相关申请的交叉引用本申请根据35u.s.c.§119(e)要求2014年9月29日提交的美国临时申请号62/056,687的申请日的权益，该临时申请全部内容通过引用并入本文。
背景技术：
：：将生物或遗传材料递送到哺乳动物合子中通常是修饰哺乳动物基因组的第一步，例如遗传修饰动物模型的创建。这在传统上和目前通过使用玻璃针将期望生物/遗传材料显微注射到合子中而实现。dna直接显微注射早在80年代末就已经用于将单纯疱疹病毒(hsv)tk基因引入培养的哺乳动物细胞(capecchi，cell，22:479-488，1980年11月)。然而，即使在小的pbr322/tkdna与sv40dna共注射，即每1,000个细胞注射15个转化体时，转化率也是极低的。此外，该实验不导致产生成熟生物体，更不用说可以表现出表型改变。大约一个月后，gordon等(proc.natl.acad.sci.u.s.a.,77:7380-7384,1980年12月)首先报道了他们已经成功将tk基因(其被引入到嵌合sv40病毒载体中)显微注射到小鼠胚胎中，并已经在从显微注射的胚胎发育的小鼠中观察到这样的tk基因。然而，这些小鼠不表达tk基因产物。也就是说，在这些实验中，没有实现测试动物的表型改变。gordon等报道的结果似乎与jaenisch等人早期的研究(proc.natl.acad.sci.u.s.a.,71:1250-1254,1974)一致，其中sv40病毒先前已经被证明在引入小鼠胚胎时在功能和遗传上无活性。随后，在1981年6月，wagner和hoppe提交了针对通过显微注射将外源遗传材料引入胚胎的美国实用新型申请，该申请最终导致美国专利no.4,873,191的授权，其是在显微注射领域中广泛许可的基础专利，描述并广泛要求保护获得具有含有并能够表达外源遗传材料的细胞的哺乳动物的显微注射方法。尽管自80年代初以来已有许多改进，显微注射仍然技术上苛刻、劳动密集并且耗时。成功的显微注射在很大程度上取决于操作员的技术熟练程度、培训和经验等主观因素。由于它需要在昂贵的显微注射设备和具有多年培训和经验的操作者方面进行大量的前期投资，即使在世界上最优秀和资金最充分的学术机构中，生产遗传修饰小鼠模型的能力也经常受到限制。此外，显微注射在通量方面固有地低，需要一次操纵一个合子，从而限制基因组工程实验的大小和规模。电穿孔或电渗透是通过使用外部施加的电场显著地增加细胞质膜渗透性和导电性的方法。电穿孔已经在分子生物学中用作将某些材料引入细胞的方式，例如用分子探针、可改变细胞功能的药物或dna分子加载它。在分子生物学中，电穿孔方法通常用于细菌、酵母和植物原生质体的转化。除了脂质膜外，细菌还具有与脂质膜不同并且由肽聚糖及其衍生物构成的细胞壁。然而，细胞壁是天然多孔的并且只用作保护细菌免受严重环境影响的硬壳。如果细菌和质粒混合在一起，则质粒可以在电穿孔后转移到细胞中。在这个方法中通常在几毫米距离上使用数百伏。该程序也可以用于组织培养细胞，例如培养的哺乳动物细胞。与细菌中的转化相反，将外源dna引入真核细胞的过程通常称为转染。电穿孔已经用于使用电穿孔电击杯转染悬浮体中的细胞。尽管有着克服上述显微注射的许多障碍，包括低效率/低通量和技术困难的巨大和明显需要，电穿孔尚未被本领域技术人员看做可行的替代方法，并且尚未有报道使用电穿孔将遗传材料引入哺乳动物胚胎，其随后发育成遗传修饰动物。具体来说，电穿孔以前主要用于小鼠中的组织培养细胞和植入后胚胎(参见mellitzer等.,mech.dev.,118:57-63(2002)；akamatsu等.,proc.natl.acad.sci.u.s.a.,96:9885-9890(1999)；potter等.,proc.natl.acad.sci.u.s.a.,81:7161-7165(1984)；osumi和inoue,methods,24:35-42(2001)；fukuchi-shimogori和grove,science294:1071-1074(2001)以及tabata和nakajima,neuroscience,103:865-872(2001))。在一项研究中，nemec等(theriogenology31:233,1989)描述了通过电穿孔将新霉素抗性基因(psvneo)引入小鼠1-细胞胚胎(即，合子)中的尝试。然而，首先将包含新霉素基因的dna注射到合子的质膜与透明带之间的卵周隙中，以据作者所说在合子经受电击之前，在暴露于电流时减少外源dna与原核之间的距离。作者报道在一个实验中，dna印迹分析显示从转移到假孕icr受体的226个胚胎产生的55只幼仔中没有引入新霉素基因。在使用旨在在电穿孔脉冲期间增加传递的总能量的高盐介质的后续实验中，作者再次报道初步数据表明种系传递未成功。最近，电穿孔已经成功用于将dsrna、sirna、编码它们的dna载体和吗啉基化合物递送到小鼠植入前胚胎中(grabarek等.,genesis,32:269-276(2002)；wang等.,dev.biol.,318:112-125(2008)；和peng等.,plosone,7(8):e43748.doi:10.1371/journal.pone.0043748(2012))。然而，这些试剂在细胞质中起作用，而不是在细胞核中，如实现可以通过种系传递的遗传修饰所需要的。更具体地说，这些试剂通过降解靶基因的mrna或通过阻断mrna的翻译或两者而抑制其各自的靶基因的表达而起作用。因此，尽管有着克服用于通过种系传递将外源生物或遗传材料引入早期胚胎以产生遗传修饰动物的显微注射的许多缺点(例如低效率)的长期需要，该流行技术似乎教导远离看似简单的技术，如电穿孔。技术实现要素：本发明的一个方面提供了产生遗传修饰哺乳动物的方法，所述方法包括通过电穿孔将材料引入到哺乳动物的配子或植入前期胚胎中以修饰所述哺乳动物的基因组。在某些实施方式中，将材料引入到配子中。例如，配子可以是卵子(ovum)或卵(egg)。在某些实施方式中，所述方法还包括将配子与相反性别的配子融合，并允许发育成活胎产的遗传修饰哺乳动物。在某些实施方式中，植入前胚胎是1-细胞胚胎(即，合子)、2-细胞胚胎、4-细胞胚胎、早期桑椹胚或晚期桑椹胚。在某些实施方式中，所述方法还包括允许(电穿孔的)植入前期胚胎发育成活胎产的遗传修饰哺乳动物。在某些实施方式中，材料包含多核苷酸、多肽(例如蛋白)或多核苷酸和多肽两者。在某些实施方式中，多聚核苷酸包含ii型cas9蛋白的编码序列。在某些实施方式中，多核苷酸包含规律成簇的间隔短回文重复(crispr)-crispr相关(cas)(crispr-cas)系统指导rna，其与哺乳动物的基因组中的靶序列杂交。在某些实施方式中，ii型cas9蛋白和crispr-cas系统指导rna的编码序列的浓度比是至少约1:1、至少约1.5:1、至少约2:1、至少约2.5:1、至少约3:1或更高。在某些实施方式中，ii型cas9蛋白的编码序列的浓度是至少约40ng/μl、至少50ng/μl、至少100ng/μl、至少150ng/μl、至少200ng/μl、至少300ng/μl、至少400ng/μl、至少500ng/μl、至少600ng/μl、至少800ng/μl、或至少1000ng/μl或更高。在某些实施方式中，材料还包含供体多核苷酸。例如，供体多核苷酸可以是线性或环状双链或单链dna分子。在某些实施方式中，多核苷酸包含对哺乳动物的基因组中的靶序列具有特异性的转录激活子样效应子核酸酶(talen)的编码序列。在某些实施方式中，多核苷酸包含对哺乳动物的基因组中的靶序列具有特异性的锌指核酸酶(zfn)的编码序列。在某些实施方式中，多核苷酸包含对哺乳动物的基因组中的靶序列具有特异性的bud衍生核酸酶(budn)的编码序列。在某些实施方式中，多核苷酸包含随机整合到哺乳动物的基因组中的dna。在某些实施方式中，多核苷酸包含dna载体。在某些实施方式中，多核苷酸包含rna。在某些实施方式中，多核苷酸包含将dna片段随机或特定整合到哺乳动物的基因组中的转座酶。在某些实施方式中，哺乳动物是人、非人灵长类动物(例如狨、猕猴、黑猩猩)、啮齿动物(例如小鼠、大鼠、沙鼠、豚鼠、仓鼠、棉鼠、裸鼹鼠)、兔、家畜哺乳动物(例如山羊、绵羊、猪、奶牛、牛、马、骆驼)、宠物哺乳动物(例如狗、猫)、动物园哺乳动物、有袋类动物、濒危哺乳动物及其远系繁殖或随机繁殖群体。在某些实施方式中，将配子(在与相反性别的配子融合之后)或植入前胚胎在电穿孔后移植到能够承载胚胎到分娩期的假孕宿主哺乳动物中。在某些实施方式中，配子(在与相反性别的配子融合之后)或植入前胚胎在移植到假孕宿主哺乳动物之前从在其中进行电穿孔的培养基移除。在某些实施方式中，哺乳动物的基因组通过一个或多个碱基对的插入或缺失、通过异源dna片段的插入、通过内源dna片段的缺失、通过内源dna片段的倒位或易位，或其组合修饰。在某些实施方式中，哺乳动物的基因组通过nhej(非同源末端连接)、hdr(同源定向修复)或hr(同源重组)修饰。在某些实施方式中，约2、3、5、10、20、30、40、50、100、125、150、200、250、300或更多个配子或植入前期胚胎同时电穿孔。在某些实施方式中，电穿孔的植入前期胚胎中的至少约50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或更多发育成胚泡期胚胎，或发育成活胎产的转基因哺乳动物。在某些实施方式中，所有的配子和植入前期胚胎都在同一电击杯(electroporationcuvette)中电穿孔。在某些实施方式中，配子或植入前期胚胎在电穿孔之前预处理以弱化透明带。在某些实施方式中，配子或植入前期胚胎在酸性台氏液(at)或等同物中预处理。在某些实施方式中，电穿孔在1mm电击杯中进行，其使用以下设置：20-30伏(例如25、26或27伏)、脉冲持续时间为1-2ms(例如1.5ms)、1-3个脉冲、脉冲间隔为100-1000ms(例如约125-130ms)。在某些实施方式中，配子或植入前期胚胎在电穿孔后冷冻储存，然后解冻。本发明的另一方面提供了通过本发明的方法中的任一种产生的遗传修饰哺乳动物。应理解上文和下文中描述的任何实施方式都设想能够与本发明的任何其他实施方式组合，包括仅在实施例中描述的那些具体实施方式(通过引用并入本文)。附图说明图1a和1b显示了使用本发明方法在小鼠胚胎中的crispr介导的基因破坏。具体地，图1a显示了靶向tet1基因座的胚胎的基因分型。relp分析显示在上方小图中，以及测序结果显示在下方小图中。用于rflp分析的靶区域处的限制性位点加粗和加上下划线。原间隔区序列邻近基序(pam)序列以红色着色。显示了来自两个胚胎的突变等位基因，并且突变的碱基以蓝色着色。图1b显示了在tet2基因座被靶向的胚胎的基因分型。图2a-2d显示了使用本发明方法在活体小鼠中的crispr介导的基因破坏。具体地，在图2a中：分别以400ng/μl和200ng/μl使用的靶向tet2基因座的cas9mrna和sgrna(单指导rna)通过电穿孔递送至小鼠胚胎。然后将电穿孔的胚胎转移到假孕雌性小鼠中。从新生小鼠采集尾部活检样品，并使用使用ecorv酶的rflp方法进行基因分型。来自小鼠85c3的pcr产物对ecorv消化具有抗性，并且来自小鼠85c10的pcr产物对ecorv消化具有部分抗性。在图2b中：分别以600ng/μl和300ng/μl使用靶向tet2基因座的cas9mrna和sgrna。来自小鼠86c3和86c9的pcr产物对ecorv消化具有抗性，并且来自86c5、86c7和86c8的那些对ecorv消化具有部分抗性。在图2c中：来自小鼠85c3、85c10、86c3、86c5、86c7、86c8和86c9的pcr产物通过sanger测序处理，并且显示与来自野生型样品的谱图相比的谱图。图2d：将来自小鼠85c3、86c3和86c9的pcr产物克隆到pcr2.1-topo载体中，并对个体克隆体进行测序。在来自所有3只首建者(founder)小鼠的等位基因中容易地检测到indel突变。图3a显示了来自实验15的11只首建者小鼠的基因分型结果。上方小图显示无rflp分析的pcr产物。中间小图显示使用ecorv的rflp分析。下方小图显示使用ecori的rflp分析。图3b显示了所选首建者小鼠与对照小鼠的sanger测序结果。已经对相对于对照小鼠中的野生型序列改变的序列(通过crispr/cas介导的hdr)加上下划线。具体实施方式1.概述为了克服在产生遗传修饰动物(例如转基因或其他遗传修饰哺乳动物)的背景下与显微注射有关的固有局限性，申请人已经开发了基于电穿孔的方法，以在使该方法可以高效率、高通量产生高存活率的遗传修饰动物的特定条件下，将生物/遗传材料递送到动物(例如哺乳动物)配子或植入前胚胎中，包括合子。所得遗传修饰可以容易地通过种系传递。具体地，在示例性实施方式中，本发明的方法用于将crispr/cas系统递送至小鼠胚胎(例如合子)，从而在所得遗传修饰/转基因小鼠的基因组中实现靶向遗传修饰。本发明的方法，包括本文优化的实施方式或方案，可以使用市售的电穿孔机进行，同时需要很少的训练或以往经验，并且因此能够在一个步骤中并行处理大量的胚胎和多个基因靶向项目。使用本文所述的本发明的方法，可以将多种生物、遗传或其他材料(包括但不限于crispr/cas、talen和zfn或其组合等)中的任一种递送至配子和早期胚胎(例如哺乳动物植入前胚胎，包括合子)。因此本文描述的技术使得具有前所未有的容易和规模的动物基因组工程成为可能。本文所述的发明部分基于以下发现：电穿孔可用于将相对高浓度(例如先前认为是毒性水平)的生物/遗传材料递送至配子和植入前胚胎(包括合子)中，该高浓度可以是在电穿孔的配子和早期胚胎的核中实现期望最终结果(例如配子或胚胎的基因组的遗传修饰，该修饰可以通过种系传递而传递)所需要的。