用于在核酸测定中改善解链分辨和多重性的探针的制作方法

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技术领域：
本发明一般性涉及分子生物学领域。更特别地，其涉及核酸的检测。
背景技术：
：聚合酶链式反应(PCR)是不采用活的生物体对DNA进行酶促复制的分子生物学技术。PCR通常用于医学和生物研究实验室以承担多种任务，例如遗传疾病的检测、基因指纹的鉴定、感染性疾病的诊断、基因克隆、亲子鉴定和DNA计算。由于其无可比拟的复制和精确能力，PCR被分子生物学家认为是核酸检测的首选方法。通常在PCR反应的终点(end-point)或者平台期进行DNA检测，这使得难以对起始模板进行定量。实时PCR或动态PCR通过记录反应过程中的扩增子浓度，从而提高了终点PCR分析的能力。最通常通过与被扩增的靶标有关的荧光信号的改变来记录扩增子浓度。实时PCR相对于终点检测的优势还在于，由于其在封闭的系统中进行，因此限制了污染。其它优势包括更高的灵敏度、动态范围、速度和需要较少的过程。在实时PCR检测方法中已经采用了几种测定化学。这些测定化学包括采用双链DNA结合染料、双标记的寡核苷酸，例如发夹引物和发夹探针。然而，目前实时PCR的一个缺陷在于其受限的多重性(multiplexing)能力。目前的实时PCR技术采用在溶液中游离的报告荧光染料。在多重反应中，该设计必须在每个测定中采用光谱不同的荧光染料。例如，设计来检测4个靶序列的多重反应将需要能够通过光谱不同来区分4个不同的、游离漂浮的荧光染料的仪器，这还不包括对照。这些要求不仅限制了实际的多重能力，而且增加了成本，其原因在于这样的设备通常需要多个发射源、检测器和滤器。目前的实时PCR技术的多重能力为大约1-6重(plex)。技术实现要素：本发明涉及用于扩增和检测DNA的系统和方法。特别地，本发明的实施方案提供了大大提高用于检测经扩增靶序列的可检测探针的多重能力的系统和方法。在第一实施方案中，提供了用于检测靶核酸存在的方法，其包括：(a)使样品与可切割探针接触，所述探针从5’至3’包含(i)包含标记物的第一序列区；(ii)第二序列区；(iii)为第二序列区的反向互补序列(reversecomplement)的序列；和(iv)包含与靶核酸第一链上的第一区互补的一个或更多个核糖核苷酸碱基的序列；(b)使所述可切割探针与内切核糖核酸酶接触，从而切割与靶核酸杂交的探针以形成截短的可切割探针；(c)使所述截短的可切割探针与其自身杂交以形成发夹探针；(d)延伸所述发夹探针；以及(e)通过检测标记物的信号改变来检测所述靶核酸。在某些方面，第一序列区(i)中的标记是报告基团-淬灭基团对，并且第一序列区上发夹探针的延伸改变报告基团和淬灭基团之间的距离；或用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸和第一序列区上发夹探针的延伸导致用报告基团-淬灭基团对的第二成员标记的互补非天然核苷酸的引入。在某些方面，所述为第二序列区的反向互补序列的序列(iii)的全部、一部分可与靶核酸第一链上的第一区互补或序列(iii)不与靶核酸第一链上的第一区互补。在一些实施方案中，所述方法还包括对发夹探针进行解链分析(meltanalysis)。在一个实施方案中，提供了用于检测靶核酸存在的方法，其包括：(a)使样品与可切割探针接触，所述探针从5’至3’包含(i)包含用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸的第一序列区；(ii)第二序列区；(iii)为第二序列区的反向互补序列的序列；和(iv)包含与靶核酸第一链上的第一区互补的一个或更多个核糖核苷酸碱基的序列；(b)使所述可切割探针与内切核糖核酸酶接触，从而切割与靶核酸杂交的探针以形成截短的可切割探针；(c)使所述截短的可切割探针与其自身杂交以形成发夹探针；(d)在能够与第一序列区的至少一个非天然核苷酸碱基配对的用报告基团-淬灭基团对的第二成员标记的非天然核苷酸的存在下延伸所述发夹探针；以及(e)通过检测可切割探针和发夹探针上标记物的信号改变来检测所述靶核酸。在某些方面，所述为第二序列区的反向互补序列的序列(iii)的一部分可以与靶核酸第一链上的第一区互补。在一些实施方案中，所述方法还包括对发夹探针进行解链分析。在另一个实施方案中，提供了用于检测靶核酸存在的方法，其包括：(a)使样品与可切割探针接触，所述探针从5’至3’包含(i)用报告基团-淬灭基团对标记的第一序列区；(ii)第二序列区；(iii)为第二序列区的反向互补序列的序列；和(iv)包含与靶核酸第一链上的第一区互补的一个或更多个核糖核苷酸碱基的序列；(b)使所述可切割探针与内切核糖核酸酶接触，从而切割与靶核酸杂交的可切割探针以形成截短的探针；(c)使所述所述截短的探针与其自身杂交以形成发夹探针；(d)将所述发夹探针延伸到第一序列区上，以使得报告基团和淬灭基团之间的距离增加；以及(e)通过检测报告基团的信号改变来检测所述靶核酸。在某些实施方案中，所述报告基团-淬灭基团对的成员之一在可切割探针的5’端。在一些实施方案中，所述报告基团-淬灭基团对的成员之一在第一序列区的5’端，而报告基团-淬灭基团对的另一个成员在第一序列区的3’端。在某些实施方案中，所述报告基团是荧光染料。在某些方面，所述为第二序列区的反向互补序列的序列(iii)的全部、一部分可以与靶核酸第一链上的第一区互补或序列(iii)不与靶核酸第一链上的第一区互补。在一些实施方案中，所述方法还包括对发夹探针进行解链分析。在某些方面，所述可切割探针还可以包含(v)在第二序列区和为第二序列区的反向互补序列的序列之间的一个或更多个核苷酸的环序列(loopsequence)。在一些方面，所述环序列的长度可以是4-20、6-15或10-15个核苷酸。在一些方面，所述环序列可以包含至少3-5个连续的A核苷酸。在一些实施方案中，所述环序列包含一个或更多个聚合酶延伸阻断部分。在某些方面，所述环序列可以包含一个或更多个核苷酸和一个或更多个延伸阻断部分的组合。聚合酶延伸阻断部分可以用作所述环序列的一部分或全部。延伸阻断部分的实例包括碳间隔区(spacer)。碳间隔区可以包括长度可以为3至36个碳原子的间隔区。内部寡核苷酸碳间隔区的常见实例包括长度为3、9和18个碳原子的间隔区。碳间隔区可用于阻止可切割探针形成非特异性双链PCR产物。碳间隔区也可以用于调节发夹探针的解链温度(melttemperature，Tm)。其他聚合酶延伸阻断部分可包含非天然核苷酸、核糖核苷酸或任何其他非核苷酸化学部分。在某些方面，所述第二序列区的长度可以是6-20个核苷酸。在某些方面，所述第二序列区互补序列的长度可以是6-20个核苷酸。在某些方面，所述第一序列区的长度可以是4-20个核苷酸。在某些方面，所述与靶核酸第一链上的第一区互补的序列的长度可以是6-50、10-50或6-30个核苷酸。在某些方面，所述可切割探针的一个或更多个核糖核苷酸碱基可以正好位于为第二序列区的反向互补序列的序列(本文也称为第二序列区互补序列)的3’。在某些方面，所述可切割探针的一个或更多个核糖核苷酸碱基可以位于距离与靶核酸第一链上的第一区互补的序列的3’端至少4个碱基。如上所述，所述为第二序列区的反向互补序列的序列的全部、一部分可以与靶核酸第一链上的第一区互补或该序列不与靶核酸第一链上的第一区互补。在某些方面，所述可切割探针可以包含这样的序列，所述序列包含与靶核酸序列的第一链上第一区互补的1至5个核糖核苷酸碱基。在一些方面，所述可切割探针可以包含这样的序列，所述序列包含与靶核酸序列第一链上的第一区互补的3至5个核糖核苷酸碱基。在某些方面，所述可切割探针可以包含非碱基配对修饰，其可以位于核糖碱基(ribobase)的3’和/或5’，并位于该探针的序列内，否则所述序列将与靶核酸第一链上的第一区互补。这些修饰可包括不与靶序列碱基配对的天然或非天然核苷酸，或可包括碳间隔区或其他非核苷酸化学部分。将非碱基配对修饰置于核糖核苷酸的上游或下游但在探针的区域内(否则其将与靶序列互补)可以提高可切割探针的特异性。非碱基配对部分可以位于核糖核苷酸上游或下游的2至20个核苷酸之间。在某些实施方案中，所述非碱基配对部分位于核糖核苷酸上游或下游1、2、3、4或5个核苷酸或其中任何范围的核苷酸。在某些方面，所述用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸可以位于可切割探针的5’端。在某些方面，所述可切割探针可以在3’端包含延伸阻断修饰。在某些方面，所述可切割探针的第二序列区可以包含至少50％的G/C含量。在某些方面，所述可切割探针的第二序列区的长度可以是6-15个核苷酸。在某些方面，所述可切割探针的第二序列区可包含一个或更多个非天然碱基。在某些方面，在内切核糖核酸酶或5’-核酸酶切割后，所述截短的可切割探针和靶核酸的解链点(meltpoint)可低于55℃。在某些方面，所述报告基团-淬灭基团对的第一成员可以是报告基团。在某些方面，用于本实施方案中的报告基团可以是荧光团。因此，在一些情况下，信号改变可以是荧光信号降低。在某些方面，所述检测标记物的信号改变可以包括随着样品的温度改变检测来自报告基团的信号改变(或变化速率)，例如信号的不淬灭(unquenching)。在一些方面，所述检测报告基团的信号改变可以包括当样品的温度升高到发夹探针的解链点以上(或降低到发夹探针的解链点以下)时检测报告基团的信号改变。在某些方面，所述可切割探针可以连接至固体支持物。实施方案的某些方面涉及使用至少一个非天然核苷酸(iv)。在一些方面，所述非天然核苷酸是异碱基(isobase)，例如异鸟嘌呤(isoG)或异胞嘧啶(isoC)。在某些方面，至少一个非天然核苷酸或淬灭基团标记的非天然核苷酸可以是isoG，并且另一个可以是isoC。在另一方面，所述方法可包括(a)使所述样品与第二(或另外的)可切割探针接触，所述探针从5’至3’包含(i)包含用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸的第一序列区；(ii)第二序列区；(iii)为第二序列区的反向互补序列的序列；和(iv)包含与第二(或另外的)靶核酸第一链上的第一区互补的一个或更多个核糖核苷酸碱基的序列；(b)使所述可切割探针与内切核糖核酸酶接触，从而切割与靶核酸杂交的探针以形成截短的可切割探针；(c)使所述截短的可切割探针与其自身杂交以形成发夹探针；(d)在能够与第一序列区的至少一个非天然核苷酸碱基配对的用报告基团-淬灭基团对的第二成员标记的非天然核苷酸的存在下延伸所述发夹探针；以及(e)通过检测可切割探针和发夹探针上标记物的信号改变来检测第二(或另外的)靶核酸。例如，检测第一和/或第二靶核酸的存在可以依次或基本上同时进行。在另一方面，所述第一和第二探针可以包含可区分的报告基团。在另一方面，所述第一和第二探针可以包含相同的报告基团，并且在一些情况下，所述第一和第二探针包含具有可区分的解链点的发夹(例如，解链点彼此相差1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30℃，或其中可导出的任何范围)。在另一方面，所述方法是多重方法(multiplexmethod)，并且包括(a)使样品与第三、第四、第五或第六可切割探针接触，所述探针从5’至3’包含(i)包含用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸的第一序列区；(ii)第二序列区；(iii)为第二序列区的反向互补序列的序列；和(iv)包含与第三、第四、第五或第六靶核酸第一链上的第一区互补的一个或更多个核糖核苷酸碱基的序列；(b)使所述可切割探针与内切核糖核酸酶接触，从而切割与靶核酸杂交的探针以形成截短的可切割探针；(c)使所述截短的可切割探针与其自身杂交以形成发夹探针；(d)在能够与第一序列区的至少一个非天然核苷酸碱基配对的用报告基团-淬灭基团对的第二成员标记的非天然核苷酸的存在下延伸所述发夹探针；以及(e)通过检测可切割探针和发夹探针上标记物的信号改变来检测第三、第四，第五或第六靶核酸。例如，检测第一和/或第二靶核酸的存在可以依次或基本上同时进行。在另一方面，所述第一和第二探针可以包含可区分的报告基团。在另一方面，所述第一和第二探针可以包含相同的报告基团，并且在一些情况下，由所述第一和第二探针形成的发夹探针可以具有可区分的解链点(例如，解链点彼此相差1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30℃，或其中可导出的任何范围)。在一个方面，由第一、第二、第三、第四、第五和/或第六探针形成的发夹探针各自可包含可区分的标记物或可区分的解链点。在另一个实施方案中，所述方法可包括(a)使所述样品与第二(或另外的)可切割探针接触，所述探针从5’至3’包含(i)包含报告基团-淬灭基团对的第一序列区；(ii)第二序列区；(iii)为第二序列区的反向互补序列的序列；和(iv)包含与第二(或另外的)靶核酸第一链上的第一区互补的一个或更多个核糖核苷酸碱基的序列；(b)使所述可切割探针与内切核糖核酸酶接触，从而切割与靶核酸杂交的探针以形成截短的可切割探针；(c)使所述截短的可切割探针与其自身杂交以形成发夹探针；(d)将所述发夹探针在第一序列区上延伸；以及(e)通过检测报告基团的信号改变来检测第二(或另外的)靶核酸。例如，检测第一和/或第二靶核酸的存在可以依次或基本上同时进行。在另一方面，所述第一和第二探针可以包含可区分的报告基团。在另一方面，所述第一和第二探针可以包含相同的报告基团，并且在一些情况下，所述第一和第二探针包含具有可区分的解链点的发夹(例如，解链点彼此相差1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30℃，或其中可导出的任何范围)。