皮钦德病毒反向遗传学系统及其使用方法与流程

相关申请的交叉引用

本申请要求2014年9月22日提交的美国临时申请序列号62/053,443的权益，所述申请以引用的方式并入本文。

政府资金

本发明是在政府支持下，在美国国立卫生研究院授予的ai083409下进行。政府对本发明拥有某些权利。

序列表

本申请含有通过efs-web作为大小为45kb并且于2015年9月22日创建的题为“2015-09-22-sequencelisting_st25.txt”的ascii文本文件以电子方式提交至美国专利和商标局的序列表。由于序列表的电子提交，以电子方式提交的序列表用作美国联邦法规第37篇第1.821条(c)款所要求的纸质副本和第1.821条(e)款所要求的美国联邦法规。序列表中含有的信息以引用方式并入本文

背景

沙粒病毒家族包括具有在相反取向上编码总共四种基因的基因组的一组二节段包膜rna病毒(knipedm，howleypm(编)，fieldsvirology，第5版lippincottwilliams&wilkins，philadelphia，pa中的buchmeier等，2007，第1791-1827页)。由大(l)基因组节段产生的z蛋白是介导病毒出芽并且还调控病毒rna合成的含有小环结构域的基质蛋白。也在l节段上编码的大l蛋白(约200kda)是病毒rna合成所需的rna依赖性rna聚合酶(rdrp)蛋白。在小(s)节段上编码的糖蛋白(gpc)被翻译后加工成稳定信号肽(ssp)、受体结合g1蛋白和跨膜g2蛋白。s节段的核蛋白(np)壳体化病毒基因组rna，是病毒rna合成所必需的，并且还抑制宿主先天免疫应答。

沙粒病毒是以啮齿动物作为其主要天然宿主的动物传染病性rna病毒(对于综述，参见mclay等，2014，jgenvirol95(pt1)：1-15)。人可通过皮肤损害与啮齿动物排泄物直接接触、吃被啮齿动物排泄物污染的食物或吸入污染的气溶胶而感染沙粒病毒。只有少数沙粒病毒可引起人的疾病(对于综述，参见mclay等，2013，antiviralres97∶81-92)。例如，淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(lcmv)可引起中枢神经系统疾病，而拉沙病毒(lasv)和几种其他沙粒病毒可引起可潜在导致终末性休克和死亡的出血热。有限的治疗选择可用于治疗这些病毒感染。唯一可用的抗病毒药物(利巴韦林)显示一些有益效果，但它具有许多副作用并且必须在感染后不久在疾病常常被误诊为只是流感样和阴险的症状时施用。

由于从事病原性沙粒病毒工作的高遏制要求(bsl-4)以及与从事非人灵长类工作相关的成本，所以只进行了有限的疫苗研究。除了未经fda批准但仅可用于针对引起阿根廷出血热的胡宁病毒(juninvirus)的标签外使用(off-labeledusage)的candid#1之外，当前没有用于这些病原性沙粒病毒的疫苗。已经开发了几种安全和方便的系统来在常规bsl-2实验室中研究沙粒病毒复制和发病机理，诸如皮钦德病毒(pichindevirus)模型系统(lan等，2009，jvirol83∶6357-6362，liang等，2009，annnyacadsci1171第1增刊：e65-74、kumar等，2012，virology433∶97-103，wang等，2012，jvirol86∶9794-9801，mclay等，2013，jvirol87∶6635-6643)。从哥伦比亚稻鼠中分离了皮钦德病毒(picv)。它未在人中引起疾病，但可在豚鼠中引起出血热样症状，并且因此是研究沙粒病毒诱导的出血热的理想替代模型。血清学证据表明人中的血清阳性率极低(82人中的2人的生活和工作与感染啮齿动物的栖息地密切相关，并且13名实验室工作人员中的6名已显示出抗picv血清阳性，但是无明显疾病(trapido等，1971，amjtropmedhyg20∶631-641，buchmeier等，1974，infectimmun9∶821-823)。因此，与lcmv(一种在人中显示2％-5％血清阳性率的原型沙粒病毒)相反，在一般人群中存在极少至无针对picv的预先存在的免疫。

申请概述

本文提供了基因工程化的皮钦德病毒。在一个实施方案中，病毒包含三种双义基因组节段。第一基因组节段包含编码z蛋白的编码区和编码lrdrp蛋白的编码区。第二基因组节段包含编码核蛋白(np)的编码区和第一限制酶位点。第三基因组节段包含编码糖蛋白的编码区和第二限制酶位点。在一个实施方案中，所述np蛋白包含与seqidno：3具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，核蛋白包含降低所述核蛋白的核糖核酸外切酶活性的至少一个突变，其中所述突变选自约氨基酸380处的天冬氨酸、约氨基酸382处的谷氨酸、约氨基酸525处的天冬氨酸、约氨基酸520处的组氨酸和约氨基酸457处的天冬氨酸，其中所述天冬氨酸、所述谷氨酸或所述组氨酸被任何其他氨基酸取代。在一个实施方案中，所述糖蛋白包含改变所述糖蛋白的活性的至少一个突变，其中所述突变选自约氨基酸20处的天冬酰胺和约氨基酸404处的天冬酰胺，并且其中所述天冬酰胺被任何其他氨基酸取代，d、e或h被任何其他氨基酸取代。

在一个实施方案中，所述第二基因组节段包含多克隆位点，并且所述第一限制酶位点是所述多克隆位点的一部分。所述第二基因组节段还可包含编码在所述第一限制性位点处插入的第一蛋白质的编码区。在一个实施方案中，所述第三基因组节段包含多克隆位点，并且所述第二限制酶位点是所述多克隆位点的一部分。在一个实施方案中，所述第三基因组节段还可包含编码在所述第一限制性位点处插入的第二蛋白质的编码区。在一个实施方案中，所述第二基因组节段还包含编码在所述第一限制性位点处插入的第一蛋白质的编码区，并且所述第三基因组节段还包含编码在所述第一限制性位点处插入的第二蛋白质的编码区。在一个实施方案中，所述第一蛋白质和所述第二蛋白质选自抗原和可检测标志物。在一个实施方案中，所述抗原是由病毒病原体、原核病原体或真核病原体表达的蛋白质。第一蛋白质和第二蛋白质可以相同或可以不同。

本文还提供了载体的集合。在一个实施方案中，载体是质粒。在一个实施方案中，所述集合包括：编码第一基因组节段的第一载体，所述第一基因组节段包含编码z蛋白的编码区和编码lrdrp蛋白的编码区，其中所述第一基因组节段是反基因组的；编码第二基因组节段的第二载体，所述第二基因组节段包含编码核蛋白(np)的编码区和第一限制酶位点，其中所述第二基因组节段是反基因组的；以及编码第三基因组节段的第三载体，所述第三基因组节段包含编码糖蛋白的编码区和第二限制酶位点，其中所述第三基因组节段是反基因组的。在一个实施方案中，所述np蛋白包含导seqidno：3具有至少80％同一性的氨基酸序列。

在一个实施方案中，所述第二基因组节段包含多克隆位点，并且所述第一限制酶位点是所述多克隆位点的一部分。所述第二基因组节段还可包含编码在所述第一限制性位点处插入的第一蛋白质的编码区。在一个实施方案中，所述第三基因组节段包含多克隆位点，并且所述第二限制酶位点是所述多克隆位点的一部分。在一个实施方案中，所述第三基因组节段还可包含编码在所述第一限制性位点处插入的第二蛋白质的编码区。在一个实施方案中，所述第二基因组节段还包含编码在所述第一限制性位点处插入的第一蛋白质的编码区，并且所述第三基因组节段还包含编码在所述第一限制性位点挞插入的第二蛋白质的编码区。在一个实施方案中，所述第一蛋白质和所述第二蛋白质选自抗原和可检测标志物。在一个实施方案中，所述抗原是由病毒病原体、原核病原体或真核病原体表达的蛋白质。第一蛋白质和第二蛋白质可以相同或可以不同。

还提供了方法。在一个实施方案中，方法包括制造如本文所述的基因工程化的皮钦德病毒。所述方法包括将本文所述的载体集合引入细胞中，并在适于第一、第二和第三基因组节段表达和包装到病毒颗粒中的条件下在培养基中孵育细胞。所述方法还可包括从培养基中分离感染性病毒颗粒。

本文还提供了用于制造基因工程化的皮钦德病毒的反向遗传学系统，其中所述系统包括三种载体。第一载体编码第一基因组节段，所述第一基因组节段包含编码z蛋白的编码区和编码lrdrp蛋白的编码区，其中所述第一基因组节段是反基因组的；第二载体编码第二基因组节段，所述第二基因组节段包含编码核蛋白(np)的编码区和第一限制酶位点，其中所述第二基因组节段是反基因组的；并且第三载体编码第三基因组节段，所述第三基因组节段包含编码糖蛋白的编码区和第二限制酶位点，其中所述第三基因组节段是反基因组的。在一个实施方案中，所述np蛋白包含与seqidno：3具有至少80％同一性的氨基酸序列。

在一个实施方案中，方法包括使用反向遗传学系统，包括将本文所述的基因组节段的三种载体引入细胞中，在适于所述三种基因组节段转录和每个基因组节段的编码区表达的条件下孵育所述细胞。在一个实施方案中，该方法还包括分离由细胞产生的感染性病毒颗粒，其中每个感染性病毒颗粒包含所述三种基因组节段。在一个实施方案中，引入包括用所述三种基因组节段转染细胞。在一个实施方案中，引入包括使所述细胞与包含所述三种基因组节段的感染性病毒颗粒接触。在一个实施方案中，细胞是离体的，诸如脊椎动物细胞。在一个实施方案中，脊椎动物细胞可以是哺乳动物细胞诸如人细胞，或者脊椎动物细胞可以是禽细胞，诸如鸡胚胎成纤维细胞。

在一个实施方案中，方法包括在受试者中产生免疫应答。所述方法包括向受试者施用本文所述的感染性病毒颗粒，其中所述第二基因组节段包含编码第一抗原的编码区，并且所述第三基因组节段还包含编码第二抗原的编码区。在一个实施方案中，细胞是离体的，诸如脊椎动物细胞。在一个实施方案中，脊椎动物细胞可以是哺乳动物细胞诸如人细胞，或者脊椎动物细胞可以是禽细胞。免疫应答可包括体液免疫应答、细胞介导的免疫应答或其组合。在一个实施方案中，所述抗原是由病毒病原体、原核病原体或真核病原体表达的蛋白质或其月段。受试者可能已经暴露于病毒病原体、原核病原体或真核病原体，或者处于暴露于病毒病原体、原核病原体或真核病原体的风险中。在一个实施方案中，施用包括施用至少两种感染性病毒颗粒群体，其中每个感染性病毒颗粒群体编码不同的抗原。

本文还提供如本文所述的感染性病毒颗粒，以及包含本文所述的感染性病毒颗粒的组合物。

附图简述

图1.2质粒picv反向遗传学系统的图(lan等，2009，jvirol83∶6357-6362)。

图2.产生感染性三节段分裂的picv-rp18tri-gfp的3质粒系统。

图3.rp18tri-gfp病毒的表征。用rp18tri-gfp病毒感染a549或bhk-21细胞24小时，并在感染的细胞中检测到gfp表达。将病毒上清液收获并用于感染bhk-21细胞的新鲜培养物，在所述培养物中也检测到gfp表达。

图4.以高(moi＝0.5)和低(moi＝0.01)moi在bhk-21细胞中rp2、rp18、三节段病毒rp18tri-gfp和rp18tri-rluc的病毒生长比较。

图5.携带流感ha或np抗原的三节段picv的产生。

图6.由基于rp18tri的疫苗载体表达的gfp报道基因产物和流感ha或np蛋白表达的检测。

图7.基于rp18tri的流感疫苗在小鼠中赋予保护性免疫。1e5，1x10⁵；2e4；2x10⁴；ip，腹膜内。

图8.由基于rp18tri的流感疫苗诱导的hai滴度。

图9.通过不同的免疫接种途径由rp18tri-gfp/ha病毒诱导的hai滴度。in，鼻内；im，肌内；ip，腹膜内。

图10.在不同的免疫接种途径后由rp18tri-gfp/ha赋予的保护。

图11.通过np四聚体分析进行的np特异性ctl应答分析。

图12.在不同的免疫接种途径后引发的cd8+t细胞应答的动力学。

图13.疫苗赋予持久的免疫和保护。在用rp18tri-gfp/ha疫苗载体进行加强免疫1或2个月后用10ld50a/pr/8攻击c57bl6小鼠。a.加强免疫后第14天和第30天(dpp)、加强免疫后第30天和第60天(dpb)时的hi滴度。b.6dpi时肺中的病毒滴度。c.重量损失百分比。d.h&e染色的肺切片。

图14.由用rp18tri-gfp/ha疫苗载体进行的初免赋予的保护。a.在不同剂量的rp18tri-gfp/ha免疫接种后的中和抗体滴度。b.重量损失百分比。c.h&e染色的肺切片。

图15.来自rp18tri-ha/np和rp18tri-np/ha的噬菌斑大小和ha和np的表达

图16.由表达双重抗原的载体(ha和np)诱导的t细胞应答和体液应答。a.免疫接种后第7天时小鼠血液中np336四聚体⁺cd44⁺cd8⁺t细胞的代表性facs图。b.在初免后7天和通过四聚体染色进行加强免疫后7天测试的外周血中np特异性cd8⁺t细胞的频率。c.使用在不同时间点时收集的血清的hi测定来确定病毒中和抗体滴度。

图17.由表达流感病毒ha和np的基于rp18tri的疫苗赋予的保护。a.来自用rp18tri-gfp/gfp、rp18tri-ha/np或rp18tri-np/ha的初免-加强免疫接种的动物的染色肺切片。b.肺中的病毒滴度。c.pr8攻击后的重量损失百分比。

图18.由表达h1n1和h3n2流感病毒亚型的ha蛋白的基于rp18tri的载体疫苗诱导的c57bl6小鼠和balb/c小鼠中的体液应答。以初免与加强免疫之间的2周间隔用rp18tri-gfp/gfp或用10⁴pfu的rp18tri-gfp/ha、rp18tri-gfp/ha3和rp18tri-ha/ha3以肌内方式接种小鼠两次。加强免疫后两周，收集血清样品并分析针对pr8(h1n1)和x31(h3n2)攻击的病毒的hi滴度。δ表示在2周的初免后的hi滴度，·表示在2周的加强免疫后的hi滴度。左图：c57bl6小鼠中的hi滴度。右图：balb/c小鼠中的hi滴度。

