本发明涉及经单取代的或二取代的吲哚化合物、通过使用所述化合物预防或治疗登革热病毒感染的方法，并且还涉及所述化合物用作药物，更优选地用作治疗或预防登革热病毒感染的药物。此外，本发明涉及这些化合物的药物组合物或组合制剂，涉及用作一种药物、更优选地用于预防或治疗登革热病毒感染的组合物或制剂。本发明还涉及用于制备这些化合物的方法。发明背景通过蚊子或蜱传播的黄病毒在人中引起危及生命的感染，如脑炎和出血热。已知黄病毒登革热的四种不同的但密切相关的血清型，所谓的denv-1、-2、-3和-4。登革热在全世界大多数热带和亚热带地区是地方性的，主要在城市和半城市地区。根据世界卫生组织(who)，25亿人(其中10亿儿童)处于denv感染的风险(who，2002)。估计每年在世界范围内发生5000万至1亿登革热[df]病例、50万严重登革热疾病(即登革出血热[dhf]和登革休克综合征[dss])病例以及超过20,000例死亡。dhf已经成为流行地区中儿童之中住院和死亡的一个主要原因。总而言之，登革热代表虫媒病毒(arboviral)疾病的最常见原因。由于最近在位于拉丁美洲、东南亚和西太平洋的国家(包括巴西、波多黎各、委内瑞拉、柬埔寨、印度尼西亚、越南、泰国)中的大规模暴发，登革热病例数量在过去几年急剧上升。随着疾病传播至新的区域，不仅登革热病例的数量在增加，而且暴发往往更严重。为了预防和/或控制与登革病毒感染相关的疾病，目前仅有的可用方法是灭蚊策略以便控制载体。虽然在针对登革热的疫苗开发中取得了进展，但是遇到许多了困难。这些困难包括被称为抗体依赖性增强作用(ade)的现象的存在。从一种血清型感染中恢复提供针对该血清型的终身免疫，但是仅赋予针对随后其他三种血清型之一感染的部分的和短暂的保护。在被另一种血清型感染之后，预先存在的异源抗体与新感染的登革病毒血清型形成复合物，但是不中和病原体。相反，据信促进病毒进入细胞，从而导致不受控制的病毒复制和更高的峰病毒滴度。在原发感染和继发感染两者中，更高的病毒滴度与更严重的登革热疾病相关。因为母体抗体能够容易地通过母乳喂养传递至婴儿，所以这可能是儿童比成年人更容易受严重登革热疾病影响的原因之一。在具有两种或更多种血清型同时流通的区域(还被称为超流行地区)，严重登革热疾病的风险显著更高，这是由于经历继发性、更严重感染的风险增加。此外，在超流行性的情况下，更强毒株出现的概率增加，这进而增加登革出血热(dhf)或登革休克综合征的概率。携带登革热的蚊子，包括埃及伊蚊(aedesaegypti)和白纹伊蚊(aedesalbopictus)(虎斑蚊(tigermosquito))在地球上向北方移动。根据美国(us)疾病控制与预防中心(cdc)，两种蚊子当前在得克萨斯州南部普遍存在。携带登革热的蚊子向北传播不仅限于美国，而且也已在欧洲观察到。尽管在过去30年做出巨大努力，但当前不存在可用于保护人免受登革病毒疾病的疫苗。主要问题是开发以相同程度提供针对所有四种血清型的保护的疫苗(四价疫苗)。此外，当前不可获得用于治疗或预防登革热病毒感染的特异性抗病毒药物。显然，对于用于预防或治疗动物中(更具体地人中)的病毒感染并且尤其是针对由黄病毒(更具体地登革病毒)引起的病毒感染的治疗剂仍然存在巨大未满足的医学需求。高度需要具有良好抗病毒效力、无副作用或低水平的副作用、针对多种登革热病毒血清型的广谱活性、低毒性和/或良好药代动力学或药效动力学特性的化合物。本发明现在提供化合物经单取代的或二取代的吲哚衍生物，这些化合物显示针对登革热病毒的所有四种(4)血清型显示出高效活性。此外，根据本发明的这些化合物具有良好药代动力学特征，并且出人意料地这些特异性化合物显示出改进的手性稳定性。发明概述本发明基于出人意料的发现，即上文提到的问题中的至少一个可以通过本发明的当前化合物来解决。本发明提供了已显示针对当前已知的所有四种(4)血清型具有有效抗病毒活性的化合物。此外，本发明证明这些化合物有效地抑制登革热病毒(denv)的增殖。因此，这些化合物构成可用于治疗和/或预防动物、哺乳动物和人的病毒感染，更具体地用于治疗和/或预防登革热病毒感染的一类有用的有效化合物。此外，本发明涉及这类化合物作为药物的用途，并且涉及其用于制造用以治疗和/或预防动物或哺乳动物(更具体地人)的病毒感染，特别是被属于登革热病毒家族的病毒感染的药剂的用途。本发明还涉及用于制备所有这类化合物的方法，并且涉及包含有效量的这些化合物的药物组合物。本发明还涉及一种通过向对其有需要的患者给予有效量的一种或多种这类化合物或其药学上可接受的盐，任选地与一种或多种其他药物(像另一种抗病毒剂)组合，来治疗或预防人的登革热病毒感染的方法。本发明的一个方面是提供具有化学式(i)的化合物其立体异构形式、药学上可接受的盐、溶剂化物或多晶型物的用途，该化合物包含经单取代的或二取代的吲哚基团；所述化合物选自下组，其中：r1是h，r2是f并且r3是h、f或ch3；r1是f或ch3，r2是och3并且r3是h；r1是h，r2是cl并且r3是h或ch3；r1是f，r2是h并且r3是ch3；r1是h，r2是och3并且r3是cl，r1是f，r2是f并且r3是h，r1是h，r2是och3并且r3是ch3，或r1是ch3，r2是h并且r3是f。具体地说，本发明的化合物或其立体异构形式、其药学上可接受的盐、溶剂化物或多晶型物选自下组：本发明的一部分还是药物组合物该药物组合物包含具有化学式(i)的化合物或其立体异构形式、药学上可接受的盐、溶剂化物或多晶型物，连同一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。具有化学式(i)的化合物的药学上可接受的盐包括其酸加成盐以及碱盐。合适的酸加成盐是从形成无毒盐的酸形成。合适的碱盐是从形成无毒盐的碱形成。本发明的化合物还可以按非溶剂化的和溶剂化的形式存在。术语“溶剂化物”在此用以描述包含本发明的化合物以及一种或多种药学上可接受的溶剂分子(例如，乙醇)的分子复合物。术语“多晶型物”是指本发明的化合物以多于一种的形式或晶体结构存在的能力。可以将本发明的化合物以晶态的或非晶态的产物给予。可以通过如方法沉淀、结晶、冷冻干燥、喷雾干燥或蒸发干燥获得例如呈固体塞、粉剂或膜的这些化合物。它们可以单独给予或与一种或多种本发明的其他化合物组合给予或与一种或多种其他药物组合给予。通常，它们将作为与一种或多种药学上可接受的赋形剂相缔合的一种配制品给予。术语“赋形剂”在此用以描述除本发明的一种或多种化合物之外的任何成分。赋形剂的选择大体上取决于因素如具体给予模式、赋形剂对溶解性和稳定性的影响以及剂型的性质。本发明的化合物或其任何亚群可以被配制成用于给予目的不同药物形式。作为适当的组合物，可以引用所有通常用于全身给予药物的组合物。为了制备本发明的药物组合物，将作为活性成分的有效量的具体化合物(任选地呈加成盐形式)与药学上可接受的载体紧密混合，该载体根据用于给予所希望的的制剂的形式可以采用多种形式。令人希望地，这些药物组合物处于适合于例如口服或经直肠给予的单位剂型。例如，在制备处于口服剂型的组合物中，可使用任何常见药物介质，例如像在口服液体制剂(例如悬浮液、糖浆剂、酏剂、乳液以及溶液)情况下的水、二醇类、油类、醇类等；或在粉剂、丸剂、胶嚢和片剂的情况下的固体载体如淀粉、糖、高岭土、稀释剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等。因为其容易给予，片剂和胶囊剂代表最有利的口服单位剂型，在该情况下显然使用固体药物载体。还包括在使用之前不久可以被转变为液体形式的固体形式制剂。为了便于给予和剂量的均一性，将上述药物组合物配制成单位剂型是特别有利的。如在此所用的单位剂型是指适合作为单位剂量的物理离散单位，各单位含有预定量的活性成分，该预定量的活性成分经计算与所需药物载体相缔合而产生所希望的治疗效果。此类单位剂型的实例是片剂(包括刻痕或包衣片剂)、胶囊剂、丸剂、粉剂包(powderpacket)、糯米纸囊剂(wafer)、栓剂、可注射溶液或悬浮液等，及其分离多倍剂(multiples)。在治疗感染性疾病的技术人员将能够从下文所呈现的测试结果来确定有效量。通常认为有效日用量将为从0.01mg/kg至50mg/kg体重，更优选从0.1mg/kg至10mg/kg体重。可以适当地将所需剂量在全天天中以适当的时间间隔按两个、三个、四个或更多个子剂量进行给予。所述子剂量可以被配制成单位剂型，例如每一单位剂型含有1至l000mg，且特别是5至200mg的活性成分。如本领域的技术人员所熟知的，给予的精确剂量和频率取决于所使用的具有化学式(i)的具体化合物，正在被治疗的具体病状，正在被治疗的病状的严重性，具体患者的年龄、体重和总体身体状况，以及个体可能服用的其他药物。此外，显然该有效量可以降低或增加，这取决于所治疗的受试者的反应和/或取决于对本发明的这些化合物开处方的医师的评估。因此以上所提及的有效量的范围仅仅是指导而不是旨在以任何程度限制本发明的范围或用途。本披露还旨在包括存在于本发明的化合物中的原子的任何同位素。例如，氢的同位素包括氚和氘，并且碳的同位素包括c-13和c-14。用于本发明中的这些化合物还可以其立体化学异构形式存在，从而定义由相同键序列键合的相同原子组成但具有不同三维结构的不可互换的所有可能的化合物。除非另外提及或指明，化合物的化学命名涵盖所述化合物可以具有的所有可能的立体化学异构形式的混合物。所述混合物可以含有所述化合物的基本分子结构的所有非对映异构体和/或对映异构体。用于本发明中的处于纯形式的或彼此混合的化合物的所有立体化学异构形式旨在被涵盖于本发明的范围内，包括任何外消旋混合物或外消旋体。在此提到的化合物和中间体的纯的立体异构形式被定义为基本上不具有所述化合物或中间体的相同基本分子结构的其他对映异构或非对映异构形式的异构体。具体地说，术语‘立体异构纯’涉及具有至少80％立体异构过量(即，最少90％的一种异构体和最大10％的其他可能的异构体)到100％立体异构过量(即，100％的一种异构体并且没有其他异构体)的化合物或中间体，更具体地具有90％至100％立体异构过量、甚至更具体地具有94％至100％立体异构过量并且最具体地具有97％至100％立体异构过量的化合物或中间体。应当以类似的方式理解术语‘对映异构纯’和‘非对映异构纯’，但是讨论中的分别是关于混合物中的对映异构过量以及非对映异构过量。可以通过领域已知的程序的应用来获得用于本发明的化合物和中间体的纯立体异构形式。例如，对映异构体可以通过用光学活性酸或碱使它们的非对映异构盐进行选择性结晶来彼此分离。其实例是酒石酸、二苯甲酰基酒石酸、二甲苯甲酰基酒石酸以及樟脑磺酸。可替代地，可以通过使用手性固定相的层析技术分离对映异构体。所述纯立体化学异构形式还可以衍生自适当起始材料的相对应的纯立体化学异构形式，其条件是立体特异性地发生反应。优选地，如果一种具体的立体异构体是所希望的，那么所述化合物将通过立体特异性的制备方法来合成。这些方法将有利地使用对映异构体纯的起始材料。通用合成方法具有通式i的化合物的合成可以如方案1中所概述的来进行。可以用氯化试剂例如像亚硫酰氯将2-(4-氟-2-甲氧基苯基)乙酸(ii)转化成相对应的2-(4-氟-2-甲氧基苯基)乙酰氯(iii)。可以使用路易斯酸(lewisacid)试剂(例如像alcl3或et2alcl)在适合的溶剂例如像ch2cl2中并且在典型地涉及冷却的适合反应条件下进行酰氯iii与具有通式iv的经取代的吲哚的弗里德尔-克拉夫茨(friedel-crafts)反应以提供具有通式v的3-酰化吲哚。在具有通式v的化合物的羰基部分的α位置中引入苯胺部分可以通过反应顺序来完成，该反应顺序涉及例如在适合的溶剂(例如像thf)中用试剂(例如像苯基-三甲基-三溴化铵)溴化v以提供具有通式vi的化合物，以及具有通式vi的化合物与2-(3-氨基-5-甲氧基苯氧基)乙醇(vii)在适合的溶剂(例如像ch3cn)中的随后反应，并且通常使用碱(例如像tea或dipea)以提供作为外消旋混合物的具有通式i的化合物。可替代地，可以将具有通式vi的化合物与具有通式viii的o-保护的苯胺(pg＝保护基团)在适合的溶剂(例如像ch3cn)中反应，并且通常使用碱(例如像tea或dipea)以提供具有通式ix的化合物。一种有用的保护基团是例如(但不限于)叔丁基(pg＝tbu)。具有通式ix的化合物的保护基团的除去可以通过本领域的技术人员熟悉的方法来完成并且包括例如(但不限于)试剂例如像浓盐酸(对于pg＝tbu)以提供作为外消旋混合物的具有通式i的化合物。具有通式i的化合物的手性分离可以通过例如手性层析来进行以提供具有通式i的对映异构体a和b。方案1实例lc/ms方法使用lc泵、二极管阵列(dad)或uv检测器以及如在对应的方法中所指定的柱进行高效液相层析(hplc)测量。如果必要的话，包括另外的检测器(参见以下方法表格)。将来自柱的流带至配置有一个大气压离子源的质谱仪(ms)。设置调谐参数(例如扫描范围、停留时间等)以便获得允许鉴别化合物的标称单一同位素分子量(mw)的离子在技术人员的知识内。