqidno.4)；her3:gcgaugcugagaaccaaua(seqidno.5),agauugugcucacgggaca(seqidno.6),gcaguggauucgagaagug(seqidno.7),ucgucauguugaacuaua(seqidno.8)；非靶向的:ugguuuacaugucgacuaa,ugguuuacauguuguguga,ugguuuacauguuuucuga(seqidno.9),ugguuuacauguuuuccua(seqidno.10)。使用rnaimax脂质体(美国生命技术公司)在无血清培养基中将sirna序列(25nm)转染三十万个细胞，并且在1小时后，在培养基中补充10％fbs。16小时后，对细胞进行48小时的血清饥饿，接着进行各种指定的处理和蛋白质印迹以检查表达水平。

sa-β-gal在ph6的活性

将细胞在pbs中洗涤两次，固定在3％甲醛中，并再次在pbs中洗涤。根据制造商的说明书，将细胞与染色溶液在37℃(无co2)孵育过夜，所述染色溶液是来自millipore(billerica，ma)的新鲜制备的与衰老相关的酸性β-半乳糖苷酶(sa-β-gal)染色溶液。

蛋白质印迹分析

从mcf-10a，sk-br-3和mcf-7，t-47d或mda-mb-231细胞制备裂解物。将细胞在含有50mmtris(ph7.4)，150mmnacl，1mmedta，1mmegta，10％甘油，70％tergitol，0.1％sds，1mmmgcl2和蛋白酶抑制剂混合物(sigma-aldrichst.louis，mo)的缓冲液中裂解。裂解物在4℃以12,000×g离心15分钟。将蛋白质溶解在样品缓冲液(lifetechnologies)中并进行sds-page。将蛋白质电印迹到pvdf上。用以下抗体对膜进行免疫印迹：全半胱天冬酶来自圣克鲁兹生物技术公司(santacruz，ca)的p15ink4b(k-18)，p16ink4a(50.1)，ifn-γrα(c-20)，her3(c-17)；来自sigma-aldrich的黏着斑蛋白(v9131)；来自细胞信号技术(danvers，ma)的her2(29d8)，裂解的半胱天冬酶-3(8g10)和tnf-r1(c25c1)。洗涤后，将膜与hrp缀合的第二抗体(bio-rad，hercules，ca)孵育。通过使用增强化学发光(ecl)蛋白质印迹检测系统蛋白质印迹分析来观察条带。

细胞死亡的流式细胞术分析

sk-br-3细胞未处理，用ifn-γ(100u/ml)和tnf-α(10ng/ml)处理，用曲妥单抗(10μg/ml)和帕妥珠单抗(10μg/ml)处理，或用ifn-γ，tnf-α，曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的联合处理24小时。孵育后，根据制造商的说明书，使用fitc-膜联蛋白v凋亡检测试剂盒(bd生物科学)测定诱导凋亡。简言之，收集未处理和处理的skbr-3细胞，用pbs洗涤并以1×10⁶个细胞/ml的浓度重悬于膜联蛋白v结合缓冲液中。将100μl细胞悬浮液与5μlpi和5μlfitc-膜联蛋白v在室温下在黑暗中一起孵育15分钟。孵育后，加入150μl膜联蛋白v结合缓冲液，并使用bdaccuric6流式细胞术(bd生物科学)分析诱导凋亡，并用cflowplus软件分析数据。将经uv照射的细胞用作阳性对照。

肿瘤发生研究

对于异种移植实验，将sk-br-3(在200μlpbs中的2×10⁶个细胞/小鼠)注射到6周龄雌性oathymic(裸)小鼠(foxnnu，harlamlaboratories，5只小鼠/组)的胁腹中。当肿瘤可触知时时，用曲妥珠单抗和帕妥珠单抗(30ug/kg)皮下处理动物，然后每周两次用hrtnf-α和hrifn-γ(10ng/kg)对动物进行皮下注射。通过触诊监测肿瘤形成，并用卡尺每周两次测定肿瘤体积(mm³)：宽度2×长度/2。所有动物实验均按照机构指南进行。

现在描述试验结果。

th1细胞因子tnf-α和ifn-γ协同诱导乳腺癌细胞中的衰老

sk-br-3细胞与人类重组肿瘤坏死因子α(tnf-α)和干扰素γ(ifn-γ)单独的或组合的在37℃下孵育5天以研究免疫系统细胞产生的细胞因子是否可以诱导肿瘤细胞的特异性衰老应答。然后将细胞再培养2代以上并进行衰老研究。两种细胞因子的组合引起sk-br-3细胞的衰老诱导，这通过与衰老相关的酸性β-半乳糖苷酶(sa-β-gal)染色的增加(图6a)和衰老相关标记物p15ink4b和p16ink4a的更高表达(图6b)得以证明，其通过与蛋白质印迹检测对照未处理细胞或每种细胞因子单独使用的结果相比较获得。在bt-474，mcf-7和t-47d乳腺癌细胞系(数据未显示)中观察到了相似的结果。因此，用10-100ng/ml的几种浓度的tnf-α和100-1000u/ml的几种浓度的ifn-γ或其组合来处理t-47d细胞。观察到衰老表型的诱导是剂量依赖性的(图6c)。在sk-br-3，bt-474和mcf-7细胞中发现类似的结果。