具体地说，基于先前的显微注射实验，其中较低浓度的cas9mrna(50或100ng/μl)和sgrna(25或50ng/μl)成功地用于原核或细胞质显微注射实验，申请人尝试使用报告的基因编码质粒对合子进行电穿孔(参见实施例1)。令人惊讶的是，在从电穿孔的合子发育的3.5天胚胎中没有观察到荧光。使用其他浓度的dna的类似实验(其预处理透明带以使之弱化；或使用其他报道体或荧光素标记寡核苷酸)也遭到失败。参见实施例1中提到的实验2-6。广泛认为用于电穿孔实验的试剂，包括cas9mrna和指导rna，在以较高浓度使用时可能对胚胎有毒。申请人已经在本文中证明早期胚胎(如合子)可以使用相对高浓度的生物材料(例如包含crispr/casmrna和指导rna的多核苷酸)进行电穿孔，以实现从电穿孔的胚胎发育的胚胎或动物中的期望遗传修饰。参见实施例2。本文所述的发明还部分基于以下发现：电穿孔的配子和植入前胚胎(包括合子)通常表现出延迟或停止发育，或以其他方式未存活成活胎产的动物，除非电穿孔的配子和植入前胚胎(包括合子)被释放到生理溶液或培养基。例如，溶液或培养基尤其是等渗的。此外，通过将电穿孔的配子和植入前胚胎(包括合子)释放到生理溶液或培养基中，除去了通常的电穿孔培养基(例如，用于溶解多核苷酸如te的缓冲液)，从而进一步减少其中的任何有害物质可以延缓后续胚胎发育的可能性。例如，在用于电穿孔的缓冲液或培养基不是生理溶液或培养基时，例如含有用于溶解待电穿孔的材料的过量(例如多于40％或50％)缓冲液，在电穿孔后很快就除去这样的缓冲液可能是有帮助的。在某些实施方式中，在常用于溶解核酸试剂的te或其他类似缓冲液在电穿孔介质中以显著量(例如＞40％或50％)存在时，可以使用多种方法以减轻任何潜在的有害影响。例如，在一个实施方式中，通过在电穿孔后立即在生理溶液中洗涤电穿孔的配子或胚胎可以使配子或胚胎在te缓冲液中洗浴的时间最小化。在其他实施方式中，溶解在te缓冲液中的核酸试剂(例如crispr/cas试剂)可以与生理溶液以适当比例混合，使得整体渗量(osmolarity)更接近生理。在又一个实施方式中，核酸试剂(例如crispr/cas试剂)可以在生理溶液中直接复原，以避免或最小化任何复杂化。也就是说，配子和植入前胚胎(包括合子)可以在生理溶液或培养基(例如等渗的溶液或培养基)中进行电穿孔。生理溶液或培养基可以是盐组成和渗透压类似于血浆的人工制备溶液。虽然电穿孔确实可以在本文所述的条件下将生物材料引入合子，但产生活胎产的动物需要合子在后续发育中生存。培养电穿孔的合子的初步失败似乎表明不管期望遗传修饰是否在电穿孔的合子中发生，合子可能无法幸存于电穿孔过程并继续发育成活胎产的动物。认识到at处理可能过度损伤合子以减缓胚胎发育，并且所递送的试剂如cas9mrna和指导rna可能对合子及其后续发育有毒，进一步教导远离使用电穿孔作为在动物中永久引入种系可传递的遗传修饰的可行手段。申请人已经在本文中证明，使用本发明的方法可以将电穿孔的合子的存活率，例如，如通过成功发育成胚泡期胚胎所测量的，显著地提高到出人意料的高水平(例如接近或甚至达到100％)。因此，本发明的一个方面提供了一种产生遗传修饰动物(例如哺乳动物)的方法，所述方法包括通过电穿孔将材料引入到动物(例如哺乳动物)的配子或植入前期胚胎中以修饰动物(例如哺乳动物)的基因组。在相关方面，本发明还提供了一种产生遗传修饰动物(例如哺乳动物)的方法，所述方法包括通过电穿孔将材料引入到动物(例如哺乳动物)的去核卵母细胞中以修饰动物(例如哺乳动物)的基因组，其中体细胞同时通过电穿孔休克与所述去核卵母细胞融合。用去核卵母细胞融合体细胞是用于猪克隆的方法。在某些实施方式中，将材料引入到配子中。例如，配子可以是精子(例如成熟精子)、极体、或者卵子或卵。如果使用成熟精子，可以首先诱导精子以经历解凝。用于精子解凝的技术是本领域已知的。参见例如mahi等.,j.reprod.fert.,44:293-296(1975)；hendricks等.,exptl.cellres.,40:402-412(1965)和wagner等.,archivesofandrology,1:31-41(1978)(均通过引用并入)。通过使用二硫化物还原剂的解凝是优选的。如果使用卵，卵可以处于通过例如孤雌生殖产生的受精或活化状态。也可以使用电穿孔的极体使单倍体卵二倍体化。在使用配子时，本发明的方法还包括将电穿孔的配子与另一个配子例如相反性别的配子融合(例如将电穿孔的卵与精子融合)，并允许融合的配子发育成活胎产的遗传修饰动物(例如哺乳动物)。例如，如果精子被电穿孔，则将在其中实现遗传修饰的精子细胞在之后置于卵中以使合子能够形成。反之亦然。精子和卵可以在合子形成之前进行电穿孔。电穿孔之后，与相反性别的配子或植入前胚胎融合之后，电穿孔的配子可以移植到假孕宿主动物/哺乳动物中，优选具有相同物种或品系，该动物(例如哺乳动物)能够承载胚胎到分娩期。在某些实施方式中，植入到假孕宿主动物/哺乳动物中在发育的桑椹胚或胚泡期发生。在其他实施方式中，植入在胚胎电穿孔后立即发生，或在电穿孔的配子与另一个配子融合后立即发生。在其他实施方式中，材料被引入早期胚胎，例如植入前期胚胎。植入前期胚胎可以是1-细胞胚胎(即，合子)、2-细胞胚胎、4-细胞胚胎、8-细胞胚胎、早期桑椹胚或晚期桑椹胚。由于胚胎发育有时可能涉及非对称分裂，至少短暂地，早期胚胎是3-、5-、6-、7-细胞胚胎或其他不是对称胚胎分裂的结果的胚胎是可能的。本发明的方法也适用于这样的早期胚胎。在某些实施方式中，所述方法还包括允许(电穿孔的)植入前期胚胎发育成活胎产的遗传修饰动物(例如哺乳动物)。例如，植入前胚胎在电穿孔之后可以移植到假孕宿主动物(例如哺乳动物)中，优选具有相同物种或品系，该动物(例如哺乳动物)能够承载胚胎到分娩期。在某些实施方式中，配子(在与相反性别的配子融合之后)或植入前胚胎在移植到假孕宿主动物(例如哺乳动物)之前先从在其中进行电穿孔的培养基中移除。例如，电穿孔的配子或植入前胚胎可以在适合或相容于胚胎发育的培养基(例如等渗生理溶液或培养基)中洗涤一次或多次。这样的洗涤还除去电穿孔培养基或缓冲液中可能有害或以其他方式不利于体外或体内进一步胚胎发育的任何物质。用于该目的的适合的培养基包括但不限于m2培养基或或任何其他生理溶液(具有适当的离子强度和ph)。在某些实施方式中，用于洗涤的培养基或缓冲液预热至动物(例如哺乳动物)胚胎发育的最佳温度(例如约37℃)，以减少或最小化任何潜在的温度冲击。在某些实施方式中，电穿孔培养基是等渗的。在某些实施方式中，洗涤电穿孔的配子或植入前胚胎以除去用于溶解多核苷酸的一种或多种缓冲液，例如te缓冲液或含有金属螯合剂例如edta的等效缓冲液。在某些实施方式中，洗涤电穿孔的配子或植入前胚胎以除去可以用作电穿孔培养基的基础或低血清培养基，例如培养基(invitrogen,carlsbad,ca)、siporttm(am8990或am8990g；ambion,austin,tx)、或其混合物或等同物。使用本发明的方法可以将许多试剂或材料引入配子或植入前胚胎，以产生可通过种系传递的遗传修饰。在某些实施方式中，材料可以包含多核苷酸、多肽或两者。在其他实施方式中，还可以通过电穿孔引入另外的材料，例如那些天然或合成的化学品，使得它们促进或抑制nhej、hdr或hr过程。例如，可以包括某些化学试剂以促进或增强crispr/cas系统的功能(见下文)。在某些实施方式中，多聚核苷酸包含ii型cas9蛋白的编码序列。在示例性实施方式中，cas9蛋白的编码序列是mrna，例如适于在真核细胞中表达的密码子优化的mrna。在某些实施方式中，多核苷酸可以包含规律成簇的间隔短回文重复(crispr)-crispr相关(cas)系统指导rna，其能够与哺乳动物的基因组中的靶序列杂交。指导rna仅需要序列与靶序列足够相似，使得它们可以在细胞内生理条件下杂交。然而，在某些实施方式中，指导rna与靶序列完全互补(或100％相同)。在某些实施方式中，指导rna可以是与反式激活cr(tracr)序列融合的指导序列。在某些实施方式中，ii型cas9蛋白与crispr-cas系统指导rna的编码序列的浓度比可以变化。例如，适合的比率可以是至少约1:1、至少约1.5:1、至少约2:1、至少约2.5:1、至少约3:1或更高。在其他实施方式中，ii型cas9蛋白与crispr-cas系统指导rna的编码序列的浓度比可以是至多约1:1、至多约1:2、至多约1:4、至多约1:5、至多约1:10或更低。在某些实施方式中，ii型cas9蛋白的编码序列的浓度是至少约40ng/μl、至少50ng/μl、至少100ng/μl、至少150ng/μl、至少200ng/μl、至少300ng/μl、至少400ng/μl、至少500ng/μl、至少600ng/μl、至少800ng/μl、或至少1000ng/μl或更高。在某些实施方式中，材料还包含供体多核苷酸(例如促进crispr介导的nhej、hdr或hr)。例如，供体多核苷酸可以是线性或环状双链或单链dna分子。可以包括这样的供体多核苷酸以促进可以是引入的crispr-cas系统的靶标的靶序列的位点特异性修饰或其周围的位点特异性修饰。除了crispr/cas系统，其他材料也可以使用本发明的方法引入配子或植入前胚胎。例如，在某些实施方式中，多核苷酸可以包含对动物(例如哺乳动物)的基因组中的靶序列具有特异性的转录激活子样效应子核酸酶(talen)的编码序列。在其他实施方式中，多核苷酸可以包含对动物(例如哺乳动物)的基因组中的靶序列具有特异性的锌指核酸酶(zfn)的编码序列。在又一些实施方式中，多核苷酸可以包含对动物(例如哺乳动物)的基因组中的靶序列具有特异性的bud衍生核酸酶(budn)、或模块化碱基-每-碱基特异性核酸结合结构域(modularbase-per-basespecificnucleicacidbindingdomains,mbbbd)衍生核酸酶的编码序列。在又一个实施方式中，多核苷酸包含随机整合到动物(例如哺乳动物)的基因组中的dna。多核酸酶可以包含dna载体或rna(例如mrna和/或crispr指导rna)。在某些实施方式中，多核苷酸包含将dna片段随机或特定整合到哺乳动物的基因组中的转座酶。本发明在进行配子配合(即通过配子细胞的结合的有性生殖)的多细胞真核动物的遗传修饰中具有应用。这样的动物的实例包括两栖动物、爬行动物、鸟类、哺乳动物、硬骨鱼类、软骨鱼类、圆口纲动物、节肢动物、昆虫、软体动物和叶状植物。示例性动物包括哺乳动物、鸟类和鱼类。在某些实施方式中，动物是哺乳动物(见下文)。例如，哺乳动物可以是人、非人灵长类动物(例如狨、猕猴、黑猩猩)、啮齿动物(例如小鼠、大鼠、沙鼠、豚鼠、仓鼠、棉鼠、裸鼹鼠)、兔、家畜哺乳动物(例如山羊、绵羊、猪、奶牛、牛、马、骆驼)、宠物哺乳动物(例如狗、猫)、动物园哺乳动物、有袋类动物、濒危哺乳动物或来自其远系繁殖或随机繁殖群体的个体。本发明的方法可用于将许多可种系传递修饰引入到相关动物物种的基因组，包括但不限于：小插入或缺失(例如一个或多个碱基对的那些)、异源dna片段的插入、内源dna片段的缺失、内源dna片段的倒位或易位，或其组合。同样，在产生修饰方面可能涉及许多不同机制，包括但不限于非同源末端连接(nhej)、同源定向修复(hdr)或同源重组(hr)。同源定向修复(hdr)是细胞中修复双链dna损伤的机制。这种修复机制只有在dna同源物片段存在于细胞核中时才可以被细胞使用，主要在细胞周期的g2和s期。在同源dna片段不存在时，可以发生另一个过程，称为非同源末端连接(nhej)。非同源末端连接(nhej)是修复dna中的双链断裂的另一个途径。nhej称为是“非同源的”，是因为与需要同源序列指导修复的同源重组相反，断裂末端直接连接而不需要同源模板。nhej通常利用短的同源dna序列(例如微同源)以指导修复。这些微同源通常存在于双链断裂的末端的单链突出端上。在突出端完全相容时，nhej通常精确地修复断裂。导致核苷酸损失的不精确修复也可能发生，但是是在突出端不相容时更为常见。不适当的nhej可以导致易位和端粒融合。nhej在所有生命界都在进化上保守，并且在哺乳动物细胞中是主要的双链断裂修复途径。在nhej途径失活时，双链断裂可以被称为微同源介导末端连接(mmej)的更容易出错的途径修复。在这个途径中，末端切除显示在断裂的任一侧的短微同源，其然后与指导修复对齐。这与通常使用已经暴露在dsb末端上的单链突出端中的微同源的经典nhej形成对比。因此，mmej进行的修复导致微同源之间的dna序列的缺失。同源重组是基因重组的一种类型，其中核酸序列在同源dna的两个相似或相同分子之间交换。它被细胞最广泛地用于精确地修复发生在dna双链两者上的有害断裂，称为双链断裂(dsb)。同源重组也是在减数分裂期间产生dna序列的新组合的过程，真核生物通过该过程产生配子细胞，如动物中的精子和卵。同源重组在生命的所有三个域以及病毒中都是保守的。本发明的方法适用于单个配子或植入前胚胎，并且也适用于约2、3、5、10、20、30、40、50、100、125、150、200、250、300或更多个配子或植入前期胚胎的多重使用和同时使用，例如均可以在相同或不同的条件下，在同一电击杯中或者在多个相似或相同电击杯中同时电穿孔。本发明的方法在许多方面优于显微注射。与显微注射相比，本发明的方法不仅效率高得多且技术要求低很多并且适合标准化，而且胚胎存活率和种系传递率两者都高很多。例如，显微注射通常可以实现注射的小鼠胚胎约20-25％的存活率(例如，约20-25％的注射的小鼠胚胎存活以产生活胎产的小鼠幼仔)。