本发明通过韩国保健福祉部的支援下的课题编号1420030实现，上述课题的研究管理专门机关为癌症征服推进研究开发事业团，研究事业名称为”癌症征服推进研究开发事业”，研究课题名称为“在大肠癌患者中克服西妥昔单抗(cetuximab)抵抗性的新型治疗法开发及生物标志物发掘”，主管机关为首尔峨山医院，研究期间为2014.05.01～2017.04.30。本发明通过韩国保健福祉部的支援下的课题编号hi06c0868实现，上述课题的研究管理专门机关为韩国保健产业振兴源，韩国保健产业振兴源，研究事业名称为“先导型特性化研究事业”，研究课题名称为“将受体酪氨酸激酶(rtk，receptortyrosinekinase)作为靶的革新抗癌剂开发”，主管机关为首尔峨山医院先导型癌症研究事业团，研究期间为2011.12.01～2016.11.30。本发明涉及与表皮生长因子受体-靶制剂有关的感受性预测用新型生物标志物及其的用途。
背景技术：
：通常，当在抗癌疗法中给药抗癌剂时的生物体的反应性大大地依赖于被成为药剂的靶的癌细胞的与该药剂有关的感受性。这种癌细胞的与药剂有关的感受性根据癌细胞大不同。这种感受性的差异源于该药剂的靶分子或与此相关的因子的量或质的差异或药剂耐性的获得等。将这种背景作为根据，在成为靶的癌细胞对药剂呈现感受性的情况下，若可确认特异性地呈现的癌细胞的遗传性变化，则在早期可实现药剂的效果判定、治疗法的确立、新的治疗法的选择等，从而非常有利。众所周知，在v-ki-ras2kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(kras,)、小鼠成神经细胞瘤ras病毒(v-ras)癌基因同源物(nras)或v-raf小鼠肉瘤病毒致癌基因同源物b1(braf)基因中的变异导致产生在肿瘤细胞具有变形的信号特征的蛋白质，这种变异与将上皮生长因子受体作为靶的治疗抗体的未成功的结果相关，例如，在利用西妥昔单抗(cetuximab)或帕尼单抗(panitumumab)的癌症治疗中未成功的结果相关(amado，wolfetal.2008；karapetis，khambata-fordetal.2008；dinicolantonio，martinietal.2008；loupakis，ruzzoetal.2009；lievre，bachetetal.2006)。但是，在具有不是这种变异的v-ki-ras2kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物、小鼠成神经细胞瘤ras病毒(v-ras)癌基因同源物或v-raf小鼠肉瘤病毒致癌基因同源物b1(braf)野生型基因型的癌症患者的情况下，如西妥昔单抗(cetuximab)等靶抗癌制剂的抗癌效果不大的情况多。众所周知，西妥昔单抗作为重组抗-表皮生长因子受体人/鼠嵌合单克隆抗体(moab)，针对于抗体-依赖性细胞毒性化学疗法及放射线疗法使肿瘤细胞敏感(grahamj，etal.，natrevdrugdiscov.jul2004；3(7)：549-50.；kimurah，etal.，cancersci.aug2007；98(8)：1275-80.；kuraij，etal.，clincancerres.mar12007；13(5)：1552-61.；dittmannk，etal.，radiotheroncol.aug2005；76(2)：157-61.)。因为具有这种优点，所以作为单独疗法或化学疗法和/或与放射线疗法的并行疗法利用西妥昔单抗的临床性优点在头部和颈部癌及转移性结肠癌中得到过证明(marshallj.etal.,cancer.sep152006；107(6)：1207-18)。另一方面，ron(recepteurd＇originenantais)作为属于间质表皮转化因子(c-met)类的蛋白质受体，在肝脏中分泌，是调节巨噬细胞的作用的血清蛋白质巨噬细胞刺激蛋白(msp，macrophage-stimulatingprotein)的受体。(zhouyq，hec，chenyq，wangd，wangmh：alteredexpressionoftheronreceptortyrosinekinaseinprimaryhumancolorectaladenocarcinomas：generationofdifferentsplicingronvariantsandtheironcogenicpotential.oncogene2003，22(2)：186-197)。ron的表达在乳腺癌及大肠直肠癌中，非正常地得到调节，尤其与大肠直肠癌的转移密切相关。例如，随着报告与ron相结合的单克隆抗体imc-41a10抑制细胞转移和肿瘤形成，ron抑制剂可对抗癌及癌症转移呈现卓越的功效。即，这种抗癌剂对耐性和毒性个体差异大，在相同的患者中，还在约半数以上中存在呈现耐性的问题，因此利用适合的治疗反应性标志物的筛选可导致抗癌剂治疗的划时代进步。对此，近来，持续地活跃展开与基于特定基因的个别抗癌剂的治疗反应性相关的研究。但是，当前，由于与特定药剂有关的生物体反应有关要素的复合作用、治疗剂及给药方式的多样性及难以确保广泛的试样，因而令人瞩目的成果还是微弱。技术实现要素：技术问题在这种状况下，本发明人为了开发在大肠癌中，可预测与作为抗癌剂的表皮生长因子受体-靶制剂有关的感受性的方法，利用用于预测作为表皮生长因子受体-靶制剂中之一的西妥昔单抗的、在大肠癌中的感受性的生物标志物，来分析ron基因和/或蛋白质的活性形态，其结果，确认在大肠癌细胞中，随着ron基因和/或蛋白质的活性形态，对作为与表皮生长因子受体-转录活性(反式激活作用(transactivation))-相关的基因的adam金属蛋白酶结构域11(adam11)、adam金属蛋白酶结构域32(adam32)、frizzled家族受体4(fzd4)、g蛋白偶联雌激素受体(gper)及g蛋白偶联受体101(gpr101)基因产生影响，来由作为表皮生长因子受体-靶制剂的西妥昔单抗的药物感受性引起的细胞凋亡程度不同，从而完成了本发明。解决问题的方案因此，本发明的目的在于，提供与表皮生长因子受体-靶制剂有关的感受性预测用生物标志物。并且，本发明的再一目的在于，提供与表皮生长因子受体-靶制剂有关的感受性预测用组合物。并且，本发明的另一目的在于，提供与表皮生长因子受体-靶制剂有关的感受性预测用组合物并且，本发明的还一目的在于，提供与表皮生长因子受体-靶制剂有关的感受性预测用试剂盒。并且，本发明的又一目的在于，提供与表皮生长因子受体-靶制剂有关的感受性增进剂。并且，本发明的又一目的在于，提供与表皮生长因子受体-靶制剂有关的感受性预测方法。并且，本发明的又一目的在于，提供包含与表皮生长因子受体-靶制剂有关的感受性增进剂及表皮生长因子受体-靶制剂作为有效成分的癌症的预防或治疗用药学组合物。并且，本发明的又一目的在于，提供与表皮生长因子受体-靶制剂有关的感受性增进方法，包括将与表皮生长因子受体-靶制剂有关的感受性增进剂及表皮生长因子受体-靶制剂共同给药到对象中的步骤。发明的效果若利用本发明的与表皮生长因子受体-靶制剂有关的感受性预测用生物标志物，则可针对于各个患者的上述感受性在治疗开始之前确实地进行判定，从而可实现选择治疗效果高的抗癌剂。并且，可回避未取得效果的抗癌剂的使用，因此可回避不必要的副作用。附图说明图1a示出在人类大肠癌细胞株中的ron蛋白质是否激活。图1b示出仅通过ron基因变化的基因的分析结果。图1c示出基于ron激活的与表皮生长因子受体反式激活作用相关的基因的实时聚合酶链式反应(real-timepcr)分析结果。图1d示出借助ron激活的与表皮生长因子受体反式激活作用相关的基因的逆转入聚合酶链式反应(rt-pcr)表达分析结果。图1e示出基于ron抑制的与表皮生长因子受体反式激活作用相关的基因的实时聚合酶链式反应分析结果。图1f示出基于ron激活的表皮生长因子受体蛋白质活性分析结果。图2a示出基于ron激活的表皮生长因子受体的磷酸化诱导结果。图2b示出基于ron抑制的表皮生长因子受体蛋白质的活性变化分析结果。图2c示出基于ron抑制的表皮生长因子受体配体(ligand)依赖性表皮生长因子受体活性变化分析结果。图3a示出ron蛋白质与表皮生长因子受体蛋白质之间的内源性(endogenous)细胞内结合分析结果。图3b示出ron蛋白质与表皮生长因子受体蛋白质之间的外源性(exogenous)细胞内结合分析结果。图3c示出与通过invivofulldown分析(invivofulldownassay)的ron蛋白质相结合的表皮生长因子受体蛋白质域(domain)分析结果。图3d示出与通过invitrocellfreefulldown分析(invitrocellfreefulldownassay)的ron蛋白质相结合的表皮生长因子受体蛋白质域分析结果。图3e示出与利用计算机建模(computermodeling)的表皮生长因子受体蛋白质相结合的ron蛋白质结合部位的预测分析结果。图3f示出与表皮生长因子受体蛋白质相结合的ron蛋白质的结合部位的预测分析结果。图3g示出基于与表皮生长因子受体蛋白质相结合的ron蛋白质的结合部位的表皮生长因子受体活性分析结果。图4a示出是否存在基于是否存在ron活性型蛋白质的配体依赖性表皮生长因子受体活性的分析结果。图4b示出是否存在基于是否存在ron的配体依赖性活性的配体依赖性表皮生长因子受体活性的分析结果。图5a示出通过ron活性抑制的表皮生长因子受体的活性抑制和对西妥昔单抗(cetuximab)的表皮生长因子受体活性抑制分析结果。图5b示出基于是否存在ron活性的西妥昔单抗的细胞凋亡分析结果。图5c示出抑制ron表达后基于西妥昔单抗的细胞凋亡分析结果。图5d示出抑制ron表达后基于西妥昔单抗的下位信号机制分析结果。图5e示出抑制ron活性后基于西妥昔单抗的细胞凋亡分析结果。图5f示出基于是否存在ron的活性的西妥昔单抗的细胞凋亡分析结果。图5g示出基于是否存在ron的活性的西妥昔单抗的细胞生长抑制分析结果。图5h示出在ron敲除等基因(ronknockoutisogenic)细胞株中基于西妥昔单抗的细胞凋亡分析结果。图5i示出在ron敲除等基因细胞株中基于西妥昔单抗的细胞生长抑制分析结果。图6示出在利用ron敲除等基因细胞株的体内异种移植(invivoxenograft)模型中，基于是否存在ron的西妥昔单抗的肿瘤抑制功效分析结果。图7示出在具有ron活性的细胞株中并用处理ron抗体抗癌剂和西妥昔单抗的结果。图8示出在大肠癌患者组织(得到西妥昔单抗处方的患者)中分析ron活性的结果。具体实施方式以下，对本发明进行更详细说明。根据本发明的一实施方式，本发明提供与表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor)-靶制剂有关的感受性预测用生物标志物或生物标志物组合物，包含ron(recepteurd＇originenantais，nm_002447.1)基因。