复合式多步核酸扩增的制作方法
背景技术：
虽然多种核酸扩增技术是已知的，但当前技术存在诸如与靶核酸扩增的速度、灵敏度和/或特异性等相关的各种局限性。因此，需要改进的核酸扩增技术。
援引并入
本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请均通过引用而并入本文，其程度犹如特别地且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用而并入。
技术实现要素：
申请人公开了用于扩增样品中的一种或多种靶核酸序列的改进方法。靶核酸可为dna序列，或可为rna序列。本文公开的改进的核酸扩增法包括循序应用两种不同的核酸扩增法。在实施方式中，将第一核酸扩增法应用于样品，扩增样品中的一种或多种靶核酸序列的拷贝数；随后将第二核酸扩增法应用于该样品或其等分试样，进一步扩增该样品中的一种或多种靶核酸序列的拷贝数。在实施方式中，可循序进行任意两种核酸扩增法，其中将第一核酸扩增法应用于样品，然后在通过第一核酸扩增法扩增后，再将第二核酸扩增法应用于该样品或其等分试样。在实施方式中，改进的核酸扩增法包括首先采用热循环扩增法，然后采用非热循环(例如，等温)扩增法，从而扩增样品中的一个靶核酸序列或扩增样品中的多个靶核酸序列。在实施方式中，第一核酸扩增法包括聚合酶链反应(pcr)扩增法。适宜的pcr方法包括两步pcr，并且包括3步pcr法。在靶核酸为rna的实施方式中，可使用逆转录酶pcr(rtpcr)。在实施方式中，第二核酸扩增法包括如于2014年3月15日提交的第pct/us14/30028号国际申请、于2014年3月15日提交的第pct/us14/30034号国际申请、于2014年9月17日提交的第pct/us14/56151号国际申请、于2014年3月15日提交的第pct/us14/30036号国际申请或于2015年9月17日提交的第pct/us15/50811号国际申请中描述的等温核酸扩增法，其中每一个申请均通过引用全文并入本文以用于所有目的。
因此，一种用于扩增样品中的靶核酸序列的方法包括：通过第一核酸扩增法来扩增该样品中的一种或多种靶核酸序列的拷贝数；然后通过第二核酸扩增法来进一步扩增该样品或其等分试样中的所述一种或多种靶核酸序列的拷贝数。在实施方式中，一种用于扩增样品中的靶核酸序列的方法包括：通过热循环核酸扩增法来扩增该样品中的一种或多种靶核酸序列的拷贝数；然后通过非热循环(例如，等温)核酸扩增法来进一步扩增该样品或其等分试样中的所述一种或多种靶核酸序列的拷贝数。在实施方式中，一种用于扩增样品中的靶核酸序列的方法包括：通过聚合酶链反应(pcr)核酸扩增法来扩增该样品中的一种或多种靶核酸序列的拷贝数；然后通过等温核酸扩增法来进一步扩增该样品或其等分试样中的所述一种或多种靶核酸序列的拷贝数，该等温核酸扩增法选自如于2014年3月15日提交的第pct/us14/30028号国际申请、于2014年3月15日提交的第pct/us14/30034号国际申请、于2014年9月17日提交的第pct/us14/56151号国际申请、于2014年3月15日提交的第pct/us14/30036号国际申请或于2015年9月17日提交的第pct/us15/50811号国际申请中描述的等温核酸扩增法。
在进一步的实施方式中，一种用于扩增样品中的靶核酸序列的方法包括：使样品与引物或引物组相接触，该引物或引物组与靶核酸序列杂交；通过第一核酸扩增法来扩增该样品中的所述靶核酸序列的拷贝数；然后通过第二核酸扩增法来进一步扩增该样品或其等分试样中的所述靶核酸序列的拷贝数。进一步的实施方式包括使样品与多个引物或多个引物组相接触，所述多个引物或多个引物组与多个靶核酸序列杂交；通过第一核酸扩增法来扩增该样品中的所述靶核酸序列的拷贝数；然后通过第二核酸扩增法来进一步扩增该样品或其等分试样中的所述靶核酸序列的拷贝数。
在进一步的实施方式中，一种改进的核酸扩增法包括首先利用非热循环(例如，等温)扩增法来扩增样品中的一个靶核酸序列或扩增样品中的多个靶核酸序列，然后将热循环扩增法应用于经扩增的样品或其等分试样，以进一步扩增该样品中的一个靶核酸序列或者扩增该样品中的多个靶核酸序列。
因此，申请人在此公开了用于进行核酸扩增的方法、装置、系统、器具(例如，容器)和试剂盒。在实施方式中，用于进行核酸扩增的这类方法、装置、系统、器具(例如，容器)和试剂盒包括用于从样品如临床样品中扩增核酸的方法、装置、系统、器具(例如，容器)和试剂盒。在实施方式中，可使用样品的一部分(例如，等分试样)提供用于扩增的核酸。在实施方式中，这样的样品可为血液、尿液、唾液或其他临床样品，或血液、尿液、唾液或其他临床样品的一部分(例如，等分试样)。
因此，在实施方式中，申请人公开了一种用于扩增样品中的靶核酸序列的方法，其包括：
首先通过第一核酸扩增法来扩增该样品中的一种或多种靶核酸序列的拷贝数；以及
其次通过第二核酸扩增法来进一步扩增该样品或其等分试样中的所述一种或多种靶核酸序列的拷贝数。在这类方法的实施方式中，所述第一核酸扩增法包括热循环核酸扩增法。在这类方法的实施方式中，所述第二核酸扩增法包括等温核酸扩增法。在这类方法的实施方式中，所述第一核酸扩增法包括热循环核酸扩增法，并且所述第二核酸扩增法包括等温核酸扩增法。在这类方法的实施方式中，所述第一核酸扩增法包括聚合酶链反应(pcr)核酸扩增法。在这类方法的实施方式中，通过所述pcr扩增法扩增的核酸包含dna。在这类方法的实施方式中，通过所述pcr扩增法扩增的核酸包含rna。在实施方式中，所述核酸可包括尿嘧啶，并且在实施方式中可包括双脱氧尿嘧啶(例如，可在扩增期间包含双脱氧尿嘧啶以代替胸腺嘧啶)。在这类方法的实施方式中，所述第二核酸扩增法包括等温核酸扩增法。
在本文公开的方法的实施方式中，所述扩增法中使用的引物针对单个靶核酸序列及其互补序列。在本文公开的方法的实施方式中，所述扩增法中使用的引物针对多个靶核酸序列及其互补序列。
因此，在实施方式中，申请人公开了一种用于检测共同核酸分子上的第一遗传元件和第二遗传元件的方法，该方法包括：
利用第一引物和第二引物进行第一核酸扩增反应，其中第一引物和第二引物都在引物的5’端上被磷酸化，其中第一引物与第一遗传元件互补，其中第二引物与第二遗传元件互补，并且其中形成了第一反应产物，其中该第一反应产物含有第一遗传元件的至少一部分和第二遗传元件的至少一部分，其中所述第一遗传元件的至少一部分和所述第二遗传元件的至少一部分在第一反应产物中彼此相隔x个核苷酸；
将第一反应产物与连接酶一起温育，以至少形成含有第一反应产物的第一连接产物，其中在第一连接产物内，所述第一遗传元件的至少一部分的拷贝和所述第二遗传元件的至少一部分的拷贝彼此相隔少于x个核苷酸；
利用第三引物和第四引物进行第二核酸扩增反应，其中第三引物与第一遗传元件互补，并且其中第四引物与第二遗传元件互补，其中形成了第二反应产物；以及
检测该第二反应产物。
因此，在实施方式中，申请人公开了一种用于扩增多核苷酸模板的方法，该方法包括：
a)在聚合酶链反应(pcr)扩增反应混合物中生成多个拷贝的多核苷酸模板，其中该pcr扩增反应混合物包含第一pcr扩增反应引物和第二pcr扩增反应引物，其中在该pcr扩增反应混合物中，第一pcr扩增反应引物与多核苷酸模板退火并且第二pcr扩增反应引物与互补于多核苷酸模板的多核苷酸退火，并且其中在该pcr扩增反应混合物中，形成了多个拷贝的pcr扩增反应产物，其中该pcr扩增反应产物为包含第一链和第二链的双链核酸分子，并且其中该pcr扩增反应产物的第一链为多核苷酸模板的拷贝；
b)在包含非热循环反应第一引物和非热循环反应第二引物的非热循环反应混合物中温育所述多核苷酸模板的拷贝，其中：
该多核苷酸模板包含第一部分、第二部分和第三部分，其中第三部分在该多核苷酸模板中位于第一部分与第二部分之间；
第一引物包含第一区和第二区，其中第一引物的第二区与多核苷酸模板的第一部分互补；并且
第二引物包含第一区和第二区，其中第二引物的第二区与所述pcr扩增反应产物第二链中互补于所述多核苷酸模板的第二部分的序列互补，第二引物的第一区与第一引物的第一区互补，并且第二引物的第一区与所述多核苷酸模板的第三部分互补。
在本文公开的方法的实施方式中，所述多核苷酸模板的第一部分和第二部分的长度均在6至30个核苷酸之间。在这类方法的实施方式中，所述多核苷酸模板的第三部分的长度在4至14个核苷酸之间。在本文公开的方法的实施方式中，所述非热循环反应混合物中的多核苷酸模板的拷贝数在所述方法开始的60分钟之内增加至少10倍。在本文公开的方法的实施方式中，在所述非热循环反应混合物的温育期间，生成了包含至少三个拷贝的多核苷酸模板的多联体链。
申请人在此进一步公开了一个容器和多个容器，其包含本文提供的反应混合物的任一种或多种组分。申请人在此进一步公开了一个试剂盒和多个试剂盒，其包含本文提供的反应混合物的任一种或多种组分。
本文公开的测定和方法可在用于处理样品的装置或系统上进行。本文公开的测定和方法可容易地并入自动化测定装置和自动化测定系统中并在其中使用。例如，如本文公开的系统可包括通信组件，该通信组件用于传输或接收基于待检测的分析物(例如，指示病毒、细菌或其他靶标的一种或多种核酸标志物)或基于待通过所述装置或系统检测的其他分析物的方案。在实施方式中，可根据待通过装置进行的多个测定的最佳安排来改变测定方案，或者可根据先前从来自受试者的样品获得的结果，或根据先前从来自该受试者的不同样品获得的结果来改变测定方案。在实施方式中，通信组件可包含用于将信息从所述装置传送至计算机的信道，所述信道选自计算机网络、电话网络、金属通信链路、光通信链路和无线通信链路。在实施方式中，如本文公开的系统可将信号传输至中央位置或终端用户，并且可包括用于传输这类信号的通信组件。如本文公开的系统可被配置成按需要或定期更新方案。
配置为根据本文公开的方法测量血液样品中的核酸标志物(例如，其可指示病毒、细菌或其他靶标)的装置和系统可被配置为从对体积不超过约1000μl、不超过约500μl、不超过约250μl，或不超过约150μl，或不超过约100μl，或不超过约50μl的样品(例如，血液、尿液、痰液、泪液的样品或其他样品)的一部分进行分析而确定，或者在实施方式中，其中样品的体积不超过约25μl，或不超过约10μl，或者其中所述血液样品包括小于约10μl。这类装置可被配置为在少于约一小时内，或在实施方式中，在少于约40分钟内或在少于约30分钟内测量靶标水平或检测样品中靶标的存在或不存在。
本文公开的装置可被配置为进行用于测量靶核酸的测定，并且还被配置为进行用于测量血液样品中的另一种分析物的测定。本文公开的装置可被配置为进行用于测量靶核酸分子的测定，并且还被配置为进行包括测量血液样品中血细胞的形态特征的测定。本文公开的装置可被配置为进行用于测量靶核酸分子的测定，并且还被配置为进行包括测量另一种血液分析物例如维生素、激素、药物或药物代谢物或其他分析物的测定。可以这样配置这类装置，其中可通过与另一装置的通信来改变通过所述装置进行的测定或测定的进行顺序。
申请人还公开了包含如本文公开的装置的系统。在实施方式中，该系统包含被配置为进行用于测量靶核酸分子的测定并且还被配置为进行用于测量样品中另一种分析物的测定的装置。在实施方式中，该系统包含被配置为进行用于测量靶核酸分子的测定并且还被配置为进行用于测量样品中细胞的形态特征的测定的装置。在此类系统的实施方式中，可通过与另一装置的通信来改变通过所述装置进行的测定或测定的进行顺序。