使用适当的软件进行数据采集。通过其实验保留时间(rt)和离子描述化合物。如果未在数据表中不同地指定，那么所报道的分子离子对应于[m+h]+(质子化的分子)和/或[m-h]-(去质子的分子)。在该化合物不是直接可电离的情况下，指定加合物的类型(即[m+nh4]+、[m+hcoo]-等)。对于具有多种同位素模式的分子(br、cl)来说，所报道的值是针对最低同位素质量获得的值。获得的所有结果具有通常与所使用的方法相关的实验不确定性。下文中，“sqd”意指单四极检测器，“msd”质量选择性检测器，“rt”室温，“beh”桥连乙基硅氧烷/二氧化硅杂化体，“dad”二极管阵列检测器，“hss”高强度二氧化硅。lcms方法代码(以ml/分钟来表示流量；以℃表示柱温(t)；以分钟来表示运行时间)sfc-ms方法使用一种分析型超临界流体层析(sfc)系统来进行sfc测量，该系统由以下构成：用于递送二氧化碳(co2)和改性剂的二元泵、自动进样器、柱烘箱、配备有经得起400巴的高压流动池的二极管阵列检测器。如果配置有质谱仪(ms)，来自该柱的流被引至该(ms)。设置调谐参数(例如扫描范围、停留时间等)以便获得允许鉴别化合物的标称单一同位素分子量(mw)的离子在技术人员的知识内。使用适当的软件进行数据采集。分析型sfc-ms方法(以ml/分钟来表示流量；以℃表示柱温(t)；以分钟表示运行时间，以巴表示背压(bpr)。熔点值是峰值抑或熔融范围，并且所获得的值具有通常与这种分析方法相关的实验不确定性。dsc823e(指示为dsc)对于多种化合物，用dsc823e(梅特勒-托利多(mettler-toledo))来确定熔点。使用10℃/分钟的一个温度梯度来测量熔点。最高温度是300℃。旋光度：在铂金埃尔默(perkin-elmer)341旋光计上用一个钠灯测量旋光度并且记录如下：[α]°(λ，cg/100ml，溶剂，t℃)。[α]λt＝(100α)/(l×c)：其中l是以dm计的路径长度并且c是在温度t(℃)和波长λ(以nm计)下的以g/100ml计的样品浓度。如果所使用的光波长是589nm(钠d线)，那么可以改为使用符号d。始终应给出旋转符号(+或-)。当使用这一等式时，常常在旋转后的括号中提供浓度和溶剂。使用度报道旋转并且没有给出浓度单位(将其假定为g/100ml)。实例1：1-(6-氟-1h-吲哚-3-基)-2-(4-氟-2-甲氧基苯基)-2-((3-(2-羟基乙氧基)-5-甲氧基苯基)氨基)乙酮(化合物1)的合成以及手性分离成对映异构体1a和1b。中间体1a的合成：将2-(4-氟-2-甲氧基苯基)乙酸[cas886498-61-9](28.9g，157mmol)以小部分添加至亚硫酰氯(150ml)并且将所得溶液在室温下搅拌过夜。将溶剂在减压下浓缩并且与甲苯共蒸发以给出呈一种油状残余物的2-(4-氟-2-甲氧基苯基)乙酰氯1a(31.8g)，其不经进一步纯化用于下一步骤。中间体1b的合成：将6-氟-1h-吲哚[cas399-51-9](14.2g，105mmol)于ch2cl2(400ml)中的溶液在n2-气氛下冷却至0℃。将二乙基氯化铝1m于己烷(160ml，160mmol)中的溶液经10分钟时间段添加至该搅拌溶液并且将所得混合物保持在0℃下持续40分钟。然后，经2.5小时时间段逐滴添加2-(4-氟-2-甲氧基苯基)乙酰氯1a(31.8g，160mmol)于ch2cl2(300ml)中的溶液，同时将反应混合物的内部温度保持在5℃以下。将搅拌反应混合物的温度维持在0℃下持续3.5小时。除去冰浴并且在室温下搅拌2.5小时之后，将反应混合物再次冷却至0℃并且将反应通过缓慢添加四水合酒石酸钾钠(罗谢尔盐)[cas6100-16-9](59.6g，210mmol)于水(70ml)中的溶液来淬灭，同时将混合物的内部温度保持在10℃以下。在0℃下搅拌另外30分钟之后，除去冰浴并且用thf(1l)稀释所得混合物。添加na2so4(150g)并且在搅拌过夜之后，将混合物经过滤。将滤饼用thf(2×1l)洗涤两次。将合并的滤液在减压下蒸发至大约50ml的残余体积。将白色沉淀物滤出并且在真空下在50℃下干燥以提供呈白色粉末的1-(6-氟-1h-吲哚-3-基)-2-(4-氟-2-甲氧基-苯基)-乙酮1b(22.3g)。化合物1的合成以及对映异构体1a和1b的手性分离：将1-(6-氟-1h-吲哚-3-基)-2-(4-氟-2-甲氧基苯基)-乙酮1b(11.0g，36.5mmol)于thf(300ml)中的搅拌溶液在n2-气氛下冷却至0℃。经45分钟时间段逐滴添加苯基三甲基三溴化铵[cas4207-56-1](13.9g，36.9mmol)于thf(100ml)中的溶液。将所得悬浮液在室温下搅拌5小时并且在减压下蒸发至白色残余物。将含有粗2-溴-1-(6-氟-1h-吲哚-3-基)-2-(4-氟-2-甲氧基-苯基)-乙酮1c的此残余物溶解于乙腈(300ml)中并且在室温下搅拌混合物。在添加2-(3-氨基-5-甲氧基-苯氧基)-乙醇[cas725237-16-1](13.4g，73mmol)和二异丙基乙胺(12.6ml，73mmol)之后，将混合物在室温下搅拌两天-直到完全转化成化合物1。将反应混合物倒入水(1.5l)中且用2-甲基-thf(2×750ml)萃取。将合并的萃取物用0.5nhcl(800ml)、饱和nahco3水溶液(200ml)和盐水(200ml)洗涤，经mgso4干燥并且在减压下蒸发。通过制备型hplc(固定相：rp制备型c18odb-10μm，30×150mm；流动相：在水中的0.25％nh4hco3溶液，ch3cn)纯化油状残余物。将产物级分浓缩、溶解于甲醇中并且再次浓缩，从而产生作为外消旋混合物的1-(6-氟-1h-吲哚-3-基)-2-(4-氟-2-甲氧基苯基)-2-((3-(2-羟基乙氧基)-5-甲氧基苯基)氨基)-乙酮(化合物1，9.3g)。经由正相手性hplc(固定相：as20μm(1kg)，流动相：100％meoh)进行化合物1(9.3g)的对映异构体的手性分离。合并产物级分且蒸发以提供作为第一洗脱产物的对映异构体1a(4.5g)和作为第二洗脱产物的对映异构体1b(4.6g)。对映异构体1a和1b两者均作为粘稠油状物出现。通过缓慢添加水(11ml)从于meoh(20ml)中的溶液中沉淀出对映异构体1a(4.5g)。在室温下搅拌30分钟之后，将白色固体滤出、用少量meoh/水(1/1)混合物洗涤并且在真空下在50℃下干燥以提供呈无定形白色粉末的对映异构体1a(2.4g)。通过在剧烈搅拌下用meoh(10ml)与水(15ml)的混合物研磨油状残余物25分钟来固化对映异构体1b(4.6g)。将固体滤出并且随后在搅拌下在室温下从meoh(70ml)与水(30ml)的混合物中结晶。将白色沉淀物滤出并且在真空下在50℃下干燥以提供呈无定形白色粉末的对映异构体1b(2.50g)。化合物1：1hnmr(360mhz,dmso-d6)δppm3.64(q,j＝4.9hz,2h),3.61(s,3h),3.76-3.90(m,2h),3.96(s,3h),4.80(t,j＝5.3hz,1h),5.72(t,j＝2.2hz,1h),5.94(d,j＝2.2hz,2h),6.14(d,j＝8.0hz,1h),6.38(d,j＝8.1hz,1h),6.73(td,j＝8.4,2.6hz,1h),6.93(dd,j＝11.5,2.4hz,1h),7.06(ddd,j＝9.7,8.8,2.4hz,1h),7.27(dd,j＝9.5,2.2hz,1h),7.37(dd,j＝8.6,6.8hz,1h),8.15(dd,j＝8.8,5.9hz,1h),8.43(s,1h),12.07(br.s,1h)lc/ms(方法lc-b)：rt1.86分钟，mh+483对映异构体1a：1hnmr(360mhz,dmso-d6)δppm3.60(s,3h)3.64(m,j＝6.60hz,2h)3.73-3.90(m,2h)3.95(s,3h)4.80(t,j＝4.94hz,1h)5.71(br.s.,1h)5.93(br.s.,2h)6.14(d,j＝7.95hz,1h)6.38(d,j＝7.97hz,1h)6.73(t,j＝8.41hz,1h)6.93(d,j＝11.24hz,1h)7.05(t,j＝9.02hz,1h)7.27(d,j＝9.58hz,1h)7.37(t,j＝7.70hz,1h)8.09-8.19(m,1h)8.43(s,1h)12.06(s,1h)lc/ms(方法lc-a)：rt1.03分钟，mh+483[α]d20：+96.9°(c0.389，dmf)手性sfc(方法sfc-f)：rt1.73分钟，mh+483，手性纯度100％。对映异构体1b：1hnmr(400mhz,dmso-d6)δppm3.61(s,3h)3.64(t,j＝5.12hz,2h)3.76-3.89(m,2h)3.95(s,3h)4.77(br.s,1h)5.71(t,j＝2.01hz,1h)5.94(d,j＝2.11hz,2h)6.14(d,j＝7.97hz,1h)6.35(d,j＝8.00hz,1h)6.72(td,j＝8.49,2.44hz,1h)6.92(dd,j＝11.36,2.48hz,1h)7.05(td,j＝9.29,2.38hz,1h)7.26(d,j＝9.49hz,1h)7.37(dd,j＝8.58,6.88hz,1h)8.14(dd,j＝8.77,5.59hz,1h)8.42(s,1h)12.08(br.s.,1h)lc/ms(方法lc-a)：rt1.03分钟，mh+483[α]d20：-100.0°(c0.478，dmf)手性sfc(方法sfc-f)：rt2.38分钟，mh+483，手性纯度100％。实例1.1：在ph7.4下对映异构体1a的手性稳定性通过在ph7.4下在40℃和60℃下在缓冲溶液中孵育24小时和48小时之后确定对映异构过量(ee％)来评估对映异构体1a(r＝ome)的手性稳定性。为了评定对映异构体1a(r＝ome)的甲氧基取代基对针对外消旋化的稳定性的影响，在相同条件下测试对映异构体1’a(r＝h)的手性稳定性。为此，通过将25μl的1a或1’a于dmso中的100μm溶液与475μl水性缓冲液(ph7.4)混合来制备1a和1’a的5μm缓冲(ph＝7.4)溶液。在40℃和60℃下孵育后24小时和48小时取得样品。将分析样品通过手性sfc(ms检测)进行分析并且将手性纯度表示为对映异构过量(ee％＝％对映异构体a-％对映异构体b)。对映异构体1a和1’a两者在其孵育之前具有100％的手性纯度。实例2：2-(4-氟-2-甲氧基苯基)-1-(6-氟-7-甲基-1h-吲哚-3-基)-2-((3-(2-羟基乙氧基)-5-甲氧基苯基)氨基)乙酮(化合物2)的合成以及手性分离成对映异构体2a和2b。中间体2a的合成：将6-氟-7-甲基-1h-吲哚[cas57817-10-4](5.41g，36.2mmol)于ch2cl2(100ml)中的搅拌溶液在n2-气氛下在冰上冷却。逐滴添加二乙基氯化铝1m于己烷(54.4ml，54.4mmol)中的溶液。在0℃下15分钟之后，逐滴添加2-(4-氟-2-甲氧基苯基)乙酰氯1a(11.0g，54.4mmol，针对合成：参见实例1)于ch2cl2(30ml)中的溶液，同时将内部温度保持在5℃以下。除去冰浴，并且将所得悬浮液在室温下搅拌4小时。将反应混合物缓慢倒入冷却的(0℃)饱和nahco3水溶液中。将混合物经过滤并且用thf洗涤滤饼。将合并的滤液用etoac萃取，经mgso4干燥，并且在减压下蒸发。将残余物用ch2cl2研磨并且滤出固体以给出呈白色粉末的2-(4-氟-2-甲氧基苯基)-1-(6-氟-7-甲基-1h-吲哚-3-基)-乙酮2a(7.47g)。中间体2b的合成：将2-(4-氟-2-甲氧基苯基)-1-(6-氟-7-甲基-1h-吲哚-3-基)乙酮2a(7.43g，23.56mmol)于thf(100ml)中的搅拌溶液在n2-气氛下在0℃下冷却。逐滴添加苯基三甲基三溴化铵[cas4207-56-1](8.96g，23.8mmol)于thf(100ml)中的溶液。添加之后，将反应混合物在室温下搅拌2小时。过滤悬浮液以除去固体并且在减压下蒸发滤液。将残余物用ch2cl2研磨，滤出固体且在真空下干燥以提供2-溴-2-(4-氟-2-甲氧基苯基)-1-(6-氟-7-甲基-1h-吲哚-3-基)-乙酮2b(8.95g)。化合物2的合成以及对映异构体2a和2b的手性分离：将2-溴-2-(4-氟-2-甲氧基苯基)-1-(6-氟-7-甲基-1h-吲哚-3-基)-乙酮2b(3.30g，8.38mmol)、2-(3-氨基-5-甲氧基苯氧基)乙醇[cas725237-16-1](1.54g，8.38mmol)以及二异丙基乙胺(1.44ml，8.38mmol)的混合物在ch3cn(100ml)中混合并且将混合物在回流下加热3小时。