在又一方面，所述方法是多重方法，并且包括(a)使所述样品与第三、第四、第五或第六可切割探针接触，所述探针从5’至3’包含(i)包含用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸的第一序列区；(ii)第二序列区；(iii)为第二序列区的反向互补序列的序列；和(iv)包含与第三、第四、第五或第六靶核酸第一链上的第一区互补的一个或更多个核糖核苷酸碱基的序列；(b)使所述可切割探针与内切核糖核酸酶接触，从而切割与靶核酸杂交的探针以形成截短的可切割探针；(c)使所述截短的可切割探针与其自身杂交以形成发夹探针；(d)在能够与第一序列区的至少一个非天然核苷酸碱基配对的用报告基团-淬灭基团对的第二成员标记的非天然核苷酸的存在下延伸所述发夹探针；以及(e)通过检测可切割探针和发夹探针上标记物的信号改变来检测第三、第四、第五或第六靶核酸。例如，检测第一和/或第二靶核酸的存在可以依次或基本上同时进行。在另一方面，所述第一和第二探针可以包含可区分的报告基团。在另一方面，所述第一和第二探针可以包含相同的报告基团，并且在一些情况下，由所述第一和第二探针形成的发夹探针可以包含可区分的解链点(例如，解链点彼此相差1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30℃，或其中可导出的任何范围)。在一个方面，由第一、第二、第三、第四、第五和/或第六探针形成的发夹探针各自可包含可区分的标记物或具有可区分的解链点。因此，在一些其他方面，根据实施方案的多重方法可包括使用至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36或更多种不同探针(或其中可导出的任何范围)，其中每种探针具有(1)可区分的解链点或包含(2)可区分的标记物，以使得来自每种不同探针的信号可以被单独辨别。在一个方面，所述第一、第二、第三、第四、第五和/或第六可切割探针各自可以包含相同的第一序列区，第二序列区和/或第二序列区与为第二序列区的反向互补序列的序列之间的相同环序列。在某些实施方案中，所述环区可以包含一个或更多个聚合酶延伸阻断部分。在另一个实施方案中，提供了组合物，其包含至少第一可切割探针，所述探针从5’至3’包含(i)包含标记物的第一序列区；(ii)第二序列区；(iii)为第二序列区的反向互补序列的序列；和(iv)包含与靶核酸第一链上的第一区互补的一个或更多个核糖核苷酸碱基的序列。在某些方面，所述组合物还可包含报告基团标记的或淬灭基团标记的非天然核苷酸。在某些实施方案中，所述第一序列区(i)中的标记物是报告基团-淬灭基团对或用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸。在一个实施方案中，提供了组合物，其包含至少第一可切割探针，所述探针从5’至3’包含(i)包含用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸的第一序列区；(ii)第二序列区；(iii)为第二序列区的反向互补序列的序列；和(iv)包含与靶核酸第一链上的第一区互补的一个或更多个核糖核苷酸碱基的序列。在某些方面，所述组合物还可包含报告基团标记的或淬灭基团标记的非天然核苷酸。在一个实施方案中，提供了组合物，其包含可切割探针，所述探针从5’至3’包含(i)用荧光团-淬灭基团对标记的第一序列区；(ii)第二序列区；(iii)为第二序列区的反向互补序列的序列；和(iv)包含与靶核酸第一链上的第一区互补的一个或更多个核糖核苷酸碱基的序列。在某些方面，所述组合物还可以包含聚合酶、内切核糖核酸酶、参照探针或游离核苷酸。在某些方面，所述可切割探针还可以包含(v)在第二序列区和为第二序列区的反向互补序列的序列之间的一个或更多个核苷酸的环序列。在一些方面，环序列的长度可以是4-20、6-15或10-15个核苷酸。在一些方面，环序列可以包含至少3-5个连续的A核苷酸。在一些实施方案中，所述环序列包含一个或更多个聚合酶延伸阻断部分。在某些方面，所述环序列可以包含一个或更多个核苷酸和一个或更多个延伸阻断部分的组合。聚合酶延伸阻断部分可以用作环序列的一部分或全部。延伸阻断部分的实例包括碳间隔区。碳间隔区可以包括长度可以为3至36个碳原子的间隔区。内部寡核苷酸碳间隔区的常见实例包括长度为3、9和18个碳原子的间隔区。碳间隔区可用于防止可切割探针形成非特异性双链PCR产物。碳间隔区也可以用于调节发夹探针的解链温度(Tm)。其他聚合酶延伸阻断部分可包含非天然核苷酸、核糖核苷酸或任何其他非核苷酸化学部分。在另一方面，所述组合物还可包含如上所述的第二(或另外的)可切割探针，其中不同探针可基于具有不同报告基团和/或不同解链点而可区分。例如，第二(或另外的)探针可以从5’到3’包含(i)包含用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸的第一序列区；(ii)第二序列区；(iii)为第二序列区的反向互补序列的序列；和(iv)包含与第二(或另外的)靶核酸第一链上的第一区互补的一个或更多个核糖核苷酸碱基的序列。在某些方面，所述第一和第二探针可以包含可区分的报告基团和/或形成具有可区分的解链点的发夹。在某些方面，所述可切割探针还可以包含(v)如上所述的环序列。在一些方面，所述组合物包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36或更多种探针。在一些方面，实施方案的方法还可以包括进行多个聚合酶链式反应循环。在一些方面，检测标记物的信号改变包括在进行多个聚合酶链式反应循环之前、期间或之后检测信号。在另一方面，检测标记物的信号改变包括仅在进行多个聚合酶链式反应循环之后检测信号。在该方面，方法还可以包括将所检测到的标记物之信号与预定比相比较，所述预定比为标记物的信号与非杂交探针上标记物之参照信号的比。在一些方面，实施方案的方法还可以包括定量样品中靶核酸的量。例如，定量样品中靶核酸的量可以包括：使用标准曲线；确定所述靶核酸的相对量；使用终点定量；或通过将所述信号相对于背景可检测时的PCR循环数与存在的靶标的量相关联来确定所述靶核酸的量。在另一个实施方案中，提供了包含一种或更多种本文公开的组合物的试剂盒。例如，在一个实施方案中，提供了试剂盒，其包含：(a)第一可切割探针，所述探针从5’至3’包含(i)包含用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸的第一序列区；(ii)第二序列区；(iii)为第二序列区的反向互补序列的序列；和(iv)包含与靶核酸第一链上的第一区互补的一个或更多个核糖核苷酸碱基的序列；和(b)报告基团标记的非天然核苷酸；淬灭基团标记的非天然核苷酸；或内切核糖核酸酶。在另一方面，所述试剂盒包含至少两种、三种、四种、五种或六种探针。在一些实施方案中，所述探针还可以包含(v)如上所述的环序列。在某些方面，所述探针可以包含可区分的报告基团或形成具有可区分的解链点的发夹。在一些方面，所述试剂盒还可以包含聚合酶、参照探针、游离核苷酸或试剂盒的使用说明书。在另一个实施方案中，提供了用于检测靶核酸存在的方法，其包括：(a)使样品与第一探针组接触，所述探针组包含可切割探针和捕获探针，所述可切割探针从5’至3’包含(i)包含用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸的序列区；(ii)捕获序列；和(iii)包含与靶核酸第一链上的第一区互补的一个或更多个核糖核苷酸碱基的序列；所述捕获探针从5’至3’包含(i)与来自可切割探针的序列区相同的序列区，其包含与来自可切割探针的至少一个非天然核苷酸相同的至少一个未标记的非天然核苷酸；和(ii)与可切割探针的捕获序列互补的序列；(b)使所述可切割探针与内切核糖核酸酶接触，从而切割与靶核酸杂交的探针以形成截短的可切割探针；(c)使所述截短的可切割探针与捕获探针杂交；(d)在能够与捕获探针中的至少一个未标记的非天然核苷酸碱基配对的用报告基团-淬灭基团对的第二成员标记的非天然核苷酸的存在下延伸所述截短的可切割探针以形成延伸的可切割探针；(e)使所述延伸的可切割探针与其自身杂交以形成发夹探针；以及(f)通过检测可切割探针和发夹探针上标记物的信号改变来检测靶核酸。在另一方面，方法可以包括(a)使样品与第二探针组接触，所述探针组包含可切割探针和捕获探针，所述可切割探针从5’至3’包含(i)包含用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸的序列区；(ii)捕获序列；和(iii)与第二靶核酸第一链上的第一区互补的包含一个或更多个核糖核苷酸碱基的序列；所述捕获探针从5’至3’包含(i)与来自可切割探针的序列区相同的序列区，其包含与来自可切割探针的至少一个非天然核苷酸相同的至少一个未标记的非天然核苷酸；和(ii)与可切割探针的捕获序列互补的序列；(b)使所述可切割探针与内切核糖核酸酶接触，从而切割与第二靶核酸杂交的探针以形成截短的可切割探针；(c)使所述截短的可切割探针与捕获探针杂交；(d)在能够与捕获探针中的至少一个未标记的非天然核苷酸碱基配对的淬灭基团标记的非天然核苷酸的存在下延伸所述截短的可切割探针以形成延伸的可切割探针；(e)使延伸的可切割探针与其自身杂交以形成发夹探针；以及(f)通过检测可切割探针和发夹探针上标记物的信号改变来检测第二靶核酸。在某些方面，可切割探针可以包含这样的序列，所述序列包含与靶核酸序列第一链上的第一区互补的1至5个核糖核苷酸碱基的。在一些方面，可切割探针可以包含这样的序列，所述序列包含与靶核酸序列的第一链上第一区互补的3至5个核糖核苷酸碱基。在另一方面，所述方法是多重方法，并且包括(a)使所述样品与第三、第四、第五或第六探针组接触，所述探针组包含可切割探针和捕获探针，所述可切割探针从5’至3’包含(i)包含用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸的序列区；(ii)捕获序列；和(iii)包含与第三、第四、第五或第六靶核酸第一链上的第一区域互补的一个或更多个核糖核苷酸碱基的序列；所述捕获探针从5’至3’包含(i)与来自可切割探针的序列区相同的序列区，其包含与来自可切割探针的所述至少一个非天然核苷酸相同的至少一个未标记的非天然核苷酸；和(ii)与可切割探针的捕获序列互补的序列；(b)使所述可切割探针与内切核糖核酸酶接触，从而切割与第三、第四、第五或第六靶核酸杂交的探针以形成截短的可切割探针；(c)使所述截短的可切割探针与捕获探针杂交；(d)在能够与捕获探针中的至少一个未标记的非天然核苷酸碱基配对的淬灭基团标记的非天然核苷酸的存在下延伸所述截短的可切割探针以形成延伸的可切割探针；(e)使所述延伸的可切割探针与其自身杂交以形成发夹探针；以及(f)通过检测可切割探针和发夹探针上标记物的信号改变来检测第三、第四、第五或第六靶核酸。例如，检测第一和/或第二靶核酸的存在可以依次或基本上同时进行。在另一方面，所述第一和第二探针组可以包含可区分的报告基团。在另一方面，所述第一和第二探针组可以包含相同的报告基团，并且在一些情况下，由所述第一和第二探针形成的发夹探针可以包含可区分的解链点(例如，解链点彼此相差1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30℃，或其中可导出的任何范围)。在一个方面，由第一、第二、第三、第四、第五和/或第六探针组形成的发夹探针各自可包含可区分的标记物或具有可区分的解链点。因此，在一些其他方面，根据一些实施方案的多重方法可以包括使用至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36或更多个不同的探针组，其中每种探针具有(1)可区分的解链点或包含(2)可区分的标记物，以使得来自每种不同探针的信号可以被单独辨别。在某些方面，可切割探针的第二序列区可包含一个或更多个非天然碱基。在某些方面，在内切核糖核酸酶切割后，截短的可切割探针和靶核酸的解链点可低于55℃。在某些方面，所述报告基团-淬灭基团对的第一成员可以是报告基团，例如荧光团。在一些方面，所述信号改变可以是荧光信号降低。在某些方面，所述检测标记物的信号改变可以包括随着样品的温度改变检测报告基团的信号改变。在一些方面，所述检测报告基团的信号改变可以包括当样品的温度升高到高于发夹探针的解链点时检测报告基团的信号改变。在某些方面，所述可切割探针和/或捕获探针可以连接至固体支持物。在另一个实施方案中，提供了组合物，其包含第一探针组，所述探针组包含可切割探针和捕获探针，所述可切割探针从5’至3’包含(i)包含用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸的序列区；(ii)捕获序列；和(iii)包含与靶核酸第一链上的第一区互补的一个或更多个核糖核苷酸碱基的序列；所述捕获探针从5’至3’包含(i)与来自可切割探针的序列区相同的序列区，其包含与来自可切割探针的所述至少一个非天然核苷酸相同的至少一个未标记的非天然核苷酸；和(ii)与可切割探针的捕获序列互补的序列。在某些方面，所述组合物还可以包含报告基团标记的或淬灭基团标记的非天然核苷酸。在某些方面，所述组合物可以包含聚合酶、参照探针或游离核苷酸。在另一方面，所述组合物还可包含第二探针组，所述探针组包含可切割探针和捕获探针，所述可切割探针从5’至3’包含(i)包含用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸的序列区；(ii)捕获序列；和(iii)包含与第二靶核酸第一链上的第一区互补的一个或更多个核糖核苷酸碱基的序列；所述捕获探针从5’到3’包含(i)与来自可切割探针的序列区相同的序列区，其包含与来自可切割探针的至少一个非天然核苷酸相同的至少一个未标记的非天然核苷酸；和(ii)与可切割探针的捕获序列互补的序列。在某些方面，所述第一和第二探针组可以包含可区分的报告基团和/或形成具有可区分的解链点的发夹。在一些方面，所述组合物包含4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36或更多个探针组。