乳腺癌细胞中的her2表达水平与诱导衰老所需的th1细胞因子tnf-α和ifn-γ剂量之间的逆相关

设计试验以确定her2表达水平是否在衰老中起作用，所述衰老是通过用tnf-α和ifn-γ在37℃下处理5天，随后没有细胞因子的sk-br-3，bt-474，mcf-7，t-47d和mda-mb-231乳腺癌细胞传代2次以上的方式诱导的，事实上，与具有更高细胞因子浓度的、中度表达her2的细胞系(t-47d，图6d和mcf-7，数据未显示)相比，在具有较低剂量的tnf-α和ifn–γ的、高度表达her2的细胞系(sk-br-3，图6d和bt-474，数据未显示)中sa-β-gal阳性细胞增加。然而，即使最高浓度的tnf-α和ifn-γ也不能在低her2的表达细胞系mda-mb-231中诱导衰老(图6d)。这些结果清楚地证明了tnf-α和ifn-γ诱导衰老和her2表达水平之间的相关性。

mda-mb-231乳腺癌细胞中，her2是th1细胞因子tnf-α和ifn-γ介导的衰老和凋亡所必需的

仅当用野生型her2质粒(pcdnaher2)稳定转染mda-mb-231细胞并用高浓度的tnf-α(200ng/ml)和ifn-γ(2000u/ml)在37℃下处理5天，然后在不存在细胞因子的情况下再传代2次以上时，sa-β-gal阳性细胞(图7a)和p15ink4b表达(图7b)有强烈增加。值得注意的是，由于发现当用最高浓度的tnf-α和ifn-γ培养her2-mda-mb-231细胞时，不仅存在相对更高的蓝色衰老细胞，而且细胞量显著更少的，因此重复实验，并对细胞进行蛋白质印迹以检测活性半胱天冬酶-3(图7b)。在上述相同条件下组合使用浓度渐增的tnf-α(75至200ng/ml)和ifn-γ(750至2000u/ml)处理用对照空载体(pcdna3)转染的细胞，通过sa-β-gal染色(图7a)或p15ink4b和裂解的半胱天冬酶3表达(图7b)评估衰老诱导，该处理对衰老诱导没有影响。这一发现强化了在乳腺癌细胞中，her2在诱导衰老和凋亡的tnf-α和ifn-γ机制中是必需的。

细胞因子受体在乳腺细胞系中以相似的水平表达

就像低her2正常无限增殖化mcf-10乳腺细胞系那样，高her2表达细胞系sk-br-3和bt-474，中度her2表达细胞系mcf-7和t-47d和低表达her2的mda-mb-231乳腺癌细胞系，通过蛋白质印迹分析显示出相似的ifn-γ和tnf-α受体表达(图12)。该结果证明这两种细胞因子受体的表达水平与her2表达水平无关。这与描述这些细胞因子在正常乳腺不同阶段行动的报告相一致。tnf-α已经涉及正常乳腺的增殖，发育和分支形态发生(lee等人，2000endocrinology141：3764-3773)。受体tnfr1的表达介导了诱导tnf-α的乳腺上皮细胞增殖，并且tnfr2的激活诱导了酪蛋白积聚(varelaetal.,1996endocrinology137:4915–4924)。类似地，ifn-γ的活性形式与其在几乎所有正常细胞表面上表达的受体相互作用(ealicketal.,1991science252:698–702；farraretal.,1993annu.rev.immunol.11:571–611)。

组合的her2和her3阻断表达增强了乳腺癌细胞中的th1细胞因子tnf-α和ifn-γ衰老诱导。

先前的结果引起了对用sirna敲低her2和her3的效果的研究，在先前的结果中显示用细胞因子组合处理的高her2表达和中等her2表达细胞系中衰老和凋亡表型增强了。通过几个研究(lee-hoeflichetal.,2008cancerres.14:5878-87；berghoffetal.,2014breast14:s0960-9776)证明了在乳腺癌中阻断her2/her3信号传导的治疗益处。尽管her-3耗尽的细胞中tnf-α和ifn-γ的联合治疗没有增加衰老或凋亡细胞的数量，但是用her2和her3sirna的双重敲低大大增加了sk-br-3细胞中的p15ink4b表达水平(图8b)和sa-β-gal染色水平(图8a)。同时，通过活性半胱天冬酶-3的蛋白质印迹，观察到用双敲低和细胞因子处理的细胞的凋亡诱导更高(图8a)。在mcf-7细胞(图13)，bt-474和t47d细胞中发现类似的结果。