在冷却至室温之后，在减压下蒸发溶剂并且通过在二氧化硅上柱层析(固定相：hp-spher25μm(340g)；流动相：庚烷/etoac梯度：100/0至0/100)纯化残余物。将产物级分浓缩并且随后通过制备型hplc(固定相：c18odb-10μm，200g，5cm；流动相：在水中的0.25％nh4hco3溶液，ch3cn)纯化。将产物级分浓缩溶解于甲醇中并且再次浓缩以提供作为外消旋混合物的2-(4-氟-2-甲氧基-苯基)-1-(6-氟-7-甲基-1h-吲哚-3-基)-2-((3-(2-羟基乙氧基)-5-甲氧基-苯基)氨基)乙酮(化合物2，1.4g)。经由制备型sfc(固定相：od20×250mm；流动相：co2，具有0.2％iprnh2的etoh)和在减压下蒸发产物级分来进行化合物2(1.18g)的对映异构体的手性分离。通过从meoh(30ml)、1nhcl(5ml)和水(130ml)的混合物中沉淀分离作为盐酸盐的第一洗脱对映异构体。在搅拌过夜之后形成白色沉淀物并且将沉淀物滤出且在室温下在真空中干燥以提供328mg的对映异构体2a(作为盐酸盐)。通过从ch3cn/水的混合物中冻干来固化第二洗脱对映异构体以给出385mg的呈无定形粉末的对映异构体2b。化合物2：1hnmr(360mhz,dmso-d6)δppm2.38(d,j＝1.62hz,3h)3.61(s,3h)3.64(q,j＝5.12hz,2h)3.76-3.89(m,2h)3.96(s,3h)4.79(t,j＝5.54hz,1h)5.71(t,j＝2.11hz,1h)5.95(d,j＝2.13hz,2h)6.16(d,j＝7.95hz,1h)6.36(d,j＝7.96hz,1h)6.72(td,j＝8.49,2.47hz,1h)6.93(dd,j＝11.37,2.49hz,1h)7.01(dd,j＝10.29,8.71hz,1h)7.37(dd,j＝8.62,6.85hz,1h)7.96(dd,j＝8.73,5.18hz,1h)8.43(s,1h)12.19(s,1h)lc/ms(方法lc-a)：rt1.08分钟，mh+497对映异构体2a：1hnmr(360mhz,dmso-d6)δppm2.38(d,j＝0.22hz,3h)3.61(s,3h)3.64(t,j＝5.21hz,2h)3.83(qt,j＝10.02,5.27hz,2h)3.96(s,3h)5.71(t,j＝1.46hz,1h)5.95(d,j＝2.11hz,2h)6.16(br.s.,1h)6.36(br.s,1h)6.72(td,j＝8.55,2.62hz,1h)6.93(dd,j＝11.33,2.46hz,1h)7.01(t,j＝9.49hz,1h)7.37(dd,j＝8.64,6.90hz,1h)7.96(dd,j＝8.73,5.39hz,1h)8.43(d,j＝3.24hz,1h)12.19(d,j＝2.95hz,1h)lc/ms(方法lc-a)：rt1.08分钟，mh+497[α]d20：-82.7°(c0.5055，dmf)手性sfc(方法sfc-g)：rt1.69分钟，mh+497，手性纯度100％。chn分析：c27h26f2n2o5.hcl的分析计算值：c，60.85；h，5.11；n，5.26。实测值：c，62.83；h，5.02；n，5.36。对映异构体2b：1hnmr(360mhz,dmso-d6)δppm2.38(d,j＝1.62hz,3h)3.61(s,3h)3.64(q,j＝5.43hz,2h)3.75-3.89(m,2h)3.96(s,3h)4.79(t,j＝5.58hz,1h)5.71(t,j＝2.11hz,1h)5.95(d,j＝2.20hz,2h)6.16(d,j＝7.97hz,1h)6.36(d,j＝8.00hz,1h)6.72(td,j＝8.56,2.56hz,1h)6.93(dd,j＝11.37,2.49hz,1h)7.01(dd,j＝10.29,8.72hz,1h)7.37(dd,j＝8.68,6.89hz,1h)7.96(dd,j＝8.75,5.21hz,1h)8.43(s,1h)12.19(br.s.,1h)lc/ms(方法lc-a)：rt1.09分钟，mh+497[α]d20：+86.7°(c0.5075，dmf)手性sfc(方法sfc-g)：rt2.88分钟，mh+497，手性纯度100％。实例3：1-(6-氯-7-甲基-1h-吲哚-3-基)-2-(4-氟-2-甲氧基苯基)-2-((3-(2-羟基乙氧基)-5-甲氧基苯基)氨基)乙酮(化合物3)的合成以及手性分离成对映异构体3a和3b。中间体3a的合成：在n2-流下将6-氯-7-甲基-1h-吲哚[cas57817-09-1](3.2g，19.3mmol)于ch2cl2(150ml)中的搅拌溶液在冰-nacl冷却浴上冷却。经2分钟时间段添加于己烷(29ml，29mmol)中的二乙基氯化铝1m并且将冷却的溶液在-10℃下搅拌30分钟。经30分钟逐滴添加2-(4-氟-2-甲氧基苯基)乙酰氯1a(5.48g，27.1mmol，合成：参见实例1)于ch2cl2(30ml)中的溶液，同时将内部温度保持在-10℃以下并且将所得混合物在-10℃下搅拌另外2小时。通过缓慢添加四水合酒石酸钾钠(罗谢尔盐)[cas6100-16-9](10.9g，38.6mmol)于水(10ml)中的溶液来淬灭反应并且将混合物在室温下搅拌15分钟。白色沉淀物存在于该反应混合物中。将沉淀物通过过滤分离，用水洗涤且在真空下干燥以提供呈灰白色固体的1-(6-氯-7-甲基-1h-吲哚-3-基)-2-(4-氟-2-甲氧基苯基)-乙酮3a(4200mg)。中间体3b的合成：将1-(6-氯-7-甲基-1h-吲哚-3-基)-2-(4-氟-2-甲氧基苯基)-乙酮3a(2000mg，6.03mmol)于thf(120ml)中的溶液在n2-气氛下在室温下搅拌。逐滴添加苯基三甲基三溴化铵[cas4207-56-1](2.38g，6.33mmol)于thf(35ml)中的溶液并且将该混合物在室温下搅拌另外90分钟。滤出沉淀物并且在真空下浓缩滤液以提供呈灰白色粉末的2-溴-1-(6-氯-7-甲基-1h-吲哚-3-基)-2-(4-氟-2-甲氧基苯基)-乙酮3b(2200mg)。化合物3的合成以及对映异构体3a和3b的手性分离：将2-溴-1-(6-氯-7-甲基-1h-吲哚-3-基)-2-(4-氟-2-甲氧基苯基)-乙酮3b(1.31g，2.23mmol)悬浮于ch3cn(60ml)中。添加2-(3-氨基-5-甲氧基-苯氧基)乙醇[cas725237-16-1](0.6g，2.46mmol)和二异丙基乙胺(847μl，4.91mmol)并且将搅拌混合物在65℃下加热过夜。在真空中浓缩混合物，并且将残余物分配在etoac与水之间。分离有机层，经na2so4干燥，过滤并且在减压下蒸发。经由制备型hplc(固定相：c18odb-10μm，200g，5cm；流动相：于水中的0.25％nh4hco3溶液，ch3cn)纯化残余物以给出作为外消旋混合物的1-(6-氯-7-甲基-1h-吲哚-3-基)-2-(4-氟-2-甲氧基苯基)-2-((3-(2-羟基乙氧基)-5-甲氧基苯基)氨基)乙酮(化合物3，590mg)。使用正相手性分离(固定相：as5μm，流动相：100％meoh，等度洗脱。检测波长308nm，流量1ml/分钟)进行化合物3(560mg)的对映异构体的手性分离。合并产物级分且蒸发以提供作为第一洗脱产物的对映异构体3a和作为第二洗脱产物的对映异构体3b。对映异构体3a和3b两者均作为粘稠油状物出现。将这些对映异构体溶解于meoh/ch2cl2(1/1)混合物中并且在减压下蒸发以提供呈无定形粉末的对映异构体3a(245mg)和对映异构体3b(263mg)。化合物3：1hnmr(400mhz,chloroform-d)δppm2.48(s,3h)3.70(s,3h)3.88-3.92(m,2h)3.93-4.02(m,2h)4.03(s,3h)5.55(br.s,1h)5.83(t,j＝2.20hz,1h)5.89(d,j＝2.16hz,2h)6.12(s,1h)6.54-6.66(m,2h)7.28(d,j＝7.80hz,1h)7.33(dd,j＝8.55,6.60hz,1h)8.12-8.17(m,2h)8.59(br.s.,1h)lc/ms(方法lc-b)：rt2.08分钟，mh+513对映异构体3a：1hnmr(400mhz,dmso-d6)δppm2.50(s,3h)3.61(s,3h)3.64(q,j＝5.54hz,2h)3.77-3.90(m,2h)3.96(s,3h)4.78(t,j＝5.40hz,1h)5.71(t,j＝2.12hz,1h)5.95(d,j＝2.13hz,2h)6.17(d,j＝7.96hz,1h)6.35(d,j＝7.96hz,1h)6.72(td,j＝8.48,2.49hz,1h)6.93(dd,j＝11.35,2.50hz,1h)7.21(d,j＝8.61hz,1h)7.37(dd,j＝8.60,6.87hz,1h)7.98(d,j＝8.50hz,1h)8.44(s,1h)12.23(s,1h)lc/ms(方法lc-a)：rt1.12分钟，mh+513[α]d20：+95.2°(c0.605，dmf)手性sfc(方法sfc-h)：rt3.21分钟，mh+513，手性纯度100％。对映异构体3b：1hnmr(400mhz,dmso-d6)δppm2.50(s,3h)3.61(s,3h)3.64(q,j＝5.38hz,2h)3.76-3.90(m,2h)3.96(s,3h)4.77(t,j＝5.51hz,1h)5.71(t,j＝2.12hz,1h)5.95(d,j＝2.13hz,2h)6.16(d,j＝7.96hz,1h)6.35(d,j＝7.96hz,1h)6.72(td,j＝8.48,2.49hz,1h)6.93(dd,j＝11.35,2.49hz,1h)7.21(d,j＝8.51hz,1h)7.37(dd,j＝8.60,6.87hz,1h)7.98(d,j＝8.50hz,1h)8.44(s,1h)12.23(s,1h)lc/ms(方法lc-a)：rt1.12分钟，mh+513[α]d20：-87.2°(c0.625，dmf)手性sfc(方法sfc-h)：rt1.85分钟，mh+513，手性纯度100％。实例4：1-(6-氯-1h-吲哚-3-基)-2-(4-氟-2-甲氧基苯基)-2-((3-(2-羟基乙氧基)-5-甲氧基苯基)氨基)乙酮(化合物4)的合成以及手性分离成对映异构体4a和4b。中间体4a的合成：在n2-流下将6-氯-1h-吲哚[cas17422-33-2](2.23g，14.7mmol)于ch2cl2(125ml)中的搅拌溶液使用冰浴冷却至0℃。逐滴添加二乙基氯化铝1m于己烷(22.1ml，22.1mmol)中的溶液并且将混合物在0℃下搅拌10分钟。然后，经50分钟时间段逐滴添加2-(4-氟-2-甲氧基苯基)乙酰氯1a(4.47g，22.1mmol，合成：参见实例1)于ch2cl2(30ml)中的溶液并且将所得混合物保持在0℃下持续1小时且随后在10℃下搅拌1小时。再次冷却至0℃之后，通过缓慢添加四水合酒石酸钾钠(罗谢尔盐)[cas6100-16-9](8.31g，29.4mmol)于水(9ml)中的溶液来淬灭反应并且使混合物经1小时加热至室温。将反应混合物通过添加2-甲基-thf(150ml)稀释并且在室温下搅拌30分钟。添加na2so4(30g)并且在搅拌30分钟后，将混合物经过滤。将滤饼用2-甲基-thf洗涤若干次并且将合并的滤液在真空中浓缩至25ml的残余体积。在静置2小时之后，将沉淀物滤出且在真空下干燥以提供1-(6-氯-1h-吲哚-3-基)-2-(4-氟-2-甲氧基苯基)乙酮4a(2.85g)。中间体4c的合成：将1-(6-氯-1h-吲哚-3-基)-2-(4-氟-2-甲氧基苯基)乙酮4a(1g，3.15mmol)于2-甲基-thf(50ml)中的溶液在n2-流下搅拌且在冰浴上冷却。逐滴添加苯基三甲基三溴化铵[cas4207-56-1](1.24g，3.31mmol)于thf(10ml)和2-甲基-thf(10ml)中的溶液并且将混合物在0℃下搅拌1小时且随后在10℃下搅拌90分钟。然后，逐滴添加3-(2-(叔丁氧基)乙氧基)-5-甲氧基苯胺[cas1428973-39-0](0.83g，3.46mmol)和二异丙基乙胺(1.63ml，9.44mmol)于ch3cn(40ml)中的溶液，并且将反应混合物在回流下加热90分钟。在减压下蒸发溶剂。将残余物吸收在ch3cn(30ml)中并且在回流下加热5小时。在冷却至室温之后，在真空下蒸发溶剂并且通过在二氧化硅上快速层析(固定相：grace二氧化硅80g；流动相：庚烷/etoac梯度100/0至0/100)纯化残余物。