本发明的最大的特征在于，将作为ron基因的活性及其的产物的活性型蛋白质利用为生物标志物，来预测与表皮生长因子受体-靶制剂有关的感受性。本发明的生物标志物可成为与作为表皮生长因子受体-靶制剂的抗癌剂有关的感受性的指标，作为与抗癌剂有关的感受性标志物的准确性及可靠度也卓越，因此可利用于癌症的发生、发展和/或转移的治疗。在本说明书中所使用的术语“感受性”是指特定药物是否对各个的患者的癌症呈现效果。在本说明书中提及感受性所使用的术语“敏感性”是指针对于相应的药物敏感地反应，来药物的功效起到作用，在本说明书中与感受性混用。在本说明书中提及感受性所使用的术语“抵抗性”是指针对于相应的药物未敏感地反应，来药物的功效不起作用。例如，上述特定药物主要是抗癌剂，在这些抗癌剂中，存在根据癌症的种类呈现效果和不呈现效果的情况。并且，众所周知，即使是认定为有效的癌症，也根据各个患者存在呈现效果的情况和不呈现效果的情况。将如上所述的对各个患者的癌症是否呈现抗癌剂效果称为抗癌剂感受性。因此，根据本发明，若可预测在治疗开始之前可期待效果的患者(反应者)和无法期待效果的患者(无反应者)，则可实现有效性和稳定性高的化学疗法。在本发明中所使用的术语“预测”使用于指称在本发明中的对象患者针对于药物或药物套件可有利地或不利地进行反应的可能性。在一实施方式中，预测与这种反应的程度相关。例如，预测涉及患者处置后，例如，在特定的治疗剂的处置和/或原发性肿瘤的手术去除和/或特定期间的化学疗法后无癌症的复发是否生存和/或那种概率。作为本发明的预测，选择与大肠癌患者相关的最适当的治疗方式，从而在确定治疗中，临床上可使用。本发明的预测是在患者的治疗处置，例如，指定的治疗性处置中有用的工具，上述指定的治疗性处置为例如，对指定的治疗剂或组合物的给药、手术性介入、化学疗法等是否有利地反应或治疗性处置后，是否患者的脏器生存。根据本发明的优选实例，本发明的生物标志物还包含选自由v-ki-ras2kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(kras，v-ki-ras2kirstenratsarcomaviraloncogenehomolog，基因文库登录号nm_033360.2)、小鼠成神经细胞瘤ras病毒(v-ras)癌基因同源物(nras，neuroblastomarasviral(v-ras)oncogenehomolog，基因文库登录号np_002515.1)、v-raf小鼠肉瘤病毒致癌基因同源物b1(braf，v-rafmurinesarcomaviraloncogenehomologb，基因文库登录号np_004324.2)、表皮生长因子受体(efgr，epidermalgrowthfactorreceptor，基因文库登录号u48722.1)、adam金属蛋白酶结构域11(adam11，adammetallopeptidasedomain11，基因文库登录号nm_002390.4)、adam金属蛋白酶结构域32(adam32，adammetallopeptidasedomain32，基因文库登录号nm_145004.5)、frizzled家族受体4(fzd4，frizzledfamilyreceptor4，基因文库登录号nm_012193.2)、g蛋白偶联雌激素受体(gper，gprotein-coupledestrogenreceptor1，nm_001505.2)及g蛋白偶联受体101(gpr101，gprotein-coupledreceptor101，基因文库登录号nm_054021.1)基因组成的组中的一种以上的基因。并且，根据本发明的优选实例，本发明的生物标志物在v-ki-ras2kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(v-ki-ras2kirstenratsarcomaviraloncogenehomolog，nm_033360.2)、小鼠成神经细胞瘤ras病毒(v-ras)癌基因同源物(neuroblastomarasviral(v-ras)oncogenehomolog，np_002515.1)或v-raf小鼠肉瘤病毒致癌基因同源物b1(v-rafmurinesarcomaviraloncogenehomologb，np_004324.2)基因为野生型的情况下，作为预测与表皮生长因子受体-靶制剂有关的感受性，在具有v-ki-ras2kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物、小鼠成神经细胞瘤ras病毒(v-ras)癌基因同源物或v-raf小鼠肉瘤病毒致癌基因同源物b1变异的癌细胞未取得所望的效果的情况下可适用。即，在本发明中利用作为本生物标志物的ron、v-ki-ras2kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物、小鼠成神经细胞瘤ras病毒(v-ras)癌基因同源物或v-raf小鼠肉瘤病毒致癌基因同源物b1基因，并且将具有v-ki-ras2kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物、小鼠成神经细胞瘤ras病毒(v-ras)癌基因同源物或v-raf小鼠肉瘤病毒致癌基因同源物b1野生型基因的癌细胞或具有癌症的客体作为对象，来确认细胞内上述基因是否以野生型存在，在上述ron基因的表达水平或其的蛋白质的表达或活性水平与正常(或野生型基因/或蛋白质的表达水平)相比，低表达或低激活的情况下，可判定为具有与表皮生长因子受体-靶制剂有关的感受性；在上述ron基因的表达水平或其的蛋白质的表达或活性水平与正常相比，高表达或高激活的情况下，可判定为具有与表皮生长因子受体-靶制剂有关的抵抗性。并且，上述adam金属蛋白酶结构域11(adammetallopeptidasedomain11，nm_002390.4)、adam金属蛋白酶结构域32(adammetallopeptidasedomain32，nm_145004.5)、frizzled家族受体4(frizzledfamilyreceptor4，nm_012193.2)、g蛋白偶联雌激素受体(gprotein-coupledestrogenreceptor1，nm_001505.2)及g蛋白偶联受体101(gprotein-coupledreceptor101，nm_054021.1)基因作为与表皮生长因子受体转录活性相关基因，根据作为本发明的生物标志物的ron基因的活性及其的产物的活性型蛋白质，诱导表达，因此可作为用于预测基于上述ron基因的与表皮生长因子受体-靶制剂有关的感受性的生物标志物包含。并且，上述表皮生长因子受体(基因文库登录号u48722.1)基因根据作为本发明的生物标志物的ron基因的活性及其的产物的活性型蛋白质诱导激活或增加激活，因此可作为用于预测基于上述ron基因的与表皮生长因子受体-靶制剂有关的感受性的生物标志物包含。根据本发明的再一实施方式，本发明提供与表皮生长因子受体-靶制剂有关的感受性预测用组合物，包含用于测定ron(recepteurd＇originenantais，基因文库登录号nm_002447.1)基因表达水平或其的蛋白质的表达或活性水平的制剂。根据本发明的优选实例，本发明的组合物还包含制剂，上述制剂用于测定选自由v-ki-ras2kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(基因文库登录号nm_033360.2)、小鼠成神经细胞瘤ras病毒(v-ras)癌基因同源物(neuroblastomarasviral(v-ras)oncogenehomolog，基因文库登录号np_002515.1)、v-raf小鼠肉瘤病毒致癌基因同源物b1(基因文库登录号np_004324.2)、表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor，基因文库登录号u48722.1)、adam金属蛋白酶结构域11(adammetallopeptidasedomain11，基因文库登录号nm_002390.4)、adam金属蛋白酶结构域32(adammetallopeptidasedomain32，基因文库登录号nm_145004.5)、frizzled家族受体4(frizzledfamilyreceptor4，基因文库登录号nm_012193.2)、g蛋白偶联雌激素受体(gprotein-coupledestrogenreceptor1，nm_001505.2)及g蛋白偶联受体101(gprotein-coupledreceptor101，基因文库登录号nm_054021.1)基因组成的一种以上的基因的表达水平或上述基因的蛋白质的表达或活性水平。并且，根据本发明的优选实例，本发明的组合物在v-ki-ras2kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(v-ki-ras2kirstenratsarcomaviraloncogenehomolog，nm_033360.2)、小鼠成神经细胞瘤ras病毒(v-ras)癌基因同源物(neuroblastomarasviral(v-ras)oncogenehomolog，np_002515.1)或v-raf小鼠肉瘤病毒致癌基因同源物b1(np_004324.2)基因为野生型的情况下，作为用于预测与表皮生长因子受体-靶制剂有关的感受性，在具有v-ki-ras2kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物、小鼠成神经细胞瘤ras病毒(v-ras)癌基因同源物或v-raf小鼠肉瘤病毒致癌基因同源物b1变异的癌细胞未取得所望的效果的情况下可适用。并且，根据本发明的优选实例，上述表皮生长因子受体-靶制剂为与选自由促肾上腺皮质激素(acth，adrenocorticotropichormone)生成肿瘤、急性淋巴细胞白血病或成淋巴细胞白血病、急性或慢性淋巴细胞白血病、急性非淋巴细胞白血病、膀胱癌、脑肿瘤、乳腺癌、宫颈癌、慢性髓细胞性白血病、淋巴瘤、子宫内膜症、食道癌、膀胱癌、尤因肉瘤(ewing’ssarcoma)、舌癌、霍普金斯淋巴瘤、卡波西肉瘤、肾癌、肝癌、肺癌、间皮瘤、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、大肠癌、阴茎癌、视网膜母细胞瘤、皮肤癌、胃癌、甲状腺癌、子宫癌、睾丸癌、肾母细胞瘤及绒膜上皮癌组成的组中的一种以上的癌症有关的治疗剂。