在另一个实施方案中，提供了试剂盒，其包含(a)第一探针组，所述探针组包含可切割探针和捕获探针，所述可切割探针从5’至3’包含(i)包含用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸的序列区；和(iii)包含与靶核酸第一链上的第一区互补的一个或更多个核糖核苷酸碱基的序列；所述捕获探针从5’到3’包含(i)与来自可切割探针的序列区相同的序列区，其包含与来自可切割探针的至少一个非天然核苷酸相同的至少一个未标记的非天然核苷酸；和(ii)与可切割探针的捕获序列互补的序列；以及(b)报告基团标记的非天然核苷酸；淬灭基团标记的非天然核苷酸；或内切核糖核酸酶。在另一方面，所述试剂盒包含至少四组探针。在某些方面，所述探针组可以包含可区分的报告基团或形成具有可区分的解链点的发夹。在一些方面，所述试剂盒还可以包含聚合酶、参照探针、游离核苷酸、参照样品或试剂盒的使用说明书。在又一个实施方案中，提供了用于检测靶核酸存在的方法，其包括：(a)使样品与第一探针组接触，所述探针组包含可切割探针和捕获探针，所述可切割探针从5’至3’包含(i)包含用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸的序列区；(ii)捕获序列；和(iii)包含与靶核酸第一链上的第一区互补的一个或更多个核糖核苷酸碱基的序列；所述捕获探针从5’到3’包含(i)与来自可切割探针的序列区的一部分相同的序列区和(ii)与可切割探针的捕获序列互补的序列；(b)使所述可切割探针与内切核糖核酸酶接触，从而切割与靶核酸杂交的可切割探针以形成截短的可切割探针；(c)使所述截短的可切割探针与捕获探针杂交；(d)延伸所述截短的可切割探针以形成延伸的探针；(e)使所述延伸的可切割探针与其自身杂交以形成发夹探针；(f)在能够与可切割探针的5’的至少一个标记的非天然核苷酸碱基配对的用报告基团-淬灭基团对的第二成员标记的非天然核苷酸的存在下进一步延伸所述发夹探针；以及(g)通过检测来自可切割探针和发夹探针上标记物的信号改变来检测靶核酸。在另一方面，所述方法可以包括(a)使所述样品与第二探针组接触，所述探针组包含可切割探针和捕获探针，所述可切割探针从5’至3’包含(i)包含用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸的序列区；(ii)捕获序列；和(iii)包含与第二靶核酸第一链上的第一区互补的一个或更多个核糖核苷酸碱基的序列；所述捕获探针从5’到3’包含(i)与来自可切割探针的序列区的一部分相同的序列区和(ii)与可切割探针的捕获序列互补的序列；(b)使所述可切割探针与内切核糖核酸酶接触，从而切割与靶核酸杂交的可切割探针以形成截短的可切割探针；(c)使所述截短的可切割探针与捕获探针杂交；(d)延伸所述截短的可切割探针以形成延伸的探针；(e)使所述经延伸的可切割探针与其自身杂交以形成发夹探针；(f)在能够与可切割探针的5’的至少一个标记的非天然核苷酸碱基配对的报告基团-淬灭基团对的用第二成员标记的非天然核苷酸的存在下进一步延伸所述发夹探针；以及(g)通过检测可切割探针和发夹探针上标记物的信号改变来检测第二靶核酸。在某些方面，所述可切割探针可以包含这样的序列，所述序列包含与靶核酸序列的第一链上的第一区互补的1至5个核糖核苷酸碱基。在一些方面，所述可切割探针可以包含这样的序列，所述序列包含与靶核酸序列的第一链上的第一区互补的3至5个核糖核苷酸碱基。在另一方面，所述方法是多重方法，并且包括(a)使所述样品与第三、第四、第五或第六探针组接触，所述探针组包含可切割探针和捕获探针，所述可切割探针从5’至3’包含(i)包含用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸的序列区；(ii)捕获序列；和(iii)包含与第三、第四、第五或第六靶核酸第一链上的第一区互补的一个或更多个核糖核苷酸碱基的序列；所述捕获探针从5’到3’包含(i)与来自可切割探针的序列区的一部分相同的序列区和(ii)与可切割探针的捕获序列互补的序列；(b)使所述可切割探针与内切核糖核酸酶接触，从而切割与靶核酸杂交的可切割探针以形成截短的可切割探针；(c)使所述截短的可切割探针与捕获探针杂交；(d)延伸所述截短的可切割探针以形成延伸的探针；(e)使所述延伸的可切割探针与其自身杂交以形成发夹探针；(f)在能够与可切割探针的5’的至少一个标记的非天然核苷酸碱基配对的用报告基团-淬灭基团对的第二成员标记的非天然核苷酸的存在下进一步延伸所述发夹探针；以及(g)通过检测所述可切割探针和发夹探针上标记物的信号改变来检测第三、第四、第五或第六靶核酸。例如，检测第一、第二和/或另外的靶核酸的存在可以依次或基本上同时进行。在另一方面，所述第一、第二和/或另外的探针组可以包含可区分的报告基团。在另一方面，所述第一、第二和/或另外的探针组可以包含相同的报告基团，并且在一些情况下，由所述第一和第二探针形成的发夹探针可具有可区分的解链点(例如，解链点彼此相差1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30℃，或其中可导出的任何范围)。在一个方面，由第一、第二、第三、第四、第五和/或第六探针组形成的发夹探针各自可包含可区分的标记物或可区分的解链点。因此，在一些另外的方面，根据实施方案的多重方法可以包括使用至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36或更多个不同的探针组，其中每种探针包含(1)可区分的解链点或(2)可区分的标记物，以使得来自每种不同探针的信号可以被单独辨别。在某些方面，所述可切割探针的第二序列区可包含一个或更多个非天然碱基。在某些方面，在内切核糖核酸酶切割后，所述截短的可切割探针和靶核酸的解链点可低于55℃。在某些方面，所述报告基团-淬灭基团对的第一成员可以是报告基团，例如荧光团。在一些方面，所述信号改变可以是荧光信号降低。在某些方面，所述检测标记物的信号改变可以包括随着样品的温度改变检测报告基团的信号改变。在一些方面，所述检测报告基团的信号改变可以包括当样品的温度升高到高于发夹探针的解链点时检测报告基团的信号改变。在某些方面，所述可切割探针和/或捕获探针可以连接至固体支持物。在另一个实施方案中，提供了组合物，其包含第一探针组，所述探针组包含可切割探针和捕获探针，所述可切割探针从5’至3’包含(i)包含用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸的序列区；(ii)捕获序列；和(iii)包含与靶核酸第一链上的第一区互补的一个或更多个核糖核苷酸碱基的序列；所述捕获探针从5’到3’包含(i)与来自可切割探针的序列区的一部分相同的序列区和(ii)与可切割探针的捕获序列互补的序列。在某些方面，所述组合物还可以包含报告基团标记的或淬灭基团标记的非天然核苷酸。在某些方面，所述组合物可以包含聚合酶、参照探针或游离核苷酸。在另一方面，组合物还可以包含第二探针组，所述探针组包含可切割探针和捕获探针，所述可切割探针从5’至3’包含(i)包含周报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸的序列区；(ii)捕获序列；和(iii)包含与第二靶核酸第一链上的第一区互补的一个或更多个核糖核苷酸碱基的序列；所述捕获探针从5’到3’包含(i)与来自可切割探针的序列区的一部分相同的序列区和(ii)与可切割探针的捕获序列互补的序列。在某些方面，所述第一和第二探针组可以包含可区分的报告基团和/或形成具有可区分的解链点的发夹。在一些方面，所述组合物包含4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36或更多个探针组。在另一个实施方案中，提供了试剂盒，其包含(a)第一探针组，所述探针组包含可切割探针和捕获探针，所述可切割探针从5’至3’包含(i)包含用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸的序列区；(ii)捕获序列；和(iii)包含与靶核酸第一链上的第一区互补的一个或更多个核糖核苷酸碱基的序列；所述捕获探针从5’到3’包含(i)与来自可切割探针的序列区的一部分相同的序列区和(ii)与可切割探针的捕获序列互补的序列；以及(b)报告基团标记的非天然核苷酸；淬灭基团标记的非天然核苷酸；或内切核糖核酸酶。在另一方面，所述试剂盒包含至少四组探针。在某些方面，所述探针组可以包含可区分的报告基团或形成具有可区分解链点的发夹。在一些方面，所述试剂盒还可以包含聚合酶、参照探针、游离核苷酸、参照样品或试剂盒的使用说明书。在另一个实施方案中，提供了用于检测靶核酸存在的方法，其包括：(a)使样品与第一可切割探针接触，所述探针从5’至3’包含(i)包含用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸的第一序列区；(ii)第二序列区；(iii)为第二序列区的反向互补序列的序列；和(iv)与靶核酸第一链上的第一区互补的序列；(b)使可切割探针和上游引物与靶核酸杂交，并使用具有5’核酸酶活性的聚合酶进行延伸；(c)延伸核酸序列，直到可切割发夹探针与具有核酸酶活性的聚合酶接触，从而切割与靶核酸杂交的探针以形成截短的可切割探针；(d)使所述截短的可切割探针与其自身杂交以形成发夹探针；(e)在能够与第一序列区的至少一个非天然核苷酸碱基配对的用报告基团-淬灭基团对的第二成员标记的非天然核苷酸的存在下延伸所述发夹探针；以及(f)通过检测所述发夹探针上标记物的信号改变来检测所述靶核酸。在某些方面，所述为第二序列区的反向互补序列的序列(iii)的一部分可以与靶核酸第一链上的第一区互补。在某些实施方案中，所述方法还可以包括对发夹探针进行解链分析。在另一个实施方案中，提供了用于检测靶核酸存在的方法，其包括：(a)使样品与第一可切割发夹探针接触，所述探针从5’至3’包含(i)用报告基团-淬灭基团对标记的第一序列区；(ii)第二序列区；(iii)为第二序列区的反向互补序列的序列；和(iv)与靶核酸第一链上的第一区互补的序列；(b)使可切割探针和上游引物与靶核酸杂交，并使用具有5’核酸酶活性的聚合酶进行延伸；(c)延伸核酸序列，直到可切割发夹探针与具有核酸酶活性的聚合酶接触，从而切割与靶核酸杂交的探针以形成截短的可切割探针；(d)使所述截短的探针与其自身杂交以形成经切割的发夹探针；(e)将经切割的发夹探针在其自身上延伸，以使得荧光团和淬灭基团物理分离；(f)通过检测延伸的发夹探针的信号改变来检测所述靶核酸。实施方案的某些方面涉及采用至少一个非天然核苷酸。在一些方面，非天然核苷酸为异碱基(isobase)，例如异鸟嘌呤(isoG)或异胞嘧啶(isoC)。在该方面，淬灭基团标记的非天然核苷酸为同源isoC(或isoG)。在另一些方面，第一和/或第二引物的至少一个在靶特异性序列中包含至少一个非天然核苷酸。例如，在某些方面，靶特异性序列中的非天然核苷酸调节序列特异性退火，由此增强了核苷酸的序列特异性扩增的引物-模板杂交(参见例如PCT公开WO2011/052078，通过引用并入本文)。本文公开的可切割探针的切割和延伸可以在等温条件下进行，其中切割和延伸可切割探针，同时反应条件保持在基本上恒定的温度。可以实现信号的等温放大，这是因为经切割探针的两个片段与靶的解链温度比切割之前探针与靶的解链温度更低。这导致两个片段与靶解离，允许另一个探针杂交和切割。这个过程自我重复，允许多个探针在恒定温度下从单个靶切割和延伸。该特征与涉及通过解链分析的封闭管多重检测的其他方法相比是独特的，后者依赖于5’-核酸酶活性以获得独特的解链特征，不能等温地扩增靶标或扩增子的信号。或者，本文公开的可切割探针的切割和延伸可以在非等温条件下进行，例如在PCR的循环温度条件下进行。在一些方面，实施方案的方法还可以包括进行扩增步骤以扩增靶序列。可切割探针的切割和延伸可以在扩增过程期间或之后进行。例如，扩增可以是等温扩增或者一个或更多个聚合酶链式反应循环。等温扩增技术包括例如链置换扩增(stranddisplacementamplification，SDA)、环介导的扩增(loop-mediatedamplification，LAMP)、滚环扩增(rollingcircleamplification，RCA)和解旋酶依赖性扩增(helicase-dependentamplification，HAD)(参见例如Yan等，2014)。在一些方面，检测标记物的信号改变包括在进行等温扩增或多个聚合酶链式反应循环之前、期间或之后检测信号。在另一方面，检测标记物的信号改变包括仅在进行等温扩增或多个聚合酶链式反应循环之后检测信号。在该方面，所述方法还可以包括将所检测到的标记物之信号与预定比相比较，所述预定比为所述标记物的信号与非杂交探针上标记物的参照信号的比。在一些方面，实施方案的方法还可以包括定量样品中靶核酸的量。例如，定量样品中靶核酸的量可以包括：使用数字PCR；使用标准曲线；确定核酸靶的相对量；使用终点定量；或通过将所述信号相对于背景可检测时的PCR循环数与存在的靶标量相关联来确定所述靶核酸的量。在本方法的多个方面，检测报告基团的信号改变可以包括随着样品的温度改变检测信号改变(或变化率)，例如信号不淬灭。在一个方面，样品的温度可以升高到样品中一种或更多种引物的发夹的解链点以上(或降低到其以下)。在存在两个或更多个引物组的情况下，改变样品的温度可以包括将样品的温度从低于第一引物组的第一引物和第二引物组的第一引物两者的温度升高到高于两个发夹的解链点的温度。在多个方面，实施方案的探针可以包含相同的报告基团并且包含具有可区分的解链点的发夹(例如，解链点彼此相差1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30℃的，或其中可导出的任何范围)。在进一步的多个方面，根据实施方案的多重方法可包括使用至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36或更多个不同探针组，其中每个探针或探针组包含(1)具有可区分的解链点的发夹或(2)可区分的报告基团，以使得来自每个不同探针或探针组的信号可以单独辨别。