图19.针对双重流感病毒攻击的保护。小鼠用10⁴pfu/mlrp18tri-ha/ha3免疫接种。病毒攻击后5或6天，测定肺中的病毒滴度。a.图示出在用pr8或x31流感病毒攻击时的病毒滴度。b.用10ld50a/pr/8或105pfux31攻击后的重量损失。c.用10ld50的a/pr/8病毒和10⁵pfu的x31攻击后6天收获的肺的h&e染色切片。

图20.rp18tri载体在加强免疫后诱导更强的ctl应答

图21.重组nprna酶突变病毒在感染细胞中诱导i型ifn产生。(a)5个催化残基中的每一个处的丙氨酸取代突变消除了picvnp抑制仙台病毒诱导的ifnβ活化的能力(qi等，2010，nature468∶779-783)。将293t细胞用ifnβ启动子定向的luc质粒和β-gal质粒以及空载体或相应的np质粒转染，随后进行仙台病毒感染。测量luc活性，并通过β-gal活性归一化转染效率。所示结果为三次独立实验的平均值。通过蛋白质印迹使用抗myc抗体来检测wt(rp2和rp18)和突变体picvnp蛋白的表达。(b)重组picvrna酶突变病毒在病毒感染时产生高水平的i型ifn。将a549细胞模拟感染或用相应的重组picv病毒以1的moi感染。将上清液在12和24hpi时收集，进行uv处理以使病毒颗粒失活，并进行基于rndv-gfp的生物测定以测量ifn水平。示出了来自三次独立实验(c)的代表性gfp图像(b)和平均gfp值以及标准偏差。

图22.nprna酶活性是在体外的具有ifn产生能力的(ifn-competent)细胞中的picv复制和体内picv感染所需的。(a)ifn缺陷型vero和具有ifn产生能力的a549细胞中的病毒生长动力学。用相应的病毒以0.01的moi感染细胞。在感染后的不同时间时，通过噬菌斑测定定量上清液中的病毒滴度。所示结果为三次独立实验的平均值。(b)用相应重组picv病毒感染的豚鼠(n＝6)的存活率(左图)和归一化的体重(右图)。使用log-rank(mantel-cox)χ²检验使用graphpadprism5软件进行存活曲线的统计分析。***，p＜0.001。**，p＜0.01。每日监测每只动物的体重并归一化至第0天。所示结果是每组归一化的体重的平均值。

图23.picvnprna酶突变体诱导强ifn应答以阻断病毒感染的建立。将豚鼠用1x10⁴pfu的相应重组病毒(每病毒组n＝3只动物)以i.p.方式感染1天和3天。(a)在1和3dpi时肝和脾中的病毒滴度。(b)通过qrt-pcr测量第1天时腹膜腔细胞中i型ifn和选择性干扰素刺激基因(isg)的水平。引物序列将根据要求来提供。每个点表示单个动物。通过studentt检验进行统计分析。

图24.表达双重抗原流感ha和np的rp18tri的产生。(a)在s1和s2节段上表达甲型流感病毒(iav)a/pr8的双重抗原ha和np的rp18tri载体、rp18tri-p/h和rp18tri-h/p的示意图。igr，基因间区。(b)如免疫荧光测定(ifa)所示，rp18tri双重抗原载体表达ha和np。(c)在bhk-21细胞中表达双重抗原的重组病毒的生长曲线分析。

图25.表达ha/np双重抗原的疫苗载体可在小鼠中诱导保护性免疫。给予一组c57bl6小鼠(n＝3)两个剂量的1x10⁴pfu相应rp18tri载体，并用10xmld50(半致死剂量)的小鼠适应的流感a/pr8病毒以鼻内方式(in)攻击。示出了3和6dpi时的体重(a)和病毒肺滴度(b)。

图26.h1/h3双重抗原载体诱导平衡的ha中和抗体。(a)表达egfp和h1ha(rp18tri-g/h1)、egfp和h3ha(rp18tri-g/h3)以及h1和h3(rp18tri-h3/h1)的rp18tri载体的示意图。(b)rp18tri-h3/h1诱导针对h1和h3ha亚型的平衡中和抗体。将c57bl6(顶图)和balb/c小鼠(底图)组用相应的rp18tri载体(n>＝3)通过im途径免疫两次。通过hai测定定量初免和加强免疫后14天时收集的血液针对a/pr8(h1n1)和a/x31(h3n2)的中和抗体的水平。

图27.通过初免和加强免疫策略用不同ha亚型诱导异源亚型中和抗体。(a)表达a/pr8np以及来自a/pr8(rp18tri-p/h1)的h1ha或来自a/x31(rp18tri-p/h3)的h3ha的rp18tri载体的示意图。(b)np特异性ctl在加强剂量时增加。以14天间隔，将c57bl6小鼠用rp18tri-p/h1进行初免，用rp18tri-p/h3进行加强免疫，并且再次用rp18tri-p/h1进行加强免疫。通过已建立的np四聚体分析来定量初免后(dpp)、第1次加强免疫后(dpb)和第2次加强免疫后(dpb2)7天的np特异性效应t细胞。(c)通过hai测定来定量初免和加强免疫后针对a/pr8(h1)、a/x31(h3)和a/wsn(异源亚型h1)的中和抗体。

图28.rp18tri载体可通过口服途径诱导体液应答和t细胞应答。通过口服管饲用rp18tri-g(n＝3)载体或rp18tri-p/h(n＝4)将bl6小鼠组免疫两次。示出了在初免或加强免疫后不同天数时的np特异性效应t细胞(a)和h1特异性中和抗体(b)。dpp，初免后天数；dpb，加强免疫后天数。

图29.失活的rp18tri载体可诱导体液应答和t细胞应答。分别用rp18tri-g载体(n＝3)、过氧化氢失活的rp18tri-p/h(n＝3)和活rp18tri-p/h(n＝1)将c57bl6小鼠组免疫两次。示出了免疫后不同天数时的np特异性效应t细胞(左图)和中和抗体(右图)。dpp，初免后天数；dpb，加强免疫后天数。

图30.rp18tri载体未在豚鼠中显示毒力，并且可保护动物免于用wtrp18病毒进行的致死攻击。(a)rp18tri-g未在豚鼠中引起强毒感染。将hartley豚鼠组(n＝3)通过ip途径模拟感染(pbs)或用wtrp18(1x10⁴pfu)或rp18tri-g(1x10⁶pfu)感染。每日监测体重并归一化至第0天(左图)。直肠温度示于右侧。(b)保护rp18tri-g免疫的豚鼠免于致死rp18攻击。将豚鼠组(n＝3)用1x10⁴pfu的pbs或rp18tri-g通过ip途径免疫，并且14天后，用1x10⁴pfu的wtrp18病毒攻击。示出了归一化的体重(左图)和直肠温度(右图)。高于39.5℃的温度被认为是发热的。

说明性实施方案的详述

本文提供了用于生产基因修饰的皮钦德病毒的反向遗传学系统。本文所述的基于基因修饰的皮钦德病毒的反向遗传学系统具有优于其他沙粒病毒系统的多个优点。未知晓皮钦德病毒在人中引起疾病，并且存在的证据是皮钦德病毒可在实验室环境中引起无症状性人感染。例如，从事病毒工作的实验室人员中的46％是血清阳性的，但未显示出明显疾病(knipe和howley(编)，fieldsvirology.第5版philadelphia，pa：lippincottwilliams&wilkins.第1791-1827页中：buchmeier等，2007，arenaviridae：thevirusesandtheirreplication.)。与由buchmeier等报道的人感染研究中使用的亲本病毒相比，本文所述的修饰的皮钦德病毒被进一步减毒。修饰的皮钦德病毒在细胞培养物中通过连续传代而在基因上稳定。一般人群未知晓先前暴露于皮钦德病毒，这使其成为疫苗开发的理想载体，因为缺乏针对这种皮钦德病毒载体的预先存在的免疫。如本文所用，“基因修饰的”和“基因工程化的”是指已被修饰并且未在任何天然环境中发现的皮钦德病毒。例如，基因修饰的皮钦德病毒是已经引入了外源多核苷酸诸如限制性内切核酸酶位点的皮钦德病毒。基因修饰的皮钦德病毒的另一个实例是已被修饰以包含三种基因组节段的皮钦德病毒。

用于这种修饰的皮钦德病毒的反向遗传学系统包括两至三种基因组节段。第一基因组节段包括两个编码区(编码z蛋白的一个编码区，以及编码rna依赖性rna聚合酶(lrdrp)的第二个编码区)。第二基因组节段包含编码核蛋白(np)的编码区，并且可包含至少一个限制酶位点，诸如多克隆位点。第三基因组节段包含编码糖蛋白的编码区，并且可包含至少一个限制酶位点，诸如多克隆位点。“编码区”是编码蛋白质的核苷酸序列，并且在置于适当调控序列的控制下时表达编码的蛋白质。如本文所用，术语“蛋白质”泛指由肽键连接在一起的两个或更多个氨基酸的聚合物。术语“蛋白质”还包括含有由二硫键、离子键或疏水相互作用连接的多于一个蛋白质的分子，或共价或非共价地连接在一起作为多聚体(例如二聚体、四聚体)的蛋白质复合体。因此，术语肽、寡肽和多肽都包括在蛋白质的定义内，并且这些术语可互换使用。应当理解，这些术语不意味着氨基酸聚合物的特定长度，它们也不旨在暗示或区分蛋白质是使用重组技术、化学或酶合成来产生，或是天然存在的。

z蛋白、lrdrp、np蛋白和糖蛋白是由皮钦德病毒编码的那些蛋白质。z蛋白是介导病毒出芽并且还调控病毒rna合成的含有小环结构域的基质蛋白。来自皮钦德病毒的z蛋白的一个实例是可以genbank登录号abu39910.1(seqidno：1)获得的序列。lrdrp蛋白是病毒dna合成所需的rna依赖性rna聚合酶。来自皮钦德病毒的lrdrp蛋白的一个实例是可以genbank登录号abu39911.1(seqidno：2)获得的序列。np蛋白壳体化病毒基因组rna，是病毒rna合成所必需的，并且还抑制宿主先天免疫应答。来自皮钦德病毒的np蛋白的一个实例是可以genbank登录号abu39909.1(seqidno：3)获得的序列。糖蛋白被翻译后加工成稳定信号肽(ssp)、受体结合g1蛋白和跨膜g2蛋白。来自皮钦德病毒的糖蛋白的一个实例是可以genbank登录号abu39908.1(seqidno：4)获得的序列。

z蛋白、lrdrp蛋白、np蛋白和糖蛋白的其他实例包括与由皮钦德病毒编码的蛋白质具有结构相似性的蛋白质，例如seqidno：1、2、3和/或4。两个多肽的结构相似性可通过比对两个多肽(例如，本文所述的候选多肽和参考多肽)的残基以优化沿其序列长度的相同氨基酸的数目来确定；虽然每个序列中的氨基酸必须仍保持其正确顺序，但是允许任一或两个序列中的空位进行比对以优化相同氨基酸的数目。参考多肽可以是本文所述的多肽，诸如seqidno：1、2、3或4。候选多肽是与参考多肽进行比较的多肽。候选多肽可例如从动物(诸如小鼠)的细胞中分离，或者可使用重组技术来产生，或者化学地或酶促地合成。候选多肽可从存在于皮钦德病毒基因组中的核苷酸序列推断。

除非如本文另有所述的那样进行修饰，否则可使用如tatiana等，(femsmicrobiollett，174，247-250(1999))等所述并且可在国家生物技术信息中心(ncbi)网站上获得的blastp套件-2序列搜索算法的blastp程序进行氨基酸序列的成对比较分析。可使用所有blastp套件-2序列搜索参数的默认值，包括一般参数：期望阈值＝10，字长＝3，短查询＝on；评分参数：矩阵＝blosum62，空位成本＝存在：11扩展：1，组成调整＝条件组成评分矩阵调整。可替代地，可使用gcg包(版本10.2，madisonwi)中的bestfit算法来比较多肽。

在两个氨基酸序列的比较中，结构相似性可由“同一性”百分比提及，或者可由“相似性”百分此提及。“同一性”是指相同氨基酸的存在。“相似性”是指不仅存在相同的氨基酸，而且存在保守取代。本文所述多肽中氨基酸的保守取代可选自所述氨基酸所属类别的其他成员。例如，在蛋白质生物化学领域中已知，属于具有特定大小或特征(诸如电荷、疏水性和亲水性)的氨基酸分组的氨基酸可取代另一个氨基酸，而不改变蛋白质的活性(特别是在与生物活性不直接相关的蛋白质区域中)。例如，非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。保守取代包括例如lys取代arg，反之亦然，以维持正电荷；glu取代asp，反之亦然，以维持负电荷；ser取代thr，以便维持游离-oh；以及gln取代asn，以维持游离-nh2。

技术人员将认识到，可使用容易获得的算法诸如clustalw来将seqidno：1所示的z蛋白与来自其他沙粒病毒(包括拉沙病毒(o73557.4)、lcmvarmstrong(aax49343.1)和胡宁病毒(np_899216.1))的z蛋白比较以鉴别z蛋白的保守区。clustalw是产生不同序列的生物学上有意义的多序列比对的用于核酸或蛋白质的多序列比对程序(larkin等，2007，clustalwandclustalxversion2，bioinformatics，23(21)：2947-2948)。使用此信息，技术人员将能够以合理的期望容易地预测对z蛋白诸如seqidno：1的某些保守取代将不会降低多肽的活性。

技术人员将认识到，可使用容易获得的算法诸如clustalw来将seqidno：2所示的lrdrp蛋白与来自其他沙粒病毒(包括拉沙病毒(aat49002.1)、lcmvarmstrong(aax49344.1)和胡宁病毒(np_899217.1))的lrdrp蛋白比较以鉴别lrdrp蛋白的保守区。使用此信息，技术人员将能够以合理的期望容易地预测对lrdrp蛋白诸如seqidno：2的某些保守取代将不会降低多肽的活性。

技术人员将认识到，可使用容易获得的算法诸如clustalw来将seqidno：3所示的np蛋白与来自其他沙粒病毒(包括拉沙病毒(p13699.1)、lcmvarmstrong(aax49342.1)和胡宁病毒(np_899219.1))的np蛋白比较以鉴别np蛋白的保守区。使用此信息，技术人员将能够以合理的期望容易地预测对np蛋白诸如seqidno：3的某些保守取代将不会降低多肽的活性。