更优选地，是促肾上腺皮质激素生成肿瘤、急性淋巴细胞白血病或成淋巴细胞白血病、急性或慢性淋巴细胞白血病、急性非淋巴细胞白血病、膀胱癌、脑肿瘤、乳腺癌、宫颈癌、慢性髓细胞性白血病、肠癌、t区淋巴瘤、子宫内膜症、食道癌、胆汁膀胱癌、尤因肉瘤(ewing’ssarcoma)、头及颈癌、舌癌、霍普金斯淋巴瘤、卡波西肉瘤、肾癌、肝癌、肺癌、间皮瘤、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、神经母细胞瘤、乳腺癌、宫颈癌、前列腺癌、胰腺癌、大肠癌、阴茎癌、视网膜母细胞瘤、皮肤癌、胃癌、甲状腺癌、子宫癌、睾丸癌、肾母细胞瘤或绒膜上皮癌，最优选地，是大肠癌。在本说明书中所使用的术语“大肠癌(coloncancer)”是指统称直肠癌、结肠癌及肛门癌。并且，本发明的表皮生长因子受体-靶制剂是指抗癌剂，在呈现抗癌效果的条件下，还可适用任意表皮生长因子受体-靶制剂，优选地，是选自由西妥昔单抗(cetuximab)、吉非替尼(gefitinib)、埃罗替尼(erlotinib)、帕尼单抗(panitumumab)、pki-166、ekb-569、hki-272(way-177820)、埃克替尼(icotinib)、布里嘉替尼(brigatinib)、阿法替尼(afatinib)、拉帕替尼(lapatinib)、卡奈替尼(canertinib)、aee788、xl647及扎克替马(zactim)组成的组中的一种以上。更有选地，是西妥昔单抗、吉非替尼(gefitinib)、埃罗替尼或帕尼单抗，进一步优选地，是西妥昔单抗、吉非替尼、埃罗替尼或帕尼单抗，最优选地，是西妥昔单抗。在本说明书中没有特别的提及的情况下，在本发明中所使用的表述“基因的表达水平或其的蛋白质的表达水平测定”是指在该试样内所要检测的对象。在本发明中，所要检测的对象为试样内该基因的信使核糖核酸和/或蛋白质。即，检测作为基因的转录产物的核糖核酸(rna)或作为基因产物的蛋白质(优选地，活性型)，从而可确认上述基因是否表达。作为核糖核酸或蛋白质的检测，通常从试样提取核糖核酸或蛋白质，来检测提取物中的核糖核酸或蛋白质而进行。这种核糖核酸或蛋白质的检测可通过免疫分析方法、杂交化反应及扩增反应，来测定，但是并不限定于此，可利用在本发明所述
技术领域：
中公知的多种技术来容易进行。并且，根据本发明的优选实例，测定上述基因表达水平的制剂包含与上述基因的信使核糖核酸进行特异性结合的反义寡核苷酸、一对引物或探针。上述用于测定信使核糖核酸是否表达的制剂选自对上述基因具有特异性的反义寡核苷酸、一对引物、探针及它们的组合组成的组中。即，核酸的检测是可通过使用对基因进行编码的核酸分子或与上述核酸分子的互补物进行杂交的一个以上的寡核苷酸引物的扩增反应来进行。例如，利用引物的信使核糖核酸的检测可使用如聚合酶链式反应(pcr)等扩增方法，来扩增基因序列后，通过本发明所属领域中公知的方法确认基因是否扩增来进行。并且，根据本发明的优选实例，用于测定上述蛋白质的表达或活性水平的制剂包含与上述蛋白质进行特异性结合的抗体、肽或核苷酸用于测定上述蛋白质的表达或活性水平的制剂是指对上述蛋白质进行特异性结合的抗体，均包含多克隆抗体单克隆抗体、重组抗体及它们的组合。上述抗体不仅包含多克隆抗体单克隆抗体、重组抗体及具有两个总长度的轻链及两个总长度的重链的完全的形态，而且均包含抗体分子的功能性片段，例如，fab、f(ab’)、f(ab’)2及fv。抗体生产而言，可利用在本发明所属领域中公知的技术来容易制备，可利用制备而在商业上销售的抗体。本发明的组合物不仅包含用于测定上述的基因是否表达的制剂，而且还可包含能够以定量或定性的方式测定抗原-抗体复合体的形成的标签、适用于免疫学分析的通常的工具、试剂等。能够以定量或定性的方式测定抗原-抗体复合体的形成的标签包含酶活性、荧光物、配体、发光物、微粒(microparticle)、氧化还原分子及放射性同位素等，但并不限定于此。可用作检测标签的酶包含β-葡萄糖醛酸酶、β-葡萄糖苷酶、β半乳糖苷酶、脲酶、过氧化物酶、碱性磷酸酶、乙酰胆碱酯酶、葡萄糖氧化酶、己糖激酶、焦磷酸化酶(gdpase)、核糖核酸酶(rnase)、葡萄糖氧化酶、荧光素酶、磷酸果糖激酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、谷草转氨酶、磷酸苯酚丙酮酸脱羧酶及β-内酰胺酶等，且并不限定于此。荧光物包含荧光素，异硫氰酸酯，罗丹明，藻红蛋白，藻青蛋白，别藻蓝蛋白，邻苯二醛及荧光胺等，但并不限定于此。作为配体包含生物素诱导体等，但并不限定于此。发光物包含吖啶酯、虫荧光素、荧光素酶等，但并不限定于此。微粒包含胶体金，着色的乳胶等，但并不限定于此。作为氧化还原分子有二茂铁、钌络合物，紫罗碱，醌、ti离子、cs离子、二酰亚胺、1，4-苯醌、氢醌、k4w(cn)8、[os(bpy)3]2+、[ru(bpy)3]2+、[mo(cn)8]4-等，但并不限定于此。放射性同位素包含3h、14c、32p、35s、36cl、51cr、57co、58co、59fe、90y、125i、131i、186re等，但并不限定于此。作为上述工具或试剂的一例，包含适合的载体、溶解剂、清洗剂、缓冲剂、稳定化剂等，但并不限定于此。在标志物物质为酶的情况下，可包含可测定酶活性的基质及反应停止剂。作为载体有可溶性载体、不溶性载体，作为可溶性载体的一例，有在本发明所属
技术领域：
中公知的生理学上接受的缓冲液，例如，有磷酸盐缓冲液(pbs)，作为不溶性载体的一例可以为聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚酯、聚丙烯腈、氟树脂、交联葡聚糖、多糖、其它纸、玻璃、金属、琼脂糖及它们的组合。本发明的组合物包含上述的生物标志物作为有效成分，为了避免本说明书的过度的复杂性，重复的内容而言，省略其记载。根据本发明的另一实施方式，本发明提供包含上述组合物的与表皮生长因子受体-靶制剂有关的感受性预测用试剂盒感受性预测用试剂盒。上述试剂盒不仅包含用于测定上述的基因的表达或上述其的蛋白质的表达或活性水平的制剂，而且可包含使用于免疫学分析的在本领域中通常所使用的工具、试剂等。作为上述工具或试剂的一例包含载体、可生成能够检测的信号的标志物物质、发色团(chromophores)、溶解剂、清洗剂、缓冲剂、稳定化剂等，但并不限定于此。在标志物物质为酶活性的情况下，可包含可测定酶活性的基质及反应停止剂。载体有包含溶性载体及不溶性载体，作为可溶性载体的一例包含在该领域中公知的在生理学上接受的缓冲液，例如磷酸盐缓冲液(pbs)，作为不溶性载体的一例，可以为聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚酯、聚丙烯腈、氟树脂、交联葡聚糖、多糖、如在乳胶镀金属的磁性微粒等高分子、其它纸、玻璃、金属、琼脂糖及它们的组合。本发明的试剂盒作为构成包含上述的生物标志物及组合物，为了避免本说明书的过度的复杂性，重复的内容而言，省略其记载。根据本发明的还一实施方式，本发明提供与对象的表皮生长因子受体-靶制剂有关的感受性增进剂或感受性增进用组合物，包含如下的抑制剂作为有效成分，上述抑制剂是指用于抑制ron(recepteurd＇originenantais，nm_002447.1)基因的表达或者抑制上述基因的蛋白质的表达或活性的抑制剂。根据本发明的优选实例，上述对象在v-ki-ras2kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(v-ki-ras2kirstenratsarcomaviraloncogenehomolog，nm_033360.2)、小鼠成神经细胞瘤ras病毒(v-ras)癌基因同源物(neuroblastomarasviral(v-ras)oncogenehomolog，np_002515.1)或v-raf小鼠肉瘤病毒致癌基因同源物b1(np_004324.2)基因为野生型的情况下，作为用于预测与表皮生长因子受体-靶制剂有关的感受性，在具有v-ki-ras2kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物、小鼠成神经细胞瘤ras病毒(v-ras)癌基因同源物或v-raf小鼠肉瘤病毒致癌基因同源物b1变异的癌细胞未取得所望的效果的情况下可适用。根据本发明，具有v-ki-ras2kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物、小鼠成神经细胞瘤ras病毒(v-ras)癌基因同源物或v-raf小鼠肉瘤病毒致癌基因同源物b1野生型基因，且作为ron基因的活性及其的产物的活性型蛋白质被表达的癌细胞与ron基因的活性及作为其的产物的活性型蛋白质不被表达的癌细胞相比，呈现基于西妥昔单抗的癌细胞的凋亡率显著降低的结果。并且，在本发明中在具有v-ki-ras2kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物、小鼠成神经细胞瘤ras病毒(v-ras)癌基因同源物或v-raf小鼠肉瘤病毒致癌基因同源物b1野生型基因，且ron基因的活性及作为其的产物的活性型蛋白质被表达的癌细胞中，抑制ron基因的表达或蛋白质的表达或活性的情况下，呈现基于西妥昔单抗的癌细胞的凋亡率显著降低的结果因此，这是与v-ki-ras2kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物、小鼠成神经细胞瘤ras病毒(v-ras)癌基因同源物或v-raf小鼠肉瘤病毒致癌基因同源物b1野生型(正常)基因的存在(正常基因的正常的表达及功能)；以及ron基因的表达抑制增进与西妥昔单抗有关的癌细胞的感受性，基于上述本发明提供与对象的表皮生长因子受体-靶制剂有关的优越的感受性增进效果。本发明的感受性增进剂或增进用组合物还可包含药学上可接受的载体。在本发明中可使用的在药学上可接受的载体可选择通常的赋形剂、崩解剂、结合剂、润滑剂、其他添加剂，例如，可选择稳定剂、润肤剂、乳化剂等而使用。例如，作为赋形剂可使用微晶纤维素、乳糖、低取代羟丙基纤维素等，作为崩解剂可使用羧甲基淀粉钠、无水磷酸氢钙等。作为结合剂可使用乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙基纤维素等，作为润滑剂可从硬脂酸镁、二氧化硅、滑石选择而使用。在本发明中，当处理表皮生长因子受体-靶制剂时，v-ki-ras2kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物、小鼠成神经细胞瘤ras病毒(v-ras)癌基因同源物或v-raf小鼠肉瘤病毒致癌基因同源物b1野生型基因的存在及ron基因的表达抑制使癌细胞的生长减少。上述ron基因的表达通过选自由与ron基因的信使核糖核酸(mrna)进行特异性结合的小干扰核糖核酸(smallinterferencerna)、短发夹核糖核酸(shorthairpinrna)、微小核糖核酸(microrna)、核酶(ribozyme)、脱氧核酶(dnazyme)、肽核酸(pna，peptidenucleicacids)、反义寡核苷酸、抗体、适体、天然提取物及化学物质组成的组中的一种以上得到抑制。