相比之下，电穿孔的植入前期胚胎(或电穿孔的、然后融合的配子)中的至少约50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或更多，优选以与匹配对照类似的速率，例如在合子电穿孔后约3.5天，发育成胚泡期胚胎，或者发育成活胎产的转基因哺乳动物。例如，匹配对照可以是伪电穿孔的配子或胚胎，其可以通过空载体、crispr/cas的加扰mrna和/或指导序列、或仅缓冲液电穿孔。在某些实施方式中，电穿孔的植入前期胚胎(或电穿孔的、然后融合的配子)中的至少约70％、75％、80％、85％、90％或更多发育成活胎产的转基因哺乳动物。在某些实施方式中，如通过含有设计的遗传修饰的活胎产的哺乳动物的百分比所测量的，宿主基因组的靶向效率为至少约80％、85％、90％、95％、97％、99％或接近100％。虽然不希望受到任何特定理论的约束，但是本发明方法的高靶向效率可能是由于胚胎浸没在同质crispr/cas溶液中并且在电穿孔时类似地暴露于crispr/cas试剂。这与相应显微注射实验形成直接对比，在显微注射实验中技术能力水平和特定实验周围的因素都可能有助于靶向效率相对大的变化。在某些实施方式中，配子或植入前期胚胎在电穿孔之前预处理以弱化透明带。例如，为此目的，配子或植入前期胚胎可以在酸性台氏液(at)中预处理。台氏液由美国药理学家mauricevejuxtyrode发明，是林格-洛克氏溶液的改良。它与间质液大致等渗，并且主要用于生理实验和组织培养。它含有镁、糖(通常是葡萄糖)作为能量来源，并使用碳酸氢盐和/或hepes作为缓冲液。一些变化还包括磷酸根和硫酸根离子。在用于细胞培养应用和生理实验时，其通常用95％的氧5％二氧化碳进行气体处理。酸性台氏液通常可以通过在室温下在100ml水中溶解nacl0.8g、kcl0.02g、cacl2·2h2o0.024g、mgcl2·6h2o0.01g、葡萄糖0.1g、聚乙烯吡咯烷酮(pvp)0.4g，并用analarhcl(bdh)调节至ph2.5而制备。添加pvp以增加粘度并降低胚胎粘性。溶液可以过滤灭菌并以等分试样储存在-20℃。at可以从例如sigma-aldrich的供应商商购获得(例如100ml包装的skut1788)。在某些实施方式中，配子或植入前胚胎在at中预处理约5-30秒、约5-20秒或约5-10秒。如果at被稀释，也可以使用更长的处理时间。可以通过在不同时间段内处理配子或植入前胚胎，然后测量活力、处理后受损或凋亡配子/胚胎的百分比或在后续发育期间胚胎的存活率，以实验为依据确定适合的at处理时间。虽然可以使用稍微不同的电穿孔条件，但在某些实施方式中，本发明中的电穿孔在1mm电击杯中进行，使用以下设置：20-30伏(例如25、26或27伏)、脉冲持续时间为1-2ms(例如1.5ms)、1-3个脉冲、脉冲间隔为100-1000ms(例如约125-130ms)。在某些实施方式中，也可以使用适当调整的参数相似的2mm电击杯。在某些实施方式中，电穿孔的配子或胚胎可以在电穿孔后立即使用，例如分别与另一个配子融合或移植到假孕雌性中。在其他实施方式中，电穿孔后，配子或植入前期胚胎冷冻储存，然后解冻进行下一步骤，例如分别与另一个配子融合或移植到假孕雌性中。在又一个实施方式中，可以使电穿孔的配子或胚胎在冷冻保存之前先发育成后期胚胎，例如早期或晚期桑椹胚，或胚泡期胚胎(在电穿孔的配子的情况下，在先与另一个配子融合之后)。使用标准技术，例如玻璃化或慢速程序化冷冻(spf)，可以进行冷冻保存。在某些实施方式中，用于电穿孔的植入前胚胎、合子或配子通过体外受精(ivf)获得、从冷冻保存恢复。本发明的另一方面提供了通过本发明的任一种方法产生的遗传修饰动物(例如哺乳动物)。尽管有上文概述的发明，下文部分还提供了关于本发明的具体方面的额外细节，其应结合概述并在其背景下阅读。本文所描述的具体实施方式中的任一个均设想可与本发明的其他实施方式中的任一个或多个组合，包括仅在实施例部分中描述的那些。2.电穿孔和电穿孔器电穿孔是一种动态现象，其取决于细胞膜上每个点处的局部跨膜电压。对于给定的脉冲持续时间和形状，存在针对电穿孔现象的表现的特定跨膜电压阈值(例如0.5v至1v)。这导致定义电穿孔的电场大小阈值(eth)。只有在e≧eth的区域内的细胞才被电穿孔。如果达到或超过第二阈值(eir)，电穿孔将损害细胞活力，导致不可逆的电穿孔(ire)。电穿孔允许细胞引入大的、高度带电的分子，例如dna、rna或蛋白，其可能不被动扩散穿过疏水双层核。虽然不希望受到任何特定理论的约束，但是据信电穿孔的机制涉及在细胞膜中产生nm级充水孔。据信在电穿孔过程中，膜中的脂质分子未化学改变，而仅仅是移动位置，打开在其充满水时充当穿过双层的导电通路的孔。电穿孔通常是具有几个不同阶段的多步骤过程。首先，必须施加短的电脉冲。典型的参数会是300-400mv对于＜1ms跨膜。在细胞实验中使用的电压通常大得多，因为它们被施加跨越长距离到主体溶液，所以跨越实际膜的所得场仅仅是施加的偏压的一小部分。在施加该电位时，膜通过来自周围溶液的离子的迁移像电容器一样充电。一旦达到临界场，脂质形态快速局部重排。所得结构据信是“前孔(pre-pore)”，因为它不导电，但迅速导致产生导电孔。这样的前孔存在的证据主要来自孔的“闪烁”，其启示导电和绝缘状态之间的转变。已经提出这些前孔是小的疏水性缺陷。如果这个理论是正确的，则转变到导电状态可以通过在孔边缘处的重排解释，其中脂质头部折叠以产生亲水界面。最后，这些导电孔可以愈合、再密封双层，或者膨胀，最终使其破裂。作为结果发生的命运取决于是否超过临界缺陷尺寸，其进而取决于所施加的场、局部机械应力和双层边缘能量。根据本发明，配子和植入前胚胎的电穿孔可以用市售的电穿孔器(在细胞溶液中产生电磁场的装置)进行。电穿孔器的示例性但非限制的商业型号包括：来自btx(sandiego,ca)的ecmtm830squarewaveelectroporator或2001electrocellmanipulator(ecm2001)。在典型设置中，将配子或植入前胚胎悬浮液移液到玻璃或塑料电击杯中，其在其侧面具有两个铝电极。在电穿孔之前，将配子或植入前胚胎与要引入至配子或植入前胚胎中的(生物)材料(例如dna、rna或蛋白或其混合物)轻轻混合。混合物可以在其移液到电击杯(例如，1mm或2mm宽的电击杯)之前制成，或在电击杯中制成。通常，使用约20μl总体积的悬浮液混合物，虽然也可以使用10-200μl、20-100μl、25-75μl总体积。然后设置电压和电容(见下文)，并将电击杯插入电穿孔器中。在电穿孔后立即将对胚胎存活最优的给定量(例如，与整个电击杯容量等体积、约20-200μl或约100μl)的液体培养基加入到电击杯中以洗出电穿孔混合物，并将整个内容物收集在适合的容器中(例如组织培养皿)。电穿孔的配子或植入前胚胎的存活及其发育成培养物或活胎产的动物在一定程度上取决于仔细洗涤和除去电穿孔培养基，如果电穿孔培养基不是生理溶液的话。生理溶液不仅为胚胎发育提供了适当的等渗环境，而且还可以除去可能不利于胚胎发育/存活的任何潜在有害物质。在发育中的胚胎，例如3.5天的胚泡期胚胎，转移到代孕母亲/假孕雌性以发育至足月并作为活的动物出生之前，配子或植入前胚胎，优选地在洗涤后，在最佳温度和/或大气条件(例如在37℃、5％co2或5％o2/5％co2/氮气下)下转移到假孕雌性或者孵育所需时间段。如可以在ecm830或ecm2001型中使用的典型电穿孔条件可以包括在1mm电击杯进行电穿孔，使用以下设置：20-30伏(例如25、26或27伏)、脉冲持续时间为1-2ms(例如1.5ms)、1-3个脉冲、脉冲间隔为100-1000ms(例如约125-130ms)。然而，应理解本文公开的条件是出于说明目的而不是限制性的。本领域技术人员可以基于例如要引入的分子的大小和量、配子或胚胎的类型等容易地调整参数。电穿孔可以在市售的台式电穿孔器中进行，例如来自btx的ecm830或ecm2001型以及devices(lonzagroupltd.)。一些装置用适合多孔细胞培养皿的特殊电极组件提供同时电穿孔多个样品的可能性。台式电穿孔器也可以设置为不同的操作参数，允许操作员探索或优化特定参数，例如场强。3.哺乳动物除了上述进行有性生殖的多细胞真核动物之外，本发明的方法特别适用于任何哺乳动物，包括人、非人灵长类(例如狨、猕猴、黑猩猩)、啮齿动物(例如小鼠、大鼠、沙鼠、豚鼠、仓鼠、棉鼠、裸鼹鼠)、兔、家畜哺乳动物(例如山羊、绵羊、猪、奶牛、牛、马、骆驼)、宠物哺乳动物(例如狗、猫)、动物园哺乳动物、有袋类动物、濒危哺乳动物及其所有远亲繁殖或随机繁殖群体。在某些实施方式中，哺乳动物是小鼠，例如近交小鼠。示例性近交小鼠系包括但不限于近交小鼠系c3h，例如cba、dba、fvb、nob、balb/c、129、c57bl，并且c57bl小鼠包括c57bl/6j、c57bl/6ntac、c57bl/6ncrl、c57bl/10等。包括重组近交系的其他近交小鼠系包括(但不限于)：129s1/svimj、129t2/svemsj、129x1/svj、129p3/j、a/j、akr/j、balb/cby、balb/cbyj、balb/cbalb/cj、c3h/hej、c3h/heouj、c3heb/fej、c57bl/10j、c58、cba/cahn-btkxid/j、cba/j、dba/1j、dba/1lacj、dba/2j、fvb/nj、mrl/mpj、nod/ltj、sjl/j、swr/j、nor/ltj、nzb/blnj、nzw/lacj、rbf/dnj、129s6/svevtac、ajtac、balb/canntac、balb/cjbomtac、balb/cabomtac、c57bl/6ntac、c57bl/6jbomtac、c57bl/10sgaitac、c3h/hentac、cba/jbomtac、dba/1jbomtac、dba/2ntac、dba/2jbomtac、fvb/ntac、nod/mrktac、nzm/aegtac、sjl/jcrntac、balb/canncrlbr、c3h/hencrlbr、c57bl/6ncrlbr、dba/2ncrlbr、fvb/ncrlbr、c.b-17/icrcrlbr、129/svpasicocrlbr、sjl/jorlicocrlbr、a/jolahsd、balb/cannhsd、c3h/henhsd、c57bl/10scnhsd、c57bl/6nhsd、cba/jcrhsd、dba/2nhsd、fvb/nhsd、samp1/kahsd、samp6/tahsd、samp8/tahsd、samp10/tahsd、sjl/jcrhsd、akr/olahsd、biozziabh/rijhsd、c57bl/6jolahsd、fvb/nhanhsd、mrl/mpolahsd、nzb/olahsd、nzw/olahsd、swr/olahsd、129p2/olahsd、and129s2/svhsd、b6.129p2-apoetm1unc/j、nod.cb17-prkdcscid/j、129s1/svimj、129x1/svj、b10.a-h2ah2-t18a/sgsnj、b10.d2-hc0h2dh2-t18c/osnj、b10.d2-hc1h2dh2-t18c/nsnj、b10.riii-h2rh2-t18b/(71ns)snj、b6(c)-h2-ab1bm12/khegj、b6.129p2-il10tm1cgn/j、b6.129p2-nos2tm1lau/j、b6.129p2-nos3tm1unc/j、b6.129s2-cd8atm1mak/j、b6.129s2-igh-6tm1cgn/j、b6.129s7-ifngtm1ts/j、b6.129s7-rag1tm1mom/j、b6.cb17-prkdcscid/szj、b6.mrl-faslpr/j、b6.v-lepob/j、bks.cg-m+/+leprdb/j、c3heb/fej、c57bl/10jc57bl/10snj、c57bl/6-tg(apoa1)1rub/j、c57bl/6j-tyrc-2j/j、cba/cahn-btkxid/j、cba/caj、cbysmn.cb17-prkdcscid/j、fvb/n-tg(mmtvneu)202mul/j、kk.cg-ay/j、mrl/mpj、mrl/mpj-faslpr/j、sjl/j、swr/j、b10.pl-h2uh2-t18a/(73ns)snj、noncnzo5/ltj、wr、bph/2、bpl/1、fs、p/j、p/a和pro。在某些实施方式中，小鼠也包括具有所有遗传工程化(例如转基因的、敲除、敲入、敲低、逆转录病毒的、病毒的)或化学诱导突变(例如enu、ems，还包括突变体存档)；辐射诱导突变；小鼠系上保持的自发突变/修饰的变体，特别是衍生自例如c57bl/6、129、fvb、c3h、nod、dba/2、balb/c和cd-1的突变体，包括同类系和重组同类系。具体实例包括：b6.129p2-apoetm1unc/j、b6.129s4-pdyntm1ute/j、b6；129p2-pemttm1j/j、nod.cgprkdcscid-b2mb/dvs等。在某些实施方式中，小鼠是通过杂交两个近交系(包括混合的近交系)产生的小鼠杂交系。示例性杂交系包括：nzbwf1/j、b6cbaf1/j、b6sjlf1/j、cb6f1/j、cbyb6f1/j、plsjlf1/j、wbb6f1/j-kitw/kitw-v、b6129pf1/j、caf1/j、b6129pf2/j、b6129sf1/j、b6129sf2/j、b6af1/j、b6c3f1/j、b6cbaf1/j和b6sjlf1/j。在任一杂交系中，比例可以在50:50f1至99:1f1之间变化。