技术人员将认识到，可使用容易获得的算法诸如clustalw来将seqidno：4所示的糖蛋白与来自其他沙粒病毒(包括拉沙病毒(p08669)、lcmvarmstrong(aax49341.1)和胡宁病毒(np_899218.1))的糖蛋白比较以鉴别糖蛋白的保守区。使用此信息，技术人员将能够以合理的期望容易地预测对糖蛋白诸如seqidno：4的某些保守取代将不会降低多肽的活性。

因此，如本文所用，皮钦德病毒z蛋白、lrdrp蛋白、np蛋白或糖蛋白包括与参考氨基酸序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％氨基酸序列相似性的那些蛋白质。可替代地，如本文所用，皮钦德病毒z蛋白、lrdrp蛋白、np蛋白或糖蛋白包括与参考氨基酸序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的那些蛋白质。除非另外指出，否则“皮钦德病毒z蛋白”、“皮钦德病毒lrdrp蛋白”、“皮钦德病毒np蛋白”和“皮钦德病毒糖蛋白”是指分别与seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3和seqidno：4具有至少80％氨基酸同一性的蛋白质。

分别与seqidno：1、2、3或4的氨基酸序列具有结构相似性的皮钦德病毒z蛋白、lrdrp蛋白、np蛋白或糖蛋白具有生物活性。如本文所用，“生物活性”是指z蛋白、lrdrp蛋白、np蛋白或糖蛋白在产生感染性病毒颗粒方面的活性。这些蛋白质中的每一种在感染性病毒颗粒的生物发生中的生物学作用是已知的，用于测量每种蛋白质的生物活性的测定也是已知的。

在一个实施方案中，np蛋白可包括一个或多个突变。np蛋白中的突变可产生继续在感染性病毒颗粒的产生中发挥作用但是抑制感染了皮钦德病毒的细胞产生某些细胞因子的能力降低的np蛋白。抑制细胞因子产生的能力降低的皮钦德病毒预期可用于增强对由病毒编码的抗原的免疫应答。突变的实例包括残基380处的天冬氨酸、残基382处的谷氨酸、残基457处的天冬氨酸、残基525处的天冬氨酸和残基520处的组氨酸。本领域普通技术人员认识到，根据np蛋白中的小插入或缺失的存在，这些突变的精确位置可在不同的np蛋白之间变化，因此突变的精确位置是近似的，并且可有1、2、3、4或5个氨基酸的变化。

在一个实施方案中，np蛋白中的突变可以是残基380、382、457、525和/或520处的天冬氨酸、谷氨酸或组氨酸被任何其他氨基酸的替换。在一个实施方案中，突变可以是残基380、382、457、525和/或520处的天冬氨酸、谷氨酸或组氨酸的保守取代。在一个实施方案中，突变可以是残基380、382、457、525和/或520处的天冬氨酸、谷氨酸或组氨酸被甘氨酸或丙氨酸的替换。在一个实施方案中，np蛋白可包括残基380、382、457、525或520中的一个、两个、三个或四个处的突变，并且在一个实施方案中，np蛋白可包括所有五个残基处的突变。

在一个实施方案中，糖蛋白可包括一个或多个突变。糖蛋白中的突变可产生损害体内病毒扩散的糖蛋白。突变的实例包括残基20处的天冬酰胺和/或残基404处的天冬酰胺。本领域普通技术人员认识到，根据糖蛋白中的小插入或缺失的存在，这些突变的精确位置可在不同的糖蛋白之间变化，因此突变的精确位置是近似的，并且可有1、2、3、4或5个氨基酸的变化。

在一个实施方案中，糖蛋白中的突变可以是天冬酰胺残基20和/或404被任何其他氨基酸的替换。在一个实施方案中，突变可以是天冬酰胺残基20和/或404的保守取代。在一个实施方案中，突变可以是天冬酰胺残基20和/或404被甘氨酸或丙氨酸的替换。

如本文所述的蛋白质还可根据编码蛋白质的多核苷酸来鉴别。因此，本公开提供编码如本文所述的蛋白质或在标准杂交条件下与编码如本文所述的蛋白质的多核苷酸和所述多核苷酸序列的互补序列杂交的多核苷酸。如本文所用，术语“多核苷酸”是指具有任何长度的核苷酸的聚合形式(核糖核苷酸或脱氧核苷酸)，并且包括双链和单链dna和rna。多核苷酸可包括具有不同功能的核苷酸序列，包括例如编码序列和非编码序列，诸如调控序列。多核苷酸可直接从天然来源获得，或者可在重组、酶促或化学技术的帮助下制备。多核苷酸的拓扑学可以是线型的或环形的。多核苷酸可以是例如载体诸如表达或克隆载体的一部分或月段。多核苷酸的实例是基因组节段。

编码z蛋白的多核苷酸的实例是可以genbank登录号ef529747.1(seqidno：5)获得的序列的核苷酸85-372，编码lrdrp蛋白的多核苷酸的实例是可以genbank登录号ef529747.1(seqidno：5)获得的序列的核苷酸443-7027的互补序列，编码np蛋白的多核苷酸的实例是可以genbank登录号ef529746.1(seqidno：6)获得的序列的核苷酸1653..3338的互补序列，并且编码糖蛋白蛋白质的多核苷酸的实例是可以genbank登录号ef529746.1(seqidno：6)获得的序列的核苷酸52-1578。应当理解，编码分别由seqidno：1、2、3或4表示的z蛋白、lrdrp蛋白、np蛋白或糖蛋白的多核苷酸不限于seqidno：5或6所公开的核苷酸序列，但还包括由于遗传密码的简并性而编码此类蛋白质的多核苷酸类别。例如，天然存在的核苷酸序列seqidno：5只是编码具有氨基酸序列seqidno：1的蛋白质和具有氨基酸序列seqidno：2的蛋白质的核苷酸序列类别中的一个成员。编码所选蛋白质序列的核苷酸序列的类别大但是有限的，并且本领域技术人员通过参考标准遗传密码可容易地确定所述类别中的每个成员的核苷酸序列，其中已知不同的核苷酸三联体(密码子)编码相同的氨基酸。

如本文所用，对如本文所述的多核苷酸的提及和/或对一种或多种seqidno的核酸序列的提及可包括与鉴别的参考多核苷酸序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的多核苷酸。

在此上下文中，“序列同一性”是指两个多核苷酸序列之间的同一性。序列同一性通常通过比对两个多核苷酸的碱基来确定(例如，比对候选序列的核苷酸序列和包括例如编码seqidno：1、2、3或4的蛋白质的核苷酸序列的核苷酸序列)，以优化沿其序列的长度的相同核苷酸的数目；虽然每个序列中的核苷酸必须仍保持其正确顺序，但是允许任一或两个序列中的空位进行比对以优化共享核苷酸的数目。候选序列是与已知序列-例如包括选自例如seqidno：5或6的适当核苷酸序列的核苷酸序列比较的序列。例如，可使用如tatiana等，femsmicrobiollett.，1999；174：247-250所述并且可在万维网上在ncbi.nlm.nih.gov/blast/获得的blast2搜索算法的blastn程序来比较两种多核苷酸序列。可使用所有blast2搜索参数的默认值，包括匹配的奖励＝1，错配的罚分＝-2，开放空位罚分＝5，延伸空位罚分＝2，空位x_dropoff＝50，期望＝10，字长＝11，并且过滤开。

在一个实施方案中，第二和/或第三基因组节段可各自独立地包含具有一个限制性位点或多于一个限制性位点的“多克隆位点”。

在一个实施方案中，第二和/或第三基因组节段可各自独立地包含编码蛋白质诸如抗原的另外的编码区。因此，第二基因组节段包含编码核蛋白的编码区，并且可包含编码抗原的第二编码区。同样地，第三基因组节段包含编码糖蛋白的编码区，并且可包含编码抗原的第二编码区。第二和第三基因组节段可编码相同抗原或不同抗原。在第二基因组节段和第三基因组节段中，此第二编码区可插入存在的限制性位点诸如存在于多克隆位点中的限制性位点中。可存在于第二基因组节段和/或第三基因组节段上的第二编码区不旨在为限制性的。

在一个实施方案中，第二编码区可编码用作可在受试者中引发免疫应答的抗原的蛋白质。实施例1、2和3显示了使用流感核蛋白和流感血凝素作为模型抗原来证实本文公开的反向遗传学系统和病毒的有效性，并且因此抗原的身份不旨在为限制性的。抗原的实例是由原核细胞、真核细胞(包括例如真菌、酵母或原生动物)或病毒编码的全长蛋白质或其片段。在一个实施方案中，蛋白质可以是由病原体诸如病毒病原体、原核病原体或真核病原体天然表达的蛋白质。由原核细胞、真核细胞或病毒编码的抗原性蛋白是本领域技术人员已知的。抗原的另一个实例是经工程化以包含一个或多个表位的蛋白质。在一个实施方案中，蛋白质可以是由肿瘤细胞表达或存在于肿瘤环境中的蛋白质。

抗原可获自的原核病原体的实例包括革兰氏阴性病原体和革兰氏阳性病原体。革兰氏阴性病原体的实例包括肠病原体，诸如肠杆菌科(enterobacteriaceae)的成员，包括作为埃希氏杆菌族(escherichieae)或沙门氏菌族(salmonelleae)成员的肠杆菌科的成员。肠病原体的实例包括肠杆菌科的成员、弧菌科(vibrionaceae)的成员(包括例如霍乱弧菌)和弯曲杆菌属(campylobacterspp.)(包括例如空肠弯曲杆菌(c.jejuni))。肠杆菌科的优选成员的实例包括例如大肠杆菌(e.coli)、志贺氏菌属(shigellaspp.)、沙门氏菌属(salmonellaspp.)、变形杆菌属(proteusspp.)、克雷伯氏菌属(klebsiellaspp.)(例如肺炎克雷伯氏菌(k.pneumoniae))、沙雷氏菌属(serratiaspp.)和耶尔森菌属(yersiniaspp.)。大肠杆菌菌株的实例包括例如大肠杆菌血清型(scrotype)o1a、o2a、o78和o157、不同的o：h血清型(包括0104、0111、026、0113、091)、肠毒性大肠杆菌的溶血菌株(诸如k88+、f4+、f18ab+和f18ac+)和非溶血菌株诸如987p、f41和k99。如本文所用，术语“菌株”是指其中成员具有不同基因型和/或表型的微生物物种的成员。大肠杆菌的其他实例包括在人中引起食物传播和水传播疾病的五种类别的致泻性大肠杆菌：肠病原性(epec)、肠出血性(ehec)、肠毒性(etec)、肠侵袭性(eiec)和肠聚集性(eaec)菌株。其他革兰氏阴性微生物包括巴氏杆菌科(pasteurellaceae)的成员，优选巴氏杆菌属(pasturellaspp.)诸如多杀性巴氏杆菌(p.multocida)和溶血性曼氏杆菌(mannheimiahaemolytica)，以及假单胞菌科(pseudomonadaceae)的成员诸如假单胞菌属(pseudomonasspp.)，包括铜绿假单胞菌。另一些革兰氏阴性微生物包括博代氏菌属(bordetellaspp.)、伯克氏菌属(burkholderiaspp.)、衣原体属(chlamydiaspp.)、肠杆菌属(enterobacterspp.)、螺杆菌属(helobacterspp.)、嗜组织菌属(histophilusspp.)、莫拉氏菌属(moraxellaspp.)、军团杆菌属(legionellaspp.)、钩端螺旋体属(leptospiriaspp.)、立克次氏体属(rickettsiaspp.)、密螺旋体属(treponnemaspp.)、奈瑟氏菌属(neisseriaspp.)、放线杆菌属(actinobacillusspp.)、嗜血杆菌属(haemophilusspp.)、分枝杆菌属(myxcobacteriaspp.)、生孢噬纤维菌属(sporocytophagaspp.)、粒球粘细菌属(chondrococcusspp.)、噬细胞菌属(cytophagaspp.)、屈挠杆菌属(flexibacterspp.)、黄杆菌属(flavobacteriumspp.)、气单胞菌属(aeromonasspp.)。耶尔森氏菌属(yersiniaspp.)的实例包括包括鼠疫耶尔森氏菌(y.pestis)、假结核耶尔森氏菌(y.pseudotuberculosis)和小肠结肠炎耶尔森氏菌(y.enterocolitica)。属于梭杆菌科(fusobacteriaceae)的梭杆菌属(fusobacteriumspp.)的实例包括坏死梭杆菌(f.necrophorum)(包括坏死菌梭杆菌坏死菌亚种(f.necrophorumsubsp.necrophorum)和死菌梭杆菌肠形梭杆菌亚种(f.necrophorumsubsp.funduliforme))、具核梭杆菌(f.nucleatum)、f.canifelinum、微生子梭杆菌(f.gonidiaformans)、死亡梭杆菌(f.mortiferum)、舟形梭杆菌(f.naviforme)、坏疽梭杆菌(f.necrogenes)、拉氏梭杆菌(f.russii)、溃疡梭杆菌(f.ulcerans)和可变梭杆菌(f.variu)。

革兰氏阳性病原体的实例包括微球科(micrococcaceae)的成员，包括葡萄球菌属(staphylococcusspp.)，诸如金黄色葡萄球菌(s.aureus)。其他革兰氏阳性病原体包括异常球菌科(deinococcaceae)的成员，诸如无乳链球菌(streptococcusagalactiae)、乳房链球菌(streptococcusuberis)、牛链球菌(streptococcusbovis)、马链球菌(streptococcusequi)、兽瘟链球菌(streptococcuszooepidemicus)和停乳链球菌(streptococcusdysgalatiae)。抗原可获自的其他革兰氏阳性微生物包括芽孢杆菌属(bacillusspp.)、梭状芽胞杆菌属(clostridiumspp.)、棒状杆菌属(corynebacteriumspp.)、丹毒丝菌属(erysipelothrixspp.)、李氏杆菌属(listeriaspp.)、分枝杆菌属(mycobacteriumspp.)，其他革兰氏阳性病原体包括以下科中的成员：棒状杆菌科(corynebacteriaceae)、肠球菌科(enterococcacae)、微球菌科(micrococcaceae)、分枝杆菌科(mycobacteriaceae)、诺卡氏菌科(nocardiaceae)和消化球菌科(peptococcaceae)，所述科包括此类细菌种，如放线菌属(actinomycesspp.)、双歧杆菌属(bifidobacteriumspp.)、肠球菌属(enterococcusspp.)、真杆菌属(eubacteriumspp.)、盖球菌属(kytococcusspp.)、乳杆菌属(lactobacillusspp.)、微球菌属(micrococcusspp.)、动弯杆菌属(mobiluncusspp.)、分枝杆菌属(mycobacteriaspp.)、消化链球菌属(peptostreptococcus)和丙酸杆菌属(propionibacteriumspp.)、加德纳菌属(gardnerellaspp.)、支原体属(mycoplasma.)、诺卡氏菌属(norcardiaspp.)、链霉菌属(streptomycesspp.)、包柔氏螺旋体属(borreliaspp.)和芽孢杆菌属(bacillusspp.)。