本文公开的方法、系统、装置、试剂盒和组合物提供了仅需要少量样品如仅需要少量血液、尿液、泪液、汗液、组织或其他样品的快速测定。本文公开的装置和系统被配置为进行仅需要少量样品，如体积小于约250μl，或小于约200μl，或小于约150μl，或小于约100μl的样品或样品部分的这类快速测定。因此，所述方法、组合物、装置和系统提供了仅需要少量生物样品的快速测试，因此提供了优于其他方法、组合物、测定、装置和系统的优势。
申请人在此公开了包含一种或多种试剂的组合物，该试剂包括引物、核苷酸、染料、缓冲液以及对本文公开的方法有用的其他试剂。申请人在此公开了用于测定装置、测定系统的容器，该测定装置、测定系统包括对本文公开的方法有用的自动化测定装置、自动化测定系统(也可称为样品分析装置和系统以及自动化样品分析装置和系统)。申请人在此公开了用于测定装置、测定系统的器具、工具和一次性用品，该测定装置、测定系统包括对本文公开的方法有用的自动化测定装置和自动化测定系统。申请人在此公开了含有一种或多种试剂的容器，该试剂包括引物、核苷酸、染料以及对本文公开的方法有用的其他试剂。申请人在此公开了包含含有一种或多种试剂的组合物的试剂盒，该试剂包括引物、核苷酸、染料、缓冲液以及对本文公开的方法有用的其他试剂；包含用于测定装置、测定系统的容器的试剂盒，该测定装置、测定系统包括对本文公开的方法有用的自动化测定装置和自动化测定系统；以及包含用于测定装置、测定系统的组合物和容器的试剂盒，该测定装置、测定系统包括对本文公开的方法有用的自动化测定装置和自动化测定系统。
本文公开的方法、系统、装置、试剂盒和组合物提供了相比于其他方法的优势，包括更高的灵敏度。本文公开的方法、系统、装置、试剂盒和组合物提供了优势，包括改善的在单个核酸扩增装置或系统(例如，其可以是或包括自动化测定装置、自动化测定系统，其也可以被称为样品分析装置和系统，以及自动化样品分析装置和系统)中多路进行两个或更多个扩增反应的能力。本文公开的方法、系统、装置、试剂盒和组合物提供了优势，包括改善的在第一核酸扩增步骤中扩增单个容器中的两种、三种或更多种靶核酸，并接着在多个第二核酸扩增步骤中进行针对多个单独容器中的单独靶核酸的步骤的能力。本文公开的方法、系统、装置、试剂盒和组合物提供了优势，包括改善的对靶核酸中的单核苷酸多态性(snp)进行扩增、检测或鉴定及其组合的能力。本文公开的方法、系统、装置、试剂盒和组合物提供了优势，包括改善的在第一核酸扩增步骤中不使用染料而进行pcr，并接着进行包括使用染料的第二核酸扩增步骤以根据第二核酸扩增步骤检测靶核酸的能力；例如，此类方法、系统、装置、试剂盒和组合物可用于检测snp。
本文公开的方法、系统、装置、试剂盒和组合物提供了优势，包括与其他方式可能需要的相比在使用样品时需要较少预处理的能力。本文公开的方法、系统、装置、试剂盒和组合物提供了优势，包括与其他方式可能需要的相比将样品稀释至更大稀释度的能力。本文公开的方法、系统、装置、试剂盒和组合物提供了优势，包括与其他方式可能发生的相比降低被除受试者之外的人(例如，操作者)污染的易发性。本文公开的方法、系统、装置、试剂盒和组合物提供了优势，包括在其他方法可能需要鼻咽拭子的情况下将这些技术应用于鼻拭子分析的能力。
当结合以下描述和附图考虑时，将会进一步领会并理解本发明的其他目的和优点。虽然以下描述可能包含描述本发明特定实施方式的具体细节，但不应当将这些细节解释为对本发明范围的限制，而应当解释为可能的实施方式的示例。对于本发明的各个方面，在不脱离本发明精神的情况下，可在本发明的范围内进行许多改变和修改。
附图说明
附图中，
图1显示了根据本文提供的方法的示例性结果。
图2显示了根据本文提供的方法的示例性结果。
图3显示了根据本文提供的方法的示例性结果。
图4显示了根据本文提供的方法的示例性结果。
图5显示了根据本文提供的方法的示例性结果。
图6示出了可与本文提供的方法一起使用的示例性引物序列。
图7为本文提供的方法的一般示意图。
图8为可与本文提供的方法一起使用的示例性引物序列。
图9显示了来自本文提供的方法的结果。
图10显示了用于本文提供的方法的引物序列。
需要注意的是，附图和其中的元件不必要按形状或比例绘制。例如，为便于呈现或使呈现清楚，附图中元件的形状或比例可进行简化或修改。应进一步理解，附图和其中的元件仅用于示例性说明目的，不应理解为以任何方式进行限制。
具体实施方式
以下专利申请在此通过引用全文并入本申请以用于所有目的：于2014年9月17日提交的第62/051,912号美国临时专利申请；于2014年9月17日提交的第62/051,945号美国临时专利申请；于2014年10月24日提交的第62/068,603号美国临时专利申请；于2014年10月24日提交的第62/068,605号美国临时专利申请；于2015年4月22日提交的第62/151,358号美国临时专利申请；于2013年11月22日提交的第61/908,027号美国临时专利申请；于2014年5月20日提交的第62/001,050号美国临时专利申请；以及于2013年3月15日提交的第61/800,606号美国临时专利申请；于2014年3月15日提交的第14/214,850号美国非临时专利申请；于2014年3月15日提交的第pct/us14/30034号国际专利申请；于2014年9月17日提交的第pct/us14/56151号国际专利申请；以及于2015年9月17日提交的第pct/us15/50811号国际申请。
本文提供了用于核酸扩增的系统和方法。本文描述的各个特征可应用于下文阐述的任何特定实施方式，或者可应用于针对或涉及核酸扩增的其他任何类型的系统。本文描述的系统和方法可作为独立的系统或方法，或作为集成系统或方法的一部分而应用。应当理解，所公开的系统和方法的不同方面可以单独地、共同地或彼此组合地来理解。
在实施方式中，本文提供的方法可如下进行。可在第一扩增反应中扩增多核苷酸模板，其中该第一扩增反应为热循环核酸扩增反应(例如，聚合酶链反应(pcr))。在第一扩增反应中，可生成核酸扩增反应产物(例如，可生成pcr扩增反应产物)。通过第一扩增反应生成的扩增反应产物随后可在第二扩增反应中进行扩增，其中该第二扩增反应为非热循环核酸扩增反应(例如，等温核酸扩增反应)。
在实施方式中，本文提供的方法可如下进行。可在第一扩增反应中扩增多核苷酸模板，其中该第一扩增反应为聚合酶链反应(pcr)反应。在第一扩增反应中，可生成pcr扩增反应产物。该pcr扩增反应产物可为包含第一链和第二链的双链核酸分子，并且其中该pcr扩增反应产物的第一链为多核苷酸模板的拷贝。接下来，该pcr反应产物(其包含多核苷酸模板的拷贝)可用作如pct/us14/56151中提供的非热循环扩增反应的模板，以便生成如pct/us14/56151中所述的非热循环反应产物。此类非热循环反应产物可包括多联体。在涉及pcr扩增反应及随后的非热循环扩增反应的该方法的实施方式中，仅检测到非热循环反应产物(而非pcr反应产物)。在实施方式中，在非热循环反应产物形成时对其进行实时检测。在实施方式中，pct/us14/56151的方法可涉及第一引物和第二引物。在实施方式中，pct/us14/56151的方法的第一引物含有第一区和第二区，其中第一区包含引物的5’端，第二区包含引物的3’端，并且第二区与双链核酸模板(即，双链核酸分子，如pcr扩增反应产物)的第一链的至少一部分互补。在实施方式中，pct/us14/56151的方法的第二引物含有第一区和第二区，其中第一区包含引物的5’端并且与第一引物的第一区互补，第二区包含引物的3’端，并且其中第二区与双链核酸模板的第二链的至少一部分互补。在实施方式中，pct/us14/56151的方法的第一引物的第二区可以与此处方法中pcr扩增反应产物的第一链退火，其退火方式与本文提供的pcr扩增反应中第一pcr扩增反应引物与多核苷酸模板链退火的方式相同，并且pct/us14/56151的方法的第二引物的第二区可以与此处方法中提供的pcr扩增反应产物的第二链退火，其退火方式与本文提供的pcr扩增反应方法中第二pcr扩增反应引物与互补于多核苷酸模板的多核苷酸退火的方式相同。
在进一步的实施方式中，本文提供的方法可如下进行。可在第一扩增反应中扩增多核苷酸模板，其中该第一扩增反应为非热循环核酸扩增反应(例如，等温核酸扩增反应)。在第一扩增反应中，可生成核酸扩增反应产物。通过第一扩增反应生成的扩增反应产物随后可在第二扩增反应中扩增，其中该第二扩增反应为热循环核酸扩增反应(例如，pcr反应)。
定义
如本文所用的，“多核苷酸”是指含有两个或更多个核苷酸的聚合链。“多核苷酸”包括引物、寡核苷酸、核酸链等。多核苷酸可含有标准或非标准核苷酸。通常，多核苷酸在链的一个末端(“5’末端”)含有5’磷酸并在链的另一末端(“3’末端”)含有3’羟基基团。多核苷酸的最5’核苷酸在本文中可被称为多核苷酸的“5’末端核苷酸”。多核苷酸的最3’核苷酸在本文中可被称为多核苷酸的“3’末端核苷酸”。
在含有5’末端核苷酸和3’末端核苷酸的多核苷酸的语境中，如本文所用的术语“下游”是指比多核苷酸中的参考位置更接近3’末端核苷酸的该多核苷酸中的位置。例如，在具有序列5’ataagc3’的引物中，“g”在“t”和全部“a”的下游。
在含有5’末端核苷酸和3’末端核苷酸的多核苷酸的语境中，如本文所用的术语“上游”是指比多核苷酸中的参考位置更接近5’末端核苷酸的该多核苷酸中的位置。例如，在具有序列5’ataagc3’的引物中，“t”在“g”、“c”以及最接近“g”的两个“a”的上游。
如本文所用的，“核酸”包括dna和rna两者，包括含有非标准核苷酸的dna和rna。“核酸”含有至少一个多核苷酸(“核酸链”)。核酸可以是单链或双链的。
如本文所用的，“多联体”是指在其内含有特定核酸的两个或更多个拷贝的核酸分子，其中这些拷贝串联连接。在该多联体内，特定核酸的拷贝可彼此直接连接，或者它们可间接地连接(例如，在特定核酸的拷贝之间可具有核苷酸)。在一个实例中，该特定核酸可以是双链核酸模板的核酸，以使得多联体可含有该双链核酸模板的两个或更多个拷贝。在另一个实例中，该特定核酸可以是多核苷酸模板的核酸，以使得多联体可含有该多核苷酸模板的两个或更多个拷贝。
如本文所用的，“靶”核酸或分子是指感兴趣的核酸。靶核酸/分子可以是任何类型的，包括单链或双链dna或rna(例如，mrna)。
如本文所用的，“互补”序列是指这样的两个核苷酸序列，这两个核苷酸序列在彼此反平行对齐时，含有按照标准碱基配对原则(例如，a-t、g-c或a-u)可彼此配对的多个单独的核苷酸碱基，使得含有该序列的分子可彼此特异性地退火。对于被认为“互补的”序列，不必要两个序列中的每一个核苷酸碱基均能够彼此配对。例如，如果当两个序列为了互补而进行最佳对齐时，该两个序列中至少30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的核苷酸碱基可彼此配对，则这两个序列可被认为是互补的。此外，当两个序列的总长度彼此明显不同时，两个序列仍可被认为是“互补的”。例如，如果在15个核苷酸的引物与含有数百个核苷酸的更长的多核苷酸的特定区域反向平行对齐的情况下该引物的多个单独的核苷酸碱基可与更长的多核苷酸中的核苷酸碱基配对，则该15个核苷酸的引物可被认为与该含有数百个核苷酸的更长的多核苷酸是“互补的”。此外，“互补”序列可含有一种或多种核苷酸类似物或核碱基类似物。如本文所用的，“完美地互补”或“完美互补”等是指彼此100％互补的两个序列(即，当序列配对达到最高程度互补时，在序列的核苷酸之间不存在错配)。