将所希望的级分合并且蒸发，并且与1,4-二噁烷共蒸发以提供2-((3-(2-(叔丁氧基)乙氧基)-5-甲氧基苯基)氨基)-1-(6-氯-1h-吲哚-3-基)-2-(4-氟-2-甲氧基苯基)乙酮4c(1.5g，lc纯度＝71％)。将粗产物按原样用于下一步骤中。化合物4的合成以及对映异构体4a和4b的手性分离：将2-((3-(2-(叔丁氧基)乙氧基)-5-甲氧基苯基)氨基)-1-(6-氯-1h-吲哚-3-基)-2-(4-氟-2-甲氧基苯基)乙酮4c(1.5g，1.92mmol)与盐酸4m在二噁烷(25ml，0.1mol)中混合并且将混合物在室温下搅拌18小时。将混合物脱气且缓慢倒入饱和nahco3水溶液中。将产物用2-甲基-thf萃取两次并且将合并的萃取物经mgso4干燥，过滤并蒸发。通过在二氧化硅上快速层析(固定相：snapultra二氧化硅50g，流动相：庚烷/etoac/etoh梯度100/0/0至60/30/10)来纯化残余物。将所希望的级分合并且蒸发并且随后经由制备型hplc(固定相：c18odb-10μm，200g，5cm；流动相：在水中的0.25％nh4hco3溶液，ch3cn)纯化。将产物级分合并且蒸发。从meoh/ch3cn的混合物中共蒸发残余物以提供呈油状物的外消旋1-(6-氯-1h-吲哚-3-基)-2-(4-氟-2-甲氧基苯基)-2-((3-(2-羟基乙氧基)-5-甲氧基苯基)氨基)-乙酮(化合物4，500mg)。经由正相手性分离(固定相：as20μm，流动相：100％meoh)进行化合物4(500mg)的手性分离。将产物级分合并且蒸发。通过在二氧化硅上快速层析(固定相：snapultragrace二氧化硅12g，流动相：庚烷/etoac梯度100/0至0/100)来进一步纯化第一洗脱产物。将产物级分合并，在减压下蒸发并且随后与ch3cn共蒸发。通过从ch3cn/水中冻干来固化残余物以提供呈无定形粉末的对映异构体4a(135mg)。通过在二氧化硅上快速层析(固定相：snapultra二氧化硅12g，流动相：庚烷/etoac梯度100/0至0/100)来进一步纯化第二洗脱产物。将产物级分合并且在减压下蒸发。通过从ch3cn/水中冻干来固化残余物以提供呈无定形粉末的对映异构体4b(160mg)。化合物4：lc/ms(方法lc-b)：rt1.99分钟，mh+499对映异构体4a：1hnmr(400mhz,dmso-d6)δppm3.61(s,3h)3.62-3.66(m,2h)3.77-3.89(m,2h)3.95(s,3h)4.76(t,j＝5.72hz,1h)5.71(t,j＝2.12hz,1h)5.93(d,j＝2.14hz,2h)6.14(d,j＝7.97hz,1h)6.35(d,j＝8.00hz,1h)6.72(td,j＝8.49,2.51hz,1h)6.92(dd,j＝11.36,2.52hz,1h)7.20(dd,j＝8.53,1.93hz,1h)7.37(dd,j＝8.60,6.88hz,1h)7.52(d,j＝1.92hz,1h)8.13(d,j＝8.51hz,1h)8.44(s,1h)12.09(br.s,1h)lc/ms(方法lc-a)：rt1.09分钟，mh+499[α]d20：+107.4°(c0.565，dmf)手性sfc(方法sfc-i)：rt1.54分钟，mh+499，手性纯度100％。对映异构体4b：1hnmr(360mhz,dmso-d6)δppm3.61(s,3h)3.64(t,j＝4.93hz,2h)3.76-3.90(m,2h)3.95(s,3h)4.80(br.s.,1h)5.71(t,j＝2.09hz,1h)5.93(d,j＝2.12hz,2h)6.14(d,j＝8.03hz,1h)6.39(d,j＝8.05hz,1h)6.73(td,j＝8.48,2.46hz,1h)6.93(dd,j＝11.37,2.48hz,1h)7.21(dd,j＝8.52,1.94hz,1h)7.37(dd,j＝8.59,6.88hz,1h)7.53(d,j＝1.93hz,1h)8.14(d,j＝8.53hz,1h)8.46(s,1h)12.12(br.s,1h)lc/ms(方法lc-a)：rt1.08分钟，mh+499[α]d20：-102.6°(c0.5295，dmf)手性sfc(方法sfc-i)：rt1.90分钟，mh+499，手性纯度100％。实例5：1-(6,7-二氟-1h-吲哚-3-基)-2-(4-氟-2-甲氧基-苯基)-2-((3-(2-羟基乙氧基)-5-甲氧基苯基)氨基)乙酮(化合物5)的合成以及手性分离成对映异构体5a和5b。中间体5a的合成：将6,7-二氟-1h-吲哚[cas271780-84-8](3.0g，19.6mmol)于ch2cl2(75ml)中的溶液在n2下搅拌并且在冰上冷却。逐滴添加二乙基氯化铝1m于己烷(30ml，30mmol)中的溶液并且将混合物在0℃下搅拌10分钟。然后，逐滴添加2-(4-氟-2-甲氧基苯基)乙酰氯1a(5.0g，24.7mmol，合成：参见实例1)于ch2cl2(15ml)中的溶液并且将所得混合物在室温下搅拌4小时。将反应混合物缓慢倒入冷却的(0℃)饱和nahco3水溶液中。将混合物经过滤并且用thf洗涤滤饼。从合并的滤液分离有机层，经mgso4干燥，过滤且在减压下蒸发。将固体残余物用ch2cl2研磨，滤出固体且在50℃下在真空中干燥以给出呈白色粉末的1-(6,7-二氟-1h-吲哚-3-基)-2-(4-氟-2-甲氧基苯基)乙酮5a(4.46g)。中间体5b的合成：将1-(6,7-二氟-1h-吲哚-3-基)-2-(4-氟-2-甲氧基苯基)乙酮5a(4.45g，13.93mmol)悬浮于thf(60ml)中并且在n2下在冰上冷却。逐滴添加苯基三甲基三溴化铵[cas4207-56-1](5.30g，14.1mmol)于thf(35ml)中的溶液并且随后将该混合物在室温下搅拌3小时。将沉淀物滤出并且用thf洗涤。在减压下蒸发合并的滤液。将残余物用少量ch2cl2研磨，滤出且在50℃下在真空下干燥以提供呈白色粉末的2-溴-1-(6,7-二氟-1h-吲哚-3-基)-2-(4-氟-2-甲氧基苯基)乙酮5b(4.10g)。化合物5的合成以及手性分离成对映异构体5a和5b：将2-溴-1-(6,7-二氟-1h-吲哚-3-基)-2-(4-氟-2-甲氧基苯基)-乙酮5b(4.10g，10.31mmol)、2-(3-氨基-5-甲氧基苯氧基)乙醇[cas725237-16-1](1.91g，10.43mmol)以及二异丙基乙胺(1.8ml，10.44mmol)的混合物在ch3cn中搅拌并且在回流下加热过夜。在冷却至室温之后，在减压下蒸发溶剂并且通过在二氧化硅上快速层析(固定相：二氧化硅340ghp-spher25μm，流动相：ch2cl2/etoac梯度100/0至50/50)纯化残余物。将产物级分合并且在减压下蒸发。经由制备型hplc(固定相：c18odb-10μm，200g，5cm。流动相：在水中的0.25％nh4hco3溶液，meoh)进一步纯化残余物。将产物级分浓缩，溶解于甲醇中并且再次浓缩，从而产生作为外消旋混合物的1-(6,7-二氟-1h-吲哚-3-基)-2-(4-氟-2-甲氧基苯基)-2-((3-(2-羟基-乙氧基)-5-甲氧基苯基)氨基)乙酮(化合物5，1.62g)。将这个批次的一小部分通过从ch3cn/水的混合物中冻干来固化以提供呈无定形白色粉末的化合物5(65mg)。经由制备型sfc(固定相：od20×250mm，流动相：co2，具有0.2％iprnh2的etoh)进行化合物5(1.50g)的手性分离。将产物级分合并且在减压下蒸发。通过在二氧化硅上柱层析(固定相：二氧化硅25ghp-spher25μm，流动相：ch2cl2/meoh梯度100/0至0/100)来进一步纯化第一洗脱产物。将产物级分浓缩至2ml的残余量。将白色沉淀物滤出，用ch2cl2洗涤若干次并且在真空下在50℃下干燥以提供呈无定形白色粉末的对映异构体5a(414mg)。通过在二氧化硅上柱层析(固定相：二氧化硅25ghp-spher25μm，流动相：ch2cl2/meoh梯度100/0至0/100)来进一步纯化第二洗脱产物。将产物级分浓缩至2ml的残余量。将白色沉淀物滤出，用ch2cl2洗涤若干次并且在真空下在50℃下干燥以提供呈无定形白色粉末的对映异构体5b(437mg)。化合物5：1hnmr(360mhz,dmso-d6)δppm3.61(s,3h)3.64(q,j＝5.36hz,2h)3.74-3.89(m,2h)3.93(s,3h)4.79(t,j＝5.66hz,1h)5.71(t,j＝2.01hz,1h)5.94(d,j＝2.18hz,2h)6.16(d,j＝8.06hz,1h)6.38(d,j＝8.06hz,1h)6.73(td,j＝8.42,2.55hz,1h)6.93(dd,j＝11.35,2.55hz,1h)7.18-7.27(m,1h)7.37(dd,j＝8.43,6.95hz,1h)7.92(dd,j＝8.60,4.92hz,1h)8.49(s,1h)12.76(s,1h)lc/ms(方法lc-a)：rt1.07分钟，mh+501对映异构体5a：1hnmr(360mhz,dmso-d6)δppm3.61(s,3h)3.64(q,j＝5.63hz,2h)3.75-3.89(m,2h)3.94(s,3h)4.79(t,j＝5.53hz,1h)5.71(t,j＝2.12hz,1h)5.95(d,j＝2.22hz,2h)6.16(d,j＝8.21hz,1h)6.38(d,j＝8.11hz,1h)6.73(td,j＝8.52,2.53hz,1h)6.93(dd,j＝11.35,2.62hz,1h)7.19-7.27(m,1h)7.37(dd,j＝8.55,6.88hz,1h)7.92(dd,j＝8.94,4.36hz,1h)8.49(s,1h)12.77(s,1h)lc/ms(方法lc-a)：rt1.07分钟，mh+501[α]d20：-88.3°(c0.506，dmf)手性sfc(方法sfc-j)：rt2.46分钟，mh+501，手性纯度100％。对映异构体5b：1hnmr(360mhz,dmso-d6)δppm3.61(s,3h)3.64(q,j＝5.05hz,2h)3.76-3.89(m,2h)3.94(s,3h)4.79(t,j＝5.55hz,1h)5.71(t,j＝2.16hz,1h)5.95(d,j＝2.07hz,2h)6.16(d,j＝8.09hz,1h)6.38(d,j＝8.15hz,1h)6.73(td,j＝8.43,2.69hz,1h)6.93(dd,j＝11.35,2.67hz,1h)7.16-7.28(m,1h)7.37(dd,j＝8.55,6.87hz,1h)7.92(dd,j＝8.92,4.37hz,1h)8.49(s,1h)12.77(br.s,1h)lc/ms(方法lc-a)：rt1.07分钟，mh+501[α]d20：+90.3°(c0.523，dmf)手性sfc(方法sfc-j)：rt4.27分钟，mh+501，手性纯度100％。实例6：2-(4-氟-2-甲氧基苯基)-2-((3-(2-羟基乙氧基)-5-甲氧基苯基)氨基)-1-(6-甲氧基-5-甲基-1h-吲哚-3-基)乙酮(化合物6)的合成以及手性分离成对映异构体6a和6b。中间体6a的合成：在0℃下将于己烷(18.6ml，18.6mmol)中的二乙基氯化铝1m逐滴添加至6-甲氧基-5-甲基-1h-吲哚[cas1071973-95-9](2g，12.4mmol)于ch2cl2(60ml)中的溶液中。在0℃下30分钟之后，在0℃下缓慢添加于ch2cl2(60ml)中的2-(4-氟-2-甲氧基苯基)-乙酰氯1a(3.3g，16.3mmol，合成：参见实例1)。将反应在0℃下搅拌3小时。添加冰水且滤出沉淀物，用水洗涤，并且在真空下干燥以提供2-(4-氟-2-甲氧基苯基)-1-(6-甲氧基-5-甲基-1h-吲哚-3-基)-乙酮6a(3.15g)。中间体6b的合成：在0℃下，将苯基三甲基三溴化铵[cas4207-56-1](3.8g，10.1mmol)于thf(90ml)中的溶液逐滴添加至2-(4-氟-2-甲氧基苯基)-1-(6-甲氧基-5-甲基-1h-吲哚-3-基)乙酮6a(3.15g，9.6mmol)于thf(90ml)中的混合物中。将混合物在0℃下搅拌1小时，并且在室温下搅拌2.5小时。将沉淀物滤出并且用etoac洗涤。在减压下浓缩滤液。将所得残余物用最少量的ch3cn和二异丙基醚吸收。将沉淀物滤出并且在真空下干燥以提供2-溴-2-(4-氟-2-甲氧基苯基)-1-(6-甲氧基-5-甲基-1h-吲哚-3-基)乙酮6b(2.8g)。