在某些实施方式中，小鼠是远交系小鼠，例如cd-1、icr、blackswiss、swisswebster、nihswiss、cf-1和nude小鼠。在某些实施方式中，大鼠是近交系大鼠，例如aci、brownnorway(bn)、bcix、copenhagen(cop)、mwf、dagouti(da)、goto-kakizaki(gk)、lewis、fischer344(f344)、wistarfurth(wf)、wistarkyoto(wky；wkyn1)或zdf。在某些实施方式中，大鼠也包括具有所有遗传工程化(例如转基因的、敲除、敲入、敲低、逆转录病毒的、病毒的)或化学诱导突变(例如enu，还包括突变体存档)；辐射诱导突变；包括同类系的大鼠系上保持的自发突变/修饰的变体。具体实例包括：f344/ntac-tg(hla-b27)-tg(2m)33-3trg；hsdamc:tr-abcc2；hsdhlr:zucker-leprfa和nihnude。在某些实施方式中，大鼠是通过杂交两个近交系产生的大鼠杂交系。示例性杂交系包括：bhr、fbnf1/hsd和lbnf1/hsd。在某些实施方式中，大鼠是远交系大鼠，例如holtzman、spraguedawley、longevans、wistar、wistarhan、wh、wky、zucker、jcr(russelrat)和ofa。4.使用crispr/cas、talen、zfn或bud进行基因组修饰或编辑本文所述的发明提供了一种修饰或“编辑”感兴趣的动物基因组的强大工具，使得修饰或编辑的动物基因组可以通过种系传递来传递。更具体地，基因组修饰或编辑可以用于通过例如引入异源转基因或通过抑制靶标内源基因的表达改变感兴趣的动物(例如哺乳动物)的基因组序列。这样的遗传修饰动物可用于例如建立与特定遗传疾病或失调相对应的相关动物模型。这样的动物模型可用于探索或研究疾病机制、进程、预防和治疗(例如药物筛选和临床前测试)。可以在动物模型中表现的说明性(非限制性)人类疾病或失调包括：各种类型的癌症、心脏病、高血压、代谢和激素失调、糖尿病、肥胖症、骨质疏松症、青光眼、皮肤色素沉着疾病、失明、耳聋、神经退行性失调(例如亨廷顿舞蹈症或阿尔兹海默病)、精神紊乱(包括焦虑和抑郁)和出生缺陷(例如腭裂和无脑儿)。大多数目前可用的动物模型都是在小鼠中形成，它们重新产生任何特定人类疾病的一些但可能不是全部方面。对于可能难以使用小鼠模型模拟的某些疾病，例如许多神经退行性疾病(其中大部分涉及认知缺陷)，本发明的方法可用于在非人灵长类中产生动物模型。例如，最近开发了使用恒河猴的亨廷顿舞蹈病转基因模型，该模型复制了该失调的特征性病理中的一些，就像该失调在人类中发生一样(yang等.,2008)。可以使用任何本领域公认的技术进行基因组编辑，例如zfn/talen或crispr技术(参见gaj等人的综述,trendsinbiotech.,31(7):397-405(2013)，整个文本和其中所有引用的参考文献都通过引用并入本文)。这样的技术使得人们几乎能够操纵广泛的细胞类型和生物体中的任何基因，从而使得能够通过诱导在特定基因组位置刺激易错非同源末端连接(nhej)或同源定向修复(hdr)的dna双链断裂(dsb)而进行广泛的遗传修饰。锌指核酸酶(zfn)和转录激活子样效应子核酸酶(talen)是由与非特异性dna切割区域连接的可编程的、序列特异性dna结合模块组成的嵌合核酸酶。它们是通过将锌指或tal效应子dna结合结构域融合到dna切割结构域而产生的人造限制性酶(re)。可以工程化锌指(zf)或转录激活子样效应子(tale)以结合任何期望靶dna序列，并融合到re的dna切割结构域，从而产生对期望靶dna序列具有特异性的工程限制性酶(zfn或talen)。在将zfn/talen引入到细胞中时，例如植入前胚胎的细胞(例如合子)，它可以用于原位基因组编辑。实际上，zfn和talen的多功能性可以扩展到除核酸酶以外的效应子结构域，例如转录激活子和抑制子、重组酶、转座酶、dna和组蛋白甲基转移酶以及组蛋白乙酰转移酶，以影响基因组结构和功能。cys2-his2锌指结构域是真核生物中发现的dna结合基序的最常见类型之一，代表人类基因组中第二经常编码的蛋白质结构域。个体锌指具有保守ββα构型的约30个氨基酸。用于特异性dna识别的锌指蛋白的应用的关键是含有多于三个锌指结构域的非天然阵列的开发。这一进步通过基于结构发现高度保守的接头序列而得以促进，该接头序列使得能够构建识别长度为9-18bp的dna序列的合成锌指蛋白。这种设计已经被证明是构建识别在复杂基因组中具有特异性的连续dna序列的锌指蛋白的最佳策略。适合的锌指可以通过模块化装配方法获得(例如使用通过选择大型组合文库或通过合理设计产生的锌指模块的预选文库)。已经开发了识别几乎所有64种可能的核苷酸三联体的锌指结构域，预选的锌指模块可以串联在一起以靶向含有一系列这些dna三联体的dna序列。或者，基于选择的方法，例如寡聚体库工程(open)，可用于从考虑到相邻指之间的上下文依赖性相互作用的随机文库中选择新的锌指阵列。还使用了两种方法的组合。工程化锌指是可商购的。sangamobiosciences(richmond,ca,usa)与sigma-aldrich(st.louis,mo,usa)合作开发了一种用于锌指构建的适合平台(compozr)，该平台允许研究人员完全避开锌指构建和验证，并且已经有数千种蛋白可用。广泛地，锌指蛋白技术使得能够靶向几乎任何序列。tal效应子是由植物致病性黄单胞菌属细菌分泌的蛋白，具有含有重复的高度保守的33-34氨基酸序列的dna结合结构域，第12和第13位氨基酸除外。这两个位置是高度可变的(重复可变双残基或rvd)并且显示与特异性核苷酸识别的强相关性。氨基酸序列与dna识别之间的这种简单关系已经允许通过选择含有适合rvd的重复区段的组合对特定dna结合结构域进行工程化。像锌指那样，模块化tale重复连接在一起以识别连续dna序列。已经使众多效应子结构域可用于针对所靶向的遗传修饰融合到tale重复，包括核酸酶、转录激活子和位点特异性重组酶。定制的tale阵列的快速组装可以通过使用包括“金门”分子克隆、高通量固相组装和连接非依赖性克隆技术的策略实现，均可用于本发明中对克隆干细胞进行基因组编辑。tale重复可以使用本领域中可用的众多工具容易地组装，例如靶向18,740个人类蛋白编码基因的talen文库(kim等.,nat.biotechnol.,31:251–258(2013))。定制设计的tale阵列也可通过例如cellectisbioresearch(paris,france)、transposagenbiopharmaceuticals(lexington,ky,usa)和lifetechnologies(grandisland,ny,usa)商购。来自re(例如foki内切核酸酶(或foki切割结构域变体，例如sharkey，具有旨在改善切割特异性和/或切割活性的突变))的末端的非特异性dna切割结构域可用于构建在酵母试验中有活性(在植物细胞和动物细胞中也有活性)的杂交核酸酶。为了提高zfn活性，可以使用瞬时低温培养条件以增加核酸酶表达水平；也可以使用位点特异性核酸酶与dna末端加工酶的共递送，和允许zfn和talen修饰细胞富集的荧光替代报告体载体的使用。zfn介导的基因组编辑的特异性也可以通过使用锌指切口酶(zfnickase)改善，这利用切口dna的诱导刺激hdr而不激活易错nhej修复途径的发现。氨基酸序列与tale结合结构域的dna识别之间的简单关系允许可设计的蛋白。可以使用可公开获得的软件程序(dnaworks)计算适合在两步pcr中组装的寡核苷酸。本领域还已经报道和已知用于产生工程化tale构造体的许多模块化组装方案。这两种方法都提供了对dna结合结构域进行工程化的系统途径，其在概念上类似于用于产生锌指dna识别结构域的模块化组装方法。一旦已经组装了talen基因，使用任何本领域公认的方法，例如使用阳离子脂质基试剂，使用质粒载体，各种病毒载体如腺病毒、aav以及整合酶缺陷型慢病毒载体(idlv)的电穿孔或转染，将它们引入至载体上的靶细胞中。或者，talen可以作为mrna递送至细胞，这消除了talen表达蛋白的基因组整合的可能性。它也可以显著增加基因编辑过程中同源定向修复(hdr)的水平和基因渗入的成功。最后，还可以使用纯化的zfn/talen蛋白直接递送到细胞中。该方法不具有插入诱变的风险，并且导致比依赖从核酸表达的递送系统更少的脱靶效应，并且因此可以最佳地用于需要细胞中的精确基因组工程的研究，例如即时干细胞。在本文所述实施方式中的任一项中，根据本发明的电穿孔方法可以将talen基因、mrna或蛋白引入至配子和植入前胚胎。talen可用于通过诱导双链断裂(dsb)而编辑基因组，其细胞响应于修复机制。非同源末端连接(nhej)重新连接来自双链断裂的任一侧的dna，在那里很少有或没有序列重叠用于退火。可以运行简单的异源双链核酸分子断裂试验，其检测通过pcr扩增的两个等位基因之间的任何差异。切割产物可以在简单的琼脂糖凝胶或平板凝胶系统上显现。或者，可以通过nhej在外源双链dna片段的存在下将dna引入基因组。同源定向修复也可以在dsb处引入外源dna，因为转染的双链序列可用作修复酶的模板。已经使用talen以产生稳定修饰的人胚胎干细胞和诱导多能干细胞(ipsc)克隆以产生敲除的秀丽隐杆线虫、大鼠和斑马鱼。zfn和talen能够纠正疾病的根本原因，从而用精准的基因组修饰永久地消除症状。例如，zfn诱导的hdr已经用于通过修复缺陷靶基因或通过敲除靶基因，直接纠正与x连锁重度联合免疫缺陷(scid)、血友病b、镰状细胞病、α1-抗胰蛋白酶缺陷和许多其他遗传疾病相关的致病突变。此外，这些位点特异性核酸酶还可用于在靶动物基因组中的特定“安全港”位置处将治疗性转基因安全地插入受试者配子或植入前胚胎。这样的技术可用于基因疗法以“纠正”给定动物基因组中的特定遗传缺陷。或者，crispr/csa系统也可用于有效地将靶向遗传改变诱导到受试者配子和植入前胚胎中。crispr/cas(crispr相关)系统或“规律成簇的间隔短回文重复“是包含多个短的直接重复的基因座，并为细菌和古菌提供获得性免疫。crispr系统依赖crrna和tracrrna对入侵的外源dna进行序列特异性沉默。术语“tracrrna”表示反式激活嵌合rna，其是促进crrna加工的非编码rna，并且是激活通过cas9进行rna指导切割所需要的。crisprrna或crrna与tracrrna碱基配对以形成引导cas9内切酶至互补dna位点进行切割的双rna结构。存在三种类型的crispr/cas系统：在ii型系统中，cas9作为rna指导的dna核酸内切酶，其在crrna-tracrrna靶标识别时切割dna。在细菌中，crispr系统通过rna指导的dna切割提供对抗侵入的外源dna的获得性免疫。可以通过重新设计crrna而使crispr/cas系统重新靶向以切割几乎任何dna序列。实际上，已经显示crispr/cas系统可以通过共递送表达cas9核酸内切酶和必需crrna组分的质粒直接移动到人细胞。这些可编程的rna指导的dna核酸内切酶已经展示了多重基因破坏能力和在ips细胞中靶向整合，因此可以在本发明方法中类似地使用。任何crispr/cas系统，包括相关cas蛋白和rna指导序列，以及它们的编码序列(例如cas9的mrna或指导rna的编码序列)或包含这样的编码序列的载体可与本发明的方法一起使用。参见美国2014-0068797a1和美国专利no.8,697,359中描述的那些(均通过引用并入本文)。在下面的描述中，rna指导序列也称为“dna靶向rna”，其包含靶向序列，并与修饰多肽(例如cas9)一起提供靶dna和/或与靶dna相关的多肽的位点特异性修饰。在下面的描述中，crispr/cas系统中的cas9型蛋白也称为“位点特异性修饰多肽”。dna靶向rna将相关多肽(例如定点修饰多肽)的活性引导至靶dna内的特异性靶序列。本发明的dna靶向rna包含：第一区段(本文中也称为“dna靶向区段”或“dna靶向序列”)和第二区段(本文中也称为“蛋白结合区段”或“蛋白结合序列”)。dna靶向rna的dna靶向区段包含与靶dna中的序列互补的核苷酸序列。本发明的dna靶向rna的dna靶向区段通过杂交(例如碱基配对)以序列特异性方式与靶dna相互作用。因此，dna靶向区段的核苷酸序列可以变化并且确定在靶dna内dna靶向rna将与靶dna相互作用的位置。可以修改dna靶向rna的dna靶向区段(例如通过基因工程)以与靶dna内的任何期望序列杂交。dna靶向区段可以具有约12个核苷酸至约100个核苷酸的长度。例如，dna靶向区段可以具有约12个核苷酸(nt)至约80nt、约12nt至约50nt、约12nt至约40nt、约12nt至约30nt、约12nt至25nt、约12nt至约20nt或约12nt至约19nt的长度。例如，dna靶向区段可以具有约19nt至约20nt、约19nt至约25nt、约19nt至约30nt、约19nt至约35nt、约19nt至约40nt、约19nt至约45nt、约19nt至约50nt、约19nt至约60nt、约19nt至约70nt、约19nt至约80nt、约19nt至约90nt、约19nt至约100nt、约20nt至约25nt、约20nt至约30nt、约20nt至约35nt、约20nt至约40nt、约20nt至约45nt、约20nt至约50nt、约20nt至约60nt、约20nt至约70nt、约20nt至约80nt、约20nt至约90nt或约20nt至约100nt的长度。