更优选地，是与上述基因的信使核糖核酸进行特异性结合的反义寡核苷酸、适体、小干扰核糖核酸、短发夹核糖核酸或微小核糖核酸，最优选地，是小干扰核糖核酸或反义寡核苷酸。在本发明中所使用的术语“小干扰核糖核酸”是指作为双链的核糖核酸借助dicer切割来生成的21～25核苷酸大小的小的核糖核酸片段，与具有互补的序列的信使核糖核酸进行特异性结合来抑制表达。指与本发明的目的信使核糖核酸进行特异性结合，来抑制上述基因的表达。能够以化学或酶活性学的方式合成小干扰核糖核酸。并不特别限定小干扰核糖核酸的制备方法，可使用在本领域中公知的方法。根据本发明的优选实例，上述小干扰核糖核酸包含序列13的碱基序列。在本说明书中所使用的术语“反义寡核苷酸”作为与上述微小核糖核酸(mirna)进行互补性结合，来抑制表达的碱基序列，并不局限于此，但包含反义核糖核酸(rna)、反义脱氧核糖核酸(dna)及拮抗剂(antagonist)信使核糖核酸。本发明的方法利用上述的生物标志物的表达水平，来增进表皮生长因子受体-靶制剂有关的感受性，因此为了避免本说明书的过度的复杂性，重复的内容而言，省略其记载。根据本发明又一实施方式，本发明提供与表皮生长因子受体信号传递途径的调节异常相关的疾病的预防或治疗用药学组合物，包含与表皮生长因子受体-靶制剂有关的感受性增进剂及表皮生长因子受体-靶制剂作为有效成分。在本发明中，与上述表皮生长因子受体信号传递途径的调节异常相关的疾病为癌症、动脉粥样硬化症、肺纤维化、肾纤维化及再生、肝脏疾病、变应性疾病、炎症性疾病、自身免疫疾病、脑血管疾病、心血管疾病或与器官移植相关的症状，优选地，是癌症。即，本发明的作为与表皮生长因子受体-靶制剂有关的感受性增进剂的ron(recepteurd＇originenantais，nm_002447.1)基因的表达或上述基因的蛋白质的表达或活性抑制剂使抗癌剂有关的感受性增加，来与它们抗癌剂一同给药的情况下，增加抗癌剂的抗癌作用，从而可使癌症的治疗变得更容易。作为基于本发明的组合物的改善、预防或治疗对象疾病的“癌症(cancer)”是指细胞无视正常的生长局限，具有进行分裂及生长的攻击性(aggressive)特性、向周围组织侵入的侵入性特性及向体内的其他部位扩散的转移性(metastatic)特性的基于细胞的疾病的总称。在本说明书中上述癌症还与恶性肿瘤(malignanttumor)相同的意义来使用。可适用本发明的组合物的癌症为乳腺癌(breastcancer)、肺癌(lungcancer)、胃癌(stomachcancer)、肝癌(livercancer)、血液癌(bloodcancer)、骨癌(bonecancer)、胰腺癌(pancreaticcancer)、皮肤癌(skincancer)、头或颈癌(headorneckcancer)、皮肤或眼球黑色素瘤(cutaneousorintraocularmelanoma)、子宫肉瘤(uterinesarcoma)、卵巢癌(ovariancancer)、直肠癌(rectalcancer)、肛门癌(analcancer)、大肠癌(coloncancer)、输卵管癌(fallopiantubecarcinoma)、子宫内膜癌(endometrialcarcinoma)、子宫颈癌(cervicalcancer)、小肠癌(smallintestinecancer)、内分泌癌(endocrinecancer)、甲状腺癌(thyroidcancer)、甲状旁腺癌(parathyroidcancer)、肾癌(adrenalcancer)、软组织肿瘤(softtissuetumor)、尿道癌(urethralcancer)、前列腺癌(prostatecancer)、支气管癌(bronchogeniccancer)、骨髓癌(bonemarrowtumor)等，但并不限定于此。优选地，本发明的组合物可适用于大肠癌(coloncancer)的预防或治疗。在本说明书中术语“预防”是指无诊断为疾病或保留疾病的情况，但是在具有易得这种疾患或疾病的倾向的动物中抑制疾患或疾病的发生。在本说明书中术语“治疗”是指(i)疾患或疾病的发展的抑制；(ii)疾患或疾病的减轻；以及(iii)疾患或疾病的去除。并且，本发明的药学组合物还可包含药学上接受的载体。在本发明的药剂学组合物中包含的药学上接受的载体是在制剂时通常利用的，其包含乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁及矿物油等，但并不限定于此。本发明的药学组合物除了上述成分之外，还能追加包含润滑剂、湿润剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂及保存剂等。适合的药学上接受的载体及制剂在emington'spharmaceuticalsciences(19thed.，1995)中有详细记载。本发明的药学组合物的适合的给药剂量会根据制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病态、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度及反应灵敏度等因素，能够下多种处方。另一方面，优选地，本发明的药学组合物的给药量为每天0.0001～100mg/kg(体重)。本发明的药学组合物能够进行口服给药或非口服给药，而在进行非口服给药的情况下，能够通过静脉内注入、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、经皮给药等方式给药。优选地，本发明的药剂学组合物而言，根据所适用的疾病的种类确定给药途径。作为在本发明的组合物中包含的有效成分的增进剂内的相当基因或其的蛋白质的表达抑制剂的浓度考虑治疗目的、患者的状态、必要期间、疾病的严重度等来确定，并不限定于特定范围的浓度。本发明的药剂学组合物根据本发明所属领域普通技术人员能够容易实施的方法，利用药学上接受的载体和/或赋形剂进行制剂化，从而以单位容量形态制备或装在大容量容器内进行制备。此时，剂型可以是油或水性介质中的溶液、悬浮液、糖浆或乳化液形态，或是浸膏剂、散剂、粉末剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂的形态，且还能包含分散剂或稳定剂。本发明的组合物利用上述的作为感受性增进剂及抗癌剂的表皮生长因子受体-靶制剂，来提高细胞死亡，为了避免本说明书的过度的复杂性，重复的内容而言，省略其记载。根据本发明的另一实施方式，本发明提供与表皮生长因子受体-靶制剂有关的感受性预测方法，上述与表皮生长因子受体-靶制剂有关的感受性预测方法包括：步骤(a)，从对象准备生物学试样；以及步骤(b)，对上述生物学试样内ron(recepteurd＇originenantais，nm_002447.1)基因的表达水平或上述基因的蛋白质的表达或水平进行测定，以及步骤(c)，基于在步骤(b)中测定的水平确认结果，判定与上述对象的表皮生长因子受体-靶制剂有关的感受性。根据本发明的优选实例，上述对象具有v-ki-ras2kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(kras,v-ki-ras2kirstenratsarcomaviraloncogenehomolog，nm_033360.2)、小鼠成神经细胞瘤ras病毒(v-ras)癌基因同源物(neuroblastomarasviral(v-ras)oncogenehomolog，np_002515.1)或v-raf小鼠肉瘤病毒致癌基因同源物b1(v-rafmurinesarcomaviraloncogenehomologb，np_004324.2)野生型基因。在本发明的预测方法中，包括如下工序来进行，即在从对象患者获得生物学试样，并从上述试样内测定选自由上述基因形成的组的一个或多个基因是否表达后，与正常试样进行比较，来所记载的基因或蛋白质的表达或活性被抑制或减少的情况下，判定为该试样针对于表皮生长因子受体-靶制剂相比具有感受性；以及所记载的基因或蛋白质的表达或活性增加或提高的情况下，判定为该试样针对于表皮生长因子受体-靶制剂相比具有抵抗性。本发明的预测方法的特征在于，将在试样内中的特定基因或蛋白质是否表达(优选地，活性型)作为与癌细胞的抗癌剂有关的感受性的指标。根据本发明的优选实例，在上述步骤(b)中，还对选自由表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor，基因文库登录号u48722.1)、adam金属蛋白酶结构域11(adammetallopeptidasedomain11，nm_002390.4)、adam金属蛋白酶结构域32(adammetallopeptidasedomain32，nm_145004.5)、frizzled家族受体4(frizzledfamilyreceptor4，nm_012193.2)、g蛋白偶联雌激素受体(gprotein-coupledestrogenreceptor1，nm_001505.2)、g蛋白偶联受体101(gprotein-coupledreceptor101，nm_054021.1)基因及它们的组合组成的组中的一种基因的表达水平或上述基因的蛋白质的表达或活性水平进行测定。根据本发明的优选实例，在上述步骤(c)中，ron基因的表达水平或其的蛋白质的表达或活性水平与正常相比，低表达或低激活的情况下，判定为具有与对象的表皮生长因子受体-靶制剂有关的感受性(敏感性)。根据本发明的优选实例，在上述步骤(c)中，ron基因的表达水平或其的蛋白质的表达或活性水平与正常相比，高表达或高激活的情况下，判定为具有与对象的表皮生长因子受体-靶制剂有关的抵抗性。根据本发明的优选实例，在选自由adam金属蛋白酶结构域11、adam金属蛋白酶结构域32、frizzled家族受体4、g蛋白偶联雌激素受体及g蛋白偶联受体101基因及它们的组合组成的组中的一种以上的基因的表达水平或上述基因的蛋白质的表达或活性水平与正常相比，低表达的情况下，判断为具有与对象的表皮生长因子受体-靶制剂有关的感受性(敏感性)。更详细地，在本发明的上述步骤(c)中基于在上述步骤(b)中测定的表达水平结果，来具有v-ki-ras2kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物、小鼠成神经细胞瘤ras病毒(v-ras)癌基因同源物或v-raf小鼠肉瘤病毒致癌基因同源物b1野生型基因，且ron基因的活性及作为其的产物的活性型蛋白质的水平与正常(野生型)的值相比，抑制和/或减少的情况下，判定为从对象患者获得的该肿瘤细胞针对于作为抗癌剂的表皮生长因子受体-靶制剂具有感受性。