化合物6的合成以及手性分离成对映异构体6a和6b：将2-溴-2-(4-氟-2-甲氧基苯基)-1-(6-甲氧基-5-甲基-1h-吲哚-3-基)乙酮6b(1.0g，2.46mmol)、2-(3-氨基-5-甲氧基苯氧基)乙醇[cas725237-16-1](676mg，3.69mmol)和二异丙基乙胺(0.64ml，3.69mmol)于ch3cn(10ml)和thf(10ml)中的混合物使用具有范围从0至400w的功率输出(固定的保持时间)的微波initiatorexp60在70℃下加热1小时。在减压下蒸发溶剂。将残余物用etoac吸收。将有机层用1nhcl洗涤两次，用水洗涤，经mgso4干燥，过滤并且在减压下浓缩溶剂。通过在硅胶上快速层析(15-40μm，40g，ch2cl2/ch3oh99.5/0.5)进行纯化。收集纯级分并且蒸发至干以给出作为外消旋混合物的2-(4-氟-2-甲氧基苯基)-2-((3-(2-羟基乙氧基)-5-甲氧基-苯基)氨基)-1-(6-甲氧基-5-甲基-1h-吲哚-3-基)乙酮(化合物6，330mg)。在手性分离之前将此级分与另一批化合物6(60mg)合并。经由制备型手性sfc(固定相：ic5μm250×30mm，流动相：70％co2，30％meoh)进行化合物6(390mg)的手性分离，从而产生137mg的第一洗脱对映异构体和146mg的第二洗脱对映异构体。将第一洗脱对映异构体与另一批次合并(级分1，总量：246mg)。将第二洗脱对映异构体与另一批次合并(级分2，总量：245mg)。通过在硅胶上快速层析(15-40μm，12g，ch2cl2/ch3oh99.5/0.5)再次纯化级分1。收集纯级分并且蒸发至干以给出207mg。从et2o/庚烷和几滴ch3cn中固化该化合物以得到呈无定形粉末的对映异构体6a(173mg)。通过在硅胶上快速层析(15-40μm，12g，ch2cl2/ch3oh99.5/0.5)再次纯化级分2。收集纯级分并且蒸发至干以得到204mg。从et2o/庚烷和几滴ch3cn中固化该化合物以得到呈无定形粉末的对映异构体6b(158mg)。化合物6：1hnmr(500mhz,dmso-d6)δppm2.20(s,3h)3.60(s,3h)3.64(q,j＝5.4hz,2h)3.77-3.87(m,5h)3.96(s,3h)4.79(t,j＝5.5hz,1h)5.70(t,j＝2.0hz,1h)5.92(d,j＝1.6hz,2h)6.10(d,j＝7.9hz,1h)6.31(d,j＝7.9hz,1h)6.72(td,j＝8.5,2.2hz,1h)6.89-6.95(m,2h)7.32-7.38(m,1h)7.89(s,1h)8.22(s,1h)11.74(br.s.,1h)lc/ms(方法lc-c)：rt2.89分钟，mh+509对映异构体6a：1hnmr(500mhz,dmso-d6)δppm2.20(s,3h)3.55-3.68(m,5h)3.74-3.91(m,5h)3.96(s,3h)4.78(t,j＝5.5hz,1h)5.70(t,j＝2.0hz,1h)5.92(d,j＝2.0hz,2h)6.10(d,j＝7.9hz,1h)6.29(d,j＝7.9hz,1h)6.67-6.76(m,1h)6.88-6.96(m,2h)7.36(dd,j＝8.5,6.9hz,1h)7.89(s,1h)8.22(s,1h)11.73(br.s.,1h)lc/ms(方法lc-c)：rt2.88分钟，mh+509[α]d20：+116.9°(c0.278，dmf)手性sfc(方法sfc-a)：rt4.07分钟，mh+509，手性纯度100％。对映异构体6b：1hnmr(500mhz,dmso-d6)δppm2.20(s,3h)3.55-3.67(m,5h)3.75-3.90(m,5h)3.96(s,3h)4.78(t,j＝5.5hz,1h)5.70(t,j＝2.0hz,1h)5.92(d,j＝2.0hz,2h)6.10(d,j＝7.9hz,1h)6.29(d,j＝7.9hz,1h)6.71(td,j＝8.5,2.4hz,1h)6.87-6.97(m,2h)7.36(dd,j＝8.5,6.9hz,1h)7.89(s,1h)8.22(s,1h)11.73(br.s.,1h)lc/ms(方法lc-c)：rt2.88分钟，mh+509[α]d20：-118.6°(c0.279，dmf)手性sfc(方法sfc-a)：rt7.13分钟，mh+509，手性纯度100％。实例7：2-(4-氟-2-甲氧基苯基)-1-(5-氟-6-甲氧基-1h-吲哚-3-基)-2-((3-(2-羟基乙氧基)-5-甲氧基苯基)氨基)乙酮(化合物7)的合成以及手性分离成对映异构体7a和7b。中间体7a的合成：在0℃下将于己烷(20ml，20mmol)中的二乙基氯化铝1m逐滴添加至5-氟-6-甲氧基-1h-吲哚[cas1211595-72-0](2.2g，13.3mmol)于ch2cl2(60ml)中的溶液中。在0℃下30分钟之后，在0℃下缓慢添加于ch2cl2(60ml)中的2-(4-氟-2-甲氧基苯基)-乙酰氯1a(3.85g，19mmol，合成：参见实例1)。将反应在0℃下搅拌3小时。添加冰水和nahco3水溶液。将反应混合物用ch2cl2/meoh萃取。将有机层用水洗涤，经mgso4干燥，过滤并且在减压下浓缩溶剂。将残余物用最少的ch2cl2吸收。将沉淀物滤出并且干燥以得到2-4-氟-2-甲氧基苯基)-1-(5-氟-6-甲氧基-1h-吲哚-3-基)-乙酮7a(3.2g)。中间体7b的合成：在0℃下，将苯基三甲基三溴化铵[cas4207-56-1](3.22g，8.56mmol)于thf(80ml)中的溶液逐滴添加至2-(4-氟-2-甲氧基苯基)-1-(5-氟-6-甲氧基-1h-吲哚-3-基)乙酮7a(2.7g，8.15mmol)于thf(80ml)中的混合物中。将混合物在0℃下搅拌1小时，并且在室温下搅拌2.5小时。将沉淀物滤出，用etoac和水洗涤并且干燥以得到第一批2-溴-2-(4-氟-2-甲氧基苯基)-1-(5-氟-6-甲氧基-1h-吲哚-3-基)乙酮7b(1.5g)。将滤液的有机层分离，经mgso4干燥，过滤且在减压下浓缩。将所得残余物用最少量的ch3cn和二异丙基醚吸收。将沉淀物滤出且在真空下干燥以给出第二批7b(1.7g)。化合物7的合成以及手性分离成对映异构体7a和7b：将2-溴-2-(4-氟-2-甲氧基苯基)-1-(5-氟-6-甲氧基-1h-吲哚-3-基)乙酮7b(0.8g，1.95mmol)、2-(3-氨基-5-甲氧基苯氧基)乙醇[cas725237-16-1](0.39g，2.15mmol)和三乙胺(0.54ml，3.9mmol)于thf(5ml)和ch3cn(5ml)中的混合物在70℃下搅拌12小时。将残余物用ch2cl2和h2o稀释。将有机层分离，经mgso4干燥，过滤并且在减压下蒸发溶剂。通过在硅胶上柱层析(15-40μm，40g于ch2cl2/meoh/nh4oh(99/1/0.1)中)来纯化粗化合物。将含有化合物7的级分合并，并且在减压下蒸发溶剂。将残余物溶解于ch2cl2中并且用1nhcl洗涤。将有机层分离，经mgso4干燥，过滤并且在减压下浓缩溶剂。经由反相hplc(固定相：x--c185μm30×150mm，流动相：梯度从60％nh4hco30.5％/40％meoh至0％nh4hco30.5％/100％meoh)进行第二纯化以给出作为外消旋混合物的2-(4-氟-2-甲氧基-苯基)-1-(5-氟-6-甲氧基-1h-吲哚-3-基)-2-((3-(2-羟基乙氧基)-5-甲氧基-苯基)氨基)乙酮(化合物7，350mg)。经由制备型手性sfc(固定相：ic5μm250×30mm，流动相：60％co2，40％meoh)分离对映异构体以给出70mg的作为外消旋混合物的化合物2、104mg的第一洗脱对映异构体和100mg的第二洗脱对映异构体。将第一洗脱对映异构体从ch3cn/et2o中结晶以得到对映异构体7a(76mg)。将第二洗脱对映异构体从ch3cn/et2o中结晶以得到对映异构体7b(62mg)。化合物7：1hnmr(500mhz,dmso-d6)δppm3.56-3.68(m,5h)3.76-3.88(m,5h)3.95(s,3h)4.78(t,j＝5.4hz,1h)5.70(s,1h)5.92(s,2h)6.11(d,j＝7.9hz,1h)6.35(d,j＝7.9hz,1h)6.72(td,j＝8.4,2.0hz,1h)6.92(dd,j＝11.0,1.9hz,1h)7.14(d,j＝7.6hz,1h)7.36(t,j＝7.7hz,1h)7.81(d,j＝12.0hz,1h)8.33(s,1h)11.93(br.s.,1h)lc/ms(方法lc-c)：rt2.74分钟，mh+513对映异构体7a：1hnmr(500mhz,dmso-d6)δppm3.59-3.67(m,5h)3.77-3.88(m,5h)3.95(s,3h)4.78(t,j＝5.5hz,1h)5.71(t,j＝1.6hz,1h)5.92(d,j＝1.6hz,2h)6.11(d,j＝7.9hz,1h)6.35(d,j＝7.9hz,1h)6.72(td,j＝8.4,2.2hz,1h)6.92(dd,j＝11.3,2.2hz,1h)7.14(d,j＝7.3hz,1h)7.31-7.41(m,1h)7.81(d,j＝11.7hz,1h)8.33(s,1h)11.71-12.11(m,1h)lc/ms(方法lc-c)：rt2.74分钟，mh+513[α]d20：+85.7°(c0.28，dmf)手性sfc(方法sfc-b)：rt1.87分钟，mh+513，手性纯度100％。熔点：226℃对映异构体7b：1hnmr(500mhz,dmso-d6)δppm3.58-3.66(m,5h)3.76-3.87(m,5h)3.95(s,3h)4.78(t,j＝5.5hz,1h)5.70(t,j＝1.6hz,1h)5.92(d,j＝1.6hz,2h)6.11(d,j＝7.9hz,1h)6.35(d,j＝7.9hz,1h)6.72(td,j＝8.4,2.2hz,1h)6.92(dd,j＝11.3,2.2hz,1h)7.14(d,j＝7.3hz,1h)7.36(t,j＝7.7hz,1h)7.81(d,j＝11.7hz,1h)8.33(s,1h)11.92(br.s.,1h)lc/ms(方法lc-c)：rt2.74分钟，mh+513[α]d20：-87.6°(c0.283，dmf)手性sfc(方法sfc-b)：rt3.24分钟，mh+513，手性纯度100％。熔点：226℃实例8：1-(7-氯-6-甲氧基-1h-吲哚-3-基)-2-(4-氟-2-甲氧基苯基)-2-((3-(2-羟基乙氧基)-5-甲氧基苯基)氨基)乙酮(化合物8)的合成以及手性分离成对映异构体8a和8b。中间体8a的合成：在0℃下将于己烷(16.5ml，16.5mmol)中的二乙基氯化铝1m逐滴添加至7-氯-6-甲氧基-1h-吲哚[cas1227604-21-8](2g，11mmol)于ch2cl2(60ml)中的溶液中。在0℃下30分钟之后，在0℃下缓慢添加于ch2cl2(60ml)中的2-(4-氟-2-甲氧基苯基)乙酰氯1a(3.3g，16.3mmol，合成：参见实例1)。将反应在0℃下搅拌3小时。添加冰水且滤出沉淀物，用水洗涤，并且在真空下干燥以给出1-(7-氯-6-甲氧基-1h-吲哚-3-基)-2-(4-氟-2-甲氧基苯基)乙酮8a(2.7g)。中间体8b的合成：在0℃下，将苯基三甲基三溴化铵[cas4207-56-1](3.06g，8.15mmol)于thf(80ml)中的溶液逐滴添加至1-(7-氯-6-甲氧基-1h-吲哚-3-基)-2-(4-氟-2-甲氧基苯基)乙酮8a(2.7g，7.76mmol)于thf(80ml)中的混合物中。将混合物在0℃下搅拌1小时，并且在室温下搅拌2.5小时。将沉淀物滤出，用etoac洗涤。将滤液在减压下浓缩，再次溶解于etoac中且用水洗涤。将有机层分离，经mgso4干燥，过滤且在减压下浓缩。将所得残余物用最少量的ch3cn和二异丙基醚吸收。将沉淀物滤出并且在真空下干燥以给出2-溴-1-(7-氯-6-甲氧基-1h-吲哚-3-基)-2-(4-氟-2-甲氧基-苯基)乙酮8b(3.2g)。化合物8的合成以及手性分离成对映异构体8a和8b：将2-溴-1-(7-氯-6-甲氧基-1h-吲哚-3-基)-2-(4-氟-2-甲氧基-苯基)乙酮8b(2g，4.69mmol)、2-(3-氨基-5-甲氧基苯氧基)乙醇[cas725237-16-1](0.86g，4.69mmol)和三乙胺(1.3ml，9.4mmol)于ch3cn(100ml)中的混合物在室温下搅拌1小时，并且然后在50℃下搅拌2小时。通过在硅胶(15-40μm，80g)于甲苯/2-丙醇/nh4oh(90/10/0.1)中)上柱层析来纯化粗产物以提供800mg的粗化合物8。将这个批次的一部分从二异丙基醚中结晶以给出第一批的1-(7-氯-6-甲氧基-1h-吲哚-3-基)-2-(4-氟-2-甲氧基苯基)-2-((3-(2-羟基-乙氧基)-5-甲氧基苯基)氨基)乙酮(化合物8，90mg)。