与靶dna的核苷酸序列(靶序列)互补的dna靶向区段的核苷酸序列(dna靶向序列)可以具有至少约12nt的长度。例如，与靶dna的靶序列互补的dna靶向区段的dna靶向序列可以具有至少约12nt、至少约15nt、至少约18nt、至少约19nt、至少约20nt、至少约25nt、至少约30nt、至少约35nt或至少约40nt的长度。例如，与靶dna的靶序列互补的dna靶向区段的dna靶向序列可以具有约12个核苷酸(nt)至约80nt、约12nt至约50nt、约12nt至约45nt、约12nt至约40nt、约12nt至约35nt、约12nt至约30nt、约12nt至约25nt、约12nt至约20nt、约12nt至约19nt、约19nt至约20nt、约19nt至约25nt、约19nt至约30nt、约19nt至约35nt、约19nt至约40nt、约19nt至约45nt、约19nt至约50nt、约19nt至约60nt、约20nt至约25nt、约20nt至约30nt、约20nt至约35nt、约20nt至约40nt、约20nt至约45nt、约20nt至约50nt或约20nt至约60nt的长度。与靶dna的核苷酸序列(靶序列)互补的dna靶向区段的核苷酸序列(dna靶向序列)可以具有至少约12nt的长度。在一些实施方式中，与靶dna的靶序列互补的dna靶向区段的dna靶向序列长度为20个核苷酸。在一些实施方式中，与靶dna的靶序列互补的dna靶向区段的dna靶向序列长度为19个核苷酸。dna靶向区段的dna靶向序列与靶dna的靶序列之间的互补性百分比可以为至少60％(例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)。在一些实施方式中，dna靶向区段的dna靶向序列与靶dna的靶序列之间的互补性百分比在靶dna的互补链的靶序列的七个连续最多5个(contiguous5’-most)核苷酸上为100％。在一些实施方式中，dna靶向区段的dna靶向序列与靶dna的靶序列之间的互补性百分比在约20个连续核苷酸上为至少60％。在一些实施方式中，dna靶向区段的dna靶向序列与靶dna的靶序列之间的互补性百分比在靶dna的互补链的靶序列的十四个连续最多5个核苷酸上为100％，并且在其余部分上为低至0％。在这样的实施方式中，dna靶向序列可以认为是长度为14个核苷酸。在一些实施方式中，dna靶向区段的dna靶向序列与靶dna的靶序列之间的互补性百分比在靶dna的互补链的靶序列的七个连续最多5个核苷酸上为100％，并且在其余部分上为低至0％。在这种情况下，dna靶向序列可以认为是长度为7个核苷酸。本发明的dna靶向rna的蛋白结合区段与定点修饰多肽相互作用。本发明的dna靶向rna通过上述dna靶向区段将结合的多肽引导到靶dna内的特定核苷酸序列。本发明的dna靶向rna的蛋白结合区段包含彼此互补的两段核苷酸。蛋白结合区段的互补核苷酸杂交以形成双链rna双链体(dsrna)。本发明的双分子dna靶向rna包含两个单独的rna分子。本发明的双分子dna靶向rna的两个rna分子中的每一个包含彼此互补的核苷酸段，使得两个rna分子的互补核苷酸杂交以形成蛋白结合区段的双链rna双链体。在一些实施方式中，激活子-rna的双链体形成区段与激活子-rna(tracrrna)分子(例如美国2014-0068797a1的seqidno:431-562所述，通过引用并入)之一或其补体在至少8个连续核苷酸段上至少约60％相同。例如，激活子-rna的双链体形成区段(或编码激活子-rna的双链体形成区段的dna)与美国2014-0068797a1的seqidno:431-562所述的tracrrna序列之一或其补体在至少8个连续核苷酸段上至少约60％相同、至少约65％相同、至少约70％相同、至少约75％相同、至少约80％相同、至少约85％相同、至少约90％相同、至少约95％相同、至少约98％相同、至少约99％相同或100％相同。在一些实施方式中，靶向体-rna的双链体形成区段与美国2014-0068797a1的seqidno:563-679(通过引用并入)所述的靶向体-rna(crrna)序列之一或其补体在至少8个连续核苷酸段上至少约60％相同。例如，靶向体-rna的双链体形成区段(或编码靶向体-rna的双链体形成区段的dna)与美国2014-0068797a1的seqidno:563-679所述的crrna序列之一或其补体在至少8个连续核苷酸段上至少约65％相同、至少约70％相同、至少约75％相同、至少约80％相同、至少约85％相同、至少约90％相同、至少约95％相同、至少约98％相同、至少约99％相同或100％相同。可以设计两分子dna靶向rna以允许靶向体-rna与激活子-rna受控(即，有条件)结合。因为两分子dna靶向rna除非激活子-rna和靶向体-rna两者与dcas9结合成功能性复合物，否则不起作用，所以可以通过使激活子-rna与靶向体-rna之间的结合可诱导而使两分子dna靶向rna可诱导(例如，可药物诱导)。作为一个非限制性实例，rna适体可用于调节(即控制)激活子-rna与靶向体-rna的结合。因此，激活子-rna和/或靶向体-rna可以包含rna适体序列。rna适体是本领域已知的并且通常是核糖开关的合成版本。术语“rna适体”和“核糖开关”在本文中可互换使用以涵盖合成和天然核酸序列，其提供它们所属的rna分子的结构的可诱导性调节(并因此提供特定序列的可利用性)。rna适体通常包含折叠成特定结构(例如发夹)的序列，其特异性结合特定药物(例如小分子)。药物的结合导致rna折叠的结构变化，其改变适体所属核酸的特征。作为非限制性实例：(i)具有适体的激活子-rna可能不能结合到关联靶向体-rna，除非适体被适合的药物结合；(ii)具有适体的靶向体-rna可能不能结合到关联激活子-rna，除非适体被适合的药物结合；和(iii)各自包含结合不同药物的不同适体的靶向体-rna和激活子-rna可能不能彼此结合，除非这两种药物都存在。如这些实例所说明的，可以将两分子dna靶向rna设计为可诱导的。可以例如在nakamura等.,genescells,2012年5月,17(5):344-364；vavalle等.,futurecardiol.,2012年5月,8(3):371-382；citartan等.,biosens.bioelectron.,2012年4月15日,34(1):1-11以及liberman等.,wileyinterdiscip.rev.rna,2012年5月至6月,3(3):369-384中发现适体和核糖开关的实例；其均通过引用全文并入本文。可以包含在两分子dna靶向rna中的核苷酸序列的非限制性实例包括与美国2014-0068797a1的seqidno:563-679所述的任何序列或其补体配对的美国2014-0068797a1的seqidno:431-562所述的序列或其补体中的任一个，其可以杂交以形成蛋白结合区段。单分子dna靶向rna包含两段核苷酸(靶向体-rna和激活子-rna)，其彼此互补、通过中间核苷酸(“接头”或“接头核苷酸”)共价连接、并且杂交以形成蛋白结合区段的双链rna双链体(dsrna双链体)，从而产生茎环结构。靶向体-rna和激活子-rna可以经由靶向体-rna的3’端和激活子-rna的5’端共价连接。或者，靶向体-rna和激活子-rna可以经由靶向体-rna的5’端和激活子-rna的3’端共价连接。单分子dna靶向rna的接头可以具有约3个核苷酸至约100个核苷酸的长度。例如，接头可以具有约3个核苷酸(nt)至约90nt、约3个核苷酸(nt)至约80nt、约3个核苷酸(nt)至约70nt、约3个核苷酸(nt)至约60nt、约3个核苷酸(nt)至约50nt、约3个核苷酸(nt)至约40nt、约3个核苷酸(nt)至约30nt、约3个核苷酸(nt)至约20nt或约3个核苷酸(nt)至约10nt的长度。例如，接头可以具有约3nt至约5nt、约5nt至约10nt、约10nt至约15nt、约15nt至约20nt、约20nt至约25nt、约25nt至约30nt、约30nt至约35nt、约35nt至约40nt、约40nt至约50nt、约50nt至约60nt、约60nt至约70nt、约70nt至约80nt、约80nt至约90nt或约90nt至约100nt的长度。在一些实施方式中，单分子dna靶向rna的接头是4nt。示例性单分子dna靶向rna包含杂交以形成dsrna双链体的两个互补核苷酸段。在一些实施方式中，单分子dna靶向rna的两个互补核苷酸段之一(或编码该段的dna)与美国2014-0068797a1的seqidno:431-562所述的激活子-rna(tracrrna)分子之一或其补体在至少8个连续核苷酸段上至少约60％相同。例如，单分子dna靶向rna的两个互补核苷酸段之一(或编码该段的dna)与美国2014-0068797a1的seqidno:431-562所述的tracrrna序列之一或其补体在至少8个连续核苷酸段上至少约65％相同、至少约70％相同、至少约75％相同、至少约80％相同、至少约85％相同、至少约90％相同、至少约95％相同、至少约98％相同、至少约99％相同或100％相同。在一些实施方式中，单分子dna靶向rna的两个互补核苷酸段之一(或编码该段的dna)与seqidno:563-679所述的靶向体-rna(crrna)序列之一或其补体在至少8个连续核苷酸段上至少约60％相同。例如，单分子dna靶向rna的两个互补核苷酸段之一(或编码该段的dna)与美国2014-0068797a1的seqidno:563-679所述的crrna序列之一或其补体在至少8个连续核苷酸段上至少约65％相同、至少约70％相同、至少约75％相同、至少约80％相同、至少约85％相同、至少约90％相同、至少约95％相同、至少约98％相同、至少约99％相同或100％相同。在确定适当的关联对时，通过考虑到物种名称和碱基配对(对于蛋白结合结构域的dsrna双链体)，对于美国2014-0068797a1的seqidno:431-679可以常规地确定crrna和tracrrna的适当的天然存在的关联对。关于单分子dna靶向rna和双分子dna靶向rna两者，与天然存在的tracrrna和crrna很少共有(约50％同一性)的人工序列可以与cas9起作用以切割靶dna，只要dna靶向rna的蛋白结合结构域的结构是保守的。因此，为了设计人工蛋白结合结构域(双分子或单分子版本)，可以将dna靶向rna的天然存在的蛋白结合结构域的rna折叠结构纳入考虑。作为非限制性实例，可以基于天然存在dna靶向rna的蛋白结合区段的结构(例如包括相同数目的沿着rna双链体的碱基对，并且包括与天然存在的rna中存在的相同的“凸起”区域)，设计功能性人工dna靶向rna。由于本领域普通技术人员可以容易地为来自任何物种的任何天然存在的crrna:tracrrna对(参见美国2014-0068797a1的seqidno:431-679，来自广泛物种的crrna和tracrrna序列)产生结构，在使用来自那些物种的cas9(或相关的cas9)时，可以设计人工dna靶向rna以模拟给定物种的天然结构。因此，适合的dna靶向rna可以是人工设计的rna(非天然存在的)，其包含设计为模拟天然存在的dna靶向rna(参见美国2014-0068797a1的seqidno:431-679，在确定适当的关联对时考虑到物种名称)的蛋白结合结构域的结构的蛋白结合结构域。蛋白结合区段可以具有约10个核苷酸至约100个核苷酸的长度。例如，蛋白结合区段可以具有约15个核苷酸(nt)至约80nt、约15nt至约50nt、约15nt至约40nt、约15nt至约30nt或约15nt至约25nt的长度。同样关于单分子dna靶向rna和双分子dna靶向rna两者，蛋白结合区段的dsrna双链体可以具有6个碱基对(bp)至约50bp的长度。例如，蛋白结合区段的dsrna双链体可以具有约6bp至约40bp、约6bp至约30bp、约6bp至约25bp、约6bp至约20bp、约6bp至约15bp、约8bp至约40bp、约8bp中约30bp、约8bp中约25bp、约8bp至约20bp或约8bp至约15bp的长度。例如，蛋白结合区段的dsrna双链体可以具有约8bp至约10bp、约10bp至约15bp、约15bp至约18bp、约18bp至约20bp、约20bp至约25bp、约25bp至约30bp、约30bp至约35bp、35bp至约40bp或40bp至约50bp的长度。在一些实施方式中，蛋白结合区段的dsrna双链体具有36个碱基对的长度。杂交以形成蛋白结合区段的dsrna双链体的核苷酸序列之间的互补性百分比可以为至少约60％。例如，杂交以形成蛋白结合区段的dsrna双链体的核苷酸序列之间的互补性百分比可以为至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或至少约99％。在一些情况下，杂交以形成蛋白结合区段的dsrna双链体的核苷酸序列之间的互补性百分比为100％。dna靶向rna和定点修饰多肽形成复合物。dna靶向rna通过包含与靶dna的序列(如上所述)互补的核苷酸序列为复合物提供靶特异性。复合物的定点修饰多肽提供位点特异性活性。换句话说，通过定点修饰多肽与dna靶向rna的至少蛋白结合区段的关联，将定点修饰多肽引导到dna序列(例如染色体序列或染色体外序列，例如附加体序列、微环序列、线粒体序列、叶绿体序列等)。定点修饰多肽修饰靶dna(例如靶dna的切割或甲基化)和/或与靶dna相关的多肽(例如组蛋白尾的甲基化或乙酰化)。定点修饰多肽在本文中也称为“定点多肽”或“rna结合定点修饰多肽”。