在另一个实施方案中，提供了包含实施方案的一个或更多个探针或探针组的试剂盒。在另一方面，试剂盒还包含具有外切核酸酶活性的聚合酶、内切核糖核酸酶(例如，RNA酶H)、参照探针、游离核苷酸、游离非天然核苷酸、参照样品和/或试剂盒的使用说明书。如本文中使用的，固体支持物可以为具有磁性的珠和/或具有使其停留在溶液中二维表面上之密度的珠。颗粒可以通过磁力、重力或离子力或通过化学键或本领域技术人员已知的任何其他方式中的一种或另一种停留在二维表面上。颗粒可以由玻璃、聚苯乙烯、乳胶、金属、量子点、聚合物、硅石、金属氧化物、陶瓷或任意其它适于结合核酸的物质，或者然后可以连接至核酸的化学物质或蛋白质组成。所述颗粒可以为杆状或球形或盘形，或包括其他任意形状。所述颗粒还可以通过其形状或大小或物理位置而区分开来。由于具有组合物可使得所述颗粒在光谱上不同，所述组合物包含染料或包含多个比或多个浓度的一种或多种染料或荧光染料，或者通过条形码或全息图像或其它印迹形式的颗粒编码可以将所述颗粒区分开。当颗粒为磁性颗粒时，可以通过施加磁场将它们吸引至室表面。同样地，通过去除磁场，可以将磁性颗粒从室表面分散开来。磁性颗粒优选为顺磁或超顺磁。在没有磁场时，顺磁和超顺磁颗粒具有可忽略的磁性，但是施加磁场诱导颗粒中的磁域对齐，从而导致颗粒被吸引至场源。当去除所述场时，磁域恢复至随机方向，从而颗粒间无磁性吸引或排斥。在超顺磁性的情况下，磁域几乎立即恢复至域的随机方向，而顺磁材料在去除磁场之后的一段时间内将仍保持域对齐。当颗粒具有足够的密度时，通过重力可以将它们吸引至室的底面，并通过搅拌室(例如通过涡旋、超声或流体运动)，从室的底面分散开来。室的搅拌还可以用于在方法和系统中进一步帮助颗粒分散，在所述方法和系统中，颗粒通过其它力被吸引至室表面，例如磁力或离子力、或吸力、或真空过滤、或亲和力、或亲水性或疏水性，或其任意组合。标记物或标签试剂是一种分子，其有利于检测其所连接的分子(例如核酸序列)。已知有大量的报告基团分子可以用于标记核酸。直接的报告基团分子包括荧光团、生色团和放射团(radiophore)。荧光团的非限制性实例包括例如红色荧光方酸菁染料(squarinedye)(例如2，4-双[1，3，3-三甲基-2-二氢亚吲哚基甲基]环丁烯二-1，3-二氧戊环(2，4-Bis[1，3,3-trimethyl-2-indolinylidenemethyl]cyclobutenediylium-1,3-dio-xolate))、红外染料(例如2,4双[3，3-二甲基-2-(1H-苯基[e]二氢亚吲哚基甲基)]环丁烯二-1，3-二氧戊环(2，4Bis[3，3-dimethyl-2-(1H-benz[e]indolinylidenemethyl)]cyclobutenediylium-1，3-dioxolate))或橙色荧光方酸菁染料(例如2，4-双[3，5-二甲基-2-吡咯基]环丁烯二-1,3-二氧戊环(2，4-Bis[3，5-dimethyl-2-pyrrolyl]cyclobutenediylium-1,3-diololate))。荧光团的另一些非限制性实例包括：量子点，AlexaFluorTM染料，AMCA，BODIPYTM630/650，BODIPYTM650/665，BODIPYTM-FL，BODIPYTM-R6G，BODIPYTM-TMR，BODIpYTM-TRX，CascadeBlueTM，CyDyeTM，包括但不限于Cy2TM、Cy3TM和Cy5TM，DNA嵌入染料，6-FAMTM，荧光素，HEXTM，6-JOE，OregonGreenTM488，OregonGreenTM500，OregonGreenTM514，PacificBlueTM，REG，藻胆蛋白(phycobilliprotein)包括但不限于藻红蛋白和别藻蓝蛋白，RhodamineGreenTM，RhodamineRedTM，ROXTM，TAMRATM，TETTM，四甲基罗丹明，或TexasRedTM。信号放大试剂，例如tyramide(PerkinElmer)，可以用于增强荧光信号。间接报告基团分子包括生物素，其必须结合另一分子(例如链霉亲和素-藻红蛋白)以进行检测。也可以采用标志物对，例如荧光共振能量转移对或染料-淬灭基团对。标记的扩增产物可以被直接或间接标记。可以通过例如采用标记的引物，标记的dNTP、标记的核酸嵌入剂或上述组合实现直接标记。可以通过例如将标记的探针与扩增产物杂交实现间接标记。本文公开的方法还可以包括对样品中的靶核酸的初始量进行定量。所述定量可以包括例如通过在对数坐标上相对于循环数对荧光作图，来在实时PCR的指数期内确定存在的DNA相对浓度。之后，可通过将结果与标准曲线比较来确定DNA的量，通过对已知量DNA的连续稀释进行实时PCR生成所述标准曲线。另外，实时PCR可以与逆转录聚合酶链式反应组合以对样品中的RNA(包括低丰度RNA)进行定量。或者可通过数字PCR实现定量。靶核酸序列可以是任何感兴趣的序列。包含靶核酸序列的样品可以是包含核酸的任何样品。在本发明的某些方面，样品是例如正在筛选一种或更多种遗传突变或多态性的存在或不存在的对象。在本发明的另一方面，样品可以来自正在测试病原体的存在或不存在的对象。当样品从对象获得时，其可以通过本领域技术人员已知的方法获得，例如抽吸、活检、擦拭、静脉穿刺、脊髓穿刺、粪便样品或尿样品。在本发明的一些方面，样品是环境样品，例如水、土壤或空气样品。在本发明的另一些方面，样品来自植物、细菌、病毒、真菌、原生动物或后生动物。每个扩增循环具有三个阶段：变性阶段、引物退火阶段和引物延伸阶段。可以重复扩增循环直至产生所需量的扩增产物。通常，扩增循环重复大约10至40次。对于实时PCR，扩增产物的检测通常在每个扩增循环之后进行。但是在本发明的某些方面，可以在每2个，3个，4个或5个扩增循环之后检测扩增产物。还可以进行检测以使得分析或检测少至2个或更多个扩增循环。扩增循环可以与扩增检测在相同的室内进行，在此情况下，该室需要包含加热元件，从而可以在扩增循环的变性阶段、引物退火阶段和引物延伸阶段对室内的温度进行调节。加热元件通常受处理器控制。然而，扩增循环可以与扩增检测在不同室内进行，在此情况下，“扩增”室需要包含加热元件，而“检测”或“成像”室不需要具有加热元件。当扩增和检测发生在不同室内时，扩增反应的流体可以通过例如泵或活塞在所述室间转移。所述泵或活塞可以受处理器控制。或者，流体可以经手动(例如使用移液器)在所述室间转移。扩增可以在反应混合物中进行，所述反应混合物包含至少一个具有非天然核苷酸的非天然核苷酸。所述反应混合物的至少一个非天然核苷酸可以与第一和/或第二引物组之引物中存在的至少一个非天然核苷酸碱基配对。任选地，所述非天然核苷酸与可以包括荧光团和淬灭基团的标记物偶联。所述淬灭基团可以使所述第一和/或第二引物组之引物中存在的荧光团淬灭。检测可以包括对群中的一个或更多个多核苷酸进行扩增。例如，在至少一个非天然核苷酸存在下，检测可以包括对群中的一个或更多个多核苷酸扩增。所述非天然核苷酸可以具有非天然核苷酸(例如isoC和isoG)，其可任选地能够与寡核苷酸混合物的非天然核苷酸(例如，变性寡核苷酸中存在的非天然核苷酸)碱基配对。所述非天然核苷酸可以与标记物偶联。适当的标记物包括荧光团和淬灭基团。所述方法可以用来在扩增期间或实时持续检测靶标。所述方法可以定量使用。实施方案的某些方面涉及内切核糖核酸酶和当探针与DNA靶序列杂交时使用这种酶特异性切割具有核糖核苷酸(RNA)位置的探针。在一些方面，内切核糖核酸酶是RNA酶H，例如RNA酶HII。在某些具体方面，内切核糖核酸酶是热稳定酶或嗜热的热启动酶(例如，热稳定的RNA酶HII和嗜热的热启动RNA酶HII)。可以在一个或更多个非天然核苷酸和/或在至少一个与非天然核苷酸偶联之淬灭基团的存在下进行扩增。在一些实施方案中，与所述至少一个淬灭基团偶联的非天然核苷酸可以为isoCTP或isoGTP。在一些方法中，第一和第二标记物可以不同。在一些方法中，第一和第二淬灭基团可以不同，并且能够淬灭两种不同的荧光团。在另一些方法中，第一和第二淬灭基团可以相同，并且能够淬灭两种不同的荧光团。本文所述的方法可以包括确定扩增子(例如至少一个经扩增的HIV核酸和扩增的对照核酸之扩增的核酸)的解链温度。所述方法可以包括确定核酸复合物的解链温度，所述核酸复合物包括与靶核酸(其可以包括扩增的靶核酸)杂交的经标记的探针。将所述扩增子或核酸复合物暴露于温度梯度并观察标记物的信号，由此可以确定所述解链温度。任选地，可以通过(a)在温度梯度下将扩增子与嵌入剂反应和(b)观察嵌入剂的可检测信号，来确定所述解链温度。可以通过(1)将探针与靶核酸杂交以形成核酸复合物，其中所述探针和所述靶核酸中的至少一个包含标记物；(2)将所述核酸复合物暴露于温度梯度；和(3)观测所述标记物的信号，来确定核酸复合物的解链温度。可以在任意适当条件下在任意适当反应室中实施所述方法。例如，可以在不打开反应室的情况下，在所述反应室中实施所述方法。所述反应室可以为反应室阵列的一部分。在一些实施方案中，所述方法的步骤可以在不同反应室中分别进行。本文公开的方法可以在液滴中进行。同样，本文公开的组合物可以设置在液滴内。例如，可以使用滴液将本文公开的可切割探针分成用于PCR或等温扩增的许多分开反应。因此，在某些实施方案中，本文公开的方法在液滴中区室化以进行定量数字PCR反应或其他定量数字扩增反应。如Vogelstein等，1999，第9236-9241页中所述，数字PCR方法可有助于分布靶核酸，以使得绝大多数反应包含一个或零个靶核酸分子。在某些稀释度下，扩增阳性反应的数目等于最初存在的模板分子的数目。在一些实施方案中，所述方法能够检测样品(例如体积大约为25微升的样品)中不超过大约100拷贝的靶核酸。在另一些实施方案中，所述方法能够检测样品(例如体积大约为25微升的样品)中不超过大约500拷贝、1000拷贝、5000拷贝或10000拷贝。在另一些实施方案中，采用实时检测，在不超过大约150个、不超过大约100个、不超过大约90个、不超过大约80个、不超过大约70个、不超过大约60个、不超过大约50个、不超过大约40个、或者不超过大约30个的PCR循环内，所述方法能够检测样品(例如体积大约为25微升的样品)中不超过大约100拷贝的靶核酸。如本文说明书中使用的没有数字限定的表述可以意指一个/种或更多个/种。如本文权利要求中使用的，当与词语“包含/包括”联合使用时，没有数字限定的表述可以意指一个/种或多于一个/种。权利要求中使用术语“或”用来意指“和/或”，除非明确表示其仅仅为替代或所述替代是互斥的，尽管本公开内容支持仅指替代以及“和/或”的定义。本文中使用的“另一个/种”可以意指至少第二个/种或更多个/种。贯穿该申请，术语“约/大约”用来表示这样的值，所述值包括装置、用于确定该值的方法的固有误差变化，或存在于研究对象之间的差异。通过以下详细描述，本发明的其它目的、特征和优势将变得明显。然而，应当理解的是，说明本发明一些优选实施方案的详细描述和特定实施例仅通过举例说明的方式给出，因此根据所述详细描述，在本发明精神和范围内的多种变化和修改对于本领域技术人员来说将变得明显。附图说明以下附图形成本说明书的一部分，并且被包括以进一步证明本发明的某些方面。通过结合本文给出的具体实施方案的详细描述参考这些附图中的一个或更多个，可以更好地理解本发明。图1A-B-是示出实施方案的探针系统的非限制性示例性示意图。图1A，可切割探针包含在其5’端的报告基团标记的isoG核苷酸(“isoG＊”)、第一序列区(“标签A(TagA)”)、第二序列区(“标签B”)、环序列、为标签B的反向互补序列的序列区(“标签B互补序列”)；和与靶扩增子互补的序列(表示为“A”)。可切割探针还包含“A”序列中的一个或更多个核糖核苷酸(由实心正方形指示)，并且可包含阻断在3’端上延伸的修饰(表示为“P”)。在靶扩增子的存在下，可切割探针与扩增子杂交，并在核糖核苷酸位置被RNA酶H切割。切割后，探针可通过标签B和标签B互补序列与其自身杂交，形成发夹。探针的延伸将合成与标签A序列互补的序列，并且将引入淬灭基团标记的isoC(“isoCQ”)。得到的发夹探针淬灭标记的isoG的荧光。图1B.可以将探针设计为具有独特的解链温度(Tm)，例如通过调节序列区的序列和长度。因此，可以对具有不同解链温度(因此在不同温度下不淬灭)的差异探针进行解链分析。图2-具有可变茎、环、Tm和ΔG的实施方案的非限制性示例性探针构建体。如图1所详述的设计探针。示出了每个探针的序列(从上到下列出的SEQIDNO：1-11)。标签A序列是粗体并且茎由3个区段构成：序列特异性(B，下划线的核苷酸)、通用序列(C，斜体的核苷酸)和以荧光团标记的异碱基结尾的可延伸的通用序列(A，黑体字体核苷酸)。图3-实施方案的非限制性示例性靶特异性探针设计(从上到下列出的SEQIDNO：12-21)。茎的三个区段如图2所示。图4-图示出了用于评估图2所示构建体的发夹折叠的温度梯度。图5-图示出了随着退火温度逐步降低，RTx-5构建体的作为时间之函数的荧光淬灭(参见例如图4)。达到71℃的温度步骤时观察到完全淬灭。图6-图示出了随着退火温度逐步降低，RTx-10构建体的作为时间之函数的荧光淬灭(参见例如图4)。达到62℃的温度步骤时观察到完全淬灭。图7-图示出了随着退火温度逐步降低，RTx-11构建体的作为时间之函数的荧光淬灭(参见例如图4)。达到41℃的温度步骤时观察到完全淬灭。图8A-8C-图示出了在50℃、62℃和68℃下从构建体RTx-1和RTx-2获得的扩增(上图)和解链曲线(下图)。图9A-9C-图示出了在50℃、62℃和68℃从构建体RTx-7和RTx-8获得的扩增(上图)和解链曲线(下图)。图10A-10C-图示出了在50℃、62℃和68℃从构建体RTx-9、RTx-10和RTx-11获得的扩增(上图)和解链曲线(下图)。图11A-11D-图示出了全长探针FL-RTx-2-20(A)、FL-RTx-2-12AT1(B)、FL-RTx-2c(C)和FL-RTx-2-12-AT-4(D)的扩增(上图)和解链(下图)曲线。