如本文所用的，当应用于蛋白质、核酸或其他生物分子时，术语“分离的”是指已从其天然存在的环境的组分中纯化或分离的分子(例如，从其天然产生的细胞中纯化的蛋白质)。“分离的”分子可与其他分子相接触(例如，作为反应混合物的一部分)。如本文所用的，“分离的”分子还包括具有天然存在的氨基酸或核苷酸序列的重组产生的蛋白质或核酸。“分离的”核酸包括在细胞中包含的编码多肽的核酸分子，该细胞通常在例如该核酸分子在与天然细胞不同的染色体位置时表达该多肽。在一些实施方式中，“分离的”多肽被纯化为至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或100％的同质性，如通过多肽的sds-page以及随后的考马斯蓝、银或其他蛋白质染色方法所证实的。
除非上下文中另外明确指出，否则如本文所用的，被描述为含有模板或其他核酸的“序列”的核酸分子也可被认为含有该模板或其他核酸本身(例如，被描述为含有模板的序列的分子也可以被描述为含有该模板)。
如本文所用的，当第一多核苷酸被描述为与第二多核苷酸“退火”等时，第一多核苷酸的全部或其任何部分可与第二多核苷酸退火，反之亦然。
如本文所用的，提及在某一条件下或采用其他对象等“处理”给定对象是指直接或间接地将给定对象暴露于所提及的条件或其他对象。因此，尽管“处理”步骤可包括不同的相关操作(例如，将酶加入到容器中，振荡容器等)，但并非每一个“处理”步骤都需要不同的相关操作。例如，涉及一种或多种试剂的反应可设置在容器中，并且一旦反应已经开始，则多个事件或步骤可以在该容器中发生，而无需进一步人为或机械干预该容器中的内容物。在容器中进行的这些多个事件或步骤中的一个或多个可以被描述为“处理”该容器中的对象，即使在反应开始后不单独地干预该容器中的内容物。
在实施方式中，本文提供了用于靶核酸扩增的方法，其中该方法包括至少两个不同的核酸扩增过程。在实施方式中，可首先通过涉及热循环的第一核酸扩增法扩增靶核酸，然后可将该热循环反应中扩增的靶核酸的一些或全部用于第二核酸扩增反应，其中该第二核酸扩增反应为等温扩增反应。例如，可首先在聚合酶链反应(“pcr”)扩增反应(例如，在第4,683,202号美国专利中描述)中扩增靶核酸。pcr扩增法为热循环扩增法。
然后，在通过pcr方法扩增之后，可将来自该pcr反应的经扩增的靶核酸的一些或全部用于等温核酸扩增反应，例如，如于2014年3月15日提交的第pct/us14/30028号国际申请、于2014年3月15日提交的第pct/us14/30034号国际申请、于2014年9月17日提交的第pct/us14/56151号国际申请、于2014年3月15日提交的第pct/us14/30036号国际申请中所述，上述申请均通过引用而以其全文并入本文以用于所有目的。后文中为了简洁起见，将pct/us14/30028、pct/us14/30034、pct/us14/56151和pct/us14/30036中描述的等温核酸扩增法统称为“naa”方法。
本方法改善(即，降低)了核酸扩增测定的检测极限(lod)。也就是说，在对样品应用通过热循环方法的预扩增，然后应用等温核酸扩增法时，相比于在不进行这种预扩增的情况下对样品应用等温方法，可检测到样品中较少数目的靶核酸序列的存在。利用pcr，随后进行naa方法，已在样品中检测到低至每微升1个拷贝的靶核酸。
naa方法
应理解，本文中被称为“naa方法”的等温核酸扩增法的完整描述将在pct/us14/30028、pct/us14/30034、pct/us14/56151和pct/us14/30036中找到；但这些方法也在下面简要概述。
核酸扩增的naa方法可应用于双链dna。然而，靶核酸分子不必限于双链dna靶标；例如，用于本文所述naa方法的双链dna可通过逆转录酶从病毒rna或mrna或其他单链rna靶标来源制备。在进一步的实例中，用于本文所述naa方法的双链dna可通过dna聚合酶从单链dna靶标制备。在应用下文所讨论的naa方法之前，此类方法可作为初始步骤来应用。
例如，双链dna靶标的扩增从待扩增的一级双链dna(下文被称为“一级核酸”)开始。一级核酸含有被称为模板区的靶区；该模板区具有模板序列。这样的双链模板区含有第一dna链和互补的第二dna链，并且包括在一条链中的5’末端核苷酸和在另一条链中的3’末端核苷酸，二者彼此互补。
提供了各自具有模板结合区和尾区的第一引物和第二引物；该引物模板结合区与靶模板区互补。引物的尾区可含有三个组件：a)引物的5’末端核苷酸，b)最内侧核苷酸，其中该最内侧核苷酸在5’末端核苷酸的下游，以及c)在5’末端核苷酸与最内侧核苷酸之间的中间区段，其包含一个或多个核苷酸。此外，两个引物尾区的至少一部分在正确对齐时可以彼此互补。
应注意，虽然第二引物的尾区可含有与第一引物的尾区的核苷酸序列互补的核苷酸序列，但通常由第一引物与第二引物退火而形成的产物对于本文提供的方法或组合物而言不是期望的或有用的。因此，在一些实施方式中，可以采取步骤来将第一引物-第二引物退火产物的形成降至最低。此类步骤可包括，例如，在开始本文提供的方法之前不在引物可退火持续延长的一段时间的条件下对第一引物和第二引物进行预温育。
可在使得第一引物的第一拷贝的模板结合区与核酸模板的第一链退火的条件下，用聚合酶和第一引物的第一拷贝来处理一级核酸。在这些条件下，形成了第一引物的第一拷贝的延伸产物。可具有链置换活性的聚合酶可催化第一引物的第一拷贝的延伸产物的形成。第一引物的第一拷贝可与合成的延伸产物共价连接，使得第一引物的第一拷贝(其与核酸模板的第一链互补)成为在本文中被描述为“第一引物的第一拷贝的延伸产物”的分子的一部分。第一引物的第一拷贝的模板结合区而非尾区与核酸模板的第一链退火。适用于基于聚合酶的核酸合成的条件的实例是本领域已知的，并且在例如molecularcloning:alaboratorymanual,m.r.green和j.sambrook,coldspringharborlaboratorypress(2012)中提供，其通过引用以其全文并入本文。
可在使得第二引物的模板结合区与第一引物的第一拷贝的延伸产物退火的条件下，用聚合酶(其可具有链置换活性)和第二引物处理第一引物的第一拷贝的延伸产物。按这种方式，可形成第二引物的延伸产物。在第二引物的延伸产物的合成期间，聚合酶可从第一引物的第一拷贝的延伸产物上置换核酸模板的第一链。第二引物可与合成的延伸产物共价连接，使得第二引物成为在本文中被描述为“第二引物的延伸产物”的分子的一部分。第二引物的延伸产物与第一引物的第一拷贝的延伸产物互补。在第二引物与第一引物的第一拷贝的延伸产物退火时，第二引物的模板结合区而非尾区可与第一引物的第一拷贝的延伸产物退火。
可用聚合酶(其可具有链置换活性)和第一引物的第二拷贝处理第二引物的延伸产物，以便形成第一引物的第二拷贝的延伸产物。在生成第一引物的第二拷贝的延伸产物期间，第一引物的第二拷贝可与合成的延伸产物共价连接，使得第一引物的第二拷贝成为在本文中被描述为“第一引物的第二拷贝的延伸产物”的分子的一部分。第一引物的第二拷贝的延伸产物与第二引物的延伸产物互补。
第一引物的第二拷贝的延伸产物的生成可导致生成包含第一引物的第二拷贝的延伸产物和第二引物的延伸产物的分子，该分子可被称为“二级核酸”。二级核酸可包含第二引物(及其互补序列)的延伸产物的3’末端区，并且可包含第一引物(及其互补序列)的第二拷贝的延伸产物的3’末端区。二级核酸分子包含与尾序列相邻的模板区的序列。在实施方式中，产生双链核酸，其中互补模板和尾区序列排列(lineup)。在实践中，通过凭之可以生成具有二级核酸的一般结构的核酸的任何过程，包括通过实施本文所讨论的naa方法，来产生多个拷贝(例如，两个或更多个)的二级核酸。
因此，可提供成对的二级核酸拷贝。例如，随后可通过重复前述步骤和方法来生成更多拷贝数。例如，上述从一级核酸生成二级核酸的完整过程可重复两次，以便生成两对二级核酸拷贝；可进行进一步的重复以进一步扩增拷贝数，例如，以指数方式扩增拷贝数(例如，以二的幂)。
此外，由于二级核酸分子包含与尾序列相邻的模板区的序列，因此可以产生其中尾区序列杂交并排列的部分双链的核酸。由于这些尾区序列附接至单链模板区，因此产生了具有由杂交的尾区序列保持在一起的两条核酸链的交叉结构。这些交叉结构可通过聚合酶延伸，以形成两条组成链的延伸产物。这些延伸产物可被称为“多联体链”。两条多联体链可以退火在一起，并可被统称为多联体；此类多联体可含有两个或更多个拷贝的核酸模板。
在一些实施方式中，可形成甚至更长的多联体。例如，多联体可以退火在一起；或者两个多联体分子可形成与如上所讨论的被称为多联体链的较短分子形成的那些相似的交叉结构，之后是含有四个拷贝的核酸模板的较大多联体分子。在另一个实例中，二级核酸和多联体可形成交叉结构，之后是含有三个拷贝的核酸模板的较大多联体分子。在一些实施方式中，可同时生成具有多个不同长度的多种不同的多联体。
因此，根据这类方法生成的多联体可具有任何长度的核苷酸。在一些实施方式中，此处生成的多联体分子可为至少30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、15,000、20,000或25,000个核苷酸长。根据这类方法生成的多联体可含有任意拷贝数的核酸模板。在一些实施方式中，此处生成的多联体分子可含有至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100个拷贝的核酸模板。提供了进一步的实例，并且这些及其他实例的更多细节在2013年3月15日提交的第61/800,606号美国专利申请中提供。
反应的检测
本文提供的方法的进程可以采用多种不同的方式进行监测。在一个实施方式中，可测定反应的核酸扩增产物(例如，产物的水平或其生成速率)。在另一个实施方式中，可测定反应的聚合酶沿核酸模板的活性(例如，聚合酶沿模板链的移动)。因此，在一些实施方式中，由于由方法产生的产物的积累(可能在该方法的步骤期间或完成后)或由于在方法的步骤期间发生的可检测事件，使得可观察到本文提供的方法的事件。
可测定扩增的核酸的存在，例如，通过检测反应产物(扩增的核酸或反应副产物)或通过检测与反应进程相关的探针。
在一些实施方式中，可通过用染料将产物染色来鉴定反应产物。在一些实施方式中，染料在与核酸结合时比未与核酸结合时可具有更大的荧光。在一些实施方式中，染料可嵌入双链核酸或者它可与核酸的外部区域结合。可与本文提供的方法和组合物一起使用的核酸染料包括，例如，花青染料、
本文公开了检测是否存在靶标志物(例如，病毒如流感病毒，细菌如金黄色葡萄球菌细菌，或样品中可检测到的其他生物靶标)的方法，其中在较短的时间段内从单个样品检测是否存在多种可能的靶标。在实施方式中，多种可能的靶标包括至少5种可能的靶标，或至少10种可能的靶标，或至少15种可能的靶标，或至少20种可能的靶标，或至少25种可能的靶标，或至少30种可能的靶标，或至少35种可能的靶标，或至少40种可能的靶标，或至少45种可能的靶标，或至少50种可能的靶标，或至少55种可能的靶标，或至少60种可能的靶标，或至少64种可能的靶标，或至少65种可能的靶标，或更多。在实施方式中，较短的时间段为五小时或更短，或四小时或更短，或三小时或更短，或两小时或更短，或一小时或更短，或50分钟或更短，或40分钟或更短，或30分钟或更短，或20分钟或更短，或10分钟或更短，或5分钟或更短的时间段。