在一些实施方式中，定点修饰多肽是天然存在的修饰多肽。在其他情况下，定点修饰多肽不是天然存在的多肽(例如，如下所述的嵌合多肽，或者经例如突变、缺失、插入修饰的天然存在的多肽)。示例性天然存在的定点修饰多肽在美国2014-0068797a1的seqidno:1-255中(通过引用并入)作为天然存在的cas9/csn1内切核酸酶的非限制性和非穷尽性列表列出。如本文公开的这些天然存在的多肽与dna靶向rna结合，从而指向靶dna内的特定序列，并切割靶dna以产生双链断裂。定点修饰多肽包含两部分：rna结合部分和活性部分。在一些实施方式中，定点修饰多肽包含：(i)与dna靶向rna相互作用的rna结合部分，其中dna靶向rna包含与靶dna中的序列互补的核苷酸序列；和(ii)显示定点酶活性(例如用于dna甲基化的活性、用于dna切割的活性、用于组蛋白乙酰化的活性、用于组蛋白甲基化的活性等)的活性部分，其中酶活性的位点由dna靶向rna确定。在其他实施方式中，定点修饰多肽包含：(i)与dna靶向rna相互作用的rna结合部分，其中dna靶向rna包含与靶dna中的序列互补的核苷酸序列；和(ii)调节靶dna内的转录(例如增加或减少转录)的活性部分，其中靶dna内调节的转录的位点由dna靶向rna确定。在一些实施方式中，定点修饰多肽具有修饰靶dna的酶活性(例如核酸酶活性、甲基转移酶活性、脱甲基酶活性、dna修复活性、dna损伤活性、脱氨基活性、歧化酶活性、烷基化活性、脱嘌呤活性、氧化活性、嘧啶二聚体形成活性、整合酶活性、转座酶活性、重组酶活性、聚合酶活性、连接酶活性、解旋酶活性、光解酶活性或糖基化酶活性)。在其他情况下，本发明定点修饰多肽具有修饰与靶dna相关的多肽(例如组蛋白)的酶活性(例如甲基转移酶活性、脱甲基酶活性、乙酰转移酶活性、脱乙酰酶活性、激酶活性、磷酸酶活性、泛素连接酶活性、去泛素化活性、腺苷酸化活性、脱腺苷化活性、sumo化活性、去sumo化活性、核糖基化活性、脱核糖基活性、豆蔻酰化活性或脱豆蔻酰化活性)。下文进一步提供示例性定点修饰多肽。具体地，在一些实施方式中，定点修饰多肽包含氨基酸序列，其与美国2014-0068797a1的图3中所示的cas9/csn1氨基酸序列的氨基酸7-166或731-1003，或与美国2014-0068797a1的seqidno:1-256和795-1346所述的氨基酸序列中的任一个的相应部分(均通过引用并入本文)具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或100％的氨基酸序列同一性。在一些实施方式中，核酸(例如dna靶向rna)包含一个或多个修饰，例如碱基修饰、主链修饰等，以为核酸提供新的或增强的特征(例如改进的稳定性)。如本领域已知的，核苷是碱基-糖组合。核苷的碱基部分通常是杂环碱基。这样的杂环碱基的两个最常见的类别是嘌呤和嘧啶。核苷酸是进一步包含与核苷的糖部分共价连接的磷酸基团的核苷。对于包含戊呋喃糖的那些核苷，磷酸基团可以连接到糖的2’、3’或5’羟基部分。在形成寡核苷酸时，磷酸基团将相邻的核苷酸彼此共价连接以形成线性聚合化合物。进而，该线性聚合化合物的各自末端可以进一步连接形成环状化合物，然而，线性化合物通常是适合的。此外，线性化合物可以具有内部核苷酸碱基互补性，并且因此可以以产生完整或部分双链化合物的方式折叠。在寡核苷酸内，磷酸基团通常涉及形成寡核苷酸的核苷间主链。rna和dna的正常连接或主链是3’至5’磷酸二酯键。含有修饰的适合核酸的实例包括含有修饰主链或非天然核苷间键的核酸。具有修饰主链的核酸包括在主链中保留磷原子的那些和在主链中不具有磷原子的那些。其中含有磷原子的适合的修饰寡核苷酸主链包括例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯(包括3’-亚烷基膦酸酯、5'-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、次膦酸酯、氨基磷酸酯(包括3’-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酰酯)、二氨基磷酸酯、硫羰基氨基磷酸酯、硫羰基烷基膦酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯、具有正3’-5’键的硒代磷酸酯和硼代三磷酸酯、这些的2’-5’连接的类似物、以及具有反向极性的那些，其中一个或多个核苷酸间键是3’至3’、5’至5’或2’至2’键。具有反向极性的适合的寡核苷酸包含在最3’-端核苷酸间键处的单个3’至3’键，例如单个倒置核苷残基，其可以是基本单元(核碱基缺失或具有代替其的羟基)。还包括各种盐(例如钾或钠)、混合盐和游离酸形式。在一些实施方式中，本发明核酸包含一个或多个硫代磷酸酯和/或杂原子核苷间键，特别是-ch2-nh-o-ch2-、-ch2-n(ch3)-o-ch2-(称为亚甲基(甲基亚氨基)或mmi主链)、-ch2-o-n(ch3)-ch2-、-ch2-n(ch3)-n(ch3)-ch2-和-o-n(ch3)-ch2-ch2-(其中天然磷酸二酯核苷酸间键表示为-o-p(＝o)(oh)-o-ch2-)。mmi型核苷间键在上述美国专利号5,489,677中公开。适合的酰胺核苷间键在美国专利号5,602,240中公开。两者均通过引用并入。还适合的是具有吗啉主链结构的核酸，如例如美国专利号5,034,506中所述(通过引用并入)。例如，在一些实施方式中，本发明核酸包含代替核糖环的6元吗啉环。在这些实施方式的一些中，二氨基磷酸酯或其他非磷酸二酯核苷间键代替磷酸二酯键。其中不含磷原子的适合的修饰聚核苷酸主链具有由短链烷基或环烷基核苷间键、混合杂原子和烷基或环烷基核苷间键、或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键形成的主链。这些包括具有吗啉键(部分由核苷的糖部分形成)；硅氧烷主链；硫化物、亚砜和砜主链；甲酰乙酰和硫代甲酰乙酰主链；亚甲基甲酰乙酰和硫代甲酰乙酰主链；核糖乙酰主链；含烯烃的主链；氨基磺酸盐主链；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基主链；磺酸酯和磺酰胺主链；酰胺主链的那些；和具有混合的n、o、s和ch2组分部分的其他。本发明的核酸也可以是核酸模拟物。术语“模拟物”在其应用于聚核苷酸时旨在包括其中仅呋喃糖环或呋喃糖环和核苷酸间键两者均被非呋喃糖基团替换的聚核苷酸，仅替换呋喃糖环在本领域也称为糖代替。杂环碱基部分或修饰的杂环碱基部分保持与适合的靶核酸杂交。一种这样的核酸，已经显示具有优异杂交性质的聚核苷酸模拟物，称为肽核酸(pna)。pna化合物中的主链是两个或更多个连接的氨基乙基甘氨酸单元，其给予pna含酰胺的主链。杂环碱基部分直接或间接地结合到主链的酰胺部分的氮杂氮原子上。描述pna化合物制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利号5,539,082、5,714,331和5,719,262。全部通过引用并入。已经研究的另一类聚核苷酸模拟物是基于具有连接到吗啉环的杂环碱基的连接的吗啉单元(吗啉核酸)。已经报道了连接吗啉核酸中的吗啉单体单元的许多连接基团。已经选择一类连接基团以提供非离子低聚化合物。非离子吗啉基低聚化合物不太可能具有与细胞蛋白质不期望的相互作用。吗啉基聚核苷酸是寡核苷酸的非离子模拟物，其不太可能与细胞蛋白质形成不期望的相互作用(dwainea.braasch和davidr.corey,biochemistry,41(14):4503-4510(2002))。吗啉基聚核苷酸在美国专利号5,034,506(通过引用并入)中公开。已经制备了吗啉类的聚核苷酸中的各种化合物，其具有连接单体亚基的多种不同连接基团。另一类聚核苷酸模拟物称为环己烯基核酸(cena)。通常存在于dna/rna分子中的呋喃糖环被环己烯基环代替。已经制备了cenadmt保护的亚磷酰胺单体，其用于根据经典亚磷酰胺化学的低聚化合物合成。已经制备并研究了完全修饰的cena低聚化合物和具有由cena修饰的特定位置的寡核苷酸(参见wang等,j.am.chem.soc.,122:8595-8602(2000)，通过引用并入)。通常将cena单体引入dna链增加其dna/rna杂交体的稳定性。cena寡腺苷酸化物与rna和dna互补物形成复合物，具有与天然复合物相似的稳定性。通过nmr和圆二色性显示将cena结构引入天然核酸结构的研究，以继续进行容易的构象适应。另外的修饰包括锁核酸(lan)，其中2’-羟基基团连接到糖环的4’碳原子上，从而形成2’-c,4’-c-氧亚甲基连接，从而形成双环糖部分。连接可以是桥连2’氧原子和4’碳原子的亚甲基(-ch2-)基团，其中n是1或2(singh等,chem.commun.,4:455-456(1998))。lna和lna类似物显示出与互补dna和rna非常高的双链体热稳定性(tm＝+3至+10℃)、对于3’-外切核酸酶降解的稳定性和良好的溶解性。已经描述了含有lna的有效且无毒的反义寡核苷酸(wahlestedt等,proc.natl.acad.sci.u.s.a.,97:5633-5638(2000)，通过引用并入)。已经描述了lna单体腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、5-甲基-胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶的合成和制备，及其低聚以及核酸识别性质(koshkin等,tetrahedron,54:3607-3630(1998)，通过引用并入)。lna及其制备也在wo98/39352和wo99/14226中描述，均通过引用并入本文。核酸也可以包含一个或多个取代的糖部分。适合的聚核苷酸包含选自以下的糖取代基团：oh；f；o-、s-或n-烷基；o-、s-或n-烯基；o-、s-或n-炔基；或o-烷基-o烷基，其中烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的c1-10烷基或c2-10烯基和炔基。特别适合的是o((ch2)no)mch3、o(ch2)noch3、o(ch2)nnh2、o(ch2)nch3、o(ch2)nonh2和o(ch2)non((ch2)nch3)2，其中n和m为1至约10。其他适合的聚核苷酸包含选自以下的糖取代基团：c1-10低级烷基、取代的低级烷基、烯基、炔基、烷芳基、芳烷基、o-烷芳基或o-芳烷基、sh、sch3、ocn、cl、br、cn、cf3、ocf3、soch3、so2ch3、ono2、no2、n3、nh2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、多烷基氨基、取代的甲硅烷基、rna切割基团、报道体基团、嵌入体、用于改善寡核苷酸的药代动力学性质的基团或用于改善寡核苷酸的药效学的基团、以及具有相似性质的其他取代基。适合的修饰包括2'-甲氧基乙氧基(2’-o--ch2ch2och3，也称为2'-o-(2-甲氧基乙基)或2'-moe)(martin等,helv.chim.acta,78:486-504(1995))，即烷氧基烷氧基基团。另外的适合修饰包括2’-二甲基氨基氧乙氧基，即o(ch2)2on(ch3)2基团，也称为2’-dmaoe，如在下文实施例中所述，以及2’-二甲基氨基乙氧基乙氧基(本领域中也称为2’-o-二甲基-氨基-乙氧基-乙基或2’-dmaeoe)，即2’-o-ch2-o-ch2-n(ch3)2。其他适合的糖取代基团包括甲氧基(-o-ch3)、氨基丙氧基(-och2ch2ch2nh2)、烯丙基(-ch2-ch＝ch2)、-o-烯丙基(-o-ch2ch＝ch2)和氟(f)。2’-糖取代基团可以在阿拉伯糖(上)位置或核糖(下)位置。适合的2’-阿拉伯糖修饰是2’-f。也可以在低聚化合物的其他位置，特别是3’端核苷上或在2’-5’连接的寡核苷酸中的糖的3’位和5’端核苷酸的5’位进行类似的修饰。低聚化合物也可以具有代替戊呋喃糖的糖模拟物，例如环丁基部分。本发明的核酸还可以包含核碱基(在本领域中通常简称为“碱基”)修饰或置换。如本文所用，“未修饰的”或“天然的”核碱基包括嘌呤碱基：腺嘌呤(a)和鸟嘌呤(g)，和嘧啶碱基：胸腺嘧啶(t)、胞嘧啶(c)和尿嘧啶(u)。修饰的核碱基包括其他合成和天然核碱基，例如5-甲基胞嘧啶(5-me-c)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、嘧啶碱基的5-丙炔基(-c＝c-ch3)尿嘧啶和胞嘧啶和其他炔基衍生物、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶；8-卤代、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代腺嘌呤和鸟嘌呤；5-卤代特别是5-溴代、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶；7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-f-腺嘌呤、2-氨基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮杂鸟嘌呤和7-脱氮杂腺嘌呤和3-脱氮杂鸟嘌呤和3-脱氮杂腺嘌呤。