此时，还对选自由adam金属蛋白酶结构域11、adam金属蛋白酶结构域32、frizzled家族受体4、g蛋白偶联雌激素受体及g蛋白偶联受体101基因及它们的组合组成的组中的一种基因的表达水平或上述基因的蛋白质的表达或活性水平进行测定，来确认为与正常(野生型)的值相比，抑制和/或减少的情况下，判定为从对象患者获得的该肿瘤细胞针对于作为抗癌剂的表皮生长因子受体-靶制剂具有感受性(敏感性)。在本说明书中，提及上述基因的表达水平所使用的术语“低表达”或“低活性”指称在生物标志物呈现非正常过程、疾患或个体内其他病态或其的症候的情况下，生物学试样内的生物标志物的值或水平低于从健康或正常的个体或作为比较对象的个体获得的生物学试样中检测的生物标志物的值或水平范围。并且，提及上述基因的表达水平所使用的术语可指称为与生物标志物的“正常”表达水平或值进行比较，来具有微分(differential)水平”或“微分值”或“得到不同的表达”，在表达中均包含两者，即，定量性差异及定性差异。根据本发明的优选实例，上述ron基因表达水平或上述基因的蛋白质的表达或活性水平的测定步骤还包括测定是否存在上述基因的剪接变异体(splicingvariant)或突变(mutant)的步骤。根据本发明，上述基因的变异体或上述基因内一个以上的变异的存在诱发上述基因的表达形态的变化，来可对与表皮生长因子受体-靶制剂有关的感受性产生影响(参照实施例3)。在本说明书中所使用的术语“变异体(variant)”是指相应基因借助选择性剪接(alternativesplicing)外显子部位被删除而生成的ron同种型(isoform)，在真核生物种中，借助作为基因表达调节的重要的过程中之一的选择性剪接(alternativesplicing)ron的活性程度被调节。在本发明中利用的ron△155(或rondelta155)、ron△160(或rondelta160)及ron△165(或rondelta165)作为借助基于这种剪接因子的外显子的跳跃(skipping)生成的形态，无配体也在结构上一直被激活。根据本发明，在通过这种ron的选择性剪接(alternativesplicing)机制，来外显子缺失的剪接变异体根据其是否表达对药物的感受性不同。在本说明书中所使用的术语“突变(mutant)”或“变异”包含该基因的核苷酸及氨基酸序列的碱基置换、缺失、插入、扩增及重排。核苷酸变异是指称对参照序列(例如，野生型序列)的核苷酸序列的变化，例如，一个以上的核苷酸的插入、缺失、逆位或置换，例如，单核苷酸多态性(snp)。上述术语若未另外表示，则还包含在核苷酸序列的补体中的相应的变化。核苷酸变异可以为体细胞突变或胚腺多态性。并且，氨基酸变异是指称相比于参照序列(例如，野生型序列)的氨基酸序列的变化(例如，1个以上的氨基酸的插入、置换或缺失，例如，内部缺失或n-或c-末端的末端截断(truncation))。在本发明的一实施例中，上述突变为一个氨基酸被置换的e387a及h424l点突变(pointmutant)。并且，在本发明中确认了ron蛋白质的氨基酸e387部位和h424部位为可与表皮生长因子受体蛋白质相结合的部位。可利用在本领域中公知的技术，可通过靶分子克隆及序列分析来执行作为上述变异的检测。例如脱氧核糖核酸(dna)序列分析；对立基因-特异性核苷酸混入测验及对立基因-特异性引物延伸测验(例如，包括对立基因-特异性聚合酶链式反应(pcr)、对立基因-特异性连接酶链反应(lcr))及缺口-连接酶链反应)的引物延伸测验；对立基因-特异性寡核苷酸杂交化测验(例如，寡核苷酸连接测验)；利用从切割剂的保护来检测核酸双重螺旋内的错配的碱基的切割保护测验；muts蛋白质集合分析；比较变异体及野生型核酸分子的移动性的电泳分析；变性-梯度凝胶电泳(dgge，例如如文献(myersetal.(1985)nature313：495))；在错配的碱基对中的核糖核酸酶(rnase)切割的分析；杂交双重螺旋脱氧核糖核酸化学或酶切割的分析；质量分光测定法(例如，malditof)；遗传位分析(gba)；5’核酸酶测验(例如，taqma；以及使用分子信标的测验，但并不局限于此。在本说明书中所使用的术语“生物学试样”是指从可检测的个体取得本发明的生物标志物的表达的全部试样。根据本发明的优选实例，上述生物学试样是选自由唾液(saliva)、活检(biopsy)、血液、皮肤组织、液体培养物、粪便及小便组成的组中的一种，且并不局限于此，可利用在本发明的
技术领域：
中通常所使用的方法进行处理而准备。在本发明的方法中，利用生物标志物判定为具有感受性，因此，为了避免本说明书的过度的复杂性，重复的内容而言，省略其记载。根据本发明的另一实施方式，本发明提供与表皮生长因子受体-靶制剂有关的感受性增进方法，包括将与表皮生长因子受体-靶制剂有关的感受性增进剂及表皮生长因子受体-靶制剂共同给药到对象中的步骤。本发明的方法利用上述的感受性增进剂及作为抗癌剂的表皮生长因子受体-靶制剂，来增进感受性，因此为了避免本说明书的过度的复杂性，重复的内容而言，省略其记载。以下，实施例仅仅是为了对本发进行更加具体的说明的，而根据本发明的主旨，本发明的范围不会因这些实施例而受到限制是对本发明所属领域的普通技术人员显而易见的。实验方法及条件免疫沉降法(immunoprecipitation)为了在大肠癌细胞株中分析ron活性型，将500μg的大肠癌细胞株与1μg的抗-ron抗体混合后，在4℃温度下培养12小时，然后添加20μl的蛋白质-琼脂糖株(protein-sepharosebead)(美国加利福尼亚州圣克鲁兹市圣克鲁斯生物技术公司(santacruzbiotehcnology，santacruz，ca，usa))，然后进行2小时的追加反应。利用缓冲液(nondietp-40细胞溶解缓冲液(lysisbuffer))将免疫沉降物清洗5次后，添加20μl的2×十二烷基磺酸钠(sds)样品溶液且进行加热，然后利用抗(anti)-ron(圣克鲁斯生物技术公司(santacruzbiotechonology))、抗磷酸络氨酸(anti-phospho-tyrosine)(美国马萨诸塞州比佛利cellsignaling公司(cellsignaling，beverly，ca，usa))抗体执行了蛋白质印迹法。为了分析内源性ron和表皮生长因子受体的相互作用，混合300μg的hct-8细胞株的溶解液和1μg的抗-ron抗体或抗-兔(rabbit)igg抗体后，在4℃温度下，培养12小时，然后添加20μl的蛋白质-琼脂糖株(美国加利福尼亚州圣克鲁兹市圣克鲁斯生物技术公司)，然后进行2小时的追加反应。利用缓冲液(nondietp-40细胞溶解缓冲液)将免疫沉降物清洗5次后，添加20μl的2×十二烷基磺酸钠样品溶液且进行加热，然后利用抗-ron(圣克鲁斯生物技术公司)、anti-表皮生长因子受体(美国马萨诸塞州比佛利cellsignaling公司)抗体执行了蛋白质印迹法。为了分析外源性ron和表皮生长因子受体的相互作用，在不表达ron蛋白质本身的lovo大肠癌细胞株中，转染作为ron活性型的△160基因型后，收取细胞液来混合300μg的细胞液和1μg的抗-ron抗体或抗兔igg抗体后，在4℃温度下，培养12小时，然后添加20μl的蛋白质-琼脂糖株(美国加利福尼亚州圣克鲁兹市圣克鲁斯生物技术公司)，然后进行2小时的追加反应。利用缓冲液(nondietp-40细胞溶解缓冲液)将免疫沉降物清洗5次后，添加20μl的2×十二烷基磺酸钠样品溶液且进行加热，然后利用抗-ron(圣克鲁斯生物技术公司)、anti-表皮生长因子受体(美国马萨诸塞州比佛利cellsignaling公司)抗体执行了蛋白质印迹法。微阵列分析在不表达蛋白质的colo320hsr大肠癌细胞株中，利用表达作为ron活性型的△160和/或间质表皮转化因子的结构物(质粒(plasmid))，将ron转染了48小时。之后，对细胞的溶解物进行了微阵列分析。*基因和表达及抑制方法为了分析ron和表皮生长因子受体的外源性相互作用，在未表达ron蛋白质的lovo大肠癌细胞株中，利用表达作为ron活性型的△160的结构物转染了48小时。为了分析ron和表皮生长因子受体的内源性相互作用，在ron处于激活状态的hct-8大肠癌细胞株中，利用ron小干扰核糖核酸(smallinterferingrna)转染了48小时。上述ron小干扰核糖核酸序列(序列13)如下：5’-acuuuguagaggaguuugauu-3’。逆转入聚合酶链式反应(reversetranscription-pcr)及实时聚合酶链式反应为了执行逆转入聚合酶链式反应，利用trizol(cat.#15596-026，lifetechnologiestm)从未表达ron的colo320hsr大肠癌细胞株、利用表达作为ron活性型的ron△160的结构物转染48小时的细胞株及利用ron小干扰核糖核酸在ron处于激活状态的km12c大肠癌细胞株中转染48小时的细胞株分别提取了核糖核酸。作为提取的核糖核酸，利用逆转入聚合酶链式反应试剂盒(kit)(accupowerrtpremix、柏业公司(bioneer))合成为互补脱氧核糖核酸(cdna)。利用合成的互补脱氧核糖核酸、基因特异性引物(primer)，通过聚合酶链式反应(accupowerpcrpremix，柏业公司(bioneer))确认了相应基因的表达程度差异，利用实时聚合酶链式反应(lightcycler480sybrgreen，roche)进行定量化。表1引物序列表2逆转入聚合酶链式反应条件42℃90℃60分钟5分钟表3聚合酶链式反应条件表4实时定量聚合酶链式反应(quantitativereal-timepcr)条件蛋白质印迹法为了执行蛋白质印迹法，通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离从各个细胞分离的蛋白质后，将其移到膜(polyscreen膜(polyscreenmembranes)(美国马萨诸塞州波斯顿市newenglandnuclear公司(newenglandnuclear、boston、ma、usa))，然后利用多种抗体(抗-磷酸ron(anti-phosphoron)、抗-磷酸酪氨酸(anti-phosphotyrosine)、抗-表皮生长因子受体、抗-磷酸表皮生长因子受体(美国马萨诸塞州比佛利cellsignalingtechnology公司(cellsignalingtechnology，beverly，ma，usa))、抗-ron(anti-ron)及抗-微管蛋白(anti-r-tubulin)(santacruzbiotechnology)，来在4℃温度下，反应12小时后，利用1×tbs-t缓冲液10分钟清洗了3次。