病原性原生动物的实例包括肠原生动物、尿殖原生动物、全身性原生动物和肠外原生动物。具体实例包括但不限于例如溶组织内阿米巴(entamoebahistolytica)、兰伯贾第虫(giardialamblia)、小球隐孢子虫(cryptosporidiumparvum)、贝氏等孢子球虫(cystoisosporabelli)、卡晏环孢子虫(cyclosporacayetanensis)、微孢子虫门(phylummicrosporidia)的成员、阴道毛滴虫(trichomonasvaginalis)、恶性疟原虫(plamodiumfalciparum)、刚地弓形虫(toxoplasmagondii)、球虫亚纲(subclasscoccidiosis)的成员诸如艾美球虫属的成员，包括堆形艾美球虫(e.acervulina.)、毒害艾美球虫(e.necatrix)和柔嫩艾美球虫(e.tenella)、线虫(nematode)、吸虫(trematode)和绦虫(cestode)。

病毒病原体的实例包括但不限于弹状病毒科成员(包括水泡性口炎病毒vsv)、口蹄疫病毒属成员(包括口蹄疫病毒fmdv)、瘟病毒属成员(包括牛病毒性腹泻病毒)、动脉炎病毒属成员(包括猪繁殖呼吸综合征病毒prrsv)、冠状病毒(包括猪流行性腹泻病毒epdv、sars-cov、mers-cov)、环曲病毒属(torovirus)成员(包括马环曲病毒)、正粘病毒科(orthomyxoviridae)成员(包括流感病毒)、呼肠病毒科(reoviridae)成员(包括轮状病毒、蓝舌病病毒、禽呼肠病毒)、圆环病毒科成员、疱疹病毒科成员、逆转录病毒科成员(包括hiv、fiv、siv、alv、blv、rsv)、非洲猪瘟病毒科(asfariridae)成员(包括非洲猪瘟病毒)、黄病毒属成员(包括登革热病毒、黄热病病毒)、副粘病毒科成员(包括新城疫病毒和呼吸道合胞病毒rsv)，以及沙粒病毒属成员(包括lcmv-拉沙病毒(东半球)复合体和塔卡里伯病毒(新大陆)复合体)。沙粒病毒属成员的具体非限制性实例包括淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、皮钦德病毒、拉沙病毒、莫佩亚病毒(mopeiavirrus)、胡宁病毒、瓜纳瑞托病毒(guanaritovirus)、lujo病毒、马秋波病毒(machupovirus)、萨比亚病毒(sabiavirus)和白水河阿罗约病毒(whitewaterarroyovirus)。

在一个实施方案中，由第二编码区编码的蛋白质可来自流感病毒，诸如核蛋白、血凝素或其部分。核蛋白可具有任何亚型，包括但不限于a/pr8np(例如，genbank登录号np_040982.1)。血凝素可具有任何亚型，包括但不限于h1和h3。

由第二编码区编码的蛋白质可以是产生体液免疫应答、细胞介导的免疫应答或其组合的蛋白质。在一个实施方案中，由第二和第三基因组节段的第二编码区编码的蛋白质的长度为至少6个氨基酸。抗原对于表达编码区的细胞可以是异源的。存在于第二和第三基因组节段上并编码抗原的第二编码区的核苷酸序列可由本领域技术人员参考标准遗传密码来容易地确定。存在于第二和第三基因组节段上并编码抗原的第二编码区的核苷酸序列可经修饰以反映将表达抗原的细胞的密码子使用偏好性。将表达皮钦德病毒的几乎所有细胞的使用偏好性是技术人员已知的。

在一个实施方案中，第二编码区可编码用作可检测标志物的蛋白，例如容易由各种方法检测到的分子。实例包括可通过荧光、酶活性或免疫学性质检测到的荧光多肽(例如绿色、黄色、蓝色或红色荧光蛋白)、荧光素酶、氯霉素乙酰转移酶和其他分子(诸如c-myc、flag、6xhis、hisgln(hq)金属结合肽和v5表位)。

当第二和/或第三基因组节段包含编码抗原的编码区时，编码区核苷酸的最大大小通过考虑第二基因组节段和第三基因组节段的总大小来确定。两个基因组节段的总大小可不大于3.4千碱基(kb)、不大于3.5kb、不大于3.6kb、不大于3.7kb、不大于3.8kb、不大于3.9kb、无大于4.0kb、不大于4.1kb、不大于4.2kb、不大于4.3kb、不大于4.4kb或不大于4.5kb。

皮钦德病毒是沙粒病毒，并且沙粒病毒的一个特征是双义基因组。如本文所用，“双义的”是指具有正义和负义部分的基因组节段。例如，本文所述的皮钦德病毒的第一基因组节段是双义的，在正义上编码z蛋白，并且在负义上编码lrdrp蛋白。因此，第一基因组节段的两个编码区中的一个处于正义取向，并且另一个处于负义取向。当第二和/或第三基因组节段包含编码抗原的第二编码区时，与第二基因组节段的np蛋白和第三基因组的糖蛋白相比，编码抗原的编码区处于负义取向。

每个基因组节段还包含编码5’非翻译区(utr)和3’utr的核苷酸。这些utr位于每个基因组节段的末端。用作5’utr和3’utr的核苷酸是存在于皮钦德病毒中并且是技术人员容易获得的那些核苷酸(参见，例如knipe和howley(编)，fieldsvirology.第5版philadelphia，pa：lippincottwilliams&wilkins.第1791-1827页中：buchmeier等，2007，arenaviridae：thevirusesandtheirreplication.)。在一个实施方案中，编码z蛋白和lrdrp蛋白的基因组节段包括5’utr序列和3’utr序列，所述5’utr序列为5’cgcaccggggauccuaggcaucuuugggucacgcuucaaauuuguccaauuugaacccagcucaaguccuggucaaaacuuggg(seqidno：8)，所述3’utr序列为cgcaccgaggauccuaggcauuucuugauc(seqidno：9)。在一个实施方案中，编码np蛋白或糖蛋白的基因组节段包括5’utr序列和3’utr序列，所述5’utr序列为5’cgcaccggggauccuaggcauaccuuggacgcgcauauuacuugaucaaag(seqidno：10)，所述3’utr序列为5’cgcacaguggauccuaggcgauucuagaucacgcuguacguucacuucuucacugacucggaggaagugcaaacaaccccaaa(seqidno：11)。允许这些序列的改变，并且末端27-30个核苷酸在基因组节段之间是高度保守的。

每个基因组节段还包含位于编码z蛋白的编码区与编码lrdrp蛋白的编码区之间的基因间区、位于编码核蛋白的编码区与至少一个第一限制酶位点之间的基因间区和位于编码糖蛋白的编码区与至少一个第二限制酶位点之间的基因间区。用作基因间区的核苷酸是存在于皮钦德病毒中并且是技术人员容易获得的那些核苷酸。在一个实施方案中，编码z蛋白和lrdrp蛋白的基因组节段的igr序列包括5’accagggccccugggcgcaccccccuccgggggugcgcccgggggcccccggccccauggggccgguuguu(seqidno：12)。在一个实施方案中，编码np蛋白或糖蛋白的基因组节段的igr序列包括5’gcccuagccucgacaugggccucgacgucacuccccaauaggggagugacgucgaggccucugaggacuugagcu(seqidno：13)。

在一个实施方案中，每个基因组节段存在于载体中。在一个实施方案中，载体中基因组节段的序列是反基因组的，并且在一个实施方案中，载体中基因组节段的序列是基因组的。如本文所用，“反基因组的”是指在与病毒基因组相反的取向上编码蛋白质的基因组节段。例如，皮钦德病毒是负义rna病毒。然而，每个基因组节段是双义的，在正义和负义取向上编码蛋白质。“反基因组的”是指正义取向，而“基因组的”是指负义取向。

载体是可附接另一多核苷酸以便引起所附接多核苷酸复制的复制型多核苷酸，诸如质粒、噬菌体或粘粒。含有基因组节段的载体的构建和包含插入编码抗原的多核苷酸的基因组节段的构建采用本领域已知的标准连接技术。参见，例如sambrook等，molecularcloning∶alaboratorymanual.，coldspringharborlaboratorypress(1989)或ausubel，r.m.，编currentprotocolsinmolecularbiology(1994)。载体可提供进一步克隆(多核苷酸的扩增)(即克隆载体)或由基因组节段编码的rna的表达(即表达载体)。术语载体包括但不限于质粒载体、病毒载体、粘粒载体或人工染色体载体。通常，载体能够在原核细胞和/或真核细胞中复制。在一个实施方案中，载体在原核细胞中复制，而不在真核细胞中复制。在一个实施方案中，载体是质粒。

载体的选择取决于所得构建体中的多种所需特征，诸如选择标志物、载体复制率等。用于克隆或表达本文载体的合适宿主细胞是原核或真核细胞。

表达载体任选地包括可操作地连接至基因组节段的调控序列。术语“可操作地连接”是指组分的并置，使得它们处于允许它们以它们预期方式发挥作用的关系。调控序列在经连接使得在与调控序列相容的条件下实现基因组节段的表达时“可操作地连接”至基因组节段。一个调控序列是启动子，其充当结合rna聚合酶以启动下游(3′方向)基因组节段的转录的调控信号。所用的启动子可以是组成型或诱导型启动子。本发明不受任何特定启动子的使用限制，并且多种后动子是已知的。在一个实施方案中，使用t7启动子。另一种调控序列是位于基因组节段下游的转录终止子。可使用用于停止在启动子处启动转录的rna聚合酶的转录的任何转录终止子。在一个实施方案中，当后动子是t7后动子时，还使用t7转录终止子。在一个实施方案中，存在核酶以帮助加工rna分子。核酶可在编码基因组节段的序列之后和转录终止子之前存在。核酶的实例是丁型肝炎病毒核酶。丁型肝炎病毒核酶的一个实例是5’agctctcccttagccatccgagtggacgacgtcctccttcggatgcccaggtcggaccgcgaggaggtggagatgccatgccgaccc(seqidno：14)。

存在于载体中的基因组节段的转录产生rna分子。当三种基因组节段中的每一个存在于细胞中时，基因组节段的编码区表达，并且产生含有每个基因组节段的一个拷贝的病毒颗粒。本文所述的反向遗传学系统的三种基因组节段基于皮钦德病毒(具有两个单链双义rna的节段基因组的沙粒病毒)。虽然反向遗传学系统复制和产生感染性病毒的能力通常需要细胞中双义rna的存在，但是本文所述的基因组节段还包含其互补序列(即，互补rna)，和两种rna序列的相应dna序列。

用于转化宿主细胞的多核苷酸任选地包括一个或多个标志物序列，所述一个或多个标志物序列通常编码失活或以其他方式检测或由生长培养基中的化合物检测的分子。例如，包含标志物序列可使转化的细胞耐受抗生素，或者其可在转化细胞上赋予化合物特异性代谢。标志物序列的实例是赋予耐受卡那霉素、氨苄青霉素、氯霉素、四环素和新霉素的序列。

本文还提供了包含本文所述的病毒颗粒或本文所述的三种基因组节段的组合物。此类组合物通常包含药学上可接受的载剂。如本文所用的“药学上可接受的载体”包括与药物施用相容的生理盐水、溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。另外的活性化合物也可掺入组合物中。

本文所述的组合物可被称为疫苗。如本文所用的术语“疫苗”是指在向动物施用时将增加受者对由本文所述的基因组节段中的一种编码的抗原产生免疫应答的可能性的组合物。

组合物可通过药学领域熟知的方法来制备。通常，组合物可配制成与其预期的施用途径相容。施用可以是全身的或局部的。施用途径的实例包括肠胃外(例如静脉内、皮内、皮下、腹膜内、肌内)、肠内(例如口服)和局部(例如表皮、吸入、经粘膜)施用。用于本发明化合物的肠内施用的适当剂型可包括片剂、胶囊剂或液体剂。用于胃肠外施用的适当剂型可包括静脉内施用。用于局部施用的适当剂型可包括鼻喷雾剂、定量剂量吸入器、干粉吸入器或通过雾化。

溶液或悬浮液可包括以下组分：无菌稀释剂，诸如施用用水、生理盐水溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌剂，诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，诸如乙二胺四乙酸；缓冲剂，诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；电解质，诸如钠离子、氯离子、钾离子、钙离子和镁离子，以及用于调节张力的试剂，诸如氯化钠或右旋糖。ph可用酸或碱诸如盐酸或氢氧化钠来调节。组合物可封闭在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。

组合物可包括无菌水溶液(在可溶于水的情况下)或分散液和用于临时制备无菌溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载剂包括生理盐水、抑菌水、磷酸盐缓冲盐水(pbs)等。组合物通常是无菌的，并且在适于可注射使用时应当为达到存在容易注射的程度的流体。所述组合物应该在制造和储存条件下稳定，并且经保存以防诸如细菌和真菌的微生物的污染作用。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如丙三醇、丙二醇和液体聚乙二醇等)以及其合适的混合物的溶剂或分散介质。防止微生物作用可由各种抗细菌及抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞(thimerosal)等)达成。在许多状况下，在组合物中优选包含等张剂，例如糖、多元醇(诸如甘露醇、山梨糖醇)、氯化钠。可通过在组合物中包含延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来使注射组合物的吸收延长。

无菌溶液可通过将活性化合物(即本文所述的病毒颗粒)以所需量与以上列举的成分之一或其组合一起掺入适当溶剂中，随后进行过滤灭菌来制备。通常，分散液通过将活性化合物掺入无菌媒介物中来制备，所述无菌媒介物含有碱性分散介质和任何其他适当成分。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选制备方法包括真空干燥和冷冻干燥，此举产生活性成分加来自其前述无菌溶液的任何另外所需成分的粉末。