另外的修饰核碱基包括三环嘧啶，例如酚噁嗪胞苷(1h-嘧啶并(5,4-b)(1,4)苯并噁嗪-2(3h)-酮)、吩噻嗪胞苷(1h-嘧啶并(5,4-b)(1,4)苯并噻嗪-2(3h)-酮)；g-clamps，如取代的吩噁嗪胞苷(例如，9-(2-氨基乙氧基)-h-嘧啶并(5,4-(b)(1,4)苯并噁嗪-2(3h)-酮)、咔唑胞苷(2h-嘧啶并(4,5-b)吲哚-2-酮)、吡啶并吲哚胞苷(h-吡啶并(3’,’:4,5)吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-酮)。杂环碱基部分还可以包括其中嘌呤或嘧啶碱基被其他杂环代替的那些，例如7-脱氮杂-腺嘌呤、7-脱氮杂-鸟苷、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。另外的核碱基包括在美国专利号3,687,808(通过引用并入)中公开的那些，在theconciseencyclopediaofpolymerscienceandengineering,第858-859页,kroschwitz,j.i.,ed.johnwiley&sons,1990中公开的那些；由englisch等,angewandtechemie,国际版,1991,30:613公开的那些；以及由sanghvi,y.s.,第15章,antisenseresearchandapplications,第289-302页,crooke,s.t.和lebleu,b.,ed.,crcpress,1993中公开的那些。这些核碱基中的某些可用于增加低聚化合物的结合亲和力。这些包括5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶和n-2、n-6和o-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已经显示5-甲基胞嘧啶置换使核酸双链体稳定性增加0.6-1.2℃(sanghvi等,eds.,antisenseresearchandapplications,crcpress,bocaraton,1993,第276-278页)，并且是适合的碱基置换，例如在与2’-o-甲氧基乙基糖修饰组合时。本发明的核酸的另一个可能修饰涉及使增强寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄取的一个或多个部分或缀合物化学连接至聚核苷酸。这些部分或缀合物可以包括与官能团如伯或仲羟基共价结合的缀合物基团。缀合物基团包括但不限于嵌入体、报告分子、聚胺、聚酰胺、聚乙二醇、聚醚、增强低聚物的药效学性质的基团、以及增强低聚物的药代动力学性质的基团。适合的缀合物基团包括但不限于胆固醇、脂质、磷脂、生物素、吩嗪、叶酸、菲啶、蒽醌、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素和染料。增强药效学性质的基团包括改善摄取、增强抗降解性和/或加强与靶核酸的序列特异性杂交的基团。增强药代动力学性质的基团包括改善本发明的核酸的摄取、分布、代谢或排泄的基团。缀合物部分包括但不限于脂质部分，例如胆固醇部分(letsinger等,proc.natl.acad.sci.usa,86:6553-6556(1989))；胆酸(manoharan等,bioorg.med.chem.let.,4:1053-1060(1994))；硫醚，例如己基-5-三苯甲基硫醇(manoharan等,ann.n.y.acad.sci.,660:306-309(1992)；manoharan等,bioorg.med.chem.let.,3:2765-2770(1993))；硫代胆固醇(oberhauser等,nucl.acidsres.,20:533-538(1992))；脂肪链，例如十二烷二醇或十一烷基残基(saison-behmoaras等,emboj.,10:1111-1118(1991)；kabanov等,febslett.,259:327-330(1990)；svinarchuk等,biochimie,75:49-54(1993))；磷脂，例如二十六烷基-外消旋-甘油或三乙铵1,2-二-o-十六烷基-外消旋-甘油基-3-h-膦酸酯(manoharan等,tetrahedronlett.,36:3651-3654(1995)；shea等,nucl.acidsres.,18:3777-3783(1990))；聚胺或聚乙二醇链(manoharan等,nucleosides&nucleotides,14:969-973(1995))；或金刚烷乙酸(manoharan等,tetrahedronlett.,36:3651-3654(1995))；棕榈基部分(mishra等,biochim.biophys.acta,1264:229-237(1995))；或者十八胺或己基氨基-羰基-氧胆固醇部分(crooke等,j.pharmacol.exp.ther.,277:923-937(1996))；全部通过引用并入。缀合物可以包括“蛋白转导结构域”或ptd(也称为cpp细胞穿透肽)，其可以指促进穿过脂质双层、胶束、细胞膜、细胞器膜或囊泡膜的多肽、聚核苷酸、碳水化合物或者有机或无机化合物。连接到范围可以从小极性分子到大的大分子和/或纳米颗粒的另一个分子的ptd促进分子穿过膜，例如从细胞外空间到细胞内空间，或从细胞质到细胞器内。在一些实施方式中，ptd共价地连接至外源多肽(例如定点修饰多肽)的氨基末端。在一些实施方式中，ptd共价地连接至外源多肽(例如定点修饰多肽)的羧基末端。在一些实施方式中，ptd共价地连接至核酸(例如dna靶向rna、编码dna靶向rna的聚核苷酸、编码定点修饰多肽的聚核苷酸等)。示例性ptd包括但不限于最小十一肽的蛋白转导结构域(对应于包含ygrkkrrqrrr的hiv-1tat的残基47-57)；包含足以引导进入细胞的大量精氨酸的聚精氨酸序列(例如3、4、5、6、7、8、9、10、或10-50个精氨酸)；vp22结构域(zender等,cancergenether.,9(6):489-496(2002))；果蝇触角足(antennapedia)蛋白转导结构域(noguchi等,diabetes,52(7):1732-1737(2003))；截短的人降钙素肽(trehin等,pharm.research,21:1248-1256(2004))；聚赖氨酸(wender等,proc.natl.acad.sci.usa,97:13003-13008(2000))rrqrrtsklmkr；转运素(transportan)gwtlnsagyllgkinlkalaalakkil；kalaweaklakalakalakhlakalakalkcea；和rqikiwfqnrrmkwkk。示例性ptd包括但不限于ygrkkrrqrrr、rkkrrqrrr；从3个精氨酸残基到50个精氨酸残基的精氨酸均聚物；示例性ptd结构域氨基酸序列包括但不限于以下中的任一种：ygrkkrrqrrr；rkkrrqrr；yaraaarqara；thrlprrrrrr和ggrrarrrrrr。在一些实施方式中，ptd是可激活的cpp(acpp)(aguilera等,integr.biol.(camb),1(5-6):371-381(2009年6月))。acpp包含通过可切割接头连接至匹配的聚阴离子(例如，glu9或“e9”)的聚阳离子cpp(例如，arg9或“r9”)，其使净电荷减少至接近零，从而抑制粘附和摄取到细胞中。在切割接头时，聚阴离子被释放，局部地暴露聚精氨酸及其固有粘性，从而“激活”acpp以穿过膜。示例性dna靶向rna在下文中进一步描述。在一些实施方式中，适合的dna靶向rna包含两个单独的rna聚核苷酸分子。两个单独rna聚核苷酸分子中的第一个(激活子-rna)包含核苷酸序列，其与seqidno:431-562所述核苷酸序列中的任一个或其补体在至少8个连续核苷酸段上具有至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％的核苷序列同一性。两个单独rna聚核苷酸分子中的第二个(靶向体-rna)包含核苷酸序列，其与美国2014-0068797的seqidno:563-679所述核苷酸序列中的任一个或其补体在至少8个连续核苷酸段上具有至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％的核苷酸序列同一性。在一些实施方式中，适合的dna靶向rna是单rna聚核苷酸并且包含第一核苷酸序列，其与美国2014-0068797的seqidno:431-562所述核苷酸序列中的任一个在至少8个连续核苷酸段上具有至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％的核苷酸序列同一性，和第二核苷酸序列，其与美国2014-0068797的seqidno:463-679所述核苷酸序列中的任一个在至少8个连续核苷酸段上具有至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％的核苷酸序列同一性。在一些实施方式中，dna靶向rna是双分子dna靶向rna并且靶向体-rna包含在其5'端连接到与靶dna互补的核苷酸段的序列5’guuuuagagcua-3’。在一些实施方式中，dna靶向rna是双分子dna靶向rna并且激活子-rna包含序列5’uagcaaguuaaaauaaggcuaguccg-3’。在一些实施方式中，dna靶向rna是单分子dna靶向rna并且包含在其5'端连接到与靶dna互补的核苷酸段的序列5’-guuuuagagcua-接头-uagcaaguuaaaauaaggcuaguccg-3’(其中“接头”表示可以包含任何核苷酸序列的任何接头核苷酸序列)。其他示例性单分子dna靶向rna包括美国2014-0068797的seqidno:680-682所述的那些(通过引用并入)。在某些实施方式中，定点修饰多肽(例如cas9)可以组成地或有条件地(例如组织或细胞型特异性地或可诱导地)表达为感兴趣的动物(如小鼠或大鼠)中的转基因，使得只有dna靶向rna或指导序列需要被引入至从这样的动物获得的配子或植入前胚胎中，以在配子或植入前胚胎中提供功能性crispr/cas系统。例如，参见platt等,rispr-cas9knockinmiceforgenomeeditingandcancermodeling,cellhttp://dxdotdoidotorgslash10.1016slashjdotcelldot2014.09.014(通过引用并入)中描述的cre依赖型cas9敲入小鼠，其中使用由腺相关病毒(aab)、慢病毒或颗粒介导的递送方法递送的指导rna，在神经元、免疫细胞和内皮细胞中展示了成功的基因组编辑。cas9型转基因可以由例如普遍存在的启动子(例如cag启动子)驱动，并且可以通过使用cre-loxp系统(例如，具有细胞型或组织特异性cre驱动子)或其本领域公知的等同物或变体使得可诱导。在某些实施方式中，cas9表达动物是可生育的，具有正常产仔数，未表现出形态异常，和/或能够繁殖到纯合性。这样的位点特异性修饰多肽表达动物(例如小鼠或大鼠)结合本发明的高效率、高通量电穿孔方法可用于体内高通量遗传筛选，以例如鉴定涉及众多重要生理过程(例如肿瘤抑制、干细胞更新、病毒复制的宿主决定因素和致癌生长的调节子)中的任一个的基因，并且可以直接结合全基因组或靶向的sgrna文库以发现新的生物学。实施例文本描述的实施例仅出于说明目的，而不是限制性的。然而，实施例中描述的条件可以具有一般适用性，并构成所述发明的具体实施方式，其设想为可与本文所述发明的任何一个或多个其他实施方式组合。遗传修饰小鼠用作研究基因功能和人类疾病的重要模型，并已经主要使用常规基因靶向或转基因技术产生。在典型的常规基因靶向实验中，首先通过同源重组将期望遗传修饰引入小鼠胚胎干(es)细胞，并分离携带预期突变的克隆衍生的es细胞克隆体(capecchi,2005)。随后将靶向的es细胞注射入野生型囊胚中。靶向的es细胞中的一些可以对所得嵌合动物的种系作出贡献，从而产生含有靶向的基因修饰的小鼠(capecchi,2005)。虽然有效，但基因靶向是昂贵且耗时的，并且严重依赖于种系感受态es细胞系的可用性和性能。为了规避对种系感受态es细胞系的需要，已经开发了使用位点特异性dna内切核酸酶，包括锌指核酸酶(zfn)(urnov等,2010)和转录激活子样效应子核酸酶(talen)(bogdanove和voytas,2011)的替代方法，其可以直接注射到单细胞胚胎中以产生具有特定基因破坏的动物(carbery等,2010；geurts等,2009；sung等,2013；tesson等,2011)。在提供单链dna(ssdna)或在双链断裂位点(dsb)侧翼具有同源性的质粒时，可以通过同源重组(hr)将限定修饰引入基因组中(brown等,2013；cui等,2011；meyer等,2010)。最近，使用rna指导的规律成簇的间隔短回文重复(crispr)/crispr相关(cas)核酸酶系统(hsu等,2014)，已经建立了在一个步骤中产生在单个或多个基因中携带突变的小鼠，以及携带报告体和有条件等位基因的小鼠的方法(wang等.,2013；yang等,2013)。使用类似的方法，已经从各种物种产生了遗传修饰动物(chang等,2013；hai等,2014；hwang等,2013；li等,2013a；li等,2013b；niu等,2014)。与传统的产生转基因小鼠的方法类似，这些研究都使用显微注射以将核酸组分递送到单细胞合子中。