在常温条件下，使适当的抗兔-辣根过氧化物酶(rabbit-hrp)或抗小鼠-辣根过氧化物酶第二(mouse-hrpsecondary)抗体反应2小时后，利用1×tbs-t缓冲液10分钟清洗了3次，然后利用ecl溶液(eclsolution)(amersham，buckinghamshire，uk)，来验证了蛋白质的表达。磷酸化受体酪氨酸激酶(phospho-rtk)阵列在未表达ron蛋白质的colo320hsr细胞株中，将作为ron活性型的△160结构物转染48小时后，收取了细胞溶解物。使50μg的收取的细胞溶解物和包含于人类磷酸化受体酪氨酸激酶试剂盒(humanphospho-rtkarraykit)(r&dsystems，inc，minneapolis，mn，usa)的模在4℃温度下，反应12小时后，利用tbs-t缓冲液清洗3次，然后使抗磷酸化-酪氨酸辣根过氧化物酶(anti-phospho-tyrosinehrp)抗体在常温条件下反应2小时，然后利用tbs-t缓冲液清洗了3次。之后，针对于膜,通过使用ecl溶液(eclsolution)(英国白金汉郡阿默舍姆公司(amersham，buckinghamshire，uk))，来验证了受体络氨酸激酶(rtk，receptortyrosinekinase)蛋白质的表达。抗癌剂处理在ron处于未激活状态的caco2及lim1215大肠癌细胞株及激活的km12c细胞株中，以5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml将西妥昔单抗(cetuximab)(美国新泽西州merck&co.，inc(merck&co.、inc、nj、usa))处理48小时后，收取细胞液来进行了台盼蓝计数法(trypanbluecounting)(图3a)。在ron处于激活状态的km12c大肠癌细胞株中，将ron小干扰核糖核酸处理48小时后，利用20μg/ml的西妥昔单抗处理48小时，然后收取细胞液来进行了台盼蓝计数法。抑制剂处理在ron处于激活状态的km12c大肠癌细胞株中，将3μm的ron抑制剂(ly2801653)和20μg/ml的表皮生长因子受体靶制剂(cetuximab)处理了48小时。处理后收取细胞溶解物来进行了台盼蓝计数法。并且，将100μg/ml的作为ron-靶抗体抗癌剂的narnatumab(creativediagnostic#tab-184抗人ron治疗剂抗体(anti-humanrontherapeuticantibody))和表皮生长因子受体靶制剂(cetuximab)处理了48小时，处理后以与上述相同的方法确认了细胞凋亡诱导程度。制作突变(pointmutant)作为突变制作利用muta-directmutagenesis试剂盒(intron，catno.15071),根据从试剂盒提供的指南进行。使用于突变制作(mutagenesis)的引物序列如下：ron(e387a)；正向(forward)：5’-ggagcgctgttgtgcatccccagtccatcc-3’、反向(reverse)：5’-ggatggactggggatgcacaacagcgctcc-3’、ron(h424l)；正向：5’-acaccagctgccgcctcttccctctgctgg-3’、反向：5’-ccagcagagggaagaggcggcagctggtgt-3’、ron(k1114m)；正向：5’-aatgtgccatcatgtcactaagtcg-3’、反向：5’-cgacttagtgacatgatggcacatt-3’、表皮生长因子受体(d813n)；正向：5’-ttggtgcaccgcaacctggcagccagg-3’及反向：5’-cctggctgccaggttgcggtgcaccaa-3’。利用上述引物和muta-direct酶(enzyme)进行突变(mutation)后，在大肠杆菌(e-coli)中进行转染(transformation)。在菌落(colonies)中提取脱氧核糖核酸后通过测序分析，来确认了是否变异(mutation)。在大肠癌细胞株或大肠癌患者组织中ron活性分析为了分析ron活性分析，在细胞株或大肠癌患者组织中，提取(使用ripa缓冲液(ripabuffer))蛋白质后，利用磷酸化ron抗体(phospho-ron抗体)(mybiosource，mbs462024，dilutionfactor1：1000)对20ug的细胞及50ug的大肠癌患者组织确认了是否具有活性。并且，利用ron抗体(santacruz；sc-322，lot#g1514，利用2μg培养(incubation)2天)进行免疫沉降后(使用300ug的细胞株和大肠癌患者组织)，利用磷酸化酪氨酸(phospho-tyrosine)抗体(cellsignaling；9411，稀释因子(dilutionfactor)1：1000)确认了是否磷酸化(phosphorylation)。为了确认作为ron活性型(form)的ron△155及ron△160(选择性剪接(alternativesplicingform))，利用trizol试剂在大肠癌细胞株或大肠癌患者组织中提取了核糖核酸。合成互补脱氧核糖核酸后，使用两种引物来进行了分析。第一、为了区分ron△155及ron△160使用设计的引物，上述引物如下：正向：5’-ctctggggaccaggttttcc-3’、反向：5’-accatcaatggcagggagtg-3’。逆转入聚合酶链式反应条件如下：以在94℃5分钟、在94℃30秒钟、在72℃下1分钟30秒的方式进行37个循环(cycles)，在72℃下，进行延伸。确认了在ron野生型的情况下为1552bp，在ron？155的情况下为1078bp，在ron？160的情况下为1225bp。为了再次确认，使用在现有文献中报告的引物，上述引物如下：正向：5’-tggtcagtagcagcttctca-3’、反向：5’-aggcagcaggataccaagga-3’。逆转入聚合酶链式反应条件如下：以在94℃5分钟、在94℃30秒钟、在57℃下45秒钟的方式进行37个循环(cycles)，在72℃下，延伸10分钟。确认了在ron野生型的情况下为1.6kb，在ron△160的情况下为1.3kb，在ron△155的情况下为1.1kb。实施例1.基于ron蛋白质是否存活性的表皮生长因子受体的活性1-1.在人类大肠癌细胞株中的ron蛋白质活性型是否存在本发明人为了筛选ron蛋白质处于激活或非激活状态的大肠癌细胞株，利用蛋白质印迹法，在总19种的人类大肠癌细胞株中确认了ron磷酸化。将这种被磷酸化的ron蛋白质视为ron活性型蛋白质。其结果，如图1a所示，在18种的细胞株中，在4个细胞株(ht-29、km12c、km12l4及sw1417)中观察到ron的磷酸化蛋白质表达，从而可知4个细胞株具有ron活性。另一方面，在lovo、colo320hsr大肠癌细胞株中呈现不存在ron蛋白质本身。1-2.基于利用dna微阵列分析的ron蛋白质激活的基因表达分析本发明人为了对基于在ron蛋白质不存在的colo320hsr细胞株中的ron表达的基因表达形态进行分析，在ron蛋白质不存在的colo320hsr细胞株中，使间质上皮转化因子(met)及作为ron激活型的△160基因一同过表达后，进行了微阵列。将ron基因的过表达视为ron基因或蛋白质的激活。如图1b所示，仅通过ron激活变化的基因与仅使间质上皮转化因子基因过表达的样品组的基因进行比较来分析，其结果，鉴定与表皮生长因子受体关联的5各基因(adam金属蛋白酶结构域11、adam金属蛋白酶结构域32、frizzled家族受体4、g蛋白偶联雌激素受体及g蛋白偶联受体101)为由ron变化的基因。1-3.基于大肠癌细胞株中的ron激活的表皮生长因子受体转录活性(反式激活作用)-相关基因的实时聚合酶链式反应(real-timepolymerasechainreaction)分析本发明人为了对基于ron激活的表皮生长因子受体转录活性-相关基因的表达变化形态进行分析，在ron蛋白质未表达的colo320hsr大肠癌细胞株中，使作为ron激活型的△160基因过表达后，针对于推定为由ron改变表达的、参与表皮生长因子受体转录活性的5个基因(adam金属蛋白酶结构域11、adam金属蛋白酶结构域32、frizzled家族受体4、g蛋白偶联雌激素受体及g蛋白偶联受体101)进行了实时聚合酶链式反应。其结果，如图1c所示，观察到借助ron过表达adam金属蛋白酶结构域11、adam金属蛋白酶结构域32、frizzled家族受体4、g蛋白偶联雌激素受体及g蛋白偶联受体101基因的表达显著增加。1-4.基于大肠癌细胞株中的ron激活的表皮生长因子受体转录活性-相关基因的逆转入聚合酶链式反应(reversetranscriptionpolymerasechainreaction)分析本发明人为了对基于ron激活的表皮生长因子受体转录活性-相关基因的表达变化形态进行分析，在ron未表达的colo320hsr大肠癌细胞株中，使作为ron激活型的△160基因过表达后，针对于推定为由ron改变表达的参与表皮生长因子受体转录活性的、5个基因(adam金属蛋白酶结构域11、adam金属蛋白酶结构域32、frizzled家族受体4、g蛋白偶联雌激素受体及g蛋白偶联受体101)进行了聚合酶链式反应。其结果，如图1d所示，观察到借助ron激活adam金属蛋白酶结构域11、adam金属蛋白酶结构域32、frizzled家族受体4、g蛋白偶联雌激素受体及g蛋白偶联受体101基因的表达仅在使作为ron基因的激活型的△160基因过表达的样品组中显著增加。1-5.在抑制ron的大肠癌细胞株中的表皮生长因子受体转录活性-相关基因的聚合酶链式反应分析本发明人为了对基于ron抑制的表皮生长因子受体转录活性-相关基因的表达变化形态进行分析，在ron处于激活状态的km12c大肠癌细胞株中，通过使用小干扰核糖核酸技法，来人为地抑制ron活性后，利用实时(real-time)聚合酶链式反应对与表皮生长因子受体转录活性相关的基因(adam金属蛋白酶结构域11、adam金属蛋白酶结构域32、frizzled家族受体4、g蛋白偶联雌激素受体及g蛋白偶联受体101)的表达进行了分析。其结果，如图1e所示，呈现基于ron激活抑制frizzled家族受体4、g蛋白偶联受体101基因显著减少。1-6.基于ron激活的表皮生长因子受体蛋白质活性分析如上所述，确认在实施例1-2(图1b)中被鉴定，在实施例1-3至实施例1-5(图1c-e)中得到验证的表皮生长因子受体转录活性(反式激活作用)相关基因的表达基于ron激活。对此，本发明人为了确认根据实际ron激活是否诱导表皮生长因子受体蛋白质的激活，在ron未表达的colo320hsr大肠癌细胞株中使作为ron激活型的△160基因过表达后，利用蛋白质印迹法确认了是否表皮生长因子受体的磷酸化蛋白质的表达是否存在。