对照：水＝细实线，临床阴性试样＝虚线。测试探针结果以粗实线示出。图12-是示出实施方案的探针系统的非限制性示例性示意图。报告基团探针(reporterprobe)包含在其5’端的报告基团标记的isoC核苷酸(“isoC＊”)、第一序列区(“区1”)、包含isoG和/或isoC位的序列(“isoprimer”)；和与扩增子互补的序列(表示为“A”)。与扩增子互补的序列还包含至少一个核糖核苷酸位置。在靶扩增子存在下，报告基团探针与扩增子杂交，并在核糖核苷酸位置被RNA酶H切割。切割后，报告基团探针可与捕获寡核苷酸(“captureoligonucleotide或captureoligo”)杂交，捕获寡核苷酸包含与isoprimer和任选的A序列部分互补的捕获区段，然后是镜像标签区(mirrortagregion)和3’未标记的isoC。报告基团探针的延伸将合成与捕获寡核苷酸上的镜像区1互补的序列，并且将引入淬灭基团标记的isoG(“isoGQ”)。延伸的报告基团探针现在包含区1和区1互补序列，其允许探针形成发夹，从而淬灭标记的isoC的荧光。可以将探针设计为具有独特的解链温度(Tm)，例如通过调节第一序列区的序列和长度。因此，可以对具有不同解链温度(因此在不同温度下不淬灭)的差异探针进行解链分析。图13-在解链分析期间获得的数据的反向导数(invertedderivative)的图。图14-使用相同荧光团的多重探针的解链谱数据。图15-示出了实施方案的探针系统的非限制性示例性示意图，其中探针包含荧光团(“F”)和淬灭基团(“Q”)二者，以及核糖切割(“R”)位点。在核糖切割位点切割后，延伸导致荧光团和淬灭基团的分离，以使得可以观察到信号中可检测的变化。图16-示出了实施方案的探针系统的非限制性示例性示意图，其中探针包含荧光团(“F”)和淬灭基团(“Q”)两者。5’核酸酶切割，随后延伸导致荧光团和淬灭基团的分离，使得可以观察到信号的可检测变化。图17-示出了实施方案的探针系统的非限制性示例性示意图，其中探针包含位于第二序列区和为第二序列区的反向互补序列的序列(B和B′)之间的一个或更多个核苷酸的环序列，其中环序列与靶核酸的序列互补。说明性实施方案的描述解链分析检测利用解链或退火峰以区分扩增子的身份，但是这些解链峰在相同温度附近解链的扩增子中并不容易被区分，并且易于受到靶标的天然序列组成的影响。通过产生具有唯一解链谱的发夹序列，可以在单色通道中实现多重性，由此使得能够用多色通道实现甚至更多的多重性。公开了用于检测样品中的核酸的方法和试剂盒。通常，所述方法包括检测信号，例如从荧光团发射的信号。还公开了可以用于检测靶核酸的寡核苷酸，特别是探针。实施方案的特定方法中采用可延伸探针以通过产生每个荧光团的多个解链曲线来促进多重性。在一些情况下，探针由发夹结构构成，所述发夹结构具有在3’端的序列特异性尾部和在以荧光团标记的异碱基结束的5’端的可延伸通用序列。与其他基于探针的化学物质不同，序列特异性区段用于靶标识别和发夹的释放用于检测。在一些方面，发夹的释放基于随着探针的序列特异性尾部与模板杂交而产生的RNA/DNA杂交体的切割。因此，序列特异性区段没有或仅少数(例如3-4个)碱基引入发夹结构中，发夹结构主要由靶独立序列构成。改变发夹的可延伸区段的长度产生具有多种尺寸的发夹，从而允许每个荧光团产生多个解链曲线。I.定义本文中使用的“核酸”意指DNA或RNA，单链或双链及其任意化学修饰。修饰包括但不限于提供其它化学基团的那些，其整合另外的电荷、极性、氢键、静电相互作用以及对核酸配体碱基或整个核酸配体的流动性(fluxionality)。这样的修饰包括但不限于，2’位的糖修饰，5位的嘧啶修饰，8位的嘌呤修饰，环外胺处的修饰，4-硫代尿苷的替换，5-溴或5-碘代-尿嘧啶的替换，骨架修饰，甲基化和不常见的碱基配对组合，例如异碱基。因此，本文所述的核酸不仅包括标准碱基腺嘌呤(A)，胞嘧啶(C)，鸟嘌呤(G)，胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)，还包括非标准的或非天然的核苷酸。例如在U.S.专利No.5,432,272，5,965,364，6,001,983，6,037,120和6,140,496中描述了形成氢键碱基配对的非标准或非天然核苷酸，通过引用将这些专利全部并入本文。“非标准核苷酸”或“非天然核苷酸”意指除了A、G、C、T或U之外的碱基，其易于整合至寡核苷酸中并且能够通过氢键或疏水、熵或范德华相互作用与互补的非标准或非天然核苷酸碱基配对以形成碱基对。一些实例包括US专利No.6,037,120中举例说明的iso-C/iso-G，K/X，K/P，H/J和M/N的碱基对组合，所述文献通过引用并入本文。这些非标准或非天然核苷酸对的氢键类似于天然碱基的那些，其中配对的非标准或非天然核苷酸的氢键受体和氢键供体之间形成两个或三个氢键。天然碱基与这些非标准或非天然核苷酸的一个区别在于氢键受体和氢键供体的数目和位置。例如，胞嘧啶可以被认为是供体/受体/受体碱基，而鸟嘌呤是互补的受体/供体/供体碱基。Iso-C是受体/受体/供体碱基，而iso-G为互补的供体/供体/受体碱基，如US专利No.6,037,120中所举例说明的，所述文献通过引用并入本文。用于寡核苷酸的其他非天然核苷酸包括例如以下中讨论的萘、菲和芘衍生物：Ren等，1996和McMinn等，1999，两者都通过引用并入本文。这些碱基不利用氢键来稳定，而是依靠疏水或范德华相互作用形成碱基对。本文使用的术语“样品”以其最宽的含义使用。样品可以包括身体组织或体液，所述体液包括但不限于血液(或者血液级分，例如血浆或血清)、淋巴、粘液、眼泪、尿和唾液。样品可以包括细胞、染色体、细胞器或病毒的提取物。样品可以包含DNA(例如基因组DNA)，RNA(例如mRNA)，和/或cDNA，可以扩增任意它们以提供扩增的核酸。样品可以包含溶液中的核酸或者结合至基底(例如微阵列的一部分)。样品可以包括从环境地点(例如，水体，土壤等)获得的材料，或者从传染物(fomite)(即用来使病原体从一个宿主转移至另一个宿主的无生命物体)获得的材料。术语“核酸源”是指含有核酸(RNA或DNA)的任何样品。特别优选的靶核酸源是生物样品，包括但不限于，血液、血浆、血清、唾液、脑脊液、胸腔液、乳汁、淋巴、痰和精液。本文中使用的术语“检测限(limitofdetection)”是指可以被检测和定量的分析物(例如核酸)的最低水平或最低量。检测限可以表示为摩尔值(例如，2.0nM的检测限)，按克的测量值(例如特定反应条件下的2.0微克的检测限)，拷贝数(例如1×105拷贝数的检测限)，或其它本领域已知的表达方式。本文中使用的关于核酸分子的术语“分离的”是指从生物体和生物材料(例如血液、细胞、血清、血浆、唾液、尿、粪便、痰、鼻咽吸出物等)分离的核酸分子，其存在于核酸分子的天然来源中。当通过重组技术产生时，分离的核酸分子(例如cDNA分子)可以基本不含有其它细胞材料或者培养基，或者当化学合成时，所述分离的核酸分子基本不含有化学前体或其它化学物质。在一些实施方案中，还可以分离或纯化编码多肽/蛋白质的核酸分子。核酸分离的方法是本领域公知的，可以包括总核酸分离/纯化方法、RNA特异性分离/纯化方法、或DNA特异性分离/纯化方法。本文中使用的术语“微阵列”是指多个多核苷酸、多肽或其它化学化合物在基底上的排列。术语“元件”和“阵列元件”是指在微阵列上具有唯一和确定位置的多核苷酸、多肽或其它化学化合物。本文中使用的寡核苷酸理解为具有骨架上之碱基序列的分子，所述骨架主要由具有确定间隔的相同单体单元构成。所述碱基在所述骨架上以这样的方式排列，使其可以与核酸键合，所述核酸具有与所述寡核苷酸的碱基互补的碱基序列。最常见的寡核苷酸具有糖磷酸单元骨架。由2’位置不具有羟基的“dNTP”构成的寡脱氧核糖核苷酸和由2’位置具有羟基的“NTP”构成的寡核糖核苷酸之间可有差别。寡核苷酸还可以包括衍生物，其中羟基的氢被有机基团(例如烯丙基)取代。寡核苷酸为包含至少两个核苷酸的核酸。用在本文公开方法中的寡核苷酸通常包含至少大约10个核苷酸，更通常至少大约15个核苷酸。用于本文公开的方法的优选寡核苷酸包含大约10-25个核苷酸。寡核苷酸可以被设计作为“引物”。“引物”是短核酸，通常为ssDNA寡核苷酸，其可以通过互补碱基配对来与靶多核苷酸退火。然后，可沿着靶DNA或RNA链通过聚合酶(例如DNA聚合酶)延伸所述引物。引物对可以用于扩增(和鉴定)核酸序列(例如通过聚合酶链式反应(PCR))。寡核苷酸可以被设计作为“探针”。“探针”是指用于检测相同、等位或相关核酸序列的寡核苷酸、其互补序列或其片段。探针可以包含已经连接至可检测标记物或报告基团分子的寡核苷酸。典型的标记物包括荧光染料、淬灭基团、放射性同位素、配体、闪烁剂、化学发光剂和酶。可以将寡核苷酸设计为对样品中的靶核酸序列具有特异性。例如，可以将寡核苷酸设计为包括靶核酸的“反义”核酸序列。本文中使用的术语“反义”是指能够与特定靶核酸序列的“有义”(编码)链进行碱基配对的任意组成。反义核酸序列可以与靶核酸序列“互补”。本文中使用的“互补性”描述了通过碱基配对而退火的两个单链核酸序列之间的关系。例如，5′-AGT-3′与其互补序列3′-TCA-5′配对。在一些实施方案中，可以将引物或探针设计为包含不同位置处的错配。本文中使用的“错配”意指不包括标准Watson-Crick碱基对的核苷酸对，或者没有优先形成氢键的核苷酸对。所述错配可以包含被靶标中特定碱基替换的非天然或非标准核苷酸或者天然核苷酸。例如，探针或引物序列5′-AGT-3′与靶序列3′-ACA-5′具有单个错配。所述探针或引物的5’“A”与靶标的3’“A”错配。类似地，靶序列5′-AGA-3′与探针或引物序列3′-(iC)CT-5′具有单个错配。此处，iso-C替换了天然“T”。然而，序列3′-(iC)CT-5′与序列5′-(iG)GA-3′没有错配。还可以将寡核苷酸设计为简并寡核苷酸。本文中使用的“简并寡核苷酸”意在包括含有不同序列混合物的寡核苷酸群、寡核苷酸库(pool)或多个寡核苷酸，其中序列差异发生在所述群的每个寡核苷酸的特定位置上。多种替换可以包括任意天然或非天然核苷酸，并且可以包括任意数目的在任意给定位置上不同的可能核苷酸。例如，上述简并寡核苷酸可以替代地包括R＝iC或iG，或者R＝A或G或T或C或iC或iG。本文中描述的寡核苷酸通常能够与具有互补碱基序列的寡核苷酸形成氢键。这些碱基可包括天然碱基，例如A、G、C、T和U，以及人工的、非标准或非天然核苷酸，例如iso-胞嘧啶和iso-鸟嘌呤。如本文中描述的，当与第二序列的连续碱基(从3′至5′读)比较时，第一序列的连续碱基(从5′至3′读)遵循Watson-Crick的碱基配对规则时，寡核苷酸的第一序列被描述为与寡核苷酸的第二序列100％互补。寡核苷酸可以包括核苷酸替换。例如，人工碱基可以用于代替天然碱基，以使得所述人工碱基显示与天然碱基类似的特异性相互作用。对靶核酸具有特异性的寡核苷酸还可以对与所述靶核酸序列具有“同源性”的核酸序列具有特异性。本文中使用的“同源性”是指两个或更多个多核苷酸序列或者两个或更多个多肽序列之间的序列相似性或(可互换地)序列同一性。用于多核苷酸序列的术语“百分比同一性”和“％同一性”是指采用标准算法(例如BLAST)时比对的至少两个多核苷酸序列之间残基匹配的百分比。对靶核酸具有特异性的寡核苷酸将在适当条件下与靶核酸“杂交”。本文中使用的“杂交”或“与......杂交”是指在限定的杂交条件下，寡核苷酸单链经碱基配对与互补链退火的过程。“特异性杂交”是指两个核酸序列共有高度互补性。在允许退火的条件下形成特异性杂交复合物，并在任意后续洗涤步骤之后保持杂交。允许核酸序列退火的条件可以由本领域普通技术人员常规地确定，并且可以在例如大约6×SCC存在下于65℃下进行。可以部分参照进行洗涤步骤的温度表示杂交的严格性。在确定的离子强度和pH下，通常选定的温度比特异性序列的热解链点(Tm)低大约5℃至20℃。Tm是指50％靶序列与完全匹配的探针杂交的温度(在确定的离子强度和pH下)。计算Tm的等式例如最邻近参数(nearest-neighborparameter)，并且核酸杂交的条件是本领域已知的。本文中使用的“靶标”或“靶核酸”是指含有至少与寡核苷酸部分互补之序列的核酸分子，所述寡核苷酸例如为探针或引物。“靶”序列可以包括基因或基因组的一部分。本文中使用的“核酸”、“核苷酸序列”或“核酸序列”是指核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸或其任意片段，以及天然存在或合成的分子。这些术语还指基因组或合成来源的DNA或RNA，其可以为单链或双链，并且可以表示有义或反义链，或者任何DNA样或RNA样材料。提及DNA序列的“RNA等同物”由与参照DNA序列相同的核苷酸线性序列构成，不同之处在于含氮碱基胸腺嘧啶全部被尿嘧啶取代以及糖骨架由核糖而不是脱氧核糖构成。RNA可以用于本文所述的方法中，和/或可以通过在本文所述方法中采用的逆转录转化为cDNA。本文中使用的“扩增”是指产生核酸序列的另外的拷贝。通常采用本领域已知的聚合酶链式反应(PCR)进行扩增。术语“扩增反应系统”是指使核酸靶序列的拷贝增加的任意体外装置。术语“扩增反应混合物”是指包含用于扩增靶核酸之多种试剂的水溶液。这些试剂可以包括酶(例如热稳定聚合酶)、缓冲水溶液、盐、扩增引物、靶核酸、核苷三磷酸，以及任选地，至少一个标记的探针和/或任选地，至少一个用于确定经扩增靶核酸的解链温度的试剂(例如在双链核酸存在下表现出荧光改变的荧光嵌入剂)。本文描述的扩增方法可以包括“实时监测”或“持续监测”。这些术语是指，在PCR循环期间监测多次，优选在温度转变期，并且更优选在每个温度转变时获得至少一个数据点。术语“均匀检测测定(homogeneousdetectionassay)”用来描述包括偶联的扩增和检测的测定，其可以包括“实时监测”或“持续监测”。核酸扩增可以包括核酸或这些核酸之亚区域的扩增。例如，扩增可以包括通过选择适当引物序列和采用PCR对30至50、50至100或100至300碱基长的核酸部分进行扩增。