在一些实施方式中，可通过分析扩增反应的浊度来鉴定反应产物，例如，在浊度增加与反应产物和反应副产物(例如，与镁复合的焦磷酸)的形成相关的情况下。
在一些实施方式中，可通过用凝胶电泳分离根据本文方法进行的反应并随后用核酸染料将凝胶染色来鉴定反应产物。该染料可以是本文公开的或本领域以其他方式已知的任何核酸染料。
在一些实施方式中，本领域已知用于检测核酸的任何方法或组合物或与核酸生成相关的过程可与本文提供的方法和组合物一起使用。
在一些实施方式中，含有与核酸模板链(或具有相似或相同序列的链)的一部分互补的核苷酸序列和含有荧光报道分子(荧光团)和猝灭剂中的一种或两种的核酸探针包含在本文提供的反应中。
在实例中，核酸探针可含有在其5’或3’末端的荧光报道分子，以及在另一末端的猝灭剂。
在另一实例中，核酸探针可在其5’或3’末端含有荧光报道分子，并且它可与含有猝灭剂的核酸引物退火。含有猝灭剂的核酸引物可在引物的位置上含有猝灭剂，使得当核酸探针与引物退火时，荧光报道分子被猝灭。
在含有荧光报道分子和猝灭剂对的探针中，可选择荧光报道分子和猝灭剂，以使得猝灭剂可有效地猝灭报道分子。在一些实施方式中，荧光报道分子与猝灭剂配对，其中荧光报道分子的发射最大值类似于猝灭剂的吸收最大值。可用作荧光报道分子的荧光团包括，例如，calfluorgold、calfluororange、quasar570、calfluorred590、calfluorred610、calfluorred610、calfluorred635、quasar670(biosearchtechnologies)、vic、ned(lifetechnologies)、cy3、cy5、cy5.5(gehealthcarelifesciences)、oyster556、oyster645(integrateddnatechnologies)、lcred610、lcred610、lcred640、lcred670、lcred705(rocheappliesscience)、德克萨斯红(texasred)、fam、tet、hex、joe、tmr和rox。可使用的猝灭剂包括，例如，ddq-i、ddq-ii(eurogentec)、eclipse(epochbiosciences)、iowablackfq、iowablackrq(integrateddnatechnologies)、bhq-1、bhq-2、bhq-3(biosearchtechnologies)、qsy-7、qsy-21(molecularprobes)和dabcyl。
在一些实施方式中，可在含有光源和光学传感器的装置中监测本文提供的方法。在一些情况下，可将反应定位于来自光源的光路上，并且可测量由样品吸收(例如，在混浊反应的情况下)、由样品散射(例如，在混浊反应的情况下)或由样品发射(例如，在含有荧光分子的反应的情况下)的光。
在实施方式中，可在检测是否存在多种致病剂之前将样品稀释。在实施方式中，对于具有指示其可能具有更高水平致病剂的状况的受试者，相比于没有这种状况的受试者或具有不同状况的受试者，样品的这种稀释更大。
用于检测样品中的靶标的系统和装置
本文公开的测定和方法可在用于处理样品的装置或系统上进行。在实施方式中，申请人在此公开了适用于进行本文公开的方法的系统和装置。本文公开的测定和方法可容易地并入用于处理样品的装置或用于处理样品的系统中并在其中使用，该装置或系统可以是自动化的测定装置，或者可以是自动化的测定系统。此类装置以及此类系统可用于实施本文公开的方法。例如，装置可用于接收样品。装置可用于制备或用于处理样品。装置可用于对样品进行测定。装置可用于从样品获得数据。装置可用于传送从样品中获得的数据。装置可用于在处理或测定样品之后处置样品。
装置可以是系统的一部分，该系统的组件可以是自动化测定装置。装置可以是自动化测定装置。如本文所公开的，自动化测定装置可配置为促进样品的采集、制备用于临床检验的样品或实现与一种或多种试剂的化学反应或其他化学或物理处理。自动化测定装置可配置为从样品获得数据。自动化测定装置可配置为传送从样品中获得的数据。自动化测定装置可配置为分析来自样品的数据。自动化测定装置可配置为与另一装置或实验室或隶属于实验室的个体通信，以分析从样品中获得的数据。
自动化测定装置可配置为放置在受试者体内或受试者上。自动化测定装置可配置为直接或间接地接纳来自受试者的样品。样品可以是，例如，血液样品(例如，由手指针刺或由静脉穿刺获得的样品，或动脉血样品)、尿液样品、活检样品、组织切片、粪便样品或其他生物样品；水样品、土壤样品、食物样品、空气样品；或其他样品。血液样品可以包括，例如，全血、血浆或血清。自动化测定装置可通过该装置的外壳接收来自受试者的样品。样品采集可发生在样品采集地点或其他地方。可在样品采集地点向该装置提供样品。
在一些实施方式中，自动化测定装置可配置为接收或容纳筒匣。在一些实施方式中，自动化测定装置可包含筒匣。该筒匣可从自动化测定装置中移除。在一些实施方式中，可向自动化测定装置的筒匣提供样品。或者，可向自动化测定装置的另一部分提供样品。该筒匣和/或装置可包含可配置为容纳样品的样品采集单元。
筒匣可包含样品，并可包含用于在处理或测试样品中使用的试剂、用于在处理或测试样品中使用的一次性用品或其他材料。将筒匣放置在自动化测定装置上或将筒匣插入自动化测定装置之后，筒匣的一个或多个组件可与自动化测定装置的其他组件流体连通。例如，如果在筒匣处收集样品，则样品可转移至自动化测定装置的其他部分。类似地，如果在筒匣上提供了一种或多种试剂，则该试剂可转移至自动化测定装置的其他部分，或者自动化测定装置的其他组件可得到该试剂。在一些实施方式中，筒匣的试剂或组件可保持在筒匣上。在一些实施方式中，不包括需要装管或需要维护(例如，人工或自动维护)的流体元件。
样品或试剂可转移至装置，诸如自动化测定装置。样品或试剂可在装置内转移。样品或试剂的这种转移可在不提供从筒匣到装置的连续流体路径的情况下完成。样品或试剂的这种转移可在不提供装置内的连续流体路径的情况下完成。在实施方式中，样品或试剂的这种转移可以通过样品处理系统(例如移液器)来完成；例如，样品、试剂或其等分试样可被吸入顶端开放的转移组件如移液器端头中，该转移组件可以可操作地连接到样品处理系统，该样品处理系统将该端头以及包含在该端头内的样品、试剂或其等分试样一起转移至自动化测定装置之上或之内的位置。该样品、试剂或其等分试样可存放在自动化测定装置之上或之内的位置。样品和试剂或多种试剂可利用样品处理系统以相似的方式进行混合。筒匣的一个或多个组件可以以自动化方式转移至自动化测定装置的其他部分，反之亦然。
装置，诸如自动化测定装置，可具有流体处理系统。流体处理系统可进行或可帮助进行运输、稀释、提取、等分、混合以及对于流体如样品的其他操作。在一些实施方式中，流体处理系统可包含在装置外壳内。流体处理系统可允许流体的采集、递送、处理和/或运输，干燥试剂的溶解，液体和/或干燥试剂与液体的混合，以及非流体组分、样品或材料的采集、递送、处理和/或运输。该流体可以是样品、试剂、稀释液、洗液、染料或可被该装置使用的其他任何流体，并且可以包括但不限于均质流体、不同的液体、乳液、悬浮液和其他流体。流体处理系统(包括但不限于移液器)还可用于在该装置周围运输容器(其中含有或不含有流体)。流体处理系统可分配或抽吸流体。样品可包含漂浮在流体内的一个或多个微粒或固体物质。
在实施方式中，流体处理系统可包含移液器、移液器端头、注射器、毛细管或其他组件。流体处理系统可具有含内表面和外表面以及开放端的部分。流体处理系统可包含移液器(其可包括移液器主体和移液器的管嘴)并且可包含移液器端头。移液器端头可以是或可以不是能从移液器管嘴上移除的。在实施方式中，流体处理系统可使用与移液器端头配对的移液器；移液器端头可以是一次性的。端头在与移液器配对时，可形成流体密封。移液器端头可使用一次、两次或更多次。在实施方式中，流体处理系统可采用具有或不具有移液器端头的移液器或相似装置来抽吸、分配、混合、运输或以其他方式处理流体。需要时，可从流体处理系统中分配流体。在从例如移液器端头的孔口中分配之前流体可包含在移液器端头内。在实施方式，或在使用的情况下，可分配全部流体；在其他实施方式，或在使用的情况下，可分配端头内流体的一部分。移液器可选择性地抽吸流体。移液器可抽吸所选量的流体。移液器可以能够驱动搅拌机构以混合端头或容器内的流体。移液器可合并端头或容器，从而产生连续的流动回路以用于包括非液体形式的材料或试剂的混合。移液器端头还可通过多个流体的同时或按顺序(如在两段式底物反应中)计量递送来促进混合。
流体处理系统可包括一个或多个流体隔离的或液压独立的单元。例如，流体处理系统可包含一个、两个或更多个移液器端头。移液器端头可被配置为接纳并限制流体。端头可以是彼此流体隔离的或彼此液压独立的。包含在每个端头内的流体可以与其他端头内的一种流体以及与装置内的其他流体为流体隔离或液压独立的。流体隔离或液压独立的单元可以是相对于装置的其他部分和/或彼此可移动的。流体隔离或液压独立的单元可以是单独可移动的。流体处理系统可以包含一个或多个基部或支持体。基部或支持体可支持一个或多个移液器或移液器单元。基部或支持体可将流体处理系统的一个或多个移液器彼此连接。
自动化测定装置可配置为对从受试者获得的样品进行处理步骤或操作。样品处理可包括样品制备，包括，例如，样品稀释、将样品分为等分试样、提取、与试剂接触、过滤、分离、离心或其他的预备或处理操作或步骤。自动化测定装置可配置为对样品进行一个或多个样品制备操作或步骤。任选地，可制备样品以用于化学反应和/或物理处理步骤。样品制备操作或步骤可包括以下的一个或多个：离心、分离、过滤、稀释、富集、纯化、沉淀、温育、移液、运输、色谱分析、细胞裂解、细胞计数、粉碎、研磨、活化、超声处理、微柱处理、用磁珠处理、用纳米颗粒处理或其他样品制备操作或步骤。例如，样品制备可包括将血液分离为血清和/或微粒部分或者将任何其他样品分离为各个组分的一个或多个步骤。样品制备可包括稀释和/或浓缩样品如血液样品或其他生物样品的一个或多个步骤。样品制备可包括向样品中加入抗凝剂或其他成分。样品制备还可包括样品的纯化。在实施方式中，所有的样品处理、制备或测定操作或步骤均由单一装置执行。在实施方式中，所有的样品处理、制备或测定操作或步骤均在单一装置的外壳内执行。在实施方式中，大多数的样品处理、制备或测定操作或步骤由单一装置执行，并且可在单一装置的外壳内执行。在实施方式中，许多的样品处理、制备或测定操作或步骤由单一装置执行，并且可在单一装置的外壳内执行。在实施方式中，样品处理、制备或测定操作或步骤可由多于一个装置执行。
自动化测定装置可配置为对样品运行一个或多个测定，并从该样品获得数据。测定可包括一种或多种物理或化学处理，并可包括运行一个或多个化学或物理反应。自动化测定装置可配置为对体液的小样品进行一个、两个或更多个测定。可在具有一定体积的样品上进行一个或多个化学反应，如本文其他地方所述。例如，可在具有小于飞升(femtoliter)体积的丸剂中进行一个或多个化学反应。在实例中，样品采集单元被配置为接收相当于单滴或更少的血液或间质液体积的体液样品。在实施方式中，样品的体积可以是小体积，其中小体积可以是小于约1000μl，或小于约500μl，或小于约250μl，或小于约150μl，或小于约100μl，或小于约75μl，或小于约50μl，或小于约40μl，或小于约20μl，或小于约10μl的体积，或其他的小体积。在实施方式中，对单一样品进行所有的样品测定操作或步骤。在实施方式中，所有的样品测定操作或步骤均由单一装置执行。在实施方式中，所有的样品测定操作或步骤均在单一装置的外壳内执行。在实施方式中，大多数的样品测定操作或步骤由单一装置执行，并且可在单一装置的外壳内执行。在实施方式中，许多的样品测定操作或步骤由单一装置执行，并且可在单一装置的外壳内执行。在实施方式中，样品处理、制备或测定操作或步骤可由多于一个装置执行。