组合的her2抑制和her2-her3二聚化抑制增强了sk-br-3乳腺癌细胞中的th1细胞因子tnf-α和ifn-γ衰老诱导和凋亡

曲妥单抗和帕妥珠单抗是在临床中广泛用于治疗her2阳性乳腺癌的抗体。为了在直移方法中研究th1细胞因子诱导的衰老和细胞凋亡，设计实验以用曲妥单抗和帕妥珠单抗预处理sk-br-3细胞，然后在37℃用tnf-α和ifn-γ处理细胞5天，然后在不加细胞因子和抗体的条件下再多传2代。观察到，与仅用细胞因子处理的细胞相比，接受完全治疗的细胞中蓝细胞的量高度增加，如通过sa-β-gal染色(图9a)和通过蛋白质印迹增强的p15ink4b表达(图9b)所示。有趣的是，通过蛋白质印迹(图9b)显示的增加的活性半胱氨酸蛋白酶3表达和通过流式细胞术分析(图9c)显示的增加量的膜联蛋白v和碘化丙锭阳性细胞，表明双重处理也对凋亡诱导具有显著影响。

cd4⁺th1介导的her2过表达人乳腺癌细胞的衰老和凋亡

设计实验使用transwell培养系统将her2ii型肽引发的cd4⁺t细胞与sk-br-3乳腺癌细胞共培养，以证实免疫系统细胞在体内产生的细胞因子也可诱导肿瘤细胞中的特异性衰老和凋亡反应。将细胞在37℃下共培养5天，然后在不含免疫系统细胞的完全培养基中再培养2代以上。共培养导致sk-br-3细胞的衰老和凋亡，其通过sa-β-gal染色的增加量(图10a)和通过蛋白质印迹检测的p15ink4b和裂解的半胱天冬酶3的表达增加(图10b)来证明。用未成熟树突细胞(dcs)或成熟树突状细胞加上不相关ii类(braf或存活)肽引发的cd4⁺t细胞不能诱导sk-br-3细胞的衰老，也不能诱导sk-br-3细胞的凋亡(图10)。

在transwell中存在曲妥单抗和帕妥珠单抗时，当我们将sk-br-3与her2ii型肽引发的cd4+t细胞共培养时，观察到的衰老和细胞凋亡在sk-br-3中高度增强。该结果通过增加的sa-β-gal染色(图10a)、和p15ink4b和裂解的半胱天冬酶3的表达水平(图10b)得到清楚地证实。

作为另一种方法，sk-br-3细胞与来自cd4⁺t细胞-成熟树突状细胞的共培养物上清液进行共培养，并观察到类似的特异性衰老反应。从cd4⁺t细胞-成熟树突状细胞的共培养上清液中获得的th1-精制的细胞因子ifn-γ和tnf-α通过先前使用elisa得到了证实。通过两种实验方法，sk-br-3衰老和凋亡可以通过中和阻断抗体的ifn-γ和tnf-α而获得部分解救(图14)。

还观察到，两种方法中该效应是剂量依赖性的，因为随着免疫系统细胞数量的增加诱导了sk-br-3细胞中更高的sa-β-gal染色，p15ink4b和裂解的半胱天冬酶3更高的表达水平。

th1细胞因子tnf-α和ifn-γ使曲妥单抗和帕妥珠单抗抗性乳腺癌细胞对衰老和凋亡诱导敏感

为了继续解开th1细胞因子可以诱导衰老和细胞凋亡的机制，人们认为tnf-α和ifn-γ可以恢复乳腺癌抗性细胞对曲妥单抗和帕妥珠单抗的敏感性。观察到与t-47d敏感细胞相反(图16)，用曲妥单抗和帕妥珠单抗的治疗不能防止两种抗性细胞系hcc-1419(o'brienetal.,2010molcancerther.6:1489-502)和jimt-1(o'brienetal.,2010molcancerther.6:1489-502；tanneretal.,2004molcancerther.12:1585-92)中akt的激活。

在hcc-1419和jimt-1细胞中以剂量依赖性的方式，使用tnf-α和ifn-γ的治疗诱导衰老和凋亡。当用曲妥单抗和帕妥珠单抗治疗细胞时，即使在较高剂量下也不能证明衰老和细胞凋亡(数据未显示)(图11)。然而，通过h1549细胞中的sa-β-gal测定(图11a，11c)和p15ink4b(图11b，11d)表达的增加显示了使用细胞因子和抗体的双重处理诱导衰老。此外，细胞因子和抗体的组合有效地诱导hcc-1419和jimt-1细胞中的细胞死亡(图11b，11d)。该结果证明th1细胞因子ifn-γ和tnf-α可以逆转对广泛影响癌症患者的治疗剂的抗性。

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