在另一些方面，可以采用等温扩增技术(即，不需要热循环)实现扩增。例如，等温核酸扩增的方法，例如U.S.专利6,410,278和US专利公开20080182312中提供的环介导等温扩增(loopmediatedisothermalamplification，LAMP)，每个所述文献通过引用整体并入本文。所公开的方法可以包括对样品中至少一个或更多个核酸进行扩增。在所公开的方法中，采用实时方法对扩增进行监测。扩增混合物可以包含天然核苷酸(包括A、C、G、T和U)和非天然或非标准核苷酸(例如，包括iC和iG)。DNA和RNA寡核苷酸分别包括通过磷酸二酯键偶联的脱氧核糖或核糖。每个脱氧核糖或核糖包含与糖偶联的碱基。天然存在的DNA和RNA中整合的碱基为腺苷(A)、鸟苷(G)、胸苷(T)、胞苷(C)和尿苷(U)。这五个碱基是“天然碱基”。根据Watson和Crick阐述的碱基配对规则，所述天然碱基杂交以形成嘌呤-嘧啶碱基对，其中G与C配对，A与T或U配对。这些配对规则有利于寡核苷酸与互补寡核苷酸的特异性杂交。每个碱基对的两个碱基之间产生两个或三个氢键有利于天然碱基形成碱基对。每个碱基包含两个或三个氢键供体和氢键接受者。通过一个碱基上的至少一个氢键供体与另一碱基上的氢键接受者的相互作用来各自形成碱基对的氢键。氢键供体包括例如，具有至少一个连接的氢的杂原子(例如，氧或氮)。氢键接受者包括例如具有孤对电子的杂原子(例如，氧或氮)。本文中使用的天然或非天然核苷酸可以通过非氢键合位点的替换而衍生，以形成经修饰的天然或非天然核苷酸。例如，通过将反应官能基团(例如，巯基、肼、醇、胺等)偶联至核苷酸的非氢键合原子，可将天然核苷酸衍生以连接至支持物。另一些可能的取代物包括例如，生物素、洋地黄毒苷、荧光基团、烷基(例如甲基或乙基)等。根据本文所公开方法的非天然核苷酸的用途可延伸超出了对样品中存在之核酸序列的检测和定量。例如，通过催化与核酸相关的反应的多种酶，可以识别非天然核苷酸。虽然聚合酶需要互补核苷酸以继续聚合并延伸寡核苷酸链，但是其它酶并不要求互补核苷酸。如果非天然核苷酸存在于模板中并且反应混合物中不存在其互补非天然核苷酸，则当尝试将延长的引物延伸通过所述非天然核苷酸时，聚合酶通常会停止(或者，在一些情况下，当给予足够量的时间时，会错整合碱基)。然而，催化与核酸相关的反应的另一些酶，例如连接酶、激酶、核酸酶、聚合酶、拓扑异构酶、解旋酶等，可以催化涉及非天然核苷酸的反应。非天然核苷酸的这些特征可以被利用，并落在本文公开的方法和试剂盒的范围内。本文所公开的包括非天然核苷酸的核苷酸可以偶联标记物(例如淬灭基团或荧光团)。可以采用本领域已知的方法进行偶联。本文方法中的寡核苷酸可以作为引物。在一些实施方案中，所述寡核苷酸被标记。例如，用发射可检测信号的报告基团(例如荧光团)标记寡核苷酸。寡核苷酸可以包括至少一个非天然核苷酸。例如，寡核苷酸可以包含具有不是A、C、G、T或U碱基的至少一个核苷酸(例如，iC或iG)。当寡核苷酸用作例如用于PCR的引物时，扩增混合物可以包括至少一个标记有淬灭基团(例如Dabcyl)的核苷酸。所述经标记的核苷酸可以包含至少一个非天然或非标准核苷酸。例如，所述经标记的核苷酸可以包含具有不是A、C、G、T或U的碱基的至少一个核苷酸(例如，iC或iG)。在一些实施方案中，可以将寡核苷酸设计为不形成分子内结构(例如发夹)。在另一些实施方案中，可以将寡核苷酸设计为形成分子内结构(例如发夹)。例如，可以将寡核苷酸设计为形成发夹结构，这在所述寡核苷酸与靶核酸杂交之后，以及任选地，在采用所述寡核苷酸作为引物对靶核酸进行扩增之后发生改变。寡核苷酸可以用荧光团标记，当所述寡核苷酸作为引物整合至扩增的产物中时，所述荧光团表现出淬灭。在另一些实施方案中，在寡核苷酸作为引物整合至扩增的产物中之后，所述寡核苷酸可以发射可检测信号(例如，固有地，或通过荧光诱导或荧光去淬灭(dequenching))。这样的引物是本领域已知的(例如，LightCycler引物、AmplifluorTM引物、ScorpionTM引物和LuxTM引物)。当嵌入双链核酸时，用于标记寡核苷酸的荧光团可以发射信号。因此，在寡核苷酸作为引物扩增核酸后，荧光团可以发射信号。用于所公开方法的寡核苷酸可以适合作为引物以扩增样品中的至少一个核酸，以及作为探针以检测样品中的至少一个核酸。在一些实施方案中，用至少一个荧光染料标记寡核苷酸，其可以产生可检测信号。所述荧光染料可以作为荧光供体以进行荧光共振能量转移(fluorescenceresonanceenergytransfer，FRET)。当寡核苷酸用于扩增靶核酸时，所述可检测信号可被淬灭。例如，扩增混合物可以包含用荧光团发射的可检测信号的淬灭基团标记的核苷酸。任选地，寡核苷酸可以标记有第二荧光染料或可作为荧光接受者的淬灭基团染料(例如用于FRET)。当寡核苷酸标记有第一荧光染料和第二荧光染料时，可以检测所述第一荧光染料、第二荧光染料或者两者的信号。可以在一定的温度梯度下检测信号(例如为了确定扩增子、包含与靶核酸杂交之探针的复合物、发夹或T探针复合物的解链温度)。可以用任意适当数目的寡核苷酸进行所公开的方法。当采用多个寡核苷酸(例如2个或更多个寡核苷酸)时，不同的寡核苷酸可以用能够产生可检测信号的不同荧光染料标记。在一些实施方案中，寡核苷酸标记有两种不同荧光染料中的至少一种。在另一些实施方案中，寡核苷酸标记有三种不同荧光染料中的至少一种。在一些实施方案中，每种不同荧光染料发射的信号可以与用来标记寡核苷酸的其它任意不同荧光染料发射的信号区分。例如，不同荧光染料可具有最大发射波长，所有最大发射波长相互之间相差至少大约5nm(优选至少大约10nm)。在一些实施方案中，每个不同荧光染料被不同波长能量激发。例如，不同荧光染料可具有最大吸收波长，所有最大吸收波长相互之间相差至少大约5nm(优选至少大约10nm)。当采用荧光染料确定所述方法中核酸的解链温度时，荧光染料可发射的信号可以与用来标记寡核苷酸的其它任意不同荧光染料发射的信号区分。例如，用于确定核酸解链温度的荧光染料具有的最大发射波长可与用来标记寡核苷酸的其它任意荧光染料的最大发射波长相差至少大约5nm(优选至少大约10nm)。在一些实施方案中，用于确定核酸解链温度的荧光染料可以被不同于用来标记寡核苷酸的其它任意不同荧光染料之波长能量的波长能量激发。例如，用于确定核酸解链温度的荧光染料的最大吸收波长可与用来标记寡核苷酸的任意荧光染料的最大吸收波长相差至少大约5nm(优选至少大约10nm)。所述方法可以包括确定样品中至少一个核酸(例如，扩增子或包含与靶核酸杂交之探针的核酸复合物)的解链温度，其可以用于鉴定核酸。确定解链温度可以包括将扩增子或核酸复合物暴露于温度梯度，并观察荧光团的可检测信号。任选地，当所述方法的寡核苷酸标记有第一荧光染料时，确定检测的核酸的解链温度可以包括观察与第一荧光染料不同的第二荧光染料的信号。在一些实施方案中，用于确定检测的核酸之解链温度的第二荧光染料是嵌入剂。适当的嵌入剂可以包括但不限于，SYBRTMGreen1染料、SYBR染料、PicoGreen、SYTO染料、SYTOX染料、溴化乙锭、乙锭同源二聚体-1、乙锭同源二聚体-2、乙锭衍生物、吖啶、吖啶橙、吖啶衍生物、乙锭-吖啶异源二聚体、单叠氮乙锭(ethidiummonoazide)、碘化丙啶、花青素单体、7-氨基放线菌素D、YOYO-1、TOTO-1、YOYO-3、TOTO-3、POPO-1、BOBO-1、POPO-3、BOBO-3、LOLO-1、JOJO-1、花青素二聚体、YO-PRO-1、TO-PRO-1、YO-PRO-3、TO-PRO-3、TO-PRO-5、PO-PRO-1、BO-PRO-1、PO-PRO-3、BO-PRO-3、LO-PRO-1、JO-PRO-1、及其混合物。在一些合适的实施方案中，所选择的嵌入剂为SYBRTMGreen1染料。在所公开的方法中，每个经扩增的靶核酸或报告基团探针-模板对具有不同的解链温度。例如，每个经扩增的靶核酸或报告基团探针-模板对的解链温度可与其它任意经扩增靶核酸或报告基团探针-模板对的解链温度相差1-10℃，例如至少大约1℃，更优选至少大约2℃，或甚至更优选至少大约4℃。本文中使用的“标记物”或“报告基团分子”是用于标记核酸的化学或生化部分。“标记物”和“报告基团分子”包括荧光剂、化学发光剂、生色剂、淬灭剂、放射性核素、酶、底物、辅因子、闪烁剂、抑制剂、磁性颗粒和其它本领域已知的部分。“标记物”或“报告基团分子”能够产生可测量的信号，并且可以与寡核苷酸共价或非共价连接。本文中使用的“荧光染料”或“荧光团”为可以被光激发而发射荧光的化学基团。一些合适的荧光团可以被光激发而发射磷光。染料可以包括能够将荧光供体染料的荧光信号淬灭的接受者染料。可以用于所公开方法中的染料包括但不限于，荧光团，例如红色荧光方酸菁染料(例如2，4-双[1，3，3-三甲基-2-二氢亚吲哚基甲基]环丁烯二-1，3-二氧戊环)、红外染料(例如2，4双[3，3-二甲基-2-(1H-苯基[e]二氢亚吲哚基甲基)]环丁烯二-1，3-二氧戊环)或橙色荧光方酸菁染料(例如2，4-双[3，5-二甲基-2-吡咯基]环丁烯二-1，3-二氧戊环)。荧光团的另一些非限制性实例包括：量子点，AlexaFluorTM染料，AMCA，BODIPYTM630/650，BODIPYTM650/665，BODIPYTM-FL，BODIPYTM-R6G，BODIPYTM-TMR，BODIPYTM-TRX，CascadeBlueTM，CyDyeTM(包括但不限于Cy2TM、Cy3TM和Cy5TM)，DNA嵌入染料，6-FAMTM，荧光素，HEXTM，6-JOE，OregonGreenTM488，OregonGreenTM500，OregonGreenTM514，PacificBlueTM，REG，藻胆蛋白包括但不限于藻红蛋白和别藻蓝蛋白，RhodamineGreenTM，RhodamineRedTM，ROXTM，TAMRATM，TETTM，四甲基罗丹明，或TexasRedTM。荧光染料或荧光团可以包括经修饰以有利于缀合至另一反应分子的衍生物。因此，荧光染料或荧光团可以包括胺反应衍生物，例如荧光团的异硫氰酸盐衍生物和/或琥珀酰亚胺酯衍生物。所公开方法的寡核苷酸和核苷酸可以用淬灭基团标记。淬灭可包括动态淬灭(例如通过FRET)，静态淬灭或两者。适当的淬灭基团包括Dabcyl。适当的淬灭基团还包括暗淬灭基团，其可以包括以商品名″BHQ″销售(例如，BHQ-0、BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3，BiosearchTechnologies，Novato，CA)的黑洞淬灭基团。暗淬灭基团还可以包括以商品名″QXLTM″销售(Anaspec，SanJose，CA)的淬灭基团。暗淬灭基团还可以包括包含2，4-二硝基苯基的DNP型非荧光团。本文公开的方法和组合物可用于区室化反应。用于区室化反应的一种方法是使用液滴，其是被第二流体或者被第二流体和一个或更多个表面完全包围的第一流体的分离体积。在分子诊断和生命科学研究领域中，这通常是两种不混溶的液体。本文公开的多个实施方案采用在非水连续相中包含多个水性液滴的油包水乳液。水滴的全部或子集可以包含感目的分析物。通常通过在一种或更多种表面活性剂的存在下将两种不混溶相(例如水和油)组合而形成乳液。乳液的基本类型是水包油(o/w)、油包水(w/o)和双连续的(bi-continuous)。在基于液滴的生物测定中，乳液通常是油包水乳液，其中测定试剂(例如，PCR引物，盐，酶等)包含在水相中。“油”相可以是单一油或不同油的混合物。任何合适的非水流体可以形成本文公开的乳液的非水连续相。在一些实施方案中，非水连续相包含矿物油、硅油或氟化油(例如，FC-40[Sigma-Aldrich])。可以通过多种技术使液滴成像。为了便于成像，可以使包含液滴的组合物分散在表面上，以使得液滴基本上以单层设置在表面上。成像表面可以例如在载玻片上或在室(例如玻璃或石英室)中。可以使用成像系统检测液滴，以及液滴内的标记的分析物或反应产物(例如，发夹探针)。例如，检测可以包括对从标记的发夹探针发射的荧光波长和/或荧光强度成像。在液滴还包含编码的颗粒(例如编码的微球)的实施方案中，成像可以包括对编码的颗粒采集解码图像并进行测定成像以检测液滴中的探针。解码图像和测定图像的比较通过使用荧光团的组合允许更大的多重能力。本发明的方法还可以包括将来自直接或间接标记的扩增产物的信号与样品中的DNA或RNA的浓度相关联。可适于与本文公开的方法和组合物一起使用的成像系统的实例描述于美国专利No.8,296,088和美国专利公开2012/0288897中，其通过引用并入本文。如上所述，聚合酶链式反应(PCR)是可以在液滴内进行的反应的实例。特别地，液滴可用于数字PCR(dPCR)技术。dPCR包括分隔样品，使得包含在样品中的独立核酸分子位于许多分开的区域中，例如微孔板的独立孔中，在乳液的分散相中，或核酸结合表面的阵列中。每个分区(例如，液滴)将含有0个或大于0个分子，分别提供阴性反应或阳性反应。与常规PCR不同，dPCR不依赖于扩增循环的数目来确定样品中靶核酸的初始量。因此，dPCR消除了对指数数据的的依赖以量化靶核酸并提供绝对定量。珠乳液PCR(其克隆性扩增乳液中珠上的核酸)是dPCR技术的一个实例，其中反应分隔在液滴中。参见例如美国专利No.8,048,627和7,842,457，其通过引用并入本文。当如下面更详细讨论的在乳液中进行dPCR时，乳液应该是热稳定的，以允许其经受热循环条件。存在在乳液中进行dPCR的多种方法。例如，在一种方法中，将DNA样品稀释至适当浓度，与PCR试剂(引物，dNTP等)混合，并如上所述包封在乳液中的液滴中，得到多个离散的反应样品。对液滴进行PCR热循环，并通过如上所述的荧光(或其他合适的报告基团)成像检测扩增子。在本发明可切割探针实施方案的上下文中，通过探针的荧光(或其他合适的报告基团)检测扩增子。液滴的热循环可以通过本领域已知的任何合适的技术进行。例如，液滴可以在管或室中热循环，而不是可以被加热和冷却。在一些实施方案中，所述方法使用持续流扩增来扩增核酸模板。已经报道了连续流扩增的多种方法。