其结果，如图1f所示，在ron被激活的情况下，观察到表皮生长因子受体的磷酸化蛋白质增加(a)，并使作为ron激活型的△160基因过表达后，通过rtk-proteinarray确认了诱导表皮生长因子受体的磷酸化。因此，可知根据ron的激活诱导表皮生长因子受体的活性。实施例2.基于是否具有ron活性的人表皮生长因子受体活性的变化2-1.基于ron蛋白质的激活的表皮生长因子受体蛋白质的激活本发明人为了确认基于ron激活的表皮生长因子受体蛋白质的激活，在ron不表达的lovo及colo320hsr大肠癌细胞株中，使作为ron基因的激活型的△160基因过表达后，进行了蛋白质印迹法。其结果，如图2a所示，可确认根据ron激活表皮生长因子受体的活性增加。2-2.基于ron抑制的表皮生长因子受体蛋白质的活性变化本发明人为了确认基于ron蛋白质的激活的表皮生长因子受体蛋白质的活性变化，在ron被表达且激活的km12c及ht29大肠癌细胞株中，使用小干扰核糖核酸技法人为地抑制ron后，进行了蛋白质印迹法，来确认了表皮生长因子受体的磷酸化诱导。其结果，如图2b所示，确认根据ron抑制表皮生长因子受体的活性还减少。2-3.基于ron抑制的表皮生长因子受体配体(ligand)依赖性表皮生长因子受体活性变化本发明人为了确认表皮生长因子受体配体依赖性表皮生长因子受体活性变化，在ron被表达且激活的km12c及ht29大肠癌细胞株中，使用小干扰核糖核酸技法抑制ron后，通过蛋白质印迹法确认了基于用于诱导表皮生长因子受体的活性的表皮细胞生长因子配体处理时间的表皮生长因子受体的磷酸化程度。其结果，如图2c所示，确认随着ron抑制由表皮生长因子诱导的表皮生长因子受体的磷酸化减少，来活性减少。实施例3.基于ron蛋白质的激活的西妥昔单抗的药物感受性分析3-1.ron蛋白质与表皮生长因子受体蛋白质之间的内源性(endogenous)细胞内结合分析本发明人为了对ron处于未激活的状态的caco2大肠癌细胞株及ron被激活的km12c大肠癌细胞株的细胞内ron蛋白质与表皮生长因子受体蛋白质之间是否结合进行分析，利用ron抗体通过免疫沉降法(immunoprecipitation)观察了ron蛋白质与表皮生长因子受体蛋白质之间是否结合。其结果，如图3a所示，可知如下：在无ron的活性的caco2细胞中未进行ron蛋白质与表皮生长因子受体蛋白质结合，在有ron的活性的km12c细胞中，进行ron蛋白质与表皮生长因子受体蛋白质的结合。3-2.ron蛋白质与表皮生长因子受体蛋白质之间的外源性(exogenous)细胞内结合分析本发明人利用ron抗体通过免疫沉降法(immunoprecipitation)，来观察了分别使利用ron抗体通过免疫沉降法(immunoprecipitation)观察了ron蛋白质与表皮生长因子受体蛋白质之间是否存在结合，上述ron抗体为在ron处于未激活的状态的大肠癌细胞株caco2中分别使ron正常型基因和表皮生长因子受体正常型基因过表达的ron抗体和使ron正常型基因和表皮生长因子受体正常型基因一同过表达后的ron抗体。其结果，如图3b所示，可知在使ron正常型基因和表皮生长因子受体正常型基因一同过表达的情况下，实现ron蛋白质和表皮生长因子受体蛋白质的结合。3-3.通过invivofulldown分析(invivofulldownassay)的与ron蛋白质相结合的表皮生长因子受体蛋白质域(domain)分析本发明人在不是大肠癌细胞株的ron和无表皮生长因子受体的表达的293t细胞株中，利用分别使ron蛋白质、表皮生长因子受体的激酶域(kinasedomain)蛋白质及胞外域(extracellulardomain)蛋白质过表达的ron抗体和使表皮生长因子受体的激酶域蛋白质一同过表达后的ron抗体，通过免疫沉降法(immunoprecipitation)观察了与ron蛋白质相结合的表皮生长因子受体的域(domain)。其结果，如图3c所示，可知ron与表皮生长因子受体的胞外域蛋白质相结合。3-4.与通过invitrocellfreefulldown分析(invitrocellfreefulldownassay)的ron蛋白质相接合的表皮生长因子受体蛋白质域分析本发明人为了重新确认ron蛋白质与表皮生长因子受体的胞外域(extracellulardomain)蛋白质的结合，通过invitrocellfreefulldown分析，使ron正常型蛋白质与活性型△160蛋白质分别与表皮生长因子受体的激酶域蛋白质与胞外域(ec，extracellulardomain)蛋白质进行反应，来观察了是否结合。其结果，图3d所示，ron的正常型蛋白质和活性型△160蛋白质均与表皮生长因子受体的胞外域蛋白质相结合。3-5.与利用计算机模型(computermodeling)的表皮生长因子受体蛋白质相结合的ron蛋白质结合部位预测分析本发明人为了分析与表皮生长因子受体蛋白质相结合的ron的重要结合部位，利用计算机模型系统，代入表皮生长因子受体蛋白质的结构和ron蛋白质的结构来预测了进行结合的ron的结合部位。其结果，如图3e所示，预测分析为ron蛋白质的氨基酸e387部位和h424部位为可与表皮生长因子受体蛋白质相结合的部位。3-6.与表皮生长因子受体蛋白质相结合的ron蛋白质的结合部位分析本发明人为了对与表皮生长因子受体蛋白质相结合的ron的重要结合部位进行分析，在无ron和表皮生长因子受体的表达的293t细胞株中，分别使ron正常型基因及活性型△160和ron的e387a及h424l点突变(pointmutant)基因过表达，并与表皮生长因子受体基因一同过表达后，利用ron抗体，通过免疫沉降法(immunoprecipitation)观察了正常型、活性型、突变型ron蛋白质与表皮生长因子受体蛋白质之间的结合。其结果，如图3f所示，确认仅在ron的正常型、活性型及e387a突变型中进行结合，在ron的h424l突变型中表皮生长因子受体蛋白质不进行结合。3-7.基于与表皮生长因子受体蛋白质相结合的ron蛋白质的结合部位的表皮生长因子受体活性分析本发明人为了根据与表皮生长因子受体蛋白质相结合的ron的结合部位分析是否存在表皮生长因子受体活性，在无ron和表皮生长因子受体的表达的293t细胞株中，分别使ron正常型基因及活性型△160和在实施例3-6(图3f)中确认的突变基因过表达，并使表皮生长因子受体正常型基因过表达，来针对于表皮生长因子受体的活性通过蛋白质印迹法确认了表皮生长因子受体的磷酸化。其结果，如图3所示，如表皮生长因子受体活性型突变(表皮生长因子受体del19)，确认如下：仅在对表皮生长因子受体正常型和ron的活性型△160基因进行过表达的位点诱导表皮生长因子受体的磷酸化，在ron的正常型及h424l突变型中未诱导表皮生长因子受体的磷酸化，从而可知表皮生长因子受体的活性可根据是否存在ron的激活来呈现活性。实施例4.是否具有基于ron活性的表皮生长因子受体的活性的分析4-1.基于是否存在ron活性型蛋白质的是否存在配体(配体)-依赖性表皮生长因子受体活性的分析本发明人在无ron和表皮生长因子受体的表达的293t细胞株中，分别使表皮生长因子受体的正常型蛋白质和表皮生长因子受体的激酶抑制(kinasedead)蛋白质过表达后，根据是否存在作为ron的激活型的△160蛋白质，对基于作为表皮生长因子受体的配体的表皮细胞生长因子是否具有活性进行分析。其结构，如图4a所示，在不存在作为ron的激活型的△160的情况下，由表皮细胞生长因子仅在表皮生长因子受体的正常型蛋白质确认表皮生长因子受体的激活，在作为ron的激活型的△160蛋白质存在的情况下，与表皮细胞生长因子及表皮生长因子受体激酶抑制(kinasedead)蛋白质无关观察到表皮生长因子受体的激活，由此可知作为ron的激活型的△160以表皮生长因子受体的配体-非依赖性诱导表皮生长因子受体的激活。4-2.基于是否存在ron配体-依赖性活性的是否存在配体-依赖性表皮生长因子受体活性的分析本发明人在无ron和表皮生长因子受体的表达的293t细胞株中，分别使表皮生长因子受体的正常型蛋白质和表皮生长因子受体的激酶抑制蛋白质过表达后，根据是否存在作为诱导ron的的配体的msp，对基于作为表皮生长因子受体的配体的表皮细胞生长因子是否具有活性进行分析。其结果，如图4b所示，在不存在作为用于诱导ron的活性的配体的msp的情况下，由表皮细胞生长因子仅在表皮生长因子受体的正常型蛋白质确认表皮生长因子受体的激活，在存在作为用于诱导ron的活性的配体的msp的情况下，与表皮细胞生长因子及表皮生长因子受体激酶抑制(kinasedead)蛋白质无关观察到表皮生长因子受体的激活，由此可知若由作为用于诱导ron的活性的msp，ron成为活性型，则以表皮生长因子受体的配体-非依赖性诱导表皮生长因子受体的激活。并且，如图4所示，使ron△155/k1114n(作为激酶抑制突变体(ronkinasedeadronmutant)激酶活动(kinaseactivity)抑制型)一同过表达，其结果，可确认与仅使ron激活型过表达的情况相比，表皮生长因子受体的活性减少。实施例5.与基于ron活性的西妥昔单抗有关的表皮生长因子受体活性及关联性分析5-1.通过ron活性抑制的表皮生长因子受体的活性抑制及对西妥昔单抗(cetuximab)的表皮生长因子受体活性抑制分析如表5所示，众所周知，km12c大肠癌细胞株具有v-ki-ras2kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物、小鼠成神经细胞瘤ras病毒(v-ras)癌基因同源物及v-raf小鼠肉瘤病毒致癌基因同源物b1野生型基因型，并对西妥昔单抗具有抵抗性(toddm.etal，dualpharmacologicaltargetingofthemapkinaseandpi3k/mtorpathwayinpreclinicalmodelsofcolorectalcancer.plos2014，volume9，issue11，e113037)。表5之前，本发明人在实施例1-1中确认过在这种km12c大肠癌细胞株中ron处于激活的状态。对此，为了对与表皮生长因子受体的活性抑制及西妥昔单抗(cetuximab)有关的表皮生长因子受体活性抑制进行分析，如上所述，具有v-ki-ras2kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物、小鼠成神经细胞瘤ras病毒(v-ras)癌基因同源物及v-raf小鼠肉瘤病毒致癌基因同源物b1野生型基因型，对西妥昔单抗具有抵抗性，ron处于激活状态的km12c大肠癌细胞株中，通过小干扰核糖核酸技法人为地抑制ron后，按时间处理西妥昔单抗，来通过蛋白质印迹法观察了表皮生长因子受体的激活程度。