经由柱层析(固定相：不规则的裸二氧化硅40g，流动相：0.3％nh4oh，97％ch2cl2，3％meoh)进行粗化合物8的剩余材料的纯化以给出作为外消旋混合物的化合物8(500mg)。经由手性sfc(固定相：ic5μm250×30mm，流动相：55％co2，45％meoh)分离对映异构体以给出184mg的第一洗脱对映异构体和190mg的第二洗脱对映异构体。将第一洗脱对映异构体从庚烷/二异丙基醚/ch3cn中结晶以得到呈无定形固体的对映异构体8a(135mg)。将第二洗脱对映异构体从庚烷/二异丙基醚/ch3cn中结晶以得到呈无定形固体的对映异构体8b(150mg)。化合物8：1hnmr(500mhz,dmso-d6)δppm3.59-3.67(m,5h)3.77-3.90(m,5h)3.95(s,3h)4.78(t,j＝5.4hz,1h)5.71(s,1h)5.94(d,j＝1.6hz,2h)6.14(d,j＝8.2hz,1h)6.35(d,j＝7.9hz,1h)6.72(td,j＝8.5,2.2hz,1h)6.93(dd,j＝11.3,2.2hz,1h)7.10(d,j＝8.8hz,1h)7.32-7.40(m,1h)8.04(d,j＝8.8hz,1h)8.33(s,1h)12.16(br.s.,1h)lc/ms(方法lc-c)：rt2.89分钟，mh+529对映异构体8a：1hnmr(400mhz,dmso-d6)δppm3.54-3.68(m,5h)3.73-3.90(m,5h)3.95(s,3h)4.78(t,j＝5.6hz,1h)5.71(t,j＝2.0hz,1h)5.94(d,j＝2.0hz,2h)6.14(d,j＝8.1hz,1h)6.36(d,j＝8.1hz,1h)6.72(td,j＝8.5,2.3hz,1h)6.93(dd,j＝11.1,2.3hz,1h)7.10(d,j＝8.6hz,1h)7.36(dd,j＝8.6,7.1hz,1h)8.04(d,j＝8.6hz,1h)8.33(s,1h)12.03-12.26(m,1h)lc/ms(方法lc-c)：rt2.88分钟，mh+529[α]d20：+84.3°(c0.267，dmf)手性sfc(方法sfc-c)：rt4.82分钟，mh+529，手性纯度100％。对映异构体8b：1hnmr(400mhz,dmso-d6)δppm3.58-3.68(m,5h)3.76-3.90(m,5h)3.95(s,3h)4.78(t,j＝5.6hz,1h)5.71(s,1h)5.94(s,2h)6.14(d,j＝8.1hz,1h)6.35(d,j＝8.1hz,1h)6.72(td,j＝8.5,2.3hz,1h)6.93(dd,j＝11.1,2.3hz,1h)7.10(d,j＝8.6hz,1h)7.31-7.41(m,1h)8.04(d,j＝8.6hz,1h)8.33(s,1h)12.06-12.31(m,1h)lc/ms(方法lc-c)：rt2.88分钟，mh+529[α]d20：-84.7°(c0.268，dmf)手性sfc(方法sfc-c)：rt6.42分钟，mh+529，手性纯度99.36％。实例9：2-(4-氟-2-甲氧基苯基)-1-(5-氟-7-甲基-1h-吲哚-3-基)-2-((3-(2-羟基乙氧基)-5-甲氧基苯基)氨基)乙酮(化合物9)的合成以及手性分离成对映异构体9a和9b。中间体9a的合成：在0℃下将于己烷(22ml，22mmol)中的二乙基氯化铝1m逐滴添加至5-氟-7-甲基-1h-吲哚[cas1082041-52-8](1.62g，10.9mmol)于ch2cl2(45ml)中的溶液中。在0℃下30分钟之后，在0℃下缓慢添加2-(4-氟-2-甲氧基苯基)乙酰氯1a(3.3g，16.3mmol，合成：参见实例1)于ch2cl2(30ml)中的溶液。将反应在0℃下搅拌3小时。添加罗谢尔盐溶液(1n，75ml)，并且将反应混合物在室温下搅拌过夜。将沉淀物滤出并且分配在etoac与1nhcl之间。将有机相用1nhcl和盐水洗涤，经mgso4干燥，过滤并且在减压下浓缩。将残余物用最少量的etoac吸收。将沉淀物滤出以给出2-(4-氟-2-甲氧基苯基)-1-(5-氟-7-甲基-1h-吲哚-3-基)-乙酮9a(2.4g)。中间体9b的合成：在0℃下，将苯基三甲基三溴化铵[cas4207-56-1](2.2g，5.85mmol)于thf(60ml)中的溶液逐滴添加至2-(4-氟-2-甲氧基苯基)-1-(5-氟-7-甲基-1h-吲哚-3-基)乙酮9a(1.66g，5.26mmol)于thf(45ml)中的溶液中。将混合物在0℃下搅拌1小时，并且在室温下搅拌过夜。将沉淀物滤出并且用etoac洗涤。在减压下浓缩滤液以给出2-溴-2-(4-氟-2-甲氧基苯基)-1-(5-氟-7-甲基-1h-吲哚-3-基)-乙酮9b(1.9g)。化合物9的合成以及手性分离成对映异构体9a和9b：将2-溴-2-(4-氟-2-甲氧基苯基)-1-(5-氟-7-甲基-1h-吲哚-3-基)-乙酮9b(0.202g，0.512mmol)和2-(3-氨基-5-甲氧基苯氧基)-乙醇[cas725237-16-1](0.468g，2.554mmol)于ch3cn(2ml)和thf(2ml)中的混合物在室温下搅拌28小时。将反应混合物用etoac稀释并且用1nhcl洗涤。将有机相用饱和nahco3水溶液和盐水洗涤，经mgso4干燥，过滤并且在减压下浓缩。通过使用于庚烷中的异丙醇(10％至40％)的梯度在硅胶上快速层析来纯化残余物。将含有预期化合物的级分合并，并且在减压下浓缩。将残余物用etoac和庚烷研磨以得到作为外消旋混合物的2-(4-氟-2-甲氧基苯基)-1-(5-氟-7-甲基-1h-吲哚-3-基)-2-((3-(2-羟基乙氧基)-5-甲氧基苯基)氨基)乙酮(化合物9，147mg)。经由手性sfc(固定相：od-h5μm250×20mm，流动相：55％co2，45％meoh)进行化合物9(430mg)的手性分离以给出198mg的第一洗脱对映异构体和188mg的第二洗脱对映异构体。将第一洗脱对映异构体从ch2cl2/二异丙基醚中结晶以得到对映异构体9a(138mg)。将第二洗脱对映异构体从ch2cl2/二异丙基醚中结晶以得到对映异构体9b(151mg)。化合物9：1hnmr(300mhz,dmso-d6)δppm2.47(s,3h)3.61(s,3h)3.62-3.67(m,2h)3.77-3.89(m,2h)3.96(s,3h)4.79(t,j＝5.1hz,1h)5.71(t,j＝2.0hz,1h)5.94(d,j＝2.0hz,2h)6.14(d,j＝7.9hz,1h)6.35(d,j＝7.9hz,1h)6.69-6.73(m,1h)6.89-6.95(m,2h)7.34-7.39(m,1h)7.63-7.67(m,1h)8.45(s,1h)12.21(br.s.,1h)lc/ms(方法lc-d)：rt3.9分钟，mh+497对映异构体9a：1hnmr(500mhz,dmso-d6)δppm2.47(s,3h)3.52-3.67(m,5h)3.76-3.89(m,2h)3.96(s,3h)4.72-4.83(m,1h)5.71(br.s.,1h)5.94(s,2h)6.15(d,j＝7.9hz,1h)6.36(d,j＝7.9hz,1h)6.69-6.77(m,1h)6.90-6.97(m,2h)7.36(t,j＝7.9hz,1h)7.62-7.69(m,1h)8.44(s,1h)12.21(br.s.,1h)lc/ms(方法lc-c)：rt2.92分钟，mh+497[α]d20：-80.0°(c0.436，dmf)手性sfc(方法sfc-d)：rt2.14分钟，mh+497，手性纯度100％。熔点：181℃对映异构体9b：1hnmr(500mhz,dmso-d6)δppm2.47(s,3h)3.53-3.68(m,5h)3.74-3.88(m,2h)3.96(s,3h)4.78(t,j＝5.4hz,1h)5.66-5.73(m,1h)5.94(s,2h)6.15(d,j＝7.9hz,1h)6.36(d,j＝7.9hz,1h)6.72(td,j＝8.0,1.6hz,1h)6.85-6.98(m,2h)7.36(t,j＝8.0hz,1h)7.65(dd,j＝9.5,1.6hz,1h)8.44(s,1h)12.04-12.43(m,1h)lc/ms(方法lc-c)：rt2.93分钟，mh+497[α]d20：+81.1°(c0.388，dmf)手性sfc(方法sfc-d)：rt3.45分钟，mh+497，手性纯度100％。熔点：179℃实例10：1-(5,6-二氟-1h-吲哚-3-基)-2-(4-氟-2-甲氧基-苯基)-2-((3-(2-羟基乙氧基)-5-甲氧基苯基)氨基)乙酮(化合物10)的合成以及手性分离成对映异构体10a和10b。中间体10a的合成：在0℃下将于己烷(9.8ml，9.8mmol)中的二乙基氯化铝1m逐滴添加至5,6-二氟-1h-吲哚[cas169674-01-5](1.00g，6.5mmol)于ch2cl2(12ml)中的溶液中。在0℃下30分钟之后，在0℃下缓慢添加2-(4-氟-2-甲氧基苯基)乙酰氯1a(1.99g，9.8mmol，合成：参见实例1)于ch2cl2(30ml)中的溶液。将反应在0℃下搅拌3小时。添加1m罗谢尔盐溶液并且将反应混合物在室温下搅拌30分钟。将所形成的固体滤出并且分配在etoac与1nhcl之间。分离各相。将有机层用盐水洗涤，经mgso4干燥，过滤且在减压下浓缩以给出1-(5,6-二-氟-1h-吲哚-3-基)-2-(4-氟-2-甲氧基苯基)-乙酮10a(1.26g)。中间体10b的合成：在0℃下，将苯基三甲基三溴化铵[cas4207-56-1](1.63g，4.34mmol)于thf(5ml)中的溶液逐滴添加至1-(5,6-二氟-1h-吲哚-3-基)-2-(4-氟-2-甲氧基苯基)-乙酮10a(1.26g，3.95mmol)于thf(35ml)中的溶液中。将该混合物在室温下搅拌过夜。将沉淀物滤出并且用etoac洗涤。将滤液在减压下进行浓缩。将残余物用最少的乙腈吸收。将沉淀物滤出，用乙腈洗涤并且在真空下干燥以给出2-溴-1-(5,6-二氟-1h-吲哚-3-基)-2-(4-氟-2-甲氧基苯基)乙酮10b(0.758g)。化合物10的合成以及手性分离成对映异构体10a和10b：将2-溴-1-(5,6-二氟-1h-吲哚-3-基)-2-(4-氟-2-甲氧基苯基)乙酮10b(0.758g，1.90mmol)和2-(3-氨基-5-甲氧基苯氧基)乙醇[cas725237-16-1](0.746g，4.07mmol)于thf(10ml)和ch3cn(10ml)中的混合物在室温下搅拌3天。在减压下浓缩反应混合物。将残余物分配于etoac与1nhcl之间。分离各相。用etoac萃取水相。将有机相合并，用饱和nahco3水溶液和盐水洗涤，经mgso4干燥，过滤且在减压下浓缩。通过使用于庚烷中的etoac(15％至100％)的梯度在硅胶上快速层析来纯化残余物。将含有化合物10的级分合并，并且在减压下浓缩。经由反相hplc(固定相：x--c185μm19×100mm，流动相：梯度从80％甲酸0.1％/20％ch3cn至10％甲酸0.1％/90％ch3cn)进行第二纯化以给出作为外消旋混合物的1-(5,6-二氟-1h-吲哚-3-基)-2-(4-氟-2-甲氧基苯基)-2-((3-(2-羟基乙氧基)-5-甲氧基-苯基)氨基)乙酮(化合物10，499mg)。经由制备型手性sfc(固定相：od-h5μm250×30mm，流动相：60％co2，40％meoh)分离化合物10(459mg)的对映异构体以给出208mg的第一洗脱对映异构体和221mg的第二洗脱对映异构体。将第一洗脱对映异构体从庚烷中固化以得到对映异构体10a(168mg)。将第二洗脱对映异构体从庚烷中固化以得到对映异构体10b(174mg)。化合物10：1hnmr(300mhz,dmso-d6)δppm3.55-3.70(m,5h)3.83(m,2h)3.94(s,3h)4.79(t,j＝5.5hz,1h)5.72(s,1h)5.93(d,j＝1.9hz,2h)6.13(d,j＝7.9hz,1h)6.38(d,j＝8.3hz,1h)6.73(td,j＝8.5,2.3hz,1h)6.93(dd,j＝11.3,2.3hz,1h)7.37(dd,j＝8.5,7.0hz,1h)7.54(dd,j＝10.7,7.0hz,1h)8.00(dd,j＝10.9,8.3hz,1h)8.47(s,1h)12.17(s,1h)lc/ms(方法lc-e)：rt8.3分钟，mh+501对映异构体10a：1hnmr(500mhz,dmso-d6)δppm12.17(br.s.,1h)8.47(s,1h)7.99(dd,j＝11.0,8.2hz,1h)7.53(dd,j＝10.6,7.1hz,1h)7.36(t,j＝7.7hz,1h)6.92(dd,j＝11.3,2.2hz,1h)6.73(td,j＝8.5,2.2hz,1h)6.38(d,j＝7.9hz,1h)6.13(d,j＝7.9hz,1h)5.93(s,2h)5.71(br.s,1h)4.79(t,j＝5.5hz,1h)3.94(s,3h)3.82(m,2h)3.57-3.67(m,5h)lc/ms(方法lc-c)：rt2.89分钟，mh+501[α]d20：-86.4°(c0.5727，dmf)手性sfc(方法sfc-e)：rt2.97分钟，mh+501，手性纯度100％。