口服组合物通常包含惰性稀释剂或可食用载剂。出于口服治疗施用的目的，活性化合物可与赋形剂一起掺入，并以片剂、锭剂或胶囊剂(例如，明胶胶囊)的形式使用。口服组合物还可使用流体载剂来制备以用作漱口水。药学上相容的粘合剂和/或辅助剂材料可包含作为组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等可含有任何以下成分或具有类似性质的化合物：粘合剂，诸如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂，诸如淀粉或乳糖；崩解剂，诸如海藻酸、羟基乙酸淀粉钠(primogel)或玉米淀粉；润滑剂，诸如硬脂酸镁或sterotes；助流剂，诸如胶体二氧化硅；甜味剂，诸如蔗糖或糖精；或调味剂，诸如薄荷、水杨酸甲酯或橙调味剂。

对于通过吸入进行的施用，活性化合物是以气雾剂喷雾形式递送，该气雾剂来自喷涂压料罐或含有适合推进剂(例如，气体，诸如二氧化碳)分配器，或喷雾器。

全身性施用也可通过经粘膜或经皮手段来进行。对于经粘膜或经皮施用，适合于待渗透的屏障的渗透剂用于制剂中。此类渗透剂在本领域中通常是已知的，且例如对于经粘膜施用，包括清洁剂、胆汁盐和梭链孢酸衍生物。可通过使用经鼻喷雾剂或栓剂实现经粘膜施用。对于经皮施用，将活性化合物配制成如本领域中通常已知的软膏剂、油膏剂、凝胶剂或霜剂。

活性化合物可用将保护化合物免于从身体迅速消除的载剂制备，诸如控释制剂，包括植入物。可使用可生物降解、生物相容的聚合物，诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。此类制剂可使用标准技术来制备。脂质体悬浮液也可用作药学上可接受的载剂。这些制剂可根据本领域技术人员已知的方法来制备。

可在配制用于动物的一系列剂量中使用由细胞培养测定和动物研究获得的数据。此类化合物的剂量优选处于包括ed50(在50％群体中治疗上有效的剂量)的循环浓度的范围内，而具有极小或无毒性。剂量可根据所采用的剂型和所利用的施用途径而在此范围内变化。

组合物可施用一次以产生免疫应答，或者作为加强施用额外一次或多次以增强免疫应答，并且增加对抗原的免疫持久的可能性。本领域技术人员应理解，某些因素可影响有效治疗受试者所需的剂量和时程，包括但不限于疾病或病症的严重性、先前治疗、受试者的一般健康状况和/或年龄，以及存在的其他疾病。

本文还提供了用于使用基因组节段的方法。在一个实施方案中，方法包括制造感染性病毒颗粒。这种方法包括但不限于提供包含本文所述的三种基因组节段(第一基因组节段、第二基因组节段和第三基因组节段)中的每个的细胞，并且在适于产生每个基因组节段的全长基因组rna分子的条件下孵育所述细胞。每个基因组节段的全长基因组rna是反基因组的。每个基因组节段的全长基因组rna分子的产生导致每个病毒基因产物的转录和翻译以及病毒基因组的扩增以产生感染性子代病毒颗粒。如本文所用，“感染性病毒颗粒”是指可与合适的真核细胞诸如哺乳动物细胞(例如，鼠细胞或人细胞)或禽细胞相互作用以导致三种基因组节段引入细胞以及三种基因组节段在细胞中转录的病毒颗粒。所述方法还可包括将编码三种基因组节段的载体引入细胞中。将感染性病毒颗粒释放到上清液中，并且可通过在细胞上培养来进一步分离和扩增。所述方法可包括从细胞或细胞和细胞碎片的混合物中分离病毒颗粒。所述方法可包括使用标准方法(诸如过氧化氢处理)来使病毒颗粒失活。还提供了含有本文所述的三种基因组节段的感染性或失活的病毒颗粒。

在一个实施方案中，方法包括在细胞中表达抗原。这种方法包括但不限于将本文所述的三种基因组节段引入细胞中。在一个实施方案中，引入是通过引入感染性或失活的病毒颗粒进行。第二和/或第三基因组节段可包含编码抗原的第二编码区。第二和第三基因组节段可编码相同抗原，或者它们可编码不同抗原。可施用多于一种类型的病毒颗粒。例如，可施用两个病毒颗粒群，其中每个群编码不同的抗原。在此实施方案中，单次施用可导致在细胞中表达多种抗原。细胞是合适的真核细胞，诸如哺乳动物细胞(例如，鼠细胞或人细胞)或禽细胞。在一个实施方案中，禽细胞是鸡胚胎成纤维细胞。细胞可以是离体的或体内的。三种基因组节段可通过使细胞与含有三种基因组节段的感染性病毒颗粒接触或通过将包含基因组节段的载体引入细胞中来引入。所述方法还包括在适于存在于三种基因组节段上的编码区表达的条件下孵育细胞，所述三种基因组节段包含存在于第二和/或第三基因组节段上的一个或两个第二编码区。如本文所用，“离体”是指已从动物体内移除的细胞。离体细胞包括例如原代细胞(例如，最近已从受试者中移除并且能够在组织培养基中进行有限生长的细胞)和培养细胞(例如，能够在组织培养基中进行长期培养的细胞)。“体内”是指处于受试者体内的细胞。

在一个实施方案中，方法包括免疫动物。这种方法包括但不限于向动物施用含有本文所述的三种基因组节段的感染性或失活的病毒颗粒。第二和/或第三基因组节段可包含编码抗原的第二编码区。第二和第三基因组节段可编码相同抗原，或者它们可编码不同抗原。可施用多于一种类型的病毒颗粒。例如，可施用两个病毒颗粒群，其中每个群编码不同的抗原。在此实施方案中，单次施用可导致用多种病原体免疫接种动物。动物可以是需要免疫的任何动物，包括脊椎动物诸如哺乳动物或禽。动物可以是例如禽(包括例如鸡或火鸡)、牛(包括例如家牛(bostaurus)物种的成员)、山羊(caprine)(包括例如山羊(goat))、绵羊(ovine)(包括例如绵羊(sheep))、猪(porcine)(包括例如猪(swine))、野牛(包括例如水牛)、伴侣动物(包括例如猫、狗和马)、鼠科成员(包括例如大鼠或小鼠)、豚鼠或人。在一个实施方案中，动物可以是处于暴露于感染性疾病诸如由病毒、原核或真核病原体引起或与其相关的疾病的风险中的动物。在一个实施方案中，动物可以是需要针对与非感染性疾病诸如癌症相关的抗原的免疫的动物。例如，抗原可以是帮助动物产生靶向和消除癌细胞的免疫应答的抗原。免疫应答可以是体液应答(例如，免疫应答包括响应于抗原产生抗体)、细胞应答(例如激活吞噬细胞、抗原特异性细胞毒性t淋巴细胞，和响应于抗原释放细胞因子)或其组合。

在另一个实施方案中，方法包括治疗动物中某些病状的一种或多种症状。在一个实施方案中，病状由病毒或微生物感染引起。如本文所用，术语“感染”是指受试者体内病毒或微生物的存在和增殖。感染可以是临床不明显的，或导致与由病毒或微生物所引起的疾病相关的症状。感染可以处于早期或处于晚期。在另一个实施方案中，病状由疾病诸如癌症引起。如本文所用，术语“疾病”是指由特征症状或一组症状表现的受试者的部分、器官或系统或其组合的正常结构或功能的任何偏离或中断。所述方法包括向患有病状或病状症状或处于病状或病状症状的风险中的动物施用有效量的本文所述的组合物，以及确定所述病状的至少一种症状是否改变，优选地减少。

与病状相关的症状的治疗可以是预防性的，或者可在病状发展之后启动。如本文所用，术语“症状”是指患有由疾病感染引起的病状的受试者中的客观证据。与本文所提及的病状相关的症状和所述症状的评估在本领域中是常规的和已知的。预防性治疗，例如在受试者表现出病状症状之前启动的治疗，在本文中被称为处于发展所述病状的“风险中”的受试者的治疗。因此，组合物的施用可在本文所述的病状发生之前、期间或之后进行。在病状发展后启动的治疗可导致降低所述病状中的一种的症状的严重性，或完全去除症状。在本发明的这个方面，“有效量”是有效预防病状症状的表现、降低病状症状的严重性和/或完全去除症状的量。

本文还提供了用于免疫动物的试剂盒。试剂盒包括如本文所述的病毒颗粒，其中第二和/或第三基因组节段各自独立地包含在合适的包装材料中以足够用于至少一次免疫的量的编码抗原的编码区。在一个实施方案中，试剂盒可包含多于一种类型的病毒颗粒，例如试剂盒可包含编码一种或两种抗原的一种病毒颗粒和编码一种或两种其他抗原的第二病毒颗粒。任选地，还包含实践本发明所需的其他药剂诸如缓冲液和溶液。通常还包含包装的病毒颗粒的使用说明书。

如本文所用，短语“包装材料”是指用于容纳试剂盒的内容物的一个或多个物理结构。包装材料通过已知方法构建，以优选提供无菌、无污染物的环境。包装材料具有指示病毒颗粒可用于免疫动物的标签。此外，包装材料含有指示如何采用试剂盒内的材料来免疫动物的说明书。如本文所用，术语“包装”是指能够在固定限度内保持病毒颗粒的固体基质或材料，诸如玻璃、塑料、纸、箔等。因此，例如，包装可为用于含有适量病毒颗粒的玻璃小瓶。“使用说明书”通常包括描述病毒颗粒的量、施用途径等的有形表达。

术语“和/或”意指所列要素中的一个或全部或所列要素中的任何两个或更多个的组合。

单词“优选的”和“优选地”是指可在某些情况下提供某些益处的本发明的实施方案。然而，在相同情况下或其他情况下，其他实施方案也可能是优选的。此外，对一个或多个优选实施方案的表述并不暗示其他实施方案是不可用的，且并非旨在将其他实施方案从本发明的范围中排除。

术语“包括”及其变型在这些术语出现在描述和权利要求中时不具有限制性意义。

除非另有说明，否则“一个/一种(a)”，“一个/一种(an)”、“所述”和“至少一个/一种”可互换使用，并且意指一个/一种或多于一个/一种。

另外，在本文中，通过端点列举的数值范围包括归入所述范围内的所有数字(例如，1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等)。

对于包括离散步骤的本文所公开的任何方法，所述步骤可以任何可行的顺序进行。并且，适当时，两个或更多个步骤的任何组合可同时进行。

本发明的以上概述不旨在描述本发明的每个公开的实施方案或每个实施方式。以下描述更具体地例证了说明性实施方案。在整个申请中的几个地方，通过实例列表提供指导，所述实例可以各种组合使用。在每种情况下，所列举的列表仅用作代表性组，并且不应被解释为排他性列表。

本发明通过以下实例来说明。应当理解，特定实例、材料、量和程序是根据如本文所述的本发明的范围和精神来宽泛地解释。

实施例1

携带流感病毒抗原的基于沙粒病毒的疫苗载体赋予小鼠针对致死性流感病毒攻击的长期保护

皮钦德病毒(picv)是已被用作模型病毒来研究病毒性出血热病感染的非病原性沙粒病毒。先前开发了反向遗传学系统以由编码病毒大(l)和小(s)rna节段的两种质粒产生感染性picv病毒(lan等，2009，jvirol83∶6357-6362)。在当前的研究中，创建第二代反向遗传学系统以由被称为三节段picv系统的3种分开的质粒产生重组感染性picv病毒。这些重组病毒携带编码所有病毒基因产物的3种病毒基因组rna节段以及两种外来基因。这种三节段picv系统可用作新型疫苗载体以递送流感病毒a/pr8毒株的血凝(ha)和核蛋白(np)。如通过对病毒感染的高水平ha中和抗体和np特异性细胞毒性t淋巴细胞(ctl)应答所提供的动物存活所证明的，针对致死性流感病毒攻击保护用这些重组病毒免疫的小鼠。这些三节段重组picv病毒不诱导强的抗picv载体免疫，因此使其成为初免-加强免疫(prime-boost)免疫接种策略中的理想候选物，以便诱导交叉反应性免疫。总之，已经开发了可表达多种外来抗原以在体内诱导强体液和细胞介导的免疫以及极少的抗载体免疫的新型活疫苗载体。

引言

我们已经开发了唯一可用的反向遗传学系统，以由质粒转染到适当的哺乳动物细胞中产生感染性picv病毒(lan等，2009，jvirol83∶6357-6362)。此系统由2种质粒组成，以分别由工程化噬菌体t7调控(后动子/终止子)信号和位于picv基因组序列上游和下游的丁型肝炎核酶序列产生全长基因组l和srna。当转染到组成性地表达噬菌体t7rna聚合酶(bsrt7-5，又称bhk-t7)的幼仓鼠肾上皮细胞中时，产生picv的l和srna节段，从中所有picv病毒基因产物(包括l聚合酶和np核蛋白)被转录和翻译，以便扩增病毒基因组并产生感染性子代病毒颗粒。将感染性picv病毒释放到上清液中，并且通过在非洲绿猴上皮(vero)细胞上培养来进一步分离和扩增。

如本文所述，已经开发了第二代反向遗传学系统以由被称为三节段picv系统的3种分开的质粒产生重组感染性picv病毒。这些重组病毒携带编码所有病毒基因产物的3种病毒基因组rna节段以及两种外来基因。这种三节段picv系统可用作新型疫苗载体以递送其他病毒抗原，诸如流感病毒的那些抗原。简略概述，已经产生了表达流感病毒a/pr8毒株的血凝(ha)或核蛋白(np)的三节段picv病毒，并且这些三节段picv疫苗载体可诱导强体液和细胞介导的免疫，诸如具有极少抗picv载体免疫的免疫接种小鼠中流感特异性中和抗体和强流感特异性细胞毒性t淋巴细胞(ctl)应答的强健产生，这使得它们成为初免-加强免疫免疫接种策略的理想候选物，以便诱导持久和交叉反应性免疫。因此，我们已开发的本文所述的这种新型基于picv的疫苗载体系统满足理想病毒载体的所有所需标准，诸如安全性、强和持久的细胞和体液免疫应答的诱导、无预先存在的免疫以及抗载体免疫缺乏。

材料和方法

构建编码多克隆位点(mcs)替代gpc或np基因的工程化皮钦德病毒p18srna节段的质粒。

先前通过将在抗基因组(ag)意义上编码l和srna节段的2种质粒转染到bhk-t7细胞中来开发用于picv的反向遗传学系统(图1)(lan等，2009，jvirol83：6357-6362)。重叠聚合酶链反应(pcr)方法用于在编码sagrna的质粒中用多克隆位点(mcs)替代病毒糖蛋白(gpc)或核蛋白(np)基因的开放阅读框(orf)。所得质粒(图2a)、p18s-gpc/mcs和p18s-mcs/np含有具有限制酶序列(nhei-mfei-acc65i-kpni-ecorv-xhoi-sphi)的mcs，所述限制酶序列引入这些质粒中以便于克隆外来基因(例如报道基因和/或病毒抗原)。