其结果，如图5a所示，在不抑制ron的km12c细胞株中，即使处理西妥昔单抗，也随着时间的流逝表皮生长因子受体的活性减少后再次增加，另一方面，在利用小干扰核糖核酸抑制ron，且处理西妥昔单抗的细胞株中，确认表皮生长因子受体的活性急剧减少，来未重新增加，从而可知根据是否存在ron与西妥昔单抗有关的表皮生长因子受体的活性得到调节。5-2.基于是否存在ron活性的西妥昔单抗的细胞凋亡分析如表6所示，众所周知，caco-2大肠癌细胞株具有v-ki-ras2kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物、小鼠成神经细胞瘤ras病毒(v-ras)癌基因同源物及v-raf小鼠肉瘤病毒致癌基因同源物b1野生型基因型，并对西妥昔单抗具有敏感性(giovannib.etal，antitumoralefficacyoftheproteaseinhibitorgabexatemesilateincoloncancercellsharbouringkras，brafandpik3camutations.plos2012，volume7，issue7，e41347)。表6之前，本发明人在实施例1-1中确认过在这种caco-2大肠癌细胞株中ron处于未激活的状态。对此，当处理西妥昔单抗时，为了对基于是否存在ron活性的细胞凋亡程度进行分析，如上所述，为了确认在caco-2大肠癌细胞株及km12c大肠癌细胞株中的西妥昔单抗的反应性，通过台盼蓝细胞计数法(trypanbluecellcounting)分析了细胞凋亡，上述caco-2大肠癌细胞株具有v-ki-ras2kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物、小鼠成神经细胞瘤ras病毒(v-ras)癌基因同源物及v-raf小鼠肉瘤病毒致癌基因同源物b1野生型基因型，对西妥昔单抗具有敏感性，ron处于未激活状态，上述km12c大肠癌细胞株的lim1215细胞株和ron处于激活的状态且对西妥昔单抗具有抵抗性。其结果，如图5b所示，在ron处于未激活的状态的caco-2细胞株和lim1215细胞株中观察到基于西妥昔单抗的细胞凋亡，另一方面，在ron处于激活状态的km12c细胞株中未观察到基于西妥昔单抗的细胞凋亡，从而可知具有抵抗性。5-3.ron表达抑制后基于西妥昔单抗的细胞凋亡分析本发明人在ron处于激活状态且对西妥昔单抗具有抵抗性的km12c大肠癌细胞株中，通过小干扰核糖核酸技法人为地抑制ron后，处理西妥昔单抗，来通过台盼蓝细胞计数法分析了细胞凋亡。其结果，如图5c所示，可知在抑制ron的情况下，与西妥昔单抗有关的感受性增加，从而细胞凋亡增加。5-4.ron表达抑制后基于西妥昔单抗的下游信号机制分析本发明人在ron处于激活状态且对西妥昔单抗具有抵抗性的km12c大肠癌细胞株中，通过小干扰核糖核酸技法人为地抑制ron后，处理西妥昔单抗，来通过蛋白质印迹法观察了下游信号机制。其结果，如图5d所示，可知在抑制ron的表达，且处理西妥昔单抗的组中对细胞生存起到重要作用的磷酸化细胞外信号调节激酶(p-erk)蛋白质减少，作为细胞凋亡(apoptosis)标志物蛋白质的cleavedcaspase-3增加。5-5.ron活性抑制后基于西妥昔单抗的细胞凋亡分析本发明人对在ron处于激活状态且对西妥昔单抗具有抵抗性的km12c大肠癌细胞株中，分别处理可抑制ron的活性的抑制剂ly2801653和西妥昔单抗的组和并用处理ly2801653和西妥昔单抗的组，通过台盼蓝细胞计数法分析了细胞凋亡。其结果，如图5e所示，可知在并用处理ron的活性抑制剂ly2801653和西妥昔单抗的组中，细胞凋亡增加。5-6.基于是否存在ron的活性的根据西妥昔单抗的细胞凋亡分析本发明人在ron处于未激活状态，对西妥昔单抗具有敏感性的caco-2和sw48大肠癌细胞株中，使作为ron的激活型的△160和△155过表达后，观察了与西妥昔单抗有关的细胞凋亡。其结果，如图5f所示，可知在对西妥昔单抗呈现敏感性的caco-2和sw48细胞株使作为ron的激活型的△160和△155过表达的情况下，由西妥昔单抗抑制细胞凋亡来呈现抵抗性。5-7.基于是否存在ron的活性的根据西妥昔单抗的细胞生长分析本发明人在ron处于未激活状态，对西妥昔单抗具有敏感性的caco-2大肠癌细胞株中，使作为ron的激活型的△160基因过表达后，通过菌落形成(colonyformation)方法观察了与西妥昔单抗有关的细胞生长。其结果，如图5g所示，在由西妥昔单抗菌落数减少的母(亲本(parent))caco-2细胞株使作为ron的激活型的△160基因过表达的情况下，即使处理西妥昔单抗也菌落数几乎不减少，从而可知由作为激活型的△160蛋白质呈现与西妥昔单抗有关的细胞生长的抵抗性。5-8.在ron敲除等基因(knockoutisogenic)细胞株中基于西妥昔单抗的细胞凋亡分析本发明人制作在ron处于激活状态，对西妥昔单抗具有敏感性的km12c大肠癌细胞株中，针对于ron，利用crispr/cas9技法使ron基因敲除(knockout)的细胞株，来为了分析与西妥昔单抗有关的下包凋亡和细胞生长，在ron敲除效率好的#1克隆(clone)中按浓度处理西妥昔单抗来观察了细胞凋亡。其结果，如图5h所示，确认与母细胞株(亲本)相比，细胞凋亡增加，从而可知在敲除ron的情况下，基于西妥昔单抗的敏感性增加。5-9.在ron敲除等基因(knockoutisogenic)细胞株中基于西妥昔单抗的细胞生长抑制分析本发明人利用在ron处于激活状态，对西妥昔单抗具有敏感性的km12c大肠癌细胞株中，针对于ron，利用crispr/cas9技法敲除(knockout)ron基因的细胞株，来通过菌落形成方法观察了与西妥昔单抗有关的细胞生长。其结果，如图5i所示，确认与母细胞株(亲本)相比，菌落数减少，从而可知在敲除ron的情况下，基于西妥昔单抗的敏感性增加。实施例6.在利用ron敲除等基因(knockoutisogenic)细胞株的体内异种移植(inviboxenograft)模型中基于是否存在ron的西妥昔单抗的肿瘤抑制功效分析本发明人在体内异种移植模型中观察了基于西妥昔单抗的肿瘤抑制功效，上述体内异种移植模型为利用在在ron处于激活状态，对西妥昔单抗具有抵抗性的km12c大肠癌细胞株中，针对于ron，利用crispr/cas9技法敲除ron基因的细胞株。其结果，如图6所示，观察到与母细胞株(亲本)相比，在ron敲除异种移植(knockoutxenograft)小鼠中肿瘤的大小显著减少，从而可知在敲除ron的激活的情况下，基于西妥昔单抗的体内(invivo)敏感性增加。因此，ron的激活呈现作为与表皮生长因子受体-靶制剂的西妥昔单抗有关的感受性预测用生物标志物的可能性。实施例7.确认基于ron抗体抗癌剂和西妥昔单抗并用处理的细胞凋亡诱导本发明人确认了基于ron抗体抗癌剂和西妥昔单抗并用处理的细胞凋亡诱导。其结果，如图7所示，确认如下：当并用处理作为将ron作为靶的抗体抗癌剂的narnatumab和西妥昔单抗时，诱导细胞凋亡。此时，确认蛋白质的表达其结果，表皮生长因子受体和ron的活性被抑制，细胞外信号调节激酶(erk)的活性被抑制。实施例8.西妥昔单抗是否具有反应性和与ron活性的关系分析本发明人对西妥昔单抗是否具有反应性和与ron活性的关系分析进行了分析。其结果，如图8所示，实际大肠癌患者被确认为ron活性型(p-ronpositive)及表皮生长因子受体活性型(p-eggrpositive)(左侧图表)，并且，确认在实际大肠癌患者(两倍阳性(doublepositive))中接收西妥昔单抗处方的患者根据是否具有ron活性，来对西妥昔单抗呈现不同的感受性。<110>财团法人峨山社会福祉财团<120>与表皮生长因子受体-靶制剂有关的感受性预测用新型生物标志物及其用途<130>asan1.104p-1<150>kr10-2014-0096716<151>2014-07-29<160>13<170>kopatentin2.0<210>1<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>adam11正向引物<400>1tggcttcctcctctgtgtcaa21<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>adam11逆向引物<400>2gcacttcccttcattgctgc20<210>3<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>adam32正向引物<400>3aatggcagattggagggaaatg22<210>4<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>adam32逆向引物<400>4ttcatagcaggcaaatggagca22<210>5<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>fzd4正向引物<400>5tgactggcttgtgctatgttgg22<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>fzd4逆向引物<400>6atgcctgaagtgatgcccac20<210>7<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>gpr101正向引物<400>7ggcagaatggaagccaagga20<210>8<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>gpr101逆向引物<400>8ttgctgttacgacgactgggtg22<210>9<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>gper正向引物<400>9atcgtgcccttcgccatcat20<210>10<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>gper逆向引物<400>10ccagtcgtgaggtttcctaagcag24<210>11<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>gapdh正向引物<400>11agaaggctggggctcatttg20<210>12<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>gapdh逆向引物<400>12aggggccatccacagtcttc20<210>13<211>21<212>rna<213>人工序列<220><223>sirnaforron<400>13acuuuguagaggaguuugauu21当前第1页12