自动化测定装置可配置为对样品进行多个测定。在实施方式中，自动化测定装置可配置为对单一样品进行多个测定。在实施方式中，自动化测定装置可配置为对单一样品进行多个测定，其中该样品是小样品。例如，小样品可以具有为小于约1000μl，或小于约500μl，或小于约250μl，或小于约150μl，或小于约100μl，或小于约75μl，或小于约50μl，或小于约40μl，或小于约20μl，或小于约10μl的小体积或其他小体积的样品体积。自动化测定装置可以能够对单一样品进行多重测定。多个测定可同时运行；可按顺序运行；或者一些测定可同时运行而其他测定按顺序运行。一个或多个对照测定和/或校准物(例如，包括具有用于测定/测试的校准物的对照的配置)也可并入该装置中；对照测定和对校准物的测定可与对样品进行的测定同时进行，或可在对样品进行的测定之前或之后进行，或以其任何组合方式进行。在实施方式中，所有的样品测定操作或步骤均由单一装置执行。在实施方式中，全部多个样品测定操作或步骤均在单一装置的外壳内执行。在实施方式中，多个测定中的大多数的样品测定操作或步骤由单一装置执行，并且可在单一装置的外壳内执行。在实施方式中，多个测定中的许多样品测定操作或步骤由单一装置执行，并且可在单一装置的外壳内执行。在实施方式中，样品处理、制备或测定操作或步骤可由多于一个装置来执行。
在实施方式中，全部多个测定可在短时间段内进行。在实施方式中，这样的短时间段包括少于约三小时，或少于约两小时，或少于约一小时，或少于约40分钟，或少于约30分钟，或少于约25分钟，或少于约20分钟，或少于约15分钟，或少于约10分钟，或少于约5分钟，或少于约4分钟，或少于约3分钟，或少于约2分钟，或少于约1分钟，或其他短时间段。
自动化测定装置可进行核酸测定，包括等温核酸测定(例如，用于检测和测量样品中包括dna和rna靶标在内的核酸靶标的测定)。在实施方式中，自动化测定装置可进行如于2014年2月18日提交的序列号为14/183,503的美国专利申请、于2014年3月15日提交的第14/214,850号美国专利申请、于2014年3月15日提交的国际专利申请pct/us2014/030034以及于2014年9月17日提交的国际专利申请pct/us2014/056151中公开的核酸测定。自动化测定装置可进行抗体测定，包括酶联免疫吸附测定(elisa)，以及用于检测和测量样品中的蛋白质(包括抗体)、肽和小分子的量的其他测定。自动化测定装置可进行一般的化学测定，包括电解质测定(例如，用于检测和测量样品中电解质如钠和钾的量的测定)。
自动化测定装置可配置为检测与样品相关的一种或多种信号。自动化测定装置可配置为鉴定样品的一种或多种特性。例如，自动化测定装置可配置为检测样品中一种分析物或多种分析物或疾病状况的存在或浓度(例如，在体液、分泌物、组织或其他样品中或通过体液、分泌物、组织或其他样品)。或者，自动化测定装置可配置为检测一种或多种可被分析以检测样品中一种或多种分析物(其可以指示疾病状况)或疾病状况的存在或浓度的信号。该信号可在该装置上或另一位置进行分析。运行临床检验可以包括或可以不包括对所收集的数据的任何分析或比较。
可在有或没有样品的情况下进行化学反应或其他处理步骤。可由装置准备或运行的步骤、测试或测定的实例可包括但不限于免疫测定、核酸测定、基于受体的测定、细胞计数测定、比色测定、酶测定、电泳测定、电化学测定、光谱测定、色谱测定、显微测定、地形测定(topographicassay)、量热测定、浊度测定、凝集测定、放射性同位素测定、粘度测定、凝聚测定、凝固时间测定、蛋白质合成测定、组织学测定、培养测定、摩尔渗透压浓度测定和/或其他类型的测定，离心、分离、过滤、稀释、富集、纯化、沉淀、粉碎、温育、移液、运输、细胞裂解或其他样品制备操作或步骤，或其组合。可由装置准备或运行的步骤、测试或测定可包括成像，包括显微镜检查、细胞计数以及制备或使用图像的其他技术。可由装置准备或运行的步骤、测试或测定可进一步包括对样品的组织学、形态学、运动学、动力学和/或状态的评估，该评估可包括对细胞的此类评估。
装置可以能够在短时间长度内进行所有的机载步骤(例如，由单一装置执行的步骤或操作)。装置可以能够在短时间长度内对单一样品进行所有的机载步骤。例如，从受试者样品采集到传输数据和/或分析可能花费约3小时或更少、2小时或更少、1小时或更少、50分钟或更少、45分钟或更少、40分钟或更少、30分钟或更少、20分钟或更少、15分钟或更少、10分钟或更少、5分钟或更少、4分钟或更少、3分钟或更少、2分钟或更少或1分钟或更少的时间。从将样品接纳在装置内到传输数据和/或针对此样品的装置分析的时间长度可能依赖于对样品进行的步骤、测试或测定的类型或数目。从将样品接纳在装置内到传输数据和/或针对此样品的装置分析的时间长度可能花费约3小时或更少、2小时或更少、1小时或更少、50分钟或更少、45分钟或更少、40分钟或更少、30分钟或更少、20分钟或更少、15分钟或更少、10分钟或更少、5分钟或更少、4分钟或更少、3分钟或更少、2分钟或更少或1分钟或更少的时间。
装置可配置为准备样品以供处置或配置为在样品的处理或测定后处置样品，诸如生物样品。
在实施方式中，自动化测定装置可配置为传送从样品获得的数据。在实施方式中，自动化测定装置可配置为通过网络进行通信。自动化测定装置可包括可与网络接合的通信模块。自动化测定装置可经由有线连接或无线地连接至网络。该网络可以是局域网(lan)或广域网(wan)如因特网。在一些实施方式中，该网络可以是个人局域网。该网络可包括云。自动化测定装置可连接至网络而无需中间装置，或者可能需要中间装置将自动化测定装置连接至网络。自动化测定装置可以通过网络与另一装置通信，该另一装置可以是任何类型的联网装置，包括但不限于个人计算机、服务器计算机或膝上型计算机；个人数字助理(pda)，诸如windowsce装置；电话，诸如蜂窝电话、智能电话(例如，iphone、android、blackberry等)或位置感知的便携式电话(例如gps)；漫游装置，诸如联网的漫游装置；无线装置，诸如无线电子邮件装置或能够与计算机网络无线通信的其他装置；或可以通过网络而可能通信并处理电子交易的其他任何类型的网络装置。这样的通信可包括向云计算基础设施或可被其他装置访问的其他任何类型的数据存储基础设施提供数据。
自动化测定装置可以向例如卫生保健专业人员、卫生保健专业场所如实验室或其附属机构提供关于样品的数据。实验室、卫生保健专业人员或受试者中的一个或多个可具有能够接收或访问由该自动化测定装置提供的数据的网络装置。自动化测定装置可配置为向数据库提供关于样品的数据。自动化测定装置可配置为向电子病历系统、向实验室信息系统、向实验室自动化系统或其他系统或软件提供关于样品的数据。自动化测定装置可以以报告的形式提供数据。
实验室、装置或其他实体或软件可对关于样品的数据进行实时分析。软件系统可进行化学分析和/或病理分析，或者这些可分布在实验室、临床以及专业或专家人员的组合中。分析可包括样品的定性和/或定量评估。数据分析可包括随后对样品的定性和/或定量评估。任选地，报告可基于原始数据、预处理的数据或经分析的数据而生成。可制作这样的报告以便维持从样品获得的数据的机密性、关于从中获得样品的受试者的身份和其他信息、数据的分析以及其他机密信息。该报告和/或数据可传输至卫生保健专业人员。可向数据库、电子病历系统、向实验室信息系统(lis)、向实验室自动化系统(las)或其他系统或软件提供由自动化测定装置获得的数据或关于此类数据的分析或报告。
本文公开的集成系统的实例包括用于对疑似罹患疾病的受试者提供测试和诊断的集成系统，所述系统包括用于获得样品的工具(其可包括，例如，包含刺血针、注射器、针和管或其他血液收集装置的样品收集装置；或鼻拭子、口拭子(例如，颊拭子)、咽拭子、阴道拭子或其他拭子，以及在拭子与受试者接触之后浸泡该拭子的流体)；包含用于测定该疾病的试剂的筒匣；用于运行多种检测多种疾病的测定的装置；用于对一种或多种所述疾病的检测进行显示/通信的装置/工具。此类集成系统可被配置用于其中样品为小体积样品的用途；用于其中在短时间段内进行检测的用途；或用于其中样品为小体积样品且其中在短时间段内进行检测的用途。
本文公开的集成系统的另一个实例包括用于对疑似罹患呼吸系统病症的受试者提供测试和诊断的集成系统，所述系统包括用于获得样品的工具(其可包括，例如，鼻拭子、咽拭子、口拭子(例如，颊拭子)、阴道拭子或其他拭子，以及在拭子与受试者接触之后浸泡该拭子的流体)；包含用于测定呼吸系统病症的试剂的筒匣；用于运行多种检测多种呼吸系统病症的测定的装置；用于对一种或多种所述呼吸系统病症的检测进行显示/通信的装置/工具。此类集成系统可被配置用于其中样品为小体积样品的用途；用于其中在短时间段内进行检测的用途；或用于其中样品为小体积样品且其中在短时间段内进行检测的用途。
本文公开的集成系统的另一个实例包括用于对疑似罹患呼吸系统病症的受试者提供测试、诊断和处方的集成系统，所述系统包括用于获得样品的工具(其可包括，例如，鼻拭子、咽拭子、口拭子(例如，颊拭子)、阴道拭子或其他拭子，以及在拭子与受试者接触之后浸泡该拭子的流体)；包含用于测定呼吸系统病症的试剂的筒匣；用于运行多种检测多种呼吸系统病症的测定的装置；用于对一种或多种所述呼吸系统病症的检测进行显示/通信的装置/工具；以及用于针对在所述样品中检测到的呼吸系统病症的治疗提供处方的工具。此类集成系统可被配置用于其中样品为小体积样品的用途；用于其中在短时间段内进行检测的用途；或用于其中样品为小体积样品且其中在短时间段内进行检测的用途。
如本文公开的集成系统的又一实例包括用于对疑似罹患呼吸系统病症的受试者提供测试、诊断、处方和治疗的集成系统，所述系统包括用于获得样品的工具(其可包括，例如，鼻拭子、咽拭子、口拭子(例如，颊拭子)、阴道拭子或其他拭子，以及在拭子与受试者接触之后浸泡该拭子的流体)；包含用于测定呼吸系统病症的试剂的筒匣；用于运行多种检测多种呼吸系统病症的测定的装置；用于对一种或多种所述呼吸系统病症的检测进行显示/通信的装置/工具；用于针对在所述样品中检测到的呼吸系统病症的治疗提供处方的工具；以及用于根据所述处方向所述受试者提供/售卖/递送治疗(药物/丸剂/注射(shot))的工具。此类集成系统可被配置用于其中样品为小体积样品的用途；用于其中在短时间段内进行检测的用途；或用于其中样品为小体积样品且其中在短时间段内进行检测的用途。
可使用本文公开的方法、装置和系统或与本文公开的方法、装置和系统一起使用的试剂、测定、方法、试剂盒、装置和系统实例的描述和公开内容可见于，例如，美国专利8,088,593；美国专利8,380,541；美国专利8,435,738；美国专利8,475,739；美国专利8,840,838；于2014年2月18日提交的序列号为14/183,503的美国专利申请；于2013年7月1日提交的序列号为13/933,035的美国专利申请；于2013年2月18日提交的序列号为13/769,820的美国专利申请；于2014年2月18日提交的序列号为14/183,503的美国专利申请；于2014年3月15日提交的专利申请14/214,850；于2014年3月15日提交的国际专利申请pct/us2014/030034；于2014年9月17日提交的国际专利申请pct/us2014/056151；于2013年2月18日提交的序列号为13/769,798的美国专利申请；于2013年2月18日提交的序列号为13/769,779的美国专利申请；于2011年9月26日提交的序列号为13/244,947的美国专利申请；于2012年9月25日提交的pct/us2012/57155；于2011年9月26日提交的序列号为13/244,946的美国申请；于2011年9月26日提交的美国专利申请13/244,949；以及于2013年7月18日提交的序列号为13/945,202的美国申请，所述专利和专利申请的公开内容全部在此通过引用全文并入本文。