例如，美国专利No.7,927,797(其通过引用并入本文)描述了与连续流动PCR结合使用的油包水乳液。也可以在液滴中进行等温反应(例如，滚环扩增、全基因组扩增、NASBA或链置换扩增)。该系统还可用于监测液滴，同时提高或降低温度以获得每个液滴的解链谱，这将允许多重检测和定量。探针本身可以在液滴内使用以等温信号放大以使得不需要其他形式的扩增(例如PCR或其他等温扩增反应)来检测液滴内低拷贝数的靶标。II.实施例包括以下实施例以证明本发明的一些优选实施方案。本领域技术人员应当理解，以下实施例中公开的技术代表由发明人发现的在本发明的实践中良好地起作用的技术，因此可以被认为构成其实践的一些优选模式。然而，根据本公开内容的教导，本领域技术人员应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对所公开的具体实施方案进行许多改变，并且仍然获得相同或相似的结果。实施例1.多探针系统用于分子测定的溶液相多重策略依赖于多个荧光团的使用并结合多个荧光解链曲线的产生以检测＞10种靶标。本文公开的多个实施方案提供基于实时探针的化学，其允许通过利用可延伸发夹探针以产生每个通道的多个解链曲线来实现更高的多重性能力。在图1A中示出了用于该系统的探针的一个实例。在该实例中，可切割探针包含在其5’端的报告基团标记的isoG核苷酸(“isoG＊”)、第一序列区(“标签A”)、第二序列区(“标签B”)、环序列、与标签B反向互补的序列区(“标签B互补序列”)；和与靶扩增子互补的序列(表示为“A”)。可切割探针还包含“A”序列中的一个或更多个核糖核苷酸(由实心正方形指示)，并且可包含阻断3’端上的延伸的修饰(表示为“P”)。在靶扩增子存在下，可切割探针与扩增子杂交，并在核糖核苷酸位置被RNA酶H2(其识别并切割退火的RNA/DNA杂交体中的核糖核苷酸)切割。切割后，探针可以通过标签B和标签B互补序列与其自身杂交以形成发夹。探针的延伸将合成与标签A序列互补的序列，并且将引入淬灭基团标记的isoC(“isoCQ”)。得到的发夹探针淬灭标记的isoG的荧光。可以将探针设计为具有独特的解链温度(Tm)，例如通过调节第一和第二序列区的序列和长度。因此，可以改变标签A和标签B茎结构的组成和长度以在发夹探针的任何所需的解链温度下分解(resolve)(参见图1B)。材料和方法探针设计参数设计可切割探针的多种构建体而不具有靶序列特异性尾部(切割后)，以确定可延伸发夹的最佳设计参数。序列特异性尾部的靶向Tm比反应温度(约58℃)高10℃。将发夹构建体设计为具有＞60℃的Tm，以允许RNA/DNA杂交体切割后形成单分子结构。设计这些构建体以确定对切割后发夹的环大小(碱基数)、茎大小、吉布斯自由能和Tm的要求。示出了构建的特异性探针的实例(图2)。对于这些概念验证实验，使用在环的每一侧以两个胞嘧啶“夹子”结束的多腺嘌呤残基的环(在斜体字体之间的序列)。1.探针的折叠温度梯度用于通过在95℃至41℃的温度范围内监测发夹的荧光强度的降低来评估这些构建体的折叠谱。将图2的构建体添加到含有BTP-KCIpH9.1缓冲液、2.5mMdNTP、2.5mMMgCl2、1mMDabcyl-isoG和TitaniumTaq酶(Clontech)的反应混合物中。在95℃的初始变性步骤之后，以3℃的增量将反应温度从95℃降低至41℃，每个间隔保持10秒。观察每种构建体的完全淬灭时的温度，记录为发夹的折叠温度。2.发夹环形成的效率：探针的折叠、延伸和淬灭通过测量每种构建体在3个温度下的淬灭速率来评价发夹形成的效率。将图2的构建体添加到含有BTP-KClpH9.1缓冲液、2.5mMdNTP、1mMisoG-dabcyl-和TitaniumTaq酶(Clontech)的反应混合物中。在95℃的2分钟的活化步骤后，将反应在50℃、62℃和68℃下孵育30分钟，以允许发夹折叠、延伸和引入isoG-dabcyl。随后是60℃30秒并递增地增加至95℃的解链曲线循环方案。通过当实现淬灭时产生的Ct值确定反应的效率。3.利用全长探针的单重RT-PCR首先在单重RT-PCR反应中评价使用多探针RTx探针用于扩增反应中的检测的可行性。基于在(图2-3)中评估的发夹设计产生全长探针(具有序列特异性尾部)的多种设计。序列特异性区段的靶Tm比反应的退火温度高约10℃。引物(表1)和探针的序列基于乙型流感病毒的基质基因(matrixgene)。从流感B毒株B/Malaysia/2506/04(Zeptometrix)提取的核酸用作一步RT-PCR反应中的模板。具体地，将PCR引物(正向180nM，反向60nM)和探针(120nM)加入到含有BTP-KClpH9.1缓冲液、2.5mMdNTP、2.5mMMgCl2、1mMDabcyl-isoG、TitaniumTaq酶(Clontech)和MMLV(Promega)和RNA酶H(IDT)的反应混合物中。以下循环条件用于扩增和解链曲线分析：50℃，5分钟；95℃10分钟；95℃10秒，58℃20秒，45个循环，随后是解链程序：60℃30秒和95℃1秒，以40℃的冷却步骤结束。表1：PCR引物引物名称序列Tm(℃)乙型流感正向-短GAAGCATTTGAAATAGCAGAAGG(SEQIDNO：22)61乙型流感反向-短CACAGAGCGTTCCTAGTTTTACT(SEQIDNO：23)62.8结果发夹环的解链谱产生图2发夹探针的解链谱，以确定各种构建体的折叠温度。这通过监测95℃至41℃的温度梯度中荧光强度的下降来测量(图4)。示出了三种示例性构建体RTx-5、RTx-10和RTx-11的淬灭谱的图分别在图5-7中示出。所有研究的结果示于下表2中。发现发夹构建体RTx-1、2、3、5、6、7和8到71℃温度步骤时完全淬灭，对应的所计算的延伸发夹的Tm为约71℃(IDT)。发夹构建体RTx-4、9和10到62℃时淬灭，发夹RTx-11在41℃淬灭。表2：多种发夹探针的折叠温度的总结当比较茎环Tm、ΔG值、环大小和茎大小时，数据表明影响发夹形成的主要因素是茎中的碱基数。次要因素可能是与发夹的折叠相关的吉布斯自由能，因为具有正确折叠Tm的构建体的ΔG低于Tm为62℃和41℃的构建体。发夹环形成的效率扩增将来自图2的发夹结构用于测定在各温度下发夹形成的效率。结果证实了上述观察结果。对于探针RT-x1、2、7和8，反应速率非常快(图8和图9)。对于探针RTx-9和10观察到更慢的反应速率，Ct值为5至10，并且对于RTx11、30-35记录了完全淬灭的最高Ct值(图10)。这些发夹需要更低的温度来形成和延伸，这转化成需要更长的时间来进行折叠。解链曲线分析发夹构建体RTx1、2、3和4的解链曲线分析显示升高的温度导致更尖锐的解链曲线(图8)。这伴随着记录的Tm的轻微偏移。构建体RT-x5和6在62℃下同样同样产生了更尖锐解链曲线，并且没有观察到Tm的偏移。构建体RTx-7和8的解链曲线和Tm偏离对于其他发夹观察到的趋势(图9)。构建体RTx9、10和11产生宽的和重叠的解链曲线(图10)，对应于上文产生的数据。利用全长探针的单重RT-PCR基于在图2和图3的发夹构建体上产生的数据创建全长探针设计。靶向的最小茎大小为8个碱基，环为12-20个残基，发夹环的Tm为55℃-66.4℃。检测所有探针产生在34-35Ct范围内的Ct值(图11A-11D)。大多数探针的解链曲线表明存在一种物质，主要是延伸的发夹。对于一些探针检测到次高(minor，high)Tm峰。除FL-RTx-2-12AT1和FL-RTx-2-12AT2之外，对于所有探针记录到相同的荧光强度。这些探针的计算的发夹环Tm非常接近反应温度(58℃)。降低反应温度可以改善形成的发夹分子的数目并提供更好的检测。特异性包括两个阴性对照(图11A-11D)。包含模板阴性对照(水)的目的是检测由于全长探针被RNA酶H2切割而非特异性形成的发夹。只有探针FL-RTx-2-12-AT-4(图11D)显示了背景非特异性解链曲线，与可能表明探针非特异性切割的发夹的大小相同。使用的第二阴性对照是从无症状患者收集的临床阴性试样。目的是评价在无关模板存在下探针的特异性。没有探针显示与模板的任何非特异性相互作用。实施例2.另外的发夹探针检测系统发夹探针检测系统的另一个实例示出于图12中。报告基团探针包含在其5’端的报告基团标记的isoC核苷酸(“isoC＊”)、第一序列区(“区1”)、包含isoG和/或isoC位的序列(“isoprimer”)；和与扩增子互补的序列(表示为“A”)。与扩增子互补的序列还包含至少一个核糖核苷酸位置。在靶扩增子存在下，报告基团探针与扩增子杂交，并在核糖核苷酸位置被RNA酶H切割。切割后，报告基团探针可与捕获寡核苷酸(“捕获oligo”)杂交，捕获寡核苷酸包含与isoprimer和任选的“A”序列部分互补的捕获区段，然后是镜像区1和3’未标记的isoC。报告基团探针的延伸将合成与捕获寡核苷酸上的镜像标签互补的序列，并且将引入淬灭基团标记的isoG(“isoGQ”)。延伸的报告基团探针现在包含标签和标签互补序列，其允许探针形成发夹，从而淬灭标记的isoC的荧光。可以将探针设计为具有独特的解链温度(Tm)，例如通过调节第一序列区的序列和长度。因此，可以对具有不同解链温度(因此在不同温度下不淬灭)的差异探针进行解链分析。图12的测定系统也可以进一步修改，以使得捕获探针不需要异碱基。在该系统中，报告基团探针包含在其5’端的报告基团标记的isoC核苷酸(“isoC＊”)、第一序列区(“区1”)、包含isoG和/或isoC位的序列(“isoprimer”)；和与扩增子互补的序列(表示为“A”)。与扩增子互补的序列还包含至少一个核糖核苷酸位置。在靶扩增子存在下，报告基团探针与扩增子杂交，并在核糖核苷酸位置被RNA酶H切割。切割后，报告基团探针可与捕获寡核苷酸杂交，捕获寡核苷酸包含与isoprimer和任选的“A”序列部分互补的捕获区段，然后是镜像区1(其与区1序列的一部分相同)。报告基团探针的延伸将合成与捕获寡核苷酸上的镜像区域1互补的序列。然后可切割探针通过区1序列和与同镜像区1互补之序列的碱基配对可形成发夹。发夹序列进一步延伸并且将引入淬灭基团标记的isoG(“isoGQ”)。可以将探针设计为具有独特的解链温度(Tm)，例如通过调节第一序列区的序列和长度。因此，可以对具有不同解链温度(因此在不同温度下不淬灭)的差异探针进行解链分析。图15示出了另一个实施方案，其中探针包含荧光团(F)和淬灭基团(Q)两者。当单链时第一序列区的构象使得荧光团与淬灭基团接近，导致荧光团信号的可检测淬灭。在靶标存在下，探针与靶标杂交，并在核糖核苷酸位置被核糖核酸酶切割。在该特定实施方案中，第二序列区互补序列、核糖核苷酸和核糖核苷酸的靶特异性区域3’与靶标互补。在探针切割后，经切割探针的第二序列区和第二序列区互补序列彼此杂交以形成发夹结构。经切割探针的3’端延伸到第一序列区上产生具有将荧光团置于距淬灭基团更远距离的构象的双链分子，以使得可观察到信号的可检测改变。图16示出了另一个实施方案，其中探针包含荧光团(F)和淬灭基团(Q)两者。当单链时第一序列区的构象使得荧光团与淬灭基团接近，导致荧光团信号的可检测淬灭。在靶标存在下，探针与靶标杂交，并被延伸上游引物的聚合酶的5’核酸酶活性切割。在该特定实施方案中，第二序列区互补序列不与靶标互补。在探针切割后，经切割探针的第二序列区和第二序列区互补序列彼此杂交以形成发夹结构。经切割探针的3’端延伸到第一序列区上产生具有将荧光团置于距淬灭基团更远距离的构象的双链分子，以使得可观察到信号的可检测改变。图17示出了一个实施方案，其中探针包含报告基团-淬灭基团对的成员之一，在该特定情况下，其为荧光团(F)。此外，探针包含第一序列区、第二序列区、环区、第二序列区互补序列、一个或更多个核糖核苷酸和核糖核苷酸的靶标特异性区3’。在该特定实施方案中，环区、第二序列区互补序列、核糖核苷酸和核糖核苷酸的靶标特异性区3’与靶标互补。实施例3.在逆转录PCR中使用具有延伸阻断剂(blocker)的发夹探针将正向引物(FwdPrimer)和反向引物(RevPrimer)与ATG0015探针或T-FL-RTx2c探针在孔中组合，所述探针的不同之处仅在于ATG00015探针在环区中含有3个碳间隔区(iSpC3)，而T-FL-RTx2c没有。将这些与PCR主混合物合并，热循环，随后进行解链分析。ATG0015：/56-FAM//iMe-isodC/ATATCAGTCATTTGCCCAAAA(SEQIDNO：24)/iSpC3/AAACCGCAAATGACrCATGAGACAGTATAGTAGCGCTGA(SEQIDNO：25)/3SpC3/T-FL-RTx2c：/56-FAM//iMc-isodC/ATATCAGTCATTTGCCCAAAAAAAACCGCAAATGACrCATGAGACAGTATAGTAGCGCTGA(SEQIDNO：15)/3SpC3/正向引物-GAAGCATTTGAAATAGCAGAAGG(SEQIDNO：22)反向引物-CACAGAGCGTTCCTAGTTTTACT(SEQIDNO：23)在没有模板的情况下进行逆转录PCR以监测解链分析期间将造成信号改变的非特异性相互作用。产生以下PCR主混合物用于25μL反应，并在ABIFast7500实时热循环仪上运行。热谱包括50℃保持5分钟，95℃保持2分20秒，以下的44个循环：95℃10秒和57℃23秒。解链分析包括从60℃升温至95℃，并且每0.5℃读数。表3：PCR主混合物试剂工作浓度无核酸酶的水10XISOlution1x100mMMgCl22.5mM1MKCl0.05M乙型流感正向引物0.12M乙型流感反向引物0.06M探针0.06MRNA酶H2热启动1mU无甘油的TitaniumTaq1xMMLV逆转录酶0.75图13示出了在解链分析期间获得的数据的反向导数。对于在环区中缺少3碳间隔区的T-FL-RTx2c探针，存在77℃的非特异性解链峰。不希望受理论束缚，认为在50℃的低温逆转录酶步骤期间，在这种情况下的反向引物与环区下游的探针杂交，这允许引物延伸通过环并且引入标记的异碱基对面的淬灭基团。这种杂交还导致核糖碱基被切割，允许探针也沿着引物延伸。