将gfp报道基因、流感ha或np基因亚克隆到p18s-gpc/mcs载体中。pcr用于在nhei与xhoi位点之间将绿色荧光蛋白(gfp)报道基因和来自a/pr8(h1n1)毒株的流感ha或np基因分别亚克隆到载体p18s-gfp/mcs中。a/pr8血凝素的氨基酸序列可以genbank登录号nc_002017.1找到，并且a/pr8核蛋白的氨基酸序列可以genbank登录号nc_002019.1找到。通过dna测序确认重组质粒构建体。所得质粒(图5)分别被称为p18s-gpc/gfp、p18s-gpc/h1和p18s-gpc/np。

表达gfp、流感ha或np的重组三节段皮钦德病毒的恢复。

通过用表达全长p18lagrna节段、mcs代替gpc的p18s节段(p18s-mcs/np)和gfp、ha或np基因代替np的p18s节段(p18s-gpc/gfp、p18s-gpc/n1或p18s-gpc/np)的3种质粒转染bsrt7-5(又称bhk-t7)细胞来由质粒恢复重组病毒(图2b和图5)。产生重组picv的程序基本上与先前所述的相同(图1b)(lan等，2009，jvirol83∶6357-6362)。简言之，使bhk-t7细胞生长至80％汇合，并且在转染前4小时将所述细胞洗涤并用无抗生素培养基孵育。对于转染，将2ug的每种质粒在250ul的opti-mem中稀释，并在室温下孵育15分钟。添加具有10ul脂质体(invitrogen，lifetechnologies)的等体积opti-mem，并将混合物在室温下孵育20分钟。孵育后，用质粒转染细胞，并且4小时后再次更换培养基以移除脂质体。转染48小时后，收集细胞上清液以进行噬菌斑测定。由单独噬菌斑生长的病毒用于制备在bhk-21细胞上生长的原种，并且在-80c下储存。

用重组三节段picv载体感染的细胞中流感抗原表达的检测。

用野生型皮钦德病毒(picv)或表达流感ha(rpicv-ha)或np基因(rpicv-np)的重组picv病毒感染在盖玻片上生长的bhk-21细胞。在病毒感染24小时后，将细胞在室温下用4％多聚甲醛固定15分钟，随后用磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗涤3次。然后将细胞在0.1％tritonx-100中孵育12分钟，随后用第一抗体(小鼠抗np流感a)孵育1小时。然后将细胞洗涤，并在室温下用第二抗体(抗小鼠alexaflour-647)孵育1小时。

小鼠免疫和攻击。

六至八周龄的雌性c57bl/6小鼠获自charlesriverlaboratories，并饲养至少1周以驯化。将小鼠饲养在bsl-2配备的动物设施中的微隔离笼中。通过腹膜内途径用100ul总体积中的100,000pfu的rpicv病毒注射小鼠。在最后加强14天后，用10ld50(10,000pfu)小鼠适应的流感a/pr8毒株以鼻内方式攻击小鼠。

通过四聚体染色分析病毒特异性ctl。

获得单细胞脾细胞，并使用ack裂解缓冲液裂解红细胞(rbc)。然后用facs缓冲液(pbs+2％fbs)将脾细胞洗涤两次。在室温下用具有np366-374表位asnenmetm(seqidno：7)的cd8-percp-cy5.5、cd3-apc和h-2db-pe四聚体将细胞(1x10⁵个)染色1小时。孵育后，用facs缓冲液将细胞洗涤三次，并通过流式细胞术分析标记的细胞。使用flojo软件分析facs数据。

血凝抑制测定。

在每次免疫14天后收集血液，并且收获血清。通过用5体积的受体破坏酶(sigma)进行过夜处理来从血清中去除非特异性抑制剂，随后在56℃下孵育45min以使酶和血清失活。然后将每个血清样品在25ul的pbs中连续稀释，然后与含有4个ha单位的a/pr8的等体积pbs混合。在室温下孵育15min后，添加50ul的0.5％火鸡rbc，并且将混合物在4c下孵育1小时，之后进行凝集评估。将滴度记录为抑制凝集的最后稀释度的倒数。

肺中病毒滴度的测定。

为评估流感a/pr8在小鼠中的复制，将肺在攻击后第6天收集、称重并在l15培养基中匀化。将组织匀浆在10,000rpm下离心10min，并在12孔板中在madin-darby犬肾(mdck)细胞的单层上滴定病毒。

结果

1.表达gfp报道基因的重组三节段皮钦德病毒的产生。

首先由delatorre组报道了用于lcmv的三节段沙粒病毒系统(emonet等，2009，procnatlacadsciusa106∶3473-3478)，所述三节段沙粒病毒系统已产生包装3种rna节段、一种全长l节段和在gpc或np中具有缺失的两种s节段的感染性重组lcmv。我们先前已经开发了用于皮钦德病毒(picv)的反向遗传学系统(lan等，2009，jvirol83∶6357-6362)，所述皮钦德病毒是在人中非病原性的原型沙粒病毒。此系统由2种质粒组成，所述2种质粒在它们被转染至bsrt7-5(又称bhkt7)细胞中时表达picv的l和s节段(图1)。

在当前的研究中，已经产生了由3种质粒组成的第二代picv反向遗传系统，所述3种质粒产生两种不同srna节段，一种在gpc中携带缺失，并且另一种s节段含有np基因的缺失(图2)。代替缺失的病毒基因，我们已插入了多克隆位点(mcs)(图2a)。然后我们使用mcs内的nhei/kpni位点将gfp报道基因在缺失的gpc位置处亚克隆到p18s2节段中，并由用三种质粒转染的bsrt7-5细胞的上清液产生感染性病毒，一种质粒在全长p18l节段上编码病毒z和l基因，并且另两种s1和s2质粒(即p18s1-mcs和p18s2-gfp)表达单独的病毒gpc基因，或np和gfp报道基因两者(图2b)。由噬菌斑纯化的病毒制备原种病毒。所有噬菌斑在荧光显微术下均显现绿色，证实rp18tri-gfp病毒的成功恢复。除了vero细胞(数据未示出)之外，rp18tri-gfp病毒感染在其他允许细胞诸如bhk-21和a549(图3)中表达gfp，并且释放在感染bhk-21靶细胞(图3)的新鲜培养物时表达gfp的更多感染性子代病毒，证实了rp18tri-gfp病毒在细胞培养物中的稳定性和完整性。时间过程研究证实gfp在感染后12h强烈表达，并且rp18tri-gfp的完整生命周期为约16h，因为上清液中rp18tri-gfp病毒的浓度在约16hpi时急剧增加(图4)。在初步实验中，发现picv-tri-gfp病毒载体可在细胞培养物中感染鸡胚胎成纤维细胞(cef细胞系)(数据未示出)。

通过以0.01的复合感染(moi)对bhk-21细胞进行rp2、rp18和rp18tri-gfp的生长曲线分析来比较二节段和三节段picv的病毒生长。正如所料，与rp2相此，已知的强毒rp18病毒生长稍微更快，并且病毒滴度好于约0.5log。虽然在约1至1.5log降低的病毒滴度下，但是三节段rp18tri-gfp病毒与rp2和rp18病毒以相似的动力学生长(图4)。总之，与二节段rp2和rp18picv病毒相比，三节段picv病毒的生长率和滴度似乎延缓。

为了确定rp18tri-gfp病毒的稳定性，即测试rp18tri-gfp病毒的体外培养是否将选择由于基因组重组而失去了gfp基因的二节段野生型病毒回复体，使rp18tri-gfp在bhk-21细胞培养中连续传代，并在各种传代处进行噬菌斑测定以检查每个噬菌斑中的gfp表达。在任何测试的传代(高达23代)中，所有噬菌斑仍表达强的gfp报道基因水平，表明即使在细胞培养物中进行大量传代后，gfp报道基因也可稳定地维持在感染性病毒颗粒中。

2.表达流感病毒抗原的重组三节段皮钦德病毒的产生。

将流感病毒a/pr8/h1n1毒株的ha和np基因分别分子克隆到p18s2质粒的msc中(图5)。将所得p18s2-ha和p18s2-np分别连同全长p18l和p18s1-gfp一起转染到bhk-t7细胞中，以便分别产生rp18tri-gfp/ha和rp18tri-gfp/np病毒。

因为重组病毒在p18s2-gfp节段上携带gfp报道基因，所有感染的细胞(即噬菌斑)在荧光显微术下均为绿色的(图6)。此外，在感染后24小时(hpi)时，在vero细胞中通过免疫荧光测定使用特异性抗ha和抗np抗体检测ha和np蛋白表达(图6)。总之，我们已经显示，可在细胞感染时使三节段病毒表达不同的外来基因，包括gfp报道基因和两种不同的流感病毒抗原(ha和np)。

3.基于rp18tri的流感疫苗在小鼠中诱导保护性免疫。

我们实验室先前的工作证实，通过不同途径即使在高剂量下用picv进行的小鼠感染也不引起疾病，因为picv在感染后4天(dpi)时清除(数据未示出)。此处，我们检查了基于rp18tri的疫苗载体是否可在小鼠中诱导保护性免疫。将c57bl6小鼠模拟感染或以鼻内方式(i.n.)用低剂量(50pfu)的a/pr8或通过i.p.途径分别用1x10⁵pfu的rp18tri-gfp、rp18tri-gfp/ha和rp18tri-gfp/np病毒感染。在第14和28天，在相同剂量下用相同病毒对小鼠进行加强免疫两次。在初免后和加强免疫后的不同时间点时收集血液样品以进行中和抗体滴度测定。在第2次加强免疫后14天时，用已知致死剂量的a/pr8(10xmld50)攻击小鼠，并监测体重和疾病症状持续多达21天。先前已接受pbs或rp18tri-gfp免疫接种的所有受攻击的动物在7dpi时达到终点，而用rp18tri-gfp/ha免疫接种的所有小鼠被完全保护免于致死性流感病毒感染。用rp18tri-gfp/np免疫接种的三只小鼠中的两只存活(图7)。对于rp18tri-gfp/ha免疫接种，攻击的小鼠维持体重，而rp18tri-gfp/np组中的两个存活者在早期显示轻微的体重损失，但快速恢复(数据现在示出)。与死亡率数据一致，与单独使用pbs或载体的那些小鼠相比，用ha或np免疫接种的小鼠在3dpi时在肺中具有最小的病理变化。类似地，3dpi时肺中的病毒滴度也与保护有关。当单独用模拟物或rp18tri-gfp载体免疫接种动物时，a/pr8病毒在3dpi时在小鼠肺中复制至高水平。相比之下，病毒滴度未在rp18tri-gfp/ha免疫接种组中检测到，并且在rp18tri-gfp/np组中显著降低。

总之，这些结果表明基于rp18tri的疫苗载体可在小鼠中诱导免于致死性流感病毒感染的保护性免疫。与先前流感疫苗研究一致，ha免疫接种可诱导免于流感病毒诱导的疾病的完全保护，而np免疫接种通常通过降低疾病严重性和控制体内病毒复制来产生部分保护。

4.rp18tri-gfp/ha疫苗在小鼠中诱导高中和抗体滴度。

在以下时间点时从免疫接种的小鼠中收集的外周血中测量血凝抑制(hai)滴度：初免后14天、第1次加强免疫后7天和14天，以及第2次加强免疫后14天(图8)。正如所料，rp18tri-gfp和rp18tri-gfp/np组的hai滴度未超过本底水平，因为预期gfp和np均不会诱导ha特异性中和抗体。相比之下，rp18tri-gfp/ha免疫接种组的hai滴度在初免后14天时达到的水平为40，并且在加强免疫后显著增加(图8)，表明rp18tri-gfp/ha疫苗可在体内诱导高水平的中和抗体滴度。作为阈值，>＝40的hai滴度通常用作成功的量度，即，使流感风险(血清保护性滴度)降低50％(reber等，2013，expertrevvaccines12∶519-536)，hai数据表明单剂量的rp18tri-gfp/ha可足以赋予保护。

比较了由不同免疫接种途径产生的hai滴度(图9)。将小鼠通过腹膜内(i.p.)、肌内(i.m.)或鼻内(i.n.)途径，通过一次初免和一次加强免疫用rp18tri-gfp/ha免疫接种。如通过相对高的总体hai滴度所证实的，所有三种免疫途径均引发显著水平的体液应答。然而，似乎i.m和i.p注射途径的血清中的hai滴度相对高于i.n.组的那些hai滴度。无论如何，这些hai滴度足够高以赋予针对用pr8流感病毒进行的致死性攻击的完全保护。如图10所示，在免疫接种的动物中未观察到显著的重量损失。

5.rp18tri-gfp/np疫苗在小鼠中诱导强ctl应答。

np是细胞内病毒蛋白，并且已知诱导针对它的cd8+t细胞应答。通过在以腹膜内方式用rp18tri-gfp/np进行初免和加强免疫后的不同时间点时进行脾细胞和pbmc的np特异性四聚体分析来检查rp18tri-gfp/np疫苗是否能诱导ctl应答。如图11(上图)所示，在即使初免后7天时的rp18tri-gfp/np免疫接种组中，检测到可与pr8感染的低剂量比较的(如果不是更高)水平的np特异性cd8+和cd44+t细胞，所述水平在加强免疫后7天时进一步增加，并且在加强免疫后14天时仍然存在(图11中间图)。我们还探索了不同接种途径对ctl应答的影响。如图12所示，与i.n.感染途径相比，i.m.和i.p.接种途径诱导更强的ctl应答。总的来说，我们的数据证实基于rp18tri的载体可在体内诱导强ctl应答，并且在诱导强ctl应答方面，肌内和腹膜内途径好于鼻内途径。因为i.m途径引发最佳体液和t细胞应答，在i.m免疫途径之后进行随后实验。