实施例
以下实施例仅为了说明目的而提供，而非意在以任何方式限制本公开内容。
实施例1
热循环预扩增法包括任何适宜的热循环方法，包括pcr、逆转录酶pcr(rtpcr)及其他pcr法。两步pcr法包括具有以下步骤的方法：在第一温度(例如，约38–45℃之间，或约42℃)下温育；在升高的第二温度(例如，约90–105℃之间，或约98℃)下温育；在两个温度之间进行热循环，其中所述两个温度为a)升高的第二温度(例如，约90–105℃之间，或约98℃)和b)较低的退火温度(tm，例如，约50℃至约80℃之间)；随后在较低的第三温度(例如，约65℃至约75℃之间的温度)下温育。三步pcr法包括具有以下步骤的方法：在第一温度(例如，约38–45℃之间，或约42℃)下温育；在升高的第二温度(例如，约90–105℃之间，或约98℃)下温育；在三个温度之间进行热循环，其中所述三个温度为a)升高的第二温度(例如，约90–105℃之间，或约98℃)和b)较低的退火温度(tm，例如，约50℃至约80℃之间)；以及c)较低的第三温度(例如，约65℃至约75℃之间的温度)；随后在较低的第三温度(例如，约65℃至约75℃之间的温度)下温育。在较低的第三温度下最后温育后，经扩增的样品可立即使用，或可储存(例如，在4℃下)备用。
如本文提供的方法如下进行：
对样品进行pcr热循环，其中使该样品经历如下的热循环：
1)在42℃下温育30分钟，然后
2)在98℃下温育2分钟，随后
3)35个如下的重复热循环：
i)98℃下10秒，随后
ii)tm℃下15秒，随后
iii)72℃下15秒；然后，在35个循环后，
4)在72℃下温育2分钟。
在备选实施方式中，可以改变上述步骤3)中重复循环的数目；例如，可将重复循环的数目减少至例如30，或25，或20，或更少的循环。在其他备选实施方式中，可将上述步骤3)中重复循环的数目增加至例如40，或45，或50，或更多个循环。在备选实施方式中，可将上述步骤iii)缩短至少于15秒，或可以完全除去。当去掉步骤iii)时，该pcr法变成了“两步”pcr法。
在上述步骤1至4后，经扩增的样品可立即用于等温扩增(例如，通过naa方法)，或可储存在4℃下备用。步骤1)至4)耗费大概一小时来完成。“tm”表示针对特定引物组的退火温度；引物组可具有与其他引物组不同的tm，或可具有与另一个引物组相同的tm。在许多情况下，tm通常在约50℃至约75℃之间。例如，在附图中示出的实验中，针对rlx3539/40引物的tm为62℃，而针对rlx3547/48引物的tm为72℃。
开发并合成了针对埃博拉病毒中存在的核酸序列的引物。将两个引物组用于本文公开的实验中。进行了实验，以便确定对靶标埃博拉病毒核酸靶序列的检测极限(lod)。利用预扩增引物组rlx3539/40和rlx3547/48进行这些实验。对于引物组rlx3539/40，采用61℃的退火温度。62℃的退火温度也可用于该引物组。71℃的退火温度用于引物组rlx3547/48。
在实施方式中，用于pcr和naa方法的引物可为嵌套引物，其中一组引物的核酸靶标在(被包含在)通过另一组引物扩增的核酸序列的内部。例如，用于naa扩增的引物可靶向在pcr扩增期间被扩增的核酸序列，即，naa靶核酸在与pcr引物杂交的靶核酸的内部。
引物组rlx3539/40具有以下核酸序列：
rlx3539tgccaacttatcatacaggc
rlx3540gactgcgccactttcc
引物组rlx3547/48具有以下核酸序列：
rlx3547tgccaacttatcatacaggcctt
tgcccttccaaatacttgactgcgc
rlx3548ca
在附图中示出的“预扩增”实验中，采用rtpcr来扩增样品中的rna靶核酸；靶核酸以每微升(μl)103、102、10、5和1个拷贝的终浓度包含在pcr试剂中，并且进行pcr扩增；在该扩增后，将2.5μl所得试剂与naa试剂混合，并进行等温naa扩增。在“对照-无预扩增”实验中，靶核酸以每微升(μl)103、102、10、5和1个拷贝的终浓度包含在naa试剂中，并进行等温naa扩增。如附图所示，将pcr预扩增与naa等温扩增结合的这些方法能够达到1个拷贝/μl的lod(附图中以“1c/ul”示出)；这种lod意味着存在5个拷贝/rtpcr反应。参见如下针对两种引物组的结果。
靶标的检测通过naa测定中测量的拐点时间(inflectiontime)指示(请注意，“ntc”(无模板对照)显示出拐点，但比针对靶序列检测到的特定信号晚得多)。将引物组rlx3539/40用于图1和图2所示实验中的rt-pcr预扩增。如图1所示，在rt-pct预扩增的情况下，针对样品中的全部拷贝数在20分钟或更短时间内检测到靶核酸序列(左侧五根柱条，显示每微升(μl)103、102、10、5和1个拷贝的拐点时间)。相反，对照实验(无rt-pcr预扩增的naa测定，在右侧示出)的拐点时间全部超过约35分钟(除了一个外全部超过60分钟；最短的拐点时间对应于最大拷贝数(103个拷贝/μl))。因此，与单独通过naa等温方法相比，当首先通过pcr“预扩增”样品(标记为“预扩增”的结果)时，更容易通过如本文公开的等温naa方法检测到样品中的靶核酸序列。
图2示出了图1中总结的实验的一些原始输出。图2所示的迹线来自在预扩增后进行的naa测定，相对荧光在垂直方向上示出，时间(作为“循环”，其中一个循环为约60至90秒，即，大约一分钟)在水平方向上示出。
将引物组rlx3547/48用于图3、4和5所示实验中的rt-pcr预扩增。如图3所示，在rt-pct预扩增的情况下，针对样品中的全部拷贝数在30分钟或更短时间内检测到靶核酸序列(左侧五根柱条，显示每微升(μl)103、102、10、5和1个拷贝的拐点时间)。相反，对照实验(无rt-pcr预扩增的naa测定，在右侧示出)的拐点时间全部超过约35分钟，并且除了一个(103个拷贝/μl)外全部超过60分钟。因此，在这些实验中也一样，与单独通过naa等温方法相比，当首先通过pcr“预扩增”样品时，更容易通过等温naa方法检测到样品中的靶核酸序列。
图4示出了来自具有预扩增的naa测定的一些原始输出(在图3中总结)，相对荧光在垂直方向上示出，时间(作为“循环”，其中一个循环为约60至90秒，即，大约一分钟)在水平方向上示出。相反，图5示出了来自没有预扩增的naa测定的一些原始输出(在图3中总结)，相对荧光在垂直方向上示出，时间(作为“循环”，其中一个循环为约60至90秒，即，大约一分钟)在水平方向上示出。图4与图5中的迹线的比较说明，与单独采用naa等温方法(在不存在rt-pcr预扩增的情况下)的检测时间(拐点时间)相比，在naa等温方法之前进行rt-pcr时检测时间缩短(拐点时间更短)。
实施例2
在一个非限制性实例中，利用能够检测hiv核酸、抗体和抗原的单一测试快速鉴定急性且确定的hiv感染可通过帮助具有阳性hiv结果的患者尽快获得其需要的医护和服务，而对公共卫生产生巨大的影响。在一个实施方式中，提供了针对hiv的单一测试，其能够检测hiv核酸、抗体和抗原(用于诊断和预后用途)，易于在经处理或未处理的样本上使用，能够进行定性和/或定量应用，可在5小时或更短、4小时或更短、3小时或更短、2小时或更短，或60分钟或更短内进行，并且适合于商业推广。
在一个实施方式中，本发明的hiv测试在单一装置或在一个装置的外壳下对来自从受试者获得的样品的全部以下各项进行测试：hiv-1rna、hiv-2rna、p24抗原、hiv-1抗体和hiv-2抗体。因此，本发明的hiv测试还能够区分hiv-1和hiv-2感染。在一个实施方式中，简化的第六代hiv测试包括对一个小样品进行所有以下测试：hiv-1rna、hiv-2rna、p24抗原、hiv-1igg、hiv-2igg、hiv-1igm和hiv-2igm。
在一个非限制性实例中，样品可为约100微升至约200微升的血液(静脉血或毛细血管血)。在另一个非限制性实例中，小样品可为约10微升至约100微升的血液(静脉血或毛细血管血)。在一些实施方式中，对血液进行预处理，使得被测样品为血浆。在一些实施方式中，对血液进行预处理，使得被测样品为血清。在一些实施方式中，对血液进行预处理，使得被测样品为稀释的血液。在一些实施方式中，被测样品是未经稀释的血液。在一些实施方式中，在与样品处理装置分开的装置上进行预处理。任选地，预处理和样品处理都在一个装置或在一个装置的外壳内进行。在一个实施方式中，从获自受试者的单个样品检测hiv-1rna、hiv-2rna、p24抗原、hiv-1抗体和hiv-2抗体。
在一个非限制性实例中，通过将核酸测试与血清学检测相结合，该测试实施方式将提供用于检测急性感染的信息，以及关于确定的感染的信息。任选地，该hiv测试是完全自动化的，并且将具有与患者样品并行处理的机载质量控制(qc)。在机载qc的一个实施方式中，机载质量控制将包括阳性对照和阴性对照，以及充当人临床样本的阳性对照的人rnasep基因，以指示由临床样本的提取导致的核酸充分分离。在一个非限制性实例中，qc试剂和消耗品被包含在具有用于hiv测试的试剂和消耗品的同一个筒匣中。
在一个非限制性实例中，该hiv测试被设计为对毛细血管全血样品进行。任选地，在更进一步的实施方式中，应当理解，该测试可被配置为对毛细血管全血或静脉全血、血清或血浆进行。在一个实施方式中，通过样品处理自动化地进行该测试，而无需任何用户干预。在一个实施方式中，在将样品装载至装置中后，通过样品处理自动化地进行该测试，而无需任何用户干预。鉴于样品收集方便，运行样品方便，核酸、抗原和血清学检测的灵敏度/特异性较高，本测试实施方式可用于快速诊断和区分hiv-1和hiv-2感染。
作为一个非限制性实例，处理样品的步骤可包括
a.通过基于珠子的方法从样品中提取rna；
b.进行逆转录(rt)；
c.通过一系列聚合酶链反应(pcr)扩增循环进行预扩增，
d.进行等温扩增和检测；
e.与上述核酸测试并行地进行用于检测p24、hiv-1抗体和hiv-2抗体的免疫测定；
f.在仪器上与样品处理并行地处理机载对照。
所述免疫测定可为直接或间接免疫测定，并且可为elisa(酶联免疫吸附测定)。例如，可采用p24特异性单克隆抗体，利用抗体夹心免疫测定对p24进行检测。本发明的hiv测试也可以能够检测hiv-1和hiv-2的igg抗体、igm抗体或二者。在特定实施方式中，本发明的测试能够检测hiv-1和hiv-2的igg抗体和igm抗体二者。在非限制性实例中，利用针对hiv-1和hiv-2的抗体夹心免疫测定来检测igg和igm抗体二者。在一个实施方式中，例如，通过使用分别对hiv-1和hiv-2具有特异性的抗原，该免疫测定能够区分hiv-1和hiv-2抗体。在另一实施方式中，例如，通过使用不同的检测试剂、彼此分开进行测定和/或使用不同的检测方法，该hiv测试能够区分抗原反应性和抗体反应性。可将捕获试剂(例如，抗原、抗体等)固定在包括但不限于珠子、孔表面和内部测定尖端的固体支持体上。