在PCR反应期间扩增双链产物。延伸阻断剂防止引物在环区上的非特异性延伸，其不仅防止淬灭基团/荧光团对的形成，而且防止在PCR的58℃退火步骤期间具有足够Tm的双链产物被扩增。实施例4.使用单一染料的多重性该研究证明了使用具有相同荧光团但在各经延伸发夹探针的Tm不同的多个发夹探针的能力。在相同的PCR管中，对甲型流感、乙型流感或腺病毒特异的具有相同的荧光团(FAM)的三种不同探针一起测试。将含有甲型流感、乙型流感或腺病毒的经提取病毒培养物的阳性对照样品置于含有多重PCR反应组分的单独的PCR管中。这些靶标以每个反应1000个拷贝进行测试。可切割的探针序列示于表4中。表4：探针序列产生下列PCR主混合物(表5)用于25μL反应，并在LifeTechnologiesQuantStudio实时PCR热循环仪上运行。热谱包括50℃保持5分钟，95℃保持2分20秒，以下的44个循环：95℃10秒和57℃23秒。解链分析包括从60℃升温至95℃，并且每0.5℃读数。表5：PCR主混合物图14示出了使用相同的多重PCR反应混合物的6个单独反应(以1000个拷贝/反应的三种靶标各自1个阳性，3个无模板对照(NTC)样品)的解链谱数据。从图14可以看到，甲型流感、乙型流感和腺病毒特异性可切割探针在相同的荧光通道中各自产生不同的解链谱。因此，在该实施例中，当使用相同的荧光标记物时，通过解链谱区分了三种不同的病毒。***根据本公开内容的教导，可以进行和执行本文公开和要求保护的所有方法而无需过度实验。虽然已经根据一些优选实施方案描述了本发明的组合物和方法，但是对于本领域技术人员明显的是，可以将变化应用于本文所述方法以及本文所述方法的步骤或步骤的顺序中而不脱离本发明的概念、精神和范围。更具体地，明显的是，化学和生理学相关的某些试剂可以代替本文所述的试剂，同时将实现相同或相似的结果。对于本领域技术人员明显的所有这些类似的替代和修改均被认为在由所附权利要求限定的本发明的精神、范围和概念内。参考文献以下参考文献通过引用具体地并入本文，达到提供示例性程序或对本文所阐述的那些程序进行细节补充的程度。美国专利No.4942,124；4284,412；4,989,977；4,498,766；5,478,722；4,857,451；4,774,189；4,767,206；4,714,682；5,160,974；4,661,913；5,654,413；5,656,493；5,716,784；5,736,330；5,837,832；5,837,860；5,981,180；5,994,056；5,736,330；5,981,180；6,057,107；6,030,787；6,046,807；6,057,107；6,103,463；6,139,800；6,174,670；6,268,222；6,322,971；6,366,354；6,410,278；6,411,904；6,449,562；6,514,295；6,524,793；6,528,165；6,592,822；6,939,720；6,977,161；7,226,737；7,645,868；和7,955,802美国专利申请No.2005/0191625；2008/0182312；和2009/0148849McMinn等，J.Am.Chem.Soc.，121：11585，1999.Ren等，J.Am.Chem.Soc.，118：1671，1996.Vogelstein等，P.C.R.Digital，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96：9236-9241，1996.Yan等，“IsothermalAmplifiedDetectionofDNA和RNA”Mol.GioSyst.10：970-1003，2014.序列表<110>LUMINEXCORPORATION<120>用于在核酸测定中改善解链分辨和多重性的探针<130>LUMN.P0129WO<150>US62/035,783<151>2014-08-11<160>31<170>PatentInversion3.5<210>1<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成探针<400>1atatcagtcattgcccaaaccgcaatgac29<210>2<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成探针<400>2atatcagtcattgcccaaaaaaaaccgcaatgac34<210>3<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成探针<400>3atatcagtcttgcccaaaccgcaagac27<210>4<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成探针<400>4atatcagtcttgcccaaaaaaaaccgcaagac32<210>5<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成探针<400>5atatcagtcaattgcccaaaccgcaattgac31<210>6<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成探针<400>6atatcagtcaattgcccaaaaaaaaccgcaattgac36<210>7<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成探针<400>7atatcagtcaagtgccaaacccacttgac29<210>8<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成探针<400>8atatcagtcaagtgccaaaaaaaacccacttgac34<210>9<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成探针<400>9atatcaggtcagccaaaccctgacc25<210>10<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成探针<400>10atatcagtctgcccaaaccgcagac25<210>11<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成探针<400>11atatcagtcgcccaaaccgcgac23<210>12<211>66<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成探针<220><221>modified_base<222>(42)..(42)<223>胞嘧啶核糖核苷（ribocytosine）<400>12atatcagtcattgcccaaaaaaaaaaaaaaaaccgcaatgaccatgagacagtatagtag60cgctga66<210>13<211>58<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成探针<220><221>modified_base<222>(35)..(35)<223>胞嘧啶核糖核苷<400>13atatcagtcattgcccaaaaaaaaccgcaatgaccatgagacagtatagtagcgctga58<210>14<211>60<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成探针<220><221>modified_base<222>(37)..(37)<223>胞嘧啶核糖核苷<400>14atatcagtcatgtgcccaaaaaaaaccgcacatgaccatgagacagtatagtagcgctga60<210>15<211>60<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成探针<220><221>modified_base<222>(37)..(37)<223>胞嘧啶核糖核苷<400>15atatcagtcatttgcccaaaaaaaaccgcaaatgaccatgagacagtatagtagcgctga60<210>16<211>60<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成探针<220><221>modified_base<222>(37)..(37)<223>胞嘧啶核糖核苷<400>16atatcagtcaattgcccaaaaaaaaccgcaattgaccatgagacagtatagtagcgctga60<210>17<211>58<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成探针<220><221>modified_base<222>(35)..(35)<223>胞嘧啶核糖核苷<400>17atatcagtcattgaccaaaaaaaacctcaatgaccatgagacagtatagtagcgctga58<210>18<211>58<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成探针<220><221>modified_base<222>(35)..(35)<223>胞嘧啶核糖核苷<400>18atatcagtcattacccaaaaaaaaccgtaatgaccatgagacagtatagtagcgctga58<210>19<211>60<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成探针<220><221>modified_base<222>(37)..(37)<223>胞嘧啶核糖核苷<400>19atatcagtcatgtacccaaaaaaaaccgtacatgaccatgagacagtatagtagcgctga60<210>20<211>62<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成探针<220><221>modified_base<222>(39)..(39)<223>胞嘧啶核糖核苷<400>20atatcagtcattgtacccaaaaaaaaccgtacaatgaccatgagacagtatagtagcgct60ga62<210>21<211>70<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成探针<220><221>modified_base<222>(47)..(47)<223>胞嘧啶核糖核苷<400>21atatcagtcaatgtgcccaaaaaaaaaaaaaaaaccgcacattgaccatgagacagtata60gtagcgctga70<210>22<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成引物<400>22gaagcatttgaaatagcagaagg23<210>23<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成引物<400>23cacagagcgttcctagttttact23<210>24<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成探针<400>24atatcagtcatttgcccaaaa21<210>25<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成探针<220><221>modified_base<222>(15)..(15)<223>胞嘧啶核糖核苷<400>25aaaccgcaaatgaccatgagacagtatagtagcgctga38<210>26<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成探针<400>26caaaaaaaagtcatgttaccaaaa24<210>27<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成探针<220><221>modified_base<222>(15)..(15)<223>胞嘧啶核糖核苷<400>27aaacctaacatgaccatgagacagtatagtagcg34<210>28<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成探针<400>28catatcatcatcatctcattttaggcccaaaa32<210>29<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成探针<220><221>modified_base<222>(15)..(15)<223>胞嘧啶核糖核苷<400>29aaaccgcctaaaatccccttagtcagaggtgac33<210>30<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成探针<400>30ctccatcctcctcctcctctctcttcgagaccaaaa36<210>31<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成探针<220><221>modified_base<222>(14)..(14)<223>胞嘧啶核糖核苷<400>31aaacctctcgaagcgtcctgtccggc26当前第1页1 2 3