6.基于rp18tri的疫苗能触发持久免疫？

评估了rp18tri-gfp/ha疫苗载体诱导持久免疫的潜力。将c57bl6小鼠以4周的间隔免疫两次，并在用致死剂量的a/pr/8(h1n1)病毒进行第二次免疫后4或8周攻击。用于在初免后第14天和第30天以及加强免疫后第30天和第60天的分析hai滴度的血清样品证实了强中和抗体滴度(图13a)。攻击的病毒a/pr/8在模拟免疫接种的小鼠的肺中良好复制，而在免疫接种4周后攻击的免疫接种小鼠的肺中不存在可检测的病毒滴度。然而，在免疫接种8周后攻击的免疫小鼠的肺中存在显著较小的病毒滴度(图13b)。如图13c所示，观察到完全保护，因为在免疫接种4周或8周后攻击的rp18tri-gfp/ha免疫的小鼠中不存在显著的重量损失。一致地，在免疫小鼠的肺中不存在显著的病理变化(图13d)。总之，免疫和保护的水平与在免疫后2周时看到的那些水平相当。

用rp18tri-gfp/ha进行的单次免疫诱导针对致死性h1n1攻击的保护

通过肌内途径用rp18trigfp-ha免疫c57bl6小鼠。显著地，单剂量的rp18tri-gfp/ha诱导针对用小鼠适应的a/pr/8(h1n1)病毒进行的致死感染的完全保护。如图14b所示，rp18tri-gfp免疫接种的对照小鼠在攻击后继续损失重量，直到它们需要安乐死。结果还证实用最小剂量为10³pfu的rp18tri-gfp/ha载体进行的单次免疫引发强健的血凝抑制(hi)ab应答，并且足以赋予保护(图14a)。攻击后5-6天进行的肺切片的组织学分析揭示用rp18tri-gfp/ha免疫接种的小鼠的炎症显著减少，而用rp18tri-gfp免疫接种的小鼠显示出炎性细胞至肺中的大量浸润、肺淤血和肺泡内水肿(图14c)。

表达双重流感病毒蛋白抗原的基于rp18tri的病毒的产生和表征

为获得表达流感ha和np或者ha1和ha3的基于rp18tri的载体，将编码相应流感病毒基因的dna相应地插入质粒载体p18s-gpc/mcs和p18s-mcs/np中。克隆rt-pcr扩增的ha1、np和ha3，并对每种克隆进行序列验证。将所得质粒命名为p18s-gpc/ha1、p18s-np1/np和p18s-ha3/np。然后通过共转染表达全长p18lagrna节段、p18s-gpc/ha1和p18s-np1/np的3种质粒来挽救表达双重抗原(流感ha1和np1)的重组病毒。同时，还通过共转染全长p18lagrna节段、p18s-gpc/np1和p18s-ha1/np来产生具有交换的流感基因的类似3节段重组病毒。类似地，通过共转染表达全长p18lagrna节段、p18s-gpc/ha1和p18s-ha3/np的3种质粒来挽救表达双重抗原(流感ha1和ha3)的重组病毒。

有趣的是，rp18tri-ha/np比rp18tri-np/ha具有更低的滴度，并在vero细胞中形成更小的噬菌斑(图15a)。然而，与rp18tri-np/ha相比，rp18tri-ha/np中流感病毒蛋白抗原的表达水平更高(图15b)。

编码多种流感病毒蛋白抗原(ha和np)的基于rp18tri的载体在免疫的小鼠中诱导体液和t细胞应答。

编码流感病毒ha和np的基于rp18tri的载体在用10⁴pfu/ml的rp18tri-ha/np或rp18tri-np/ha载体免疫的小鼠中成功诱导强力的体液和t细胞应答。使用小鼠的外周血和脾用i类mhc四聚体来监测免疫显性np336表位的t细胞应答水平。在免疫小鼠的外周血和脾细胞中检测到抗np特异性cd8+t细胞。在免疫后第7天，小鼠具有显著更大百分比的np特异性t细胞(图16a)。四聚体阳性cd8+t细胞在加强免疫7天后达到峰值，并维持在静止水平直至加强免疫后14天(图16b)。这两个候选疫苗均还引发强体液应答，所述强体液应答由初免后14天和加强免疫后14天时收集的血清中血凝抑制滴度评估。hi滴度在用rp18tri-ha/np免疫的小鼠中在加强免疫后增加，而在用rp18tri-np/ha免疫的小鼠中未观察到此类提升(图16c)。

总之，与rp18tri-np/ha疫苗相比，rtrip18-ha/np疫苗引发更强的免疫应答。rp18tri-ha/np的更好免疫应答水平可归因于流感病毒抗原的更高表达水平(图15b)。然而，载体疫苗rp18tri-ha/np和rp18tri-np/ha均赋予针对a/pr/8流感病毒的致死攻击的完全保护。在免疫的小鼠中未观察到疾病症状。如图17a所示，在用任一疫苗候选物免疫的小鼠的肺中未可检测到显著的组织学变化。相比之下，在用rp18tri-gfp免疫接种的小鼠的肺中观察到炎性细胞的浸润。在感染后第3天和第6天时分析肺中的病毒滴度以确定攻击的病毒的复制。模拟免疫接种的小鼠显示出高病毒滴度，而用rp18tri-ha/np和rp18tri-np/ha免疫接种的小鼠在第6天时未显示可检测的滴度，并且各组中三只小鼠中的一只在感染后第3天分别显示出3x10³pfu/ml和5x10³pfu/ml的滴度(图17b)。用任一疫苗候选物免疫接种的小鼠未显示出重量损失(图17c)。

编码多种流感抗原(ha1和ha3)的基于rp18tri的载体诱导针对双重攻击的保护

用两种剂量的仅编码h1亚型病毒的ha(rp18tri-ha1)或h3亚型的ha(rp18tri-ha3)或h1亚型的ha和h3亚型的ha两者(rp18tri-ha1/ha3)的基于rtrip18的载体疫苗免疫不同组的c57bl6雌性小鼠。结果指示，如通过针对pr8和x31的强健hi滴度所揭示的，第一剂量的编码ha1和ha3的基于rtrip18的载体诱导对编码的流感病毒抗原的抗体应答。第二剂量的疫苗还加强抗体应答。有趣的是，由编码ha1和ha3的rp18tri诱导的针对pr8(h1)和x31(h3)的hi滴度与由仅编码ha1或ha3的基于rtrip18的载体诱导的hi滴度相当(图18a)。在balb/c小鼠中获得了相似的结果(图18b)。在用致死剂量的pr8(h1n1)或x31(h3n2)病毒攻击时，针对两种病毒攻击保护用编码ha1和ha3(rp18tri-ha1/ha3)的基于rp18tri的载体免疫的小鼠。在病毒攻击后第5天时评估rp18tri-ha1/ha3在预防攻击的病毒的复制中的保护功效。攻击的病毒pr8(h1n1)和x31(h3n2)在模拟免疫接种的小鼠的肺中良好复制，平均滴度分别为10⁵pfu/ml和10⁴pfu/ml。用rp18tri-ha1/ha3进行的免疫保护小鼠免于两种病毒攻击，因为不存在体重损失，并且免疫的小鼠在肺中均没有任何可检测的病毒滴度(图19a和19b)。

基于rp18tri的流感疫苗未诱导抗载体免疫。

感知的活病毒载体弱点是抗载体免疫，所述抗载体免疫损害由相同载体诱导的免疫应答，并排除其在初免-加强免疫接种策略中的使用。picv在一般群体中具有极少至无预先存在的免疫(trapido等，1971，amjtropmedhyg20∶631-641)。我们通过测量用相同载体进行的初免-加强免疫的抗体和ctl应答水平来确定针对picv载体的抗载体免疫的作用。令人惊讶的是，我们未发现针对rpicvtri载体的抗载体免疫的证据。如图8所示，用相同载体进行的加强免疫还显著增加hai滴度，表明ha特异性体液应答在第2次和甚至第3次加强免疫之后增加。对于ctl应答，观察到类似的发现。脾和pbmc中的np特异性cd8和cd44t细胞在加强免疫之后增加(图20)。总之，我们的数据表明rpicv载体不诱导强抗载体免疫，并且因此可重复用于初免-加强免疫疫苗策略中。

概述

已经开发了新型picv反向遗传系统以产生可编码多达两个外来目标基因的三节段重组picv病毒。这些基于rp18tri的重组病毒可在靶细胞中表达流感ha和/或np基因以及gfp报道基因。当在小鼠中测试时，rp18tri-gfp/ha病毒可诱导高水平的ha特异性中和抗体，而rp18tri-gfp/np病毒可诱导强np特异性ctl应答。此外，表达双重流感病毒抗原ha和np的基于rp18tri的载体成功地诱导体液和t细胞应答，所述体液和t细胞应答在免疫小鼠中赋予针对用a/pr8进行的致死攻击的完全保护。更重要的是，表达两种不同流感病毒亚型(即pr8(h1n1)和x31(h3n2))的ha的基于trip18的载体赋予针对两种病毒攻击的保护，证实这些新型疫苗载体针对病原性流感病毒的威力(prowess)和多功能性(versatility)。同样重要的是注意，不存在针对picv载体的预先存在的免疫，并且用三节段picv病毒免疫的动物极少产生抗picv载体免疫，使得其成为用于在需要初免-加强免疫接种策略的情况下在重复免疫接种时诱导强力、持久和交叉反应性免疫的理想载体疫苗平台。

实施例2

np核糖核酸外切酶在体外和体内沙粒病毒感染中的生物学作用

沙粒病毒nprna酶活性对于i型干扰素(ifn)抑制是重要的，但其生物学作用尚未被良好表征。具有rna酶催化突变的重组皮钦德病毒诱导高水平的ifn，并且在具有ifn产生能力的细胞中生长不良，并在感染豚鼠时刺激强ifn应答，未能生产性地复制，并产生野生型回复体。因此，nprna酶活性对于ifn抑制和在沙粒病毒感染早期建立生产性复制是必要的。

沙粒病毒包括具有有限预防或治疗措施的几种引起出血热(hf)的试剂(例如，拉沙病毒--lasv)(mclay等，2013，antiviralres97∶81-92、mclay等，2014，jgenvirol95：1-15)。沙粒病毒发病机理与高病毒血症和广义免疫抑制相关，所述高病毒血症和广义免疫抑制的机制了解甚少。已经显示，病毒np可通过其核糖核酸外切酶(rna酶)功能有效地介导i型ifn抑制(jiang等，2013，jbiolchem288∶16949-16959，martinez-sobrido等，2007，jvirol81∶12696-12703，martinez-sobrido等，2006，jvirol80∶9192-9199，qi等，2010，nature468：779-783，hastie等，2011，procnatlacadsciusa108∶2396-2401，hastie等，2012，plosone7：e44211)。然而，nprna酶活性在体内介导宿主免疫抑制中的作用尚未被良好表征。在此研究中，豚鼠的皮钦德病毒(picv)感染用作沙粒病毒出血热(hf)的替代模型(aronson等，1994，amjpathol145∶228-235，lan等，2009，jvirol83∶6357-6362)，以表征nprna酶在病毒感染和宿主ifn应答中的作用。每个rna酶催化残基(d380a、e382a、d525a、h520a和d457a)处的单个丙氨酸取代可通过荧光素酶(luc)报道测定消除np抑制仙台病毒诱导的ifnβ活化的能力(图21a)，确证我们先前用lasvnp进行的观察(qi等，2010，nature468∶779-783)。使用我们开发的rp18picv反向遗传学系统(lan等，2009，jvirol83∶6357-6362)，我们成功产生了携带单独rna酶突变的重组病毒，所述单独rna酶突变通过测序确认。将5种rna酶突变体连同引起豚鼠强毒感染的wtrp18和引起无毒感染的picvrp2一起用于以moi＝1感染人气道上皮a549细胞。通过rndv-gfp生物测定(park等，2003，jvirol77：1501-1511)定量12hpi和24hpi时的i型ifn产生。如通过高的gfp表达水平所证实的，类似于模拟感染，rp2和rp18都产生低的ifn水平(图21b)。这并不令人惊讶，因为两种毒株的np蛋白都编码功能性rna酶结构域，并且它们抑制ifn产生的能力似乎没有差异(lan等，2008，archvirol153：1241-1250)。相比之下，如由大大减少的gfp表达所示，rna酶突变体产生显著更多的ifn(图21b)。因此，在病毒感染的细胞中有效抑制i型ifn需要nprna酶活性。

在ifn缺陷型vero细胞和具有ifn产生能力的a549细胞中以moi＝0.01测定病毒生长动力学。所有5种突变体在vero细胞中良好复制，在48hpi时达到10⁶pfu/ml，虽然比wtrp18低约0.5-1log(图22a，左图)。与之形成鲜明对比的是，这些rna酶突变病毒在a549细胞中几乎不生长(图22a，右图)。与关于lasv双突变体(d389a/g392a)的最近公布的数据一致，我们的研究结果表明nprna酶活性对于基本的病毒生命周期不是必要的，但是具有ifn产生能力的细胞中的生产性病毒复制所需的(carnec等，2011，jvirol85∶12093-12097)。

为了比较体内病毒毒力，如先前所述，我们用1x10⁴pfu的每种病毒以腹膜内方式感染6只hartley远交系豚鼠(lan等，2009，jvirol83∶6357-6362，kumar等，2012，virology433∶97-103，mclay等，2013，jvirol87∶6635-6643)。所有程序均由明尼苏达大学的机构动物护理和使用委员会(institutionalanimalcareandusecommittee，iacuc)批准。每日监测动物的体重和疾病体征持续18天，并且在它们达到预定终点(濒死)时(诸如，与诺模图相比超过30％的重量损失或低于38℃的直肠温度以及继续的重量损失)进行安乐死。正如所料，所有rp2感染的动物均存活并清除病毒，而rp18感染的动物发展了早期发热发作，在7dpi时开始显示显著降低的体重，并到13dpi时达到终点(图22b)。rna酶突变病毒引起可变的疾病结果(图22b和表1)。所有e382a突变病毒感染的动物存活而没有任何体重损失的证据，而用3种其他突变病毒(d525a、h520a和d457a)中的每一种感染的动物显示不同的减毒作用(图22b)。然而，大多数d380a感染的动物死于感染，尽管在晚于rp18的时间点。为确定是否发生wt回复体，我们测量了终点时的病毒血症水平并对病毒进行测序(表1)。正如所料，濒死动物与高病毒血症相关，而所有存活的那些动物具有极低至不可检测的病毒感染水平。无例外地，从突变体感染的动物分离的病毒已经回复到wtnp序列(表1)。这非常不可能归因于pcr污染或测序错误，因为同时进行的从突变病毒感染的其他动物分离的病毒仍含有预期的突变(数据未示出)。因此，我们认为疾病表型是由wt病毒(包括wt回复体)引起的，并且疾病严重性由体内回复发生多快而确定(发现几个存活的动物在第18天时携带低水平的wt病毒)。我们的结果强烈表明nprna酶活性在体内沙粒病毒感染中的必要作用。