此外，尽管本文许多实施方式描述了利用等温技术的核酸扩增，但应理解，并不排除其他核酸扩增技术，如pcr、qpcr、巢式pcr或其他核酸检测技术。在另一个实施方式中，通过使用分别对hiv-1和hiv-2具有特异性的引物，该测试能够区分hiv-1和hiv-2rna。
在一个非限制性实例中，将来自该测试的原始数据传输至数据分析仪进行解读。在一个实施方式中，数据分析仪与采用上述步骤处理样品的装置并非处于同一位置。任选地，其他实施方式可具有与样品处理器位置相同的数据分析仪。任选地，其他实施方式可将数据分析仪与样品处理器组合在同一装置中。还应理解，在一些实施方式中，原始数据是电压、电流、数字、电子、光学、数码或其他非最终值的形式，如果其被另一方或装置拦截，除非拦截方或装置具有用于将此类原始数据或其他读出转换成健康量度的转换信息或算法，否则是无意义的。
在一个实施方式中，测试筒匣在使用前冷藏储存(4-8℃)。任选地，该测试筒匣在使用前冷藏储存(2-10℃)。在一个实施方式中，该测试采用提供至少用于核酸测试和血清学测试的所有试剂和消耗品的单个筒匣。任选地，组合测试采用提供用于核酸测试、抗体测试和抗原测试的所有试剂和消耗品的单个筒匣。任选地，组合测试采用单个筒匣，该筒匣提供用于对该筒匣中所含的血液和组织样品进行核酸测试、抗体测试和抗原测试的所有试剂和消耗品。任选地，组合测试采用单个筒匣，该筒匣提供用于对该筒匣中所含的鼻拭子上的血液和样品进行核酸测试、抗体测试和抗原测试的所有试剂和消耗品。任选地，组合测试采用单个筒匣，该筒匣提供用于对该筒匣中所含的咽拭子上的血液和样品进行核酸测试、抗体测试和抗原测试的所有试剂和消耗品。任选地，组合测试采用提供用于对毛细血管血进行核酸测试、抗体测试和抗原测试的所有试剂和消耗品的单个筒匣。任选地，组合测试采用提供用于对稀释的毛细血管血进行核酸测试、抗体测试和抗原测试的所有试剂和消耗品的单个。任选地，组合测试采用提供用于对稀释的静脉血进行核酸测试、抗体测试和抗原测试的所有试剂和消耗品的单个筒匣。任选地，组合测试采用提供用于对静脉血进行核酸测试、抗体测试和抗原测试的所有试剂和消耗品的单个筒匣。
如本文一个实施方式所述，可在紧急医护中心现场由经培训和认证的医务人员进行手指针刺测试并收集样品来开展hiv测试。任选地，可以在正常医生办公室打烊或甚至医生办公室开放时，在零售药店、零售商店的位置，或在受试者可能为了其他目的(购物等)而前往的位置处，一些人可进行此类测试。
在一个实施方式中，全自动化生产设施可以支持极大量的测试(足以处理数千万个样品)。
在一个非限制性实例中，hiv测试的灵敏度将与其他fda批准的核酸测试如abbott实时hiv-1测试相当或比其更灵敏。在一个实施方式中，检测极限(lod)可低至样品中的5、8、10、15、20、50、100、500或1000个hiv拷贝。
在本文的一个实施方式中，核酸测试对低拷贝数灵敏度高度敏感，使得其可用于急性感染期间的快速诊断。作为非限制性实例，本实施方式中的核酸测试分别对m组(a-h)和o组hiv-1以及a亚型和b亚型hiv-2具有特异性。
在本文测试的一个实施方式中，周转时间可能是少于60分钟的运行时间。对于单个或合并的核酸测试，现有核酸测试的传统周转时间为6.5小时(3.5小时提取和3小时扩增及检测)。
在clia状态和测试复杂性方面，考虑到样品收集、机载qc、自动化样品处理和自动化分析和结果解读较容易，可将hiv配置为关于测试复杂性的clia豁免或其他监管机构的类似豁免，而一些情况下可选择通过clia认证的或其他监管机构认证的实验室进行该测试。
通过简化的用于检测和定量hiv的核酸测试，本文的实施方式可显著改善快速鉴定急性和确定的hiv感染的能力，因此允许患者更快地接受医护和服务。
在一些实施方式中，hiv测试采用定量核酸扩增过程。任选地，一些实施方式可采用定性核酸扩增过程。
实施例3mrsa检测
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)是一类可导致人类感染并且耐受β-内酰胺抗生素的金黄色葡萄球菌(s.aureus)。由于其对某些抗生素的抗性，mrsa感染可能难以治疗。
金黄色葡萄球菌通常通过获得meca基因而变为耐甲氧西林的。meca基因通常位于葡萄球菌盒式染色体mec(sccmec)中，后者是一种多基因、可转移的基因组元件。存在不同类型的sccmec，已知的sccmec类型的大小约为21,000-67,000个核苷酸长度。通常，在每种类型的sccmec中，meca基因被作为sccmec的其他组分的其他基因或元件包围。在mrsa细菌中，含有meca基因的sccmec被整合至金黄色葡萄球菌染色体中。
为了鉴定和控制mrsa细菌，需要用于mrsa检测的有效试剂及方法。
本文提供了用于mrsa检测的系统和方法。本文所述的各个特征可应用于下文阐述的任何特定实施方式，或者可应用于针对或涉及mrsa检测的任何其他类型的系统。本文描述的系统和方法可作为独立的系统或方法，或作为集成系统或方法的一部分而应用。应当理解，所公开的系统和方法的不同方面可以单独地、共同地或彼此组合地来理解。
现有mrsa检测方法通常分开测试样品的meca基因和来自金黄色葡萄球菌染色体的遗传物质。如果在样品中同时发现了meca基因和金黄色葡萄球菌遗传物质，则作出存在mrsa的推定结论。然而，这个结论可能不准确，因为meca基因可能存在于金黄色葡萄球菌外(作为可在生物体之间转移的sccmec的一部分)。因此，同时含有meca基因和金黄色葡萄球菌的样品可能不会真正含有mrsa；相反，其可能含有非mrsa金黄色葡萄球菌，以及含有meca基因的不同细菌或游离遗传元件。因此，这种情况可能导致对样品中mrsa的假阳性鉴定。
本文提供的方法和组合物解决了上述问题，并且提供了鉴定金黄色葡萄球菌染色体中的meca基因(因此是真正的mrsa)的方法和组合物。
鉴定金黄色葡萄球菌染色体中的meca基因的一种途径可以是进行例如聚合酶链反应(pcr)，其中pcr反应将含有可能含有mrsa细菌或mrsa遗传物质的样品，并且其中用于pcr反应的一条引物将与meca基因的一部分退火，并且用于pcr反应的另一条引物将与金黄色葡萄球菌染色体的一部分退火。如果这样的pcr反应产生了反应产物，则其将表明meca基因和来自金黄色葡萄球菌染色体的遗传物质在同一链上(因此表明该样品含有真正的mrsa细菌)。然而，通常这种方法是无效的，因为在大多数mrsa细菌中，meca基因距离金黄色葡萄球菌染色体的遗传物质达数千个核苷酸。这是由于在mrsa中，meca基因被整合至金黄色葡萄球菌染色体中作为sccmec的一部分，并且meca基因通常位于sccmec的内部部分中，两侧被sccmec插入物的数千个其他核酸包围。由于传统的pcr和许多其他核酸扩增技术在扩增相对较长的核苷酸序列时不是很有效，因此在大多数mrsa菌株中meca基因与金黄色葡萄球菌染色体之间相对较大的核苷酸距离通常导致如上所述的传统pcr反应(例如，其中一条引物与meca基因的一部分退火而另一条引物与金黄色葡萄球菌染色体的一部分退火)表现不佳。
已鉴定了多种不同类型的sccmec。例如，meca基因的位置在不同的sccmec类型之间可能不同；sccmec元件的含量在不同的sccmec类型之间可能不同，并且sccmec所插入的金黄色葡萄球菌染色体中的位置(例如，attl和attr)在不同的sccmec类型之间可能不同。meca基因在存在于金黄色葡萄球菌染色体中时，通常与金黄色葡萄球菌遗传物质相隔数千或甚至数万个核苷酸。
本文提供了用于鉴定金黄色葡萄球菌染色体中的meca基因(因此是真正的mrsa)的改进的方法和组合物。
在实施方式中，本文提供的方法包括至少两个步骤：1)生成核酸链的步骤，其中meca基因的至少一部分与金黄色葡萄球菌染色体的至少一部分在该链内彼此物理地紧邻；以及2)采用至少第一引物、第二引物和步骤1)的核酸链进行核酸扩增法的步骤，其中第一引物与meca基因的一部分退火并且第二引物与金黄色葡萄球菌染色体的一部分退火，并且其中生成了包含meca基因和金黄色葡萄球菌染色体二者的部分的扩增产物。
在本文提供的系统和方法的实施方式中，可提供包含含有meca基因200的sccmec盒的金黄色葡萄球菌染色体或其部分(称之为“mrsa染色体”)。可将mrsa染色体200与第一引物和第二引物一起温育，其中第一引物与meca基因的一部分(或者，任选地，sccmec盒的其他元件)互补，并且第二引物与金黄色葡萄球菌染色体的一部分互补。此外，一条或两条引物在5’端被磷酸化。在第一dna扩增反应中，将mrsa染色体与具有高持续性的dna聚合酶一起温育。示例性的具有高持续性的dna聚合酶为phi29聚合酶。例如，第一dna扩增反应可为等温法。通过采用具有高持续性的dna聚合酶，可生成至少少量的扩增产物202。来自该反应的扩增产物202将含有金黄色葡萄球菌和meca遗传物质两者，但通常仅生成少量的扩增物质202。由于生成的量较少，该扩增物质202通常难以检测出。因此，然后将扩增物质202与dna连接酶一起温育，由于用于扩增反应的引物的5’端上的磷酸基团，该dna连接酶可将扩增产物202连接在一起。扩增物质202与连接酶的温育可导致两种一般类型的连接产物：a)由两个或更多个扩增产物202端对端连接形成的多联体204；或b)由扩增产物202的一端与同一扩增产物202的另一端连接形成的环化产物206。通过这两种类型的连接产物(204和206)，使得meca基因与金黄色葡萄球菌遗传物质(例如，attr、orfx)物理地紧邻。因此，这两种类型的连接产物是在扩增相对较小的扩增子(例如，2000个核苷酸或更短)时最有效的核酸扩增法的适宜模板。因此，本文提供的方法的下一步涉及将连接产物用于第二核酸扩增步骤。该第二核酸扩增步骤将至少采用与meca基因的一部分(或任选地，sccmec盒的另一部分)退火的第一引物，以及与金黄色葡萄球菌遗传物质退火的第二引物。多种核酸扩增法可用于第二核酸扩增步骤，如pcr或如2014年9月17日提交的pct/us14/56151中描述的扩增法，其通过引用全文并入本文用于所有目的。在实施方式中，第二核酸扩增步骤的第一引物和第二引物不同于第一核酸扩增步骤(其产生产物202)的第一引物和第二引物。在实施方式中，第二核酸扩增步骤的第一引物和第二引物与第一核酸扩增步骤的第一引物和第二引物具有相反的取向。在实施方式中，第二核酸扩增步骤的第一引物和第二引物与第一核酸扩增步骤的第一引物和第二引物相同。
图6提供了可与本文提供的方法一起使用的示例性引物序列。
在实施方式中，本文提供的方法的所有步骤都可被允许在同一容器中同时发生(例如，用于本文提供的方法的所有试剂都可在同一容器中同时提供)。
除了用于检测真正的mrsa细菌外，本文提供的方法还可用于检测其他物种或分子中的其他遗传元件，其中，例如，存在可在共同核酸链上或共同分子的一部分上的两个或更多个遗传元件，但其元件彼此相隔较大的核苷酸距离。如本文提供的一般途径(即，进行第一扩增反应，随后进行连接反应，之后进行第二扩增反应)可用于呈现出类似结构问题的许多种遗传元件。
此外，在实施方式中，如果已经存在多个拷贝的含有感兴趣遗传元件的分子，而且这类分子可被连接在一起以形成其中感兴趣的元件可通过例如pcr或如pct/us14/56151中描述的扩增法而容易地扩增的结构，则可省略本文提供的第一扩增反应。