对映异构体10b：1hnmr(500mhz,dmso-d6)δppm12.17(br.s.,1h)8.47(s,1h)7.99(dd,j＝10.9,8.4hz,1h)7.53(dd,j＝10.6,7.1hz,1h)7.36(t,j＝7.7hz,1h)6.92(dd,j＝11.3,1.6hz,1h)6.73(t,j＝7.7hz,1h)6.38(d,j＝8.2hz,1h)6.13(d,j＝7.9hz,1h)5.93(s,2h)5.71(br.s,1h)4.79(t,j＝5.5hz,1h)3.94(s,3h)3.77-3.88(m,2h)3.58-3.67(m,5h)lc/ms(方法lc-c)：rt2.89分钟，mh+501[α]d20：+90.7°(c0.5227，dmf)手性sfc(方法sfc-e)：rt4.67分钟，mh+501，手性纯度100％。实例11：2-(4-氟-2-甲氧基苯基)-2-((3-(2-羟基乙氧基)-5-甲氧基苯基)氨基)-1-(6-甲氧基-7-甲基-1h-吲哚-3-基)乙酮(化合物11)的合成以及手性分离成对映异构体11a和11b。中间体11a的合成：在n2-气氛下在-25℃下将于己烷(40.8ml，40.8mmol)中的二乙基氯化铝1m逐滴添加至6-甲氧基-7-甲基-1h-吲哚[cas19500-05-1](4.39g，27.2mmol)于ch2cl2(200ml)中的溶液中。在-25℃下搅拌15分钟之后，在-25℃下逐滴添加2-(4-氟-2-甲氧基苯基)乙酰氯1a(7.72g，38.1mmol，合成：参见实例1)于ch2cl2(200ml)中的溶液。在-25℃下继续搅拌1小时并且随后使反应混合物加热至室温同时搅拌2小时。将反应混合物倒入冰水/罗谢尔盐溶液中，并且在搅拌一段时间之后，通过经过滤除去固体，并且将滤饼用小部分thf冲洗若干次。分离各相并且用thf萃取水层。将合并的有机层用盐水洗涤，经mgso4干燥，过滤并且在减压下蒸发。将固体残余物悬浮于ch2cl2(20ml)中。将固体滤出，用小部分ch2cl2洗涤并且在50℃下在真空下干燥以给出2-(4-氟-2-甲氧基苯基)-1-(6-甲氧基-7-甲基-1h-吲哚-3-基)乙酮11a(7.5g)。中间体11b的合成：在0℃下，将苯基三甲基三溴化铵[cas4207-56-1](5.8g，15.5mmol)于thf(200ml)中的溶液逐滴添加至2-(4-氟-2-甲氧基苯基)-1-(6-甲氧基-7-甲基-1h-吲哚-3-基)乙酮11a(4.95g，14.1mmol)于thf(200ml)中的溶液中。将混合物在室温下搅拌2小时。将沉淀物滤出并且用thf洗涤。在减压下浓缩滤液。将残余物用少量的ch2cl2研磨。将沉淀物滤出，用ch2cl2洗涤并且在真空下干燥以给出2-溴-2-(4-氟-2-甲氧基苯基)-1-(6-甲氧基-7-甲基-1h-吲哚-3-基)乙酮11b(4.04g)。化合物11的合成以及手性分离成对映异构体11a和11b：将2-溴-2-(4-氟-2-甲氧基苯基)-1-(6-甲氧基-7-甲基-1h-吲哚-3-基)乙酮11b(1434mg，3.78mmol)和2-(3-氨基-5-甲氧基-苯氧基)乙醇[cas725237-16-1](1037mg，5.66mmol)以及二异丙基-乙胺(976μl，5.66mmol)于ch3cn(100ml)中的混合物在室温下搅拌18小时。在减压下浓缩反应混合物。将残余物分配于ch2cl2与0.5nhcl之间。分离各相。将有机层用水洗涤，经mgso4干燥，过滤并且在减压下浓缩。通过在硅胶上快速层析(固定相：snapultra100g，流动相：etoac:etoh(3:1)/庚烷梯度0/100至60/40)来纯化残余物。合并含有化合物11的级分并且在减压下浓缩以给出作为外消旋混合物的2-(4-氟-2-甲氧基-苯基)-2-((3-(2-羟基乙氧基)-5-甲氧基苯基)氨基)-1-(6-甲氧基-7-甲基-1h-吲哚-3-基)乙酮(化合物11，995mg)。使用正相手性分离(固定相：(s,s)whelk-o1(500g)，流动相：100％etoh，等度洗脱)进行化合物11(995mg)的对映异构体的手性分离。合并产物级分且蒸发以提供作为第一洗脱产物的对映异构体11a和作为第二洗脱产物的对映异构体11b。通过在硅胶上柱层析(固定相：snapultra10g，流动相：ch2cl2/meoh梯度100/0至98/2)来进一步纯化对映异构体11a。将产物级分合并，在减压下蒸发溶剂并且将残余物在50℃下在真空下干燥以提供呈无定形白色粉末的对映异构体11a(255mg)。通过在硅胶上柱层析(固定相：snapultra10g，流动相ch2cl2/meoh梯度100/0至98/2)来进一步纯化对映异构体11b。将产物级分合并，在减压下蒸发溶剂并且将残余物在50℃下在真空下干燥以提供呈无定形白色粉末的对映异构体11b(270mg)。化合物11：1hnmr(400mhz,dmso-d6)δppm2.29(s,3h)3.61(s,3h)3.64(q,j＝5.2hz,2h)3.79(s,3h)3.80-3.90(m,2h)3.97(s,3h)4.77(t,j＝5.4hz,1h)5.71(t,j＝2.0hz,1h)5.94(d,j＝2.0hz,2h)6.13(d,j＝7.9hz,1h)6.32(d,j＝7.9hz,1h)6.71(td,j＝8.5,2.5hz,1h)6.92(dd,j＝11.3,2.4hz,1h)6.94(d,j＝8.8hz,1h)7.37(dd,j＝8.6,6.9hz,1h)7.93(d,j＝8.9hz,1h)8.31(d,j＝2.9hz,1h)11.83(d,j＝3.1hz,1h)lc/ms(方法lc-a)：rt1.10分钟，mh+509对映异构体11a：1hnmr(360mhz,dmso-d6)δppm2.29(s,3h)3.61(s,3h)3.64(q,j＝5.4hz,2h)3.79(s,3h)3.80-3.89(m,2h)3.97(s,3h)4.79(t,j＝5.5hz,1h)5.70(t,j＝2.0hz,1h)5.94(d,j＝2.2hz,2h)6.13(d,j＝7.7hz,1h)6.34(d,j＝7.7hz,1h)6.72(td,j＝8.4,2.6hz,1h)6.93(dd,j＝11.5,2.4hz,1h)6.94(d,j＝8.8hz,1h)7.37(dd,j＝8.6,6.8hz,1h)7.93(d,j＝8.8hz,1h)8.32(brs,1h)11.85(brs,1h)lc/ms(方法lc-a)：rt1.05分钟，mh+509[α]d20：+98.8°(c0.5285，dmf)手性sfc(方法sfc-f)：rt2.26分钟，mh+509，手性纯度100％。对映异构体11b：1hnmr(360mhz,dmso-d6)δppm2.29(s,3h)3.61(s,3h)3.64(q,j＝5.1hz,2h)3.79(s,3h)3.80-3.90(m,2h)3.97(s,3h)4.79(t,j＝5.5hz,1h)5.70(t,j＝2.0hz,1h)5.94(d,j＝2.2hz,2h)6.13(d,j＝8.1hz,1h)6.34(d,j＝8.1hz,1h)6.72(td,j＝8.4,2.6hz,1h)6.93(dd,j＝11.5,2.4hz,1h)6.94(d,j＝8.8hz,1h)7.37(dd,j＝8.8,7.0hz,1h)7.93(d,j＝8.4hz,1h)8.32(brs,1h)11.85(brs,1h)lc/ms(方法lc-a)：rt1.05分钟，mh+509[α]d20：-94.1°(c0.461，dmf)手性sfc(方法sfc-f)：rt2.73分钟，mh+509，手性纯度100％。实例12：2-(4-氟-2-甲氧基苯基)-1-(7-氟-5-甲基-1h-吲哚-3-基)-2-((3-(2-羟基乙氧基)-5-甲氧基苯基)氨基)乙酮(化合物12)的合成以及手性分离成对映异构体12a和12b。中间体12a的合成：在n2-气氛下在0℃下将于己烷(25.6ml，25.6mmol)中的二乙基氯化铝1m逐滴添加至7-氟-5-甲基-1h-吲哚[cas442910-91-0](2.54g，17.0mmol)于ch2cl2(150ml)中的溶液中。在0℃下搅拌30分钟之后，在0℃下逐滴添加2-(4-氟-2-甲氧基苯基)乙酰氯1a(5.2g，25.6mmol，合成：参见实例1)于ch2cl2(150ml)中的溶液。在0℃下继续搅拌1小时并且随后使反应混合物加热至室温同时搅拌3小时。将反应混合物倒入冰水/罗谢尔盐溶液中，并且在搅拌一段时间之后，通过经过滤除去固体，并且将滤饼用小部分thf冲洗若干次。分离各相并且用thf萃取水层。将合并的有机层用盐水洗涤，经mgso4干燥，过滤并且在减压下蒸发。将固体残余物悬浮于ch2cl2(20ml)中。将固体滤出，用小部分ch2cl2/庚烷(1/1)洗涤并且在50℃下在真空下干燥以给出2-(4-氟-2-甲氧基苯基)-1-(7-氟-5-甲基-1h-吲哚-3-基)乙酮12a(4.13g)。中间体12b的合成：在0℃下，将苯基三甲基三溴化铵[cas4207-56-1](5.39g，14.3mmol)于thf(150ml)中的溶液逐滴添加至2-(4-氟-2-甲氧基苯基)-1-(7-氟-5-甲基-1h-吲哚-3-基)乙酮12a(4.11g，13.0mmol)于thf(100ml)中的溶液中。在将混合物在室温下搅拌1小时。将沉淀物滤出并且用thf洗涤。将滤液在减压下进行浓缩。将残余物用少量的ch2cl2研磨。将沉淀物滤出，用ch2cl2洗涤并且在真空下在50℃下干燥以给出2-溴-2-(4-氟-2-甲氧基苯基)-1-(7-氟-5-甲基-1h-吲哚-3-基)乙酮12b(4.81g)。化合物12的合成以及手性分离成对映异构体12a和12b：将2-溴-2-(4-氟-2-甲氧基苯基)-1-(7-氟-5-甲基-1h-吲哚-3-基)乙酮12b(1096mg，2.78mmol)和2-(3-氨基-5-甲氧基苯氧基)-乙醇[cas725237-16-1](764mg，4.17mmol)以及二异丙基乙胺(718μl，4.17mmol)于ch3cn(25ml)中的混合物在室温下搅拌90小时。在减压下浓缩反应混合物。将残余物分配于ch2cl2与0.5nhcl之间。分离各相。将有机层用水洗涤，经mgso4干燥，过滤并且在减压下浓缩。通过在硅胶上快速层析(固定相：snapultra100g，流动相：etoac:etoh(3:1)/庚烷梯度0/100至50/50)来纯化残余物。合并含有化合物12的级分并且在减压下浓缩以给出作为外消旋混合物的2-(4-氟-2-甲氧基苯基)-1-(7-氟-5-甲基-1h-吲哚-3-基)-2-((3-(2-羟基-乙氧基)-5-甲氧基苯基)氨基)乙酮(化合物12，919mg)。经由制备型sfc(固定相：od20×250mm，流动相：co2，具有0.2％iprnh2的etoh)进行化合物12(919mg)的对映异构体的手性分离。将产物级分合并，蒸发并且在50℃下在真空下干燥以提供作为第一洗脱产物的对映异构体12a(307mg)和作为第二洗脱产物的对映异构体12b(302mg)。两种对映异构体均作为无定形白色粉末出现。化合物12：lc/ms(方法lc-a)：rt1.08分钟，mh+497对映异构体12a：1hnmr(360mhz,dmso-d6)δppm2.39(s,3h)3.62(s,3h)3.65(q,j＝5.4hz,2h)3.77-3.90(m,2h)3.95(s,3h)4.80(t,j＝5.5hz,1h)5.72(t,j＝2.0hz,1h)5.95(d,j＝2.2hz,2h)6.15(d,j＝8.1hz,1h)6.35(d,j＝8.1hz,1h)6.74(td,j＝8.5,2.4hz,1h)6.92(dd,j＝12.1,1.1hz,1h)6.94(dd,j＝11.3,2.2hz,1h)7.37(dd,j＝8.8,7.0hz,1h)7.79(s,1h)8.40(s,1h)12.48(brs,1h)lc/ms(方法lc-b)：rt1.98分钟，mh+497[α]d20：-113.5°(c0.355，dmf)手性sfc(方法sfc-k)：rt2.26分钟，mh+497，手性纯度100％。