表1.用相应重组picv感染的豚鼠。

¹，当动物达到终点时或在感染后第18天时，在安乐死时收集的血液中的病毒滴度。

²，当动物达到终点时或在感染后第18天时，在安乐死时从动物分离的病毒的序列。

³，在感染后第18天时，rp2感染组中的所有6只动物均存活，而没有可检测的病毒血症。

⁴，nd，未可通过噬菌斑测定检测

为检查rna酶在受感染动物中的早期病毒感染和宿主先天免疫应答中的作用，我们在1dpi和3dpi时监测病毒播散并且定量先天抗病毒基因。在第1天时，在rp18感染的动物的肝和脾中以及在用rp2和rna酶突变病毒感染的一些动物的肝中检测到低水平的病毒(图23a)。在第3天时，rp18和rp2在肝和脾中均复制到相对高的水平。相比之下，rna酶突变病毒似乎从肝中清除，并且仅在几个脾中检测到处于极低水平(图23a)，在第1天时通过qrt-pcr定量腹膜腔细胞中的代表性先天免疫应答基因ifn-α1、ifn-β1、isg15、irf7、rig-i和mda5(图23b)。这些基因被rna酶突变病毒高度活化，但不被wt病毒(rp2和rp18)高度活化，证实nprna酶是体内沙粒病毒诱导的先天免疫抑制所需的。

总之，我们用重组picvrna酶突变体进行的研究不仅确认nprna酶在i型ifn抑制和体外病毒复制的重要作用，而且还提供了其在早期先天免疫抑制中的重要作用的明确证据，以允许建立体内生产性感染。考虑到nprna酶依赖性ifn抑制机制在沙粒病毒中是保守的(jiang等，2013，jbiolchem288∶16949-16959)，我们的结果可外推到其他沙粒病毒病原体，并且涉及nprna酶作为用于抗病毒开发的理想靶标。

实施例3

基于沙粒病毒的疫苗载体递送两种抗原并赋予每种抗原免疫

1.表达双重流感抗原ha和np的rp18tri活疫苗载体的产生

实施例1公开了具有复制能力的三节段rpicv系统(rp18tri)，以及使用此rp18tri载体来表达流感ha(缩写为h)或np抗原(p)，证实载体可在小鼠中诱导强抗体和ctl应答。为确定单个rp18tri病毒体颗粒是否可用于递送ha和np基因，分别产生s1和s2病毒基因组rna节段以编码流感ha和np基因。通过在转染反应中使用不同的质粒组合，我们已成功地产生了活疫苗载体rp18tri-p/h和rp18tri-h/p，如图24a所示，所述活疫苗载体在不同的s节段上编码ha和np基因。作为对照载体，还产生在s1和s2节段上编码egfp报道基因的rp18tri载体-rp18tri-g/g。为检查抗原表达，分别用rp18tri-g/g、rp18tri-p/h和rp18tri-h/p感染vero细胞。在24hpi时，通过ifa分别使用小鼠抗ha抗体和抗np抗体检测细胞的ha和np的表达，随后用pe缀合的抗小鼠抗体检测。ha和np蛋白的表达在用rp18tri-p/h和rp18tri-h/p感染的细胞中检测到，但是在用载体对照rp18tri-g/g感染的那些细胞中未检测到。由rp18tri-h/p感染进行的表达ha和np的细胞数量低于rp18tri-p/h是由于感染中使用的病毒滴度较低(图24b)。随后在bhk-21细胞中以0.01的moi进行的病毒生长分析表明rp18tri-p/h和rp18tri-h/p在相似的动力学下复制，并且比载体对照rp18tri-g/g低＜0.5log(图24c)。

2.ha/np双重抗原疫苗载体可在小鼠中诱导保护性免疫。

为测试体内rp18tri-p/h和rp18tri-h/p活载体的保护性免疫，我们用1x10⁴pfu的rp18tri-g/g对照载体rp18tri-p/h或rp18tri-h/p通过im途径免疫一组小鼠(n>＝3)，14天后用相同载体加强免疫，并在免疫接种后14天用致死剂量的小鼠适应的a/pr8流感病毒(10xmld50)攻击。所有对照载体免疫的小鼠到第6天时死于感染，而接受rp18tri-p/h或rp18tri-h/p的所有小鼠从攻击中存活，而没有任何疾病体征或体重损失(图25a)。与在3和6dpi时在肺中具有高病毒滴度(2-10x10⁵pfu/g)的对照载体免疫的小鼠相比，rp18tri-p/h或rp18tri-h/p免疫的小鼠(各组中，n＝3)在6dpi时没有可检测的病毒，并且仅三组中的一组在3dpi时具有相对低水平的病毒(＜5x10³pfu/g)(图25b)。我们的数据表明表达双重抗原的病毒载体可诱导由ha特异性中和抗体赋予的针对流感病毒的强保护性免疫。

3.h1/h3双重抗原载体诱导平衡的ha中和抗体。

确定是否可使用两种不同的ha亚型来以相等的效率诱导中和抗体。为此，我们已将a/x31(流感病毒的h3n2亚型)的h3ha基因克隆到s2节段，并且在用全长l节段和编码a/pr8的h1ha的s1节段转染时可产生活rp18tri-h3/h1载体(图26a)。作为对照，我们还产生了在s2节段上编码egfp以及在s1节段上编码h1或h3的rp18tri载体，分别称为rp18tri-g/h1或rp18tri-g/h3(图26a)。为测试它们的免疫原性，通过im途径以14天的间隔分别用三种载体对c57bl6小鼠组(每组n＝3)进行初免和加强免疫。测量初免和加强免疫后14天收集的血液针对a/pr8/h1n1和a/x31/h3n2的中和抗体水平(图26b，上图)。编码单个ha亚型的rp18tri载体rp18tri-g/h1和rp18tri-g/h3各自诱导在加强剂量下增加的强同源亚型中和抗体，但在初免或加强免疫后未诱导可检测水平的交叉反应性抗体。rp18tri-h1/h3双重抗原载体诱导在加强剂量时增加的h1和h3中和抗体，并且每种中和抗体的水平与由相应单一抗原载体诱导的每种中和抗体水平相当(图26b顶图)。用balb/c小鼠获得类似的发现(图26b底图)。总之，我们的数据强烈表明h1/h3双重抗原载体在小鼠中诱导针对两种抗原的平衡中和抗体。换言之，不存在针对一种或另一种ha抗原的中和抗体的产生的偏好(偏移)。

4.通过初免和加强免疫策略用不同ha亚型诱导异源亚型中和抗体

最近的研究表明，广泛中和抗体可由初免和加强免疫接种或连续感染产生(wei等，2010，science329∶1060-1064、wei等，2012，scitranslmed4∶147ra114、miller等，2013，scitranslmed5：198ra107、wrammert等，2011，jexpmed208：181-193、krammer等，2012，jvirol86：10302-10307、miller等，2013，jinfectdis207∶98-105、margine等，2013，jvirol87∶4728-4737)。因为rp18tri载体在加强剂量下增强免疫应答，测试其是否可使用初免和加强免疫策略用不同的ha亚型诱导交叉反应性免疫。为此，产生活rp18tri-p/h1和rp18tri-p/h3载体，所述载体各自编码a/pr8np(一种已知引发t细胞应答的保守病毒蛋白(参见genbank登录号np_040982.1))，以及h1(a/pr8)或h3(x31)ha(图27a)。每次以14天间隔，将小鼠用rp18tri-p/h1进行初免，用rp18tri-p/h3进行加强免疫，并且再次用rp18tri-p/h1进行加强免疫。正如所料，在初免(7dpp)后检测到np特异性ctl，在加强剂量时(7dpb)显著增加，并且在第二次加强剂量后仍然保持在高水平(3-5％)(图27b)。将血液在每次施用后14天收集，并测试针对a/pr8、a/x31和a/wsn的中和抗体的水平。对同源病毒a/pr8(h1)和a/31(h3)特异的中和抗体在暴露相同ha抗原时被高度诱导，并且通常不通过异源ha加强免疫来增强，而针对异源亚型病毒a/wsn(h1)的中和抗体在加强剂量时稳定增加(图27c)。这些免疫的小鼠在用异源亚型病毒a/wsn进行致死攻击后显示出显著改善的存活(图27d)。总之，我们的数据表明用异源ha亚型使用rp18tri载体进行的初免和加强免疫可引发交叉反应性中和抗体，并引起针对异源亚型流感病毒攻击的交叉保护。

5.rp18tri载体可通过口服途径诱导体液应答和t细胞应答。

为确定rp18tri载体是否可通过口服途径方便地给予，通过口服管饲用1x10⁴pfu的rp18tri-g载体(n＝3)或rp18tri-p/h(n＝4)免疫c57bl6小鼠，并且在42天后用相同载体进行加强免疫。通过建立的np四聚体分析测量初免和加强免疫后7天时的np四聚体阳性效应t细胞(cd8⁺cd44^高)。在初免后7天时，来自rp18tri-p/h免疫的小鼠的三只测试小鼠中的两只具有明显高于载体免疫的小鼠中观察到的本底水平(0.13％和0.09％)的np⁺cd8⁺cd44^高细胞(1.24％和0.55％)。在所有4只免疫的小鼠中，np特异性效应细胞在加强免疫后7天显著增加，范围为5.7％至7.1％(图28a)。对于中和抗体观察到类似的模式。四只免疫小鼠中的两只在初免后14天时显示出阳性hai滴度(hai＝20)。在初免后42天时，所有4只小鼠显示出平局值为40的hai滴度。在加强剂量后，所有4只小鼠的hai滴度显著增加，范围从80至160(图28b)。总之，我们的数据强烈地表明，rp18tri载体可通过口服途径在加强剂量后诱导高水平的体液应答和t细胞应答。

6.失活的rp18tri载体可诱导体液应答和t细胞应答。

确定失活的rp18tri载体是否可诱导疫苗免疫。使用活的或过氧化氢处理的rp18tri-p/h疫苗载体(即失活的疫苗载体)以34天间隔以2个剂量免疫小鼠。在初免后(初免后7天，7dpp)未立即检测到中和抗体或np特异性t细胞。然而，在用失活疫苗载体的加强剂量(加强免疫后7天，7dpb)后检测到高水平的np特异性效应t细胞(图29，左图)。在初免后34天(34dpp)，低水平(hai＝20)的中和抗体在所有三只小鼠中检测到，并且在用失活的疫苗载体进行加强剂量(加强免疫后14天，14dpb)后显著增加，范围为40至80(图29，右图)。值得注意的是，由化学失活的rp18tri-p/h疫苗载体诱导的t细胞和体液应答的水平显著低于由活疫苗载体诱导那些水平。然而，失活的rp18tri-p/h在加强剂量后仍可诱导体液和t细胞应答，表明此病毒载体作为活疫苗和失活疫苗的疫苗平台的多功能性。

7.rp18tri载体在豚鼠模型中诱导针对强毒p18病毒的保护性免疫。

wtp18病毒在豚鼠中在皮钦德病毒(picv)的连续传代后获得，并且在动物中引起出血性热病样疾病，其已经用作用于研究人中拉沙热病毒感染的发病机制的安全替代模型(jahrling等，1981，infectimmun32∶872-880，aronson等，1994，amjpathol145∶228-235、liang等，2009，annnyacadsci1171第1增刊：e65-74)。与wtp18病毒相比，三节段rp18tri载体在体外生长低至少1log。我们还确定了rp18tri-g载体在豚鼠中的毒力潜力。用1x10⁴pfu的rp18病毒感染的豚鼠发展早期发作发热，在感染后7天快速减重，并到第14天时达到终点(图30a)。相比之下，用1x10⁶pfu的rp18tri-g(比rp18对照高100倍的滴度)感染的豚鼠与模拟感染的动物显示出相似的体重生长，并且没有经历多于1天的发热(图30a)。

确定这种非病原性rp18tri载体是否能够在豚鼠中诱导针对致死性rp18攻击的保护性免疫。将豚鼠用代表模拟感染的豚鼠缓冲盐水(pbs)或用1x10⁴pfu的rp18tri-g通过ip途径注射，并且14天后，用致死剂量的rp18病毒攻击。pbs免疫的豚鼠(n＝3)很快发热并显著丧失体重，并且所有动物到第11天时达到预定终点(图30b)。相比之下，rp18tri-g免疫的豚鼠(n＝3)被完全保护，而没有明显的体重损失(图30b)。针对picv的保护性免疫可能由t细胞应答介导，因为中和抗体在攻击时尚未发展。先前研究已经证实了不同的沙粒病毒诸如lcmv和picv、拉沙和莫佩亚病毒、胡宁和tacaribe复合病毒之间的交叉保护，并且已经探索了病原性沙粒病毒作为活疫苗(综述于olschlager等，2013，plospathog9：e1003212)。我们提出将保护性t细胞表位并入picv蛋白中的rp18tri载体可诱导针对其他沙粒病毒病原体的交叉保护性免疫。具有编码多达两种另外抗原的能力，rp18tri载体可开发作为针对沙粒病毒病原体和其他所需病原体的双重(或三重)疫苗载体。

总之，开发了包装3种rna节段并编码2种外来蛋白抗原的基于皮钦德病毒(picv)的活病毒载体rp18tri。病毒载体在体外和体内减毒。使用流感ha作为模型抗原，rp18tri-g/h可在小鼠中诱导持久保护性免疫。rp18tri载体可在小鼠和豚鼠中诱导强体液应答，以及高水平的病毒特异性效应t细胞。rp18载体诱导的抗体和t细胞应答通过加强免疫接种显著增加，并且甚至在四次施用后仍处于高水平，这种活病毒载体的独特特征对于初免和加强免疫接种策略是理想的。载体可通过各种途径给予，所述各种途径包括肌内(im)、腹膜内(ip)、鼻内(in)和口服。用来自不同流感病毒株的不同ha蛋白进行的初免和加强免疫诱导异源亚型免疫，因此存在开发通用流感疫苗的潜力。化学失活的rp18tri-p/h在加强剂量后诱导体液应答和ctl应答。rp18tri载体诱导针对强毒rp18病毒的保护性免疫，因此存在开发针对其他病原性沙粒病毒诸如拉萨热病毒的交叉反应性疫苗和针对其他病原体组合的双重(三重)疫苗的潜力。

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