实施例4snp检测
在丙型肝炎基因型1a中，蛋白酶基因ns3中存在与蛋白酶抑制剂波普瑞韦(boceprevir)的治疗失败相关的多态性位点q80k，否则波普瑞韦可有效阻断病毒中的肽成熟。评估1a亚型患者的ns3基因中的q80多态性可能是制定治疗方案的重要部分。
因此，需要改进的用于评估q80多态性的试剂和方法。此外，需要改进的用于评估其他snp的试剂和方法。
本文提供了用于评估snp的系统和方法。本文描述的各个特征可应用于下文阐述的任何特定实施方式，或者可应用于针对或涉及snp评估的任何其他类型的系统。本文描述的系统和方法可作为独立的系统或方法，或作为集成系统或方法的一部分而应用。应当理解，所公开的系统和方法的不同方面可以单独地、共同地或彼此组合地来理解。
在实施方式中，本文提供了用于评价靶序列中的snp、突变或感兴趣的其他核苷酸的组合物和方法。在一些情况下，靶序列可具有围绕感兴趣核苷酸位置的多种不同的多态性。例如，感兴趣的核苷酸可位于具有150个核苷酸的靶序列的第60个核苷酸位置(最5’端的核苷酸在第一位，紧接着最5’端的核苷酸的核苷酸在第二位，以此类推)。
在实施方式中，可通过利用如2014年9月17日提交的pct/us14/56151中所提供的snp检测方法来评价感兴趣的核苷酸，该申请在此通过引用全文并入以用于所有目的。在这样的方法中，利用引物对来扩增含有感兴趣核苷酸的靶核酸，其中每个引物均含有尾区/第一区和模板结合区/第二区。在实施方式中，引物对的第二引物的尾区/第一区与包含感兴趣核苷酸的靶核酸的一部分互补。在如pct/us14/56151公开的方法中，例如，可通过比较使用在引物的第一区/尾区中具有略微不同的核苷酸序列的一种或多种引物对(一般在引物对之间仅有单个核苷酸差异)扩增含有感兴趣核苷酸的靶核酸的速率或量，来确定感兴趣的核苷酸的身份。
然而，在某些情况下，如果靶核酸中感兴趣核苷酸附近的一个或多个位置存在大量的序列变异，则可能难以进行如pct/us14/56151中提供的snp检测方法。例如，这样的位置可以在与第一引物和/或第二引物的模板结合区相对应的区域中。如果如pct/us14/56151中描述的用于snp检测的引物不能容易地与靶核酸序列相结合，则其中公开的方法可能对snp检测是无效的。
因此，本文提供了有利于鉴定snp的组合物和方法。在第一步中，通过第一扩增反应(如pcr)扩增含有感兴趣核苷酸的靶核酸区，以生成第一扩增产物。在该第一扩增反应中，使用相对较长的引物对(例如，每个引物含有至少15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、80、90或100个核苷酸)扩增靶核酸。长引物可容许模板结合区中的相对大量的序列多样性(即，因为引物较长，其可能仍然与靶序列退火，即使多个核苷酸是错配的)。重要的是，在第一扩增反应中，两个引物都不会与感兴趣核苷酸/snp的确切位置退火(即，引物应该只与感兴趣snp附近的区域退火)。这是因为对于本文提供的方法，不期望改变感兴趣核苷酸/snp的身份(因为鉴定感兴趣的核苷酸/snp是期望的)。一旦在第一扩增反应中生成了第一扩增产物，则第一扩增产物将具有通常已知的核苷酸序列(因为用于在第一扩增反应中生成该第一扩增产物的引物的核苷酸序列是已知的)。然而，由于第一扩增反应中所用的引物均没有与感兴趣的核苷酸/snp的位置退火，因此在第一扩增产物中，感兴趣的核苷酸/snp的身份将仍然是未知的。然后可将第一扩增产物与如pct/us14/56151中提供的用于snp检测的引物一起温育。基于第一扩增产物通过采用具有已知序列的引物生成这一事实，这些引物可被设计为具有与已知存在于第一扩增产物中的序列互补的区域。然后可如pct/us14/56151中所述确定感兴趣snp/核苷酸的身份。
图7提供了本文提供的方法的一般示意图。可提供含有靶核酸102的核酸链100。靶核酸102可含有多个多态性/变异核苷酸104。靶核酸102还含有感兴趣的核苷酸/snp106。将靶核酸与第一引物112和第二114引物一起温育，以便生成第一扩增产物120。由于第一扩增产物120是采用第一引物112和第二引物114(它们具有已知的核苷酸序列)扩增的，因此第一扩增产物120将具有通常已知的核苷酸序列。在生成第一扩增产物120的过程中，所述多个多态性/变异核苷酸104被第一引物112和第二引物114的核苷酸替代。然而，第一扩增产物120仍具有未知的感兴趣核苷酸/snp106。然后可将第一扩增产物120用于如pct/us14/56151中所述的用于snp检测的方法中。
在实施方式中，本文提供的方法可用于评估丙型肝炎蛋白酶基因ns3中的多态性位点q80k中的snp。图8提供了可用作评估q80k位点的方法的一部分的示例性引物序列。本文提供的方法可用于评估许多不同靶核酸中的snp，其中该靶核酸具有高水平的序列变异性。
图9提供了来自如本文所述进行的方法的步骤的结果。图10提供了用于图9的实验的引物序列。此外，也用于图9的结果的核苷酸序列如下：
t255q序列：
ggaacgaggaccatcgcatcacccaagggtcctgttatccagatgtataccaatgtagaccaagacctcgtgggctggcccgctcctcaaggtgcccgctcattgacaccctgcacctgcg。
t255k序列：
ggaacgaggaccatcgcatcacccaagggtcctgttatccagatgtataccaatgtagacaaagacctcgtgggctggcccgctcctcaaggtgcccgctcattgacaccctgcacctgcg。
在实施方式中，本文提供的方法的所有步骤都可被允许在同一容器中同时发生(例如，用于本文提供的方法的所有试剂都可在同一容器中同时提供)。
虽然本文已经示出和描述了本发明的优选实施方式，但对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施方式只是以示例的方式提供的。本领域技术人员现将在不偏离本发明的情况下想到许多更改、改变和替代。应当理解，在实践本发明的过程中可以采用本文所描述的本发明实施方式的各种替代方式。例如，一个实施方式的特征可与另一个实施方式的特征相组合，无论这种组合在本文中是否已经描述。还应当理解，虽然出于方便的目的，本文中已经使用有限数目的术语和短语描述了本文提供的发明，但本发明也可以使用本文未提供的同样准确描述本发明的其他术语和短语进行描述。
另外，尽管本文的一些实施方式可能将初始热循环描述为“pcr”过程，但在初始“pcr过程”期间，本文的许多实施方式可以仅进行热循环形式的处理，并不进行任何类型的检测。在实施方式中，应理解，提供增加的拷贝数的其他过程可用于初始的样品富集。如本文实施例中所用的，术语“初始”并不一定意味着其为第一步，而仅仅意味着其在一个或多个后续检测步骤之前发生。一些实施方式可将其视为预扩增步骤。一些实施方式可将其视为样品富集步骤。
在实施方式中，还应理解，可对其中具有针对多个不同基因座的多种不同结合物类型(埃博拉、疟疾等)的样品的本体部分和/或共同部分进行初始热循环过程，其中在热循环后，可以处理该过程以用于更特别的检测，诸如但不限于dna扩增或目前已知或可在未来开发的其他检测处理。在对具有多种不同结合物的样品进行批量处理的这类实施方式中，应理解，虽然没有特别地排除在初始阶段中进行检测，但由于样品中可能会或可能不会产出可用数据的多种不同结合物，这样的检测通常没有进行。在实施方式中，可将该复合式过程配置为从经富集的单个共同样品中检测许多靶标，其中该靶标可为至少5种或更多种。在实施方式中，该过程可以从单个样品中检测许多靶标，其中该靶标可为至少7种或更多种。在实施方式中，该过程可以从单个样品中检测许多靶标，其中该靶标可为至少10种或更多种。在实施方式中，该过程可以从单个样品中检测许多靶标，其中该靶标可为至少20种或更多种。
在实施方式中，本文的复合式过程可至少部分地由于来自初始热循环的拷贝数增加而改善等温过程的灵敏度，还可部分地由于至少两种不同引物(例如，热循环过程中的引物和等温过程中的引物)的使用而提供比pcr特异性更好的特异性。在实施方式中，对于用于富集靶标的热循环步骤而言，初始过程可能较粗，但其对在初始处理期间的检测而言不一定较粗。在实施方式中，初始处理可产生非特异性产物(伴随着更多拷贝的靶物质的产生)，并且后续步骤中的样品处理至少提供第二层检测，该检测对所需靶标更具特异性，但具有以下益处：由于来自初始步骤的富集，有更多用于检测的拷贝(即使在该过程中产生了一些非特异性产物)。在实施方式中，该复合式过程的第二或其他后续检测过程可被视为序列特异性的终点检测。在实施方式中，就灵敏度和特异性而言，该复合式过程可能优于单独的pcr过程或等温过程中的任一个。
在实施方式中，一些情况下可采用并行轨迹(track)处理，其中利用该复合式过程沿一条轨迹处理初始样品的至少一部分，并在诸如但不限于另一pcr过程或等温检测过程的至少一条其他轨迹上处理至少另一部分。因为可能不知道样品中是否具有足够拷贝数的靶标，所以可能出现在一条非复合式处理轨迹中进行检测不需要预扩增的一些情况，特别是在未进行样品富集的情况下拷贝数足够时。如果一条轨迹更早地返回信号，则如果在一条轨迹上接收到足够的响应就可较早停止该过程，从而减少沿一条其他平行轨迹继续检测的需要。在实施方式中，样品处理装置可包含至少一个热循环仪和至少一个非循环加热器。任选地，一些实施方式可具有多个热循环仪，其中可控制至少一个不进行循环。在实施方式中，一些实施方式可具有带有较少的用于热循环的孔、腔或容器的热循环仪，使得任选地，随后的检测过程均可被配置成比后续检测方法的孔负载更大的体积。因此，一个实施方式可具有一个或两个用于热循环的孔、腔或容器，以及至少10个或更多个用于后续检测的孔、腔或容器，其中每个孔、腔或容器可对某些基因座更具特异性。在这样的实施方式中，可在富集样品的初始热循环步骤之后进行样品向较小等分试样的分割。在一个实施方式中，还可将对照样品进行热循环以用于对照目的。
应当理解，除非上下文另有明确规定，否则在本文的说明书和随后的整个权利要求书中使用的“一个”、“一种”和“该”的含义包括复数的提及物。例如，提到“一个测定”可以指单个测定或多个测定。另外，除非上下文另有明确规定，否则在本文的说明书和随后的整个权利要求书中使用的“在……中”的含义包括“在……中”和“在……上”。所附权利要求不应解释为包括装置加功能式限定，除非在给定的权利要求中使用短语“用于……的装置”明确地叙述了这样的限定。如在此处的说明书和随后的整个权利要求书中所用的，描述为含有第二个对象的“至少一部分”的第一对象可含有所有量的/完整的第二对象。
如在此处的说明书和随后的整个权利要求书中所用的，术语“包含”、“包括”和“含有”以及相关的时态是包含在内且开放式的，并且不排除额外的、未叙述的要素或方法步骤。而且，在一些情况下，拓宽性词语和短语如“一个或多个(一种或多种)”、“至少”、“但不限于”或其他类似短语的存在不应被理解为有以下含义：在可能不存在这类拓宽性短语的情况下，预期或要求较窄的范围。最后，除非上下文另有明确规定，否则在此处的说明书和随后的整个权利要求书中使用的“或”的含义包括连接性和转折性的含义。因此，除非上下文另有明确规定，否则术语“或”包括“和/或”。
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