对映异构体12b：1hnmr(360mhz,dmso-d6)δppm2.38(s,3h)3.61(s,3h)3.64(q,j＝5.1hz,2h)3.77-3.89(m,2h)3.94(s,3h)4.79(t,j＝5.5hz,1h)5.71(t,j＝1.8hz,1h)5.94(d,j＝1.8hz,2h)6.15(d,j＝8.1hz,1h)6.34(d,j＝7.7hz,1h)6.73(td,j＝8.5,2.4hz,1h)6.91(brd,j＝12.1hz,1h)6.93(dd,j＝11.3,2.6hz,1h)7.36(dd,j＝8.4,7.0hz,1h)7.78(s,1h)8.39(s,1h)12.46(brs,1h)lc/ms(方法lc-b)：rt1.98分钟，mh+497[α]d20：+117.0°(c0.448，dmf)手性sfc(方法sfc-k)：rt3.67分钟，mh+497，手性纯度100％。本发明的化合物的抗病毒活性denv-2抗病毒测定本发明的所有化合物的抗病毒活性针对denv-216681株进行测试，该菌株用增强型绿色荧光蛋白标记(egpf)。培养基由补充有2％热灭活的胎牛血清、0.04％庆大霉素(50mg/ml)以及2mml-谷氨酰胺的最低必需培养基组成。将获自ecacc的vero细胞悬浮于培养基中，并且将25μl添加至384孔板(2500个细胞/孔)，这些板已经含有抗病毒化合物。通常，这些板含有在100％dmso(200nl)中的处于最终浓度的200倍的测试化合物的9个稀释步骤的4倍连续稀释液。此外，每种化合物浓度一式四份地进行测试(最终浓度范围：25μm-0.00038μm)。最后，每个板含有被指定为病毒对照(在不存在化合物的情况下含有细胞和病毒)、细胞对照(在不存在病毒和化合物的情况下含有细胞)和培养基对照(在不存在细胞、病毒和化合物的情况下含有培养基)的孔。向被指定为培养基对照的这些孔添加25μl的培养基而不是vero细胞。一旦细胞被添加到这些板，就将这些板在室温下孵育30分钟以便允许这些细胞在这些孔内均匀地分布。接着，将这些板在一个完全润湿的孵育箱(37℃，5％co2)中孵育直到第二天。然后，以0.5的感染复数(moi)添加用egfp标记的denv-2株16681。因此，将15μl的病毒悬浮液添加至所有含有测试化合物的孔中并且添加至被指定为病毒对照的孔中。并行地，将15μl的培养基添加至培养基对照和细胞对照。接着，将这些板在一个完全润湿的孵育箱(37℃，5％co2)中孵育3天。在读出当天，使用自动化荧光显微镜在488nm(蓝色激光)下测量egfp荧光。使用一种内部lims系统，计算每种化合物的抑制剂量反应曲线并且确定半最大有效浓度(ec50)。因此，使用以下公式来计算每一测试浓度的抑制百分比(i)：i＝100*(st-scc)/(svc-scc)；st、scc和svc分别是测试化合物孔、细胞对照孔和病毒对照孔中的egfp信号的量。ec50表示如通过相较于病毒对照的egfp荧光强度的50％降低所测量，病毒复制被抑制50％的化合物的浓度。被使用线性内插法计算ec50(表1)。并行地，在相同板上评定这些化合物的毒性。一旦进行egfp信号的读出，就将10μl的刃天青(一种细胞存活力染色剂)添加至384孔板的所有孔。刃天青测定是基于通过由这些细胞产生的nadh将蓝色刃天青还原成高度荧光产物试卤灵。粉色荧光试卤灵的形成与孔中存活细胞的数目直接相关。将这些板在一个完全润湿的孵育箱(37℃，5％co2)中培育另外5小时。接着，在一个无限阅读器(帝肯(tecan))上使用530nm的激发波长对这些板进行测量。还测定了半最大细胞毒性浓度(cc50)，其被定义为使刃天青转化相较于细胞对照孔的转化降低50％所需的浓度。最后，确定这些化合物的选择性指数(si)，该指数如下计算：si＝cc50/ec50。表1：在denv-2抗病毒测定中本发明的化合物的ec50、cc50和sin＝对这些化合物进行测试的独立实验的数目。四价逆转录酶定量-pcr(rt-qpcr)测定：方案a。在rt-qpcr测定中针对denv-1株tc974#666(ncpv)、denv-2株16681、denv-3株h87(ncpv)以及denv-4株h241(ncpv)和eden(sg/06k2270dk1/2005；genbank登录号qg398256)测试本发明的这些化合物的抗病毒活性。因此，在存在或不存在测试化合物的情况下用denv-1或-2或-3或-4感染vero细胞。在感染后第3天，将细胞溶解并且细胞溶解产物用于制备病毒靶标(denv的3’utr；表2)和细胞参考基因(β-肌动蛋白，表2)两者的cdna。随后，在lightcycler480仪器上进行双重实时pcr。所生成的cp值与这些靶标的rna表达的量成反比。通过测试化合物抑制denv复制导致3’utr基因的cp的移位。另一方面，如果测试化合物对细胞有毒性，那么将观察到对β-肌动蛋白表达的类似作用。对比δδcp方法用于计算计算ec50，该方法是基于用细胞管家基因(β-肌动蛋白)标准化的靶基因(3’utr)的相对基因表达。此外，cc50值是基于针对管家基因β-肌动蛋白获取的cp值。表2：用于实时、定量rt-pcr的引物和探针。a报道染料(fam，hex)和淬灭剂(bhq1)元素以粗体和斜体指示。b这些引物和探针的核苷酸序列选自登革热病毒基因组的3’utr区中的保守区，其是基于保藏在genbank的四种登革热血清型的300个核苷酸序列的比对(gong等人，2013，分子生物学方法(methodsmolbiol)，第16章)。培养基由补充有2％热灭活的胎牛血清、0.04％庆大霉素(50mg/ml)以及2mml-谷氨酰胺的最低必需培养基组成。将获自ecacc的vero细胞悬浮于培养基中，并且将75μl/孔添加在96孔板(10000个细胞/孔)中，这些板已经含有抗病毒化合物。通常，这些板含有测试化合物的9个稀释步骤的4倍连续稀释液，在于100％dmso(500nl；最终浓度范围：25μm-0.00038μm)中的最终浓度的200倍下。此外，每个板包括被指定为病毒对照(在不存在化合物的情况下含有细胞和病毒)和细胞对照(在不存在病毒和化合物的情况下含有细胞)。一旦将这些细胞添加在这些板中，就将这些板在一个完全润湿的孵育箱(37℃，5％co2)中孵育直到第二天。然后，添加denv-1株tc974#666、denv-2株16681、denv-3株h87或denv-4株h241或eden。因此，将25μl的病毒悬浮液(其中在rtqpcr中实现约22的cp)添加至所有含有测试化合物的孔并且添加至被指定为病毒对照的孔。并行地，将25μl的培养基添加至细胞对照。接着，将这些板在一个完全润湿的孵育箱(37℃，5％co2)中孵育3天。在3天之后，将上清液从这些孔中除去并且将这些孔用冰冷pbs(约100μl)洗涤两次。将这些96孔板内的细胞沉淀储存在-80℃下持续至少1天。接着，根据制造商的指导(应用生物系统公司(appliedbiosystems))使用cells-to-cttm溶解试剂盒萃取rna。这些细胞溶解产物可以储存在-80℃下或立即用于逆转录步骤中。在逆转录步骤的准备中，制备混合物a(表3a)并且将7.57μl/孔分配在一个96孔板中。在添加5μl的细胞溶解产物之后，进行在75℃下的一个五分钟变性步骤(表3b)。之后，添加7.43μl的混合物b(表3c)并且起始逆转录步骤(表3d)以产生cdna。最后，制备一种rt-qpcr混合物，混合物c(表4a)，将该混合物分配在96孔lightcyclerqpcr板中，向这些板添加3μl的cdna，并且根据表4b中的条件在一个lightcycler480上进行qpcr。使用lightcycler软件和一种内部lims系统，计算每种化合物的剂量反应曲线，并且测定半最大有效浓度(ec50)和半最大细胞毒性浓度(cc50)(表6-9)。表3：使用混合物a、变性、混合物b和逆转录进行cdna合成混合物ab变性步骤：步骤温度时间变性75℃5'保持4℃保持c混合物bd方案cdna合成步骤温度时间逆转录42℃30'变性99℃5'保持4℃保持表4：qpcr混合物和方案。a混合物cb方案qpcr3四价定量逆转录酶-pcr(rt-qpcr)测定：方案b。将vero细胞(4×104)接种在96孔板中。在一天之后，将细胞培养基用100μl的含有化合物的2倍、3倍或5倍连续稀释液(浓度范围：分别50μg/ml-0.00038μg/ml、50μg/ml-0.0076μg/ml以及50μg/ml-0.00013μg/ml)和100μl的登革热病毒稀释液的测定培养基替换，其中在中rtqpcr实现约20的ct。在2小时孵育期之后，将细胞单层用测定培养基洗涤3次以除去残余物，将未吸附的病毒和培养物在抑制剂存在下进一步孵育4天(denv-2ngc-tongalike)或7天(denv-1djibouti株d1/h/imtssa/98/606、denv-3株h87原型、denv-4株h241’)。收获上清液并且通过实时定量rt-pcr确定病毒rna负载。使用对数内插法测定50％有效浓度(ec50)(其被定义为将病毒rna复制抑制50％所需的化合物浓度)(表7和8)。使用nucleospin96病毒试剂盒(filterservice，迪伦(düren)，德国)如由制造商所描述从100μl上清液分离rna。使用引物表达软件(2.0版；应用生物系统公司，莱尼克(lennik)，比利时)从对应黄病毒的非结构基因3(ns3)或ns5选择taqman引物(denv-正向，denv-反相；表5)和taqman探针(denv-探针表5)的序列。将taqman探针在5’端用6-羧基荧光素(fam)作为报道染料进行荧光标记，并且在3’端用小沟结合物(mgb)作为淬灭剂进行荧光标记(表5)。一步定量rt-pcr在25μl的总体积中进行，该总体积含有13.9375μlh2o、6.25μl主混合物(eurogentec，seraing，比利时)、0.375μl正向引物、0.375μl反向引物、1μl探针、0.0625μl逆转录酶(eurogentec)和3μl样品。使用abi7500快速实时pcr系统(应用生物系统公司，布兰斯堡(ranchburg)，新泽西州(newjersey)，美国)使用以下条件进行rt-pcr：在48℃下30分钟和在95℃下10分钟，随后是在95℃下15秒和在60℃下1分钟的40个循环。使用abiprism7500sds软件(1.3.1版；应用生物系统公司)分析数据。对于绝对定量，使用具有已知浓度的模板制剂的10倍稀释液产生标准曲线。表5：用于实时定量rt-pcr的引物和探针。a报道染料(fam)和淬灭剂(mgb/tamra)元素以粗体和斜体指示。b基因组内引物和探针的核苷酸序列和位置推导自denv2ngc(genbank登录号m29095；入江(irie)等人，1989)的核苷酸序列、登革热病毒血清型1djibouti株d1/h/imtssa/98/606(genbank登录号af298808)、登革热病毒血清型3株h87原型(c93130)、登革热病毒血清型4株h241(不可获得序列)。细胞毒性测定(方案b)在未感染的vero细胞中评估这些化合物的潜在细胞毒性作用。在化合物的两倍、三倍或五倍连续稀释液(范围分别为50μg/ml-0.0038μg/ml、50μg/ml-0.0076μg/ml以及50μg/ml-0.00013μg/ml)存在下将细胞以4×104个细胞/孔接种在一个96孔板中并且孵育4至7天。将培养基丢弃并且将于pbs中的100μl3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基-苯基)-2-(4-磺苯基)-2h-四氮唑/吩嗪硫酸甲酯(mts/pms；普洛麦格(promega)，莱顿(leiden)，荷兰(thenetherlands))添加至各孔。在37℃下孵育2小时时间段之后，在498nm下确定光密度。使用以下公式计算细胞毒性活性：细胞存活力％＝100×(od化合物/odcc)，其中od化合物和odcc分别对应于用化合物处理的未感染的细胞培养物在498nm下的光密度和未感染的未处理的细胞培养物在498nm下的光密度。使用线性内插法计算50％细胞毒性浓度(即，使总细胞数目减少50％的浓度；cc50)(表7和8)。表6：在rt-qpcr测定中化合物针对血清型1的ec50、cc50和sin＝对这些化合物进行测试的独立实验的数目。表7：在rt-qpcr测定中化合物针对血清型2的ec50、cc50和sin＝对这些化合物进行测试的独立实验的数目。na：未批准。表8：在rt-qpcr测定中化合物针对血清型3的ec50、cc50和sin＝对这些化合物进行测试的独立实验的数目。表9：在rt-qpcr测定中化合物针对血清型4的ec50、cc50和sin＝对这些化合物进行测试的独立实验的数目。当前第1页12