本文描述的方法使用电穿孔将生物/遗传材料例如crispr/cas系统递送至哺乳动物(例如小鼠)合子，并且成功产生携带靶向的基因修饰的活的转基因动物(例如小鼠)。实施例1用报告体-编码多核苷酸对小鼠合子和假定合子进行电穿孔该实验描述了用报告体-基因编码质粒对小鼠合子或假定合子(简称“合子”)进行电穿孔的结果。本实验选择pmaxgfp载体(lonza，usa)，其携带cmv启动子和支持普遍存在的表达的sv40聚腺苷酸化信号。收集b6d2f2小鼠胚胎并在酸性台氏溶液(at)(p/nt1788，sigmaaldrich)中处理5秒，在kosmaa/bsa(p/nzeks-050,zenithbiotech)中洗涤两次，并放入25μl的opti-mem(p/n31985,lifetechnologies)中。然后将25μl中的胚胎在te缓冲液(10mmtris,0.1mmedta,ph7.5)中与80ng/μl的等体积(25μl)pmaxgfp混合，达到约40ng/μl的最终dna浓度，并将该混合物装入1-mm电击杯中，并使用以下设置进行电穿孔：30伏、脉冲持续时间1毫秒、两个脉冲、脉冲间隔100毫秒(ecm830,btx)。电穿孔后，用100μl的预平衡的kosmaa/bsa回收胚胎，随后在组织培养箱(37℃，5％co2)中培养3.5天。培养3.5天后，在荧光显微镜下观察胚胎的gfp表达。在所检测的3个胚胎中未观察到荧光(实验1)。由于透明带层在实验2和3中可能作为质粒进入合子的物理屏障，申请人寻求通过在带上戳洞、通过除去带或通过在at中处理胚胎10秒，同时将pmaxgfp的浓度从20ng/μl变为40ng/μl、变为100ng/μl而弱化或破坏透明带层。再次，所检测的胚胎中未观察到荧光。其他报道体系统，包括用6-fluoresceinamidite(6-fam)(40、100和500ng/μl)、turbogfpmrna(40ng/μl)、egfpmrna(25ng/μl)或mcherrymrna(40和100ng/μl)标记的寡核苷酸，在所检测的胚胎中没有观察到荧光(实验4、5和6)。仅在一例中观察到具有gfp信号的仅一个胚胎，但该胚胎死亡或发育迟缓。实施例2用crispr/cas系统对小鼠合子和假定合子进行电穿孔该实验展示使用本发明的方法将crispr/cas系统递送至小鼠合子或假定合子(简称“合子”)用于crispr/cas介导的靶向的基因破坏。为此，使用前述的指导rna(wang等,2013，通过引用并入本文)，选择tet1外显子4和tet2外显子3作为靶标。tet1和tet2系统的便利之处是sac1(tet1)或ecorv(tet2)限制性位点与pam(原间隔序列邻近基序)近端序列重叠。因此，使用从包含靶位点的胚胎扩增的pcr产物(wang等,2013)，限制性片段长度多态性(rflp)分析可以用于检测突变等位基因。在实验6中，小鼠b6d2f2合子首先使用at处理10秒，与40/20ng/μl或100/50ng/μl的cas9mrna/tet1sgrna混合，并如上所述进行电穿孔。然后将胚胎培养3.5天直至它们发育成囊胚。然后收获胚胎进行全基因组扩增和pcr分析。使用sac1限制酶通过rflp分析包含靶位点的pcr产物。在使用cas9mrna(40ng/μl)和tet1sgrna(20ng/μl)的混合物时，在从电穿孔的合子发育的胚胎中没有检测到突变。在使用cas9mrna(100ng/μl)和tet1sgrna(50ng/μl)的混合物时，根据rflp分析，发现16个at处理的胚胎中的3个以及16个未经at处理的胚胎中的1个在tet1基因座处携带突变等位基因(图1a)。通过sanger测序进一步证实突变(图1a)。接下来，在实验7中，将甚至更高浓度的cas9mrna(400ng/μl)+tet2sgrna(200ng/μl)电穿孔到小鼠合子中，并且发现9个at处理的胚胎中有4个在tet2基因座处携带双等位基因突变(图1b)。因此，tet1和tet2基因两者都可以使用电穿孔递送的crispr/cas系统(例如cas9mrna+sgrna)有效地靶向到小鼠合子中。同时，使用不同的质粒浓度，即200ng/μl、400ng/μl和800ng/μl质粒dna，尝试crispr/cas编码质粒的电穿孔(作为以casmrna和指导rna形式递送crispr试剂的替代方法)。在200ng/μl组中，确定了12个总筛选中的一个突变胚胎。因此，也可以实现dna电穿孔到合子中，虽然在crispr/cas系统的情况下，mrna/指导rna组合似乎比dna更有效。在本实验和使用crispr/cas系统的其他实验中，使用以下程序制备cas9mrna和sgrna。简而言之，携带野生型cas9基因的px330质粒(cong等,2013)用作在聚合酶链反应(pcr)中扩增cas9编码序列的dna模板。将t7启动子序列加入在cas9野生型基因的编码序列侧翼的正向引物中并与反向引物配对。使用qiagen柱(qiagen)纯化pcr产物，并使用mmessagemmachinet7ultra转录试剂盒(lifetechnologies)进行体外转录(ivt)。对于sgrna合成，将t7启动子序列加入到sgrna模板/正向引物中，并通过pcr扩增产生ivt模板。将t7-sgrnapcr产物进行柱纯化，并用作使用megashortscriptt7试剂盒(lifetechnologies)的ivt的模板。使用megaclear试剂盒(lifetechnologies)对cas9mrna和sgrna两者进行纯化，并在试剂盒提供的洗脱缓冲液中洗脱。在琼脂糖凝胶上分离来自ivt反应的等分试样以评估反应质量。如所描述的进行surveyor试验(guschin等,2010)。从小鼠或胚胎提取基因组dna，并在以下条件下使用基因特异性引物进行pcr：95℃5分钟；35×(95℃30秒，60℃30秒，68℃40秒)；68℃2分钟；保持在4℃。然后将pcr产物变性，退火，用surveyor核酸酶(transgenomic)处理。然后将产物在10％丙烯酰胺criteriontbe凝胶(biorad)上分离，用溴化乙锭染色并显影。对于rflp分析，用sac1(tet1)或ecorv(tet2)消化10μl的tet1或tet2pcr产物，并在gelred(biotium)染色的琼脂糖凝胶(2％)上分离。对于测序，将pcr产物直接测序或克隆到topo克隆试剂盒(invitrogen)中，并通过sanger测序测序个体克隆体。实施例3电穿孔的小鼠合子的发育合子的体外培养和分析是一个重要的方法，可以基于此以快速的周转时间和优选地较低操作成本测试和分析与基因编辑技术相关的大量参数。然而，在使用常规体外培养系统培养电穿孔的合子时，后续胚胎发育似乎被阻滞或中止。通常，在不同浓度范围(例如50/25ng/μl至1000/500ng/μl)的cas9mrna/sgrna的电穿孔后，在3.5天培养期结束时，胚胎进展到不同的发育阶段，包括1-细胞、2-细胞或4-细胞期、桑椹胚期和偶尔的胚泡期(实验8)的那些。相反，未经电穿孔的对照胚胎在相同时间段结束时达到胚泡期，无论对照胚胎是否用at进行预处理。在一些实验中(实验10和11)，实验中的所有组中的胚胎均未能达到囊胚期。在培养电穿孔的合子中这样的最初失败似乎表明合子可能不在电穿孔过程中存活并继续发育成活胎产的动物，无论在电穿孔的合子中是否发生期望遗传修饰。对于at指导可能过度损伤合子以减缓胚胎发育，以及对于所递送的试剂(例如cas9mrna和指导rna)可能对合子及其后续发育具有毒性的认识，使得对使用电穿孔作为在动物中永久引入种系可传递的遗传修饰的可行手段进一步产生怀疑。在试图解决电穿孔的合子的体外发育不良问题时，申请人惊奇地通过改变体外培养条件(表1)，更具体地，通过洗掉电穿孔培养基中的任何潜在有害物质，其通常包含多核苷酸缓冲液(例如te缓冲液)和低血清培养基(例如培养基)，确定了解决方案。这对于电穿孔的合子的生存和发育的显著效果在本文描述的实验中证明。特别是，使b6d2f1/j供体雌性小鼠超量排卵以使胚胎产量最大化。每只供体雌性接受5iu(腹腔注射)孕马血清促性腺激素(pmsg)，并在约47小时后接受5iu(腹腔注射)人绒毛膜促性腺激素(hcg)。在施用hcg后，使雌性立即与b6d2f1/j种畜雄性1:1交配。约24小时后，检查雌性是否存在交配塞(copulationplug)。使显示交配塞的雌性安乐死，并将其输卵管切除并置于m2培养基中。然后将输卵管置于含有以约0.3mg/ml浓度加入的透明质酸酶的m2培养基中。通过裂解壶腹而移除卵母细胞窝(clutch)，允许其在含有透明质酸酶的m2培养基中孵育，直到卵丘细胞脱落。收集合子并将其通过新鲜m2培养基洗涤两次，然后放入已经在cookminc台式培养箱中在油下平衡24小时的rcvl培养基的微滴中。将酸性台氏溶液解冻，并将100μl液滴置于皮氏培养皿中，每50个待处理的合子1滴。从rcvl培养基中移出确定进行ep(电穿孔)的合子，并将其放入(预加温的)m2培养基的100μl液滴中。以50个为一组，将合子置于酸性台氏溶液中10秒，然后移出并通过预加温的m2培养基的三个100μl液滴洗涤。然后将经处理的合子放入培养基的5-10μl液滴中准备电穿孔。每个培养基液滴中的合子数量和液滴数量随进行的实验的参数变化。对于实验14和15两者，使用含有200/100、400/200和600/300ng/μl的cas9mrna/tet2sgrna的crispr混合物。此外，对于实验15，携带用于将ecorv位点(gatatc)转化成ecori位点(gaattc)的突变的供体寡核苷酸也以200、400或200ng/μl提供。使混合物在te缓冲液(10mmtris，0.1mmedta，ph7.5)中达到每个实验组10μl，并加入到10μl中的胚胎中。然后将20μl的总含量加载到1-mm电击杯中并进行电穿孔(30伏，脉冲持续时间1ms，2个脉冲，脉冲间隔100-1000ms)。在电穿孔完成后，如果期望在下面的步骤(例如体外培养和/或转移到假孕雌性中)之前洗涤电穿孔的配子或植入前胚胎，则将胚胎从电击杯回收到100μl的预加温的ksomaa/bsa培养基中，并连续通过预加温的m2培养基的三个100μl液滴以洗掉任何剩余电穿孔溶液(1:1的te缓冲液与培养基)。然后评估合子的生活力。将判断为健康的那些转移到含有950μl预加温的m2培养基的冷冻小瓶中以运送到无特定病原(spf)的手术间。在spf设施中，使用p1000移液管将合子从冷冻小瓶中移出，并置于已经在cookminc台式培养箱中在油下平衡24小时的rcvl培养基的培养滴液中。在转移时，将胚胎从rcvl微滴中移出并置于m2培养基的预加温100μl液滴中，并按照标准方案(例如jacksonlaboratorieslah(实验室动物健康)常规程序94-09)转移到cbyb6f1/j假孕雌性中。在出生时分析小鼠的子集。对于这些，在小鼠出生时采集尾部活检样品，并通过使用ecorv消化的rflp进行分析(图2a和2b)。筛选自cas9mrna400ng/μl和sgrna200ng/μl的组的13只小鼠中的两只小鼠的pcr产物对ecorv消化具有抗性(首建者85c3)或部分抗性(85c10)(图2，小图a)。在分别使用600ng/μl和300ng/μl的更高浓度的cas9mrna和sgrna时，如通过rflp试验分析的，5只小鼠是阳性的(首建者86c3、86c5、86c7、86c8和86c9)，其中两只(86c3和86c9)对ecorv消化具有完全的抗性，而3只(86c5、86c7和86c8)对ecorv消化具有部分的抗性。pcr产物的sanger测序确认了7只小鼠中的6只存在突变等位基因(图2c，85c3、85c10、86c3、86c7、86c8和86c9)，而一只可以携带低丰度的突变等位基因(86c5)。此外，在将来自首建者85c3、86c3和86c9的pcr产物克隆到pcr2.1-topo载体中并测序个体克隆体时，检测到如所预期的精确地位于tet2靶位点的pam近端区域的indel突变(图2d)。在来自这两个实验的其余小鼠为一周龄时，对它们进行了分析。如前所述采集并通过rflp分析尾部活检样品，并通过对从这些小鼠扩增的pcr产物进行sanger测序而确认结果。如表1所总结的，观察到这两个实验之间的首建者效率的浓度依赖性改善。在使用200ng/μl的cas9mrna和100ng/μl的sgrna时，在34个筛选中鉴定出1个首建者(3.2％)。在浓度增加到cas9mrna为400ng/μl和sgrna为200ng/μl时，首建者效率增加到48.3％(29个筛选中14只首建者小鼠)。在浓度进一步增加到cas9mrna为600ng/μl和sgrna为300ng/μl时，效率是45.4％(33个筛选中15只首建者小鼠)。值得注意的是，对于实验15，实现了100％的首建者效率，发现所有11只筛选小鼠都携带突变等位基因(图3)。还在实验15中测试了crispr介导的hdr，其中将供体寡核苷酸引入实验设计中。具体来说，对合子进行电穿孔，并且使小鼠出生并基因分型。扩增466bps的pcr产物，该扩增产物包含靶位点，暴露于ecorv消化以检测携带nhej突变的等位基因并暴露于ecori消化以检测hdr等位基因。虽然其他实验组未检测到成功的hdr等位基因，检测到携带由ecori切割的等位基因的两个首建者小鼠(图3，小图a，87ep11和86ep14)，并从使用400ng/μl的cas9mrna、200ng/μl的靶向tet2基因座的3’utr的sgrna和400ng/μl的ssdna供体进行电穿孔的组获得它们。在该组中，所有11只小鼠都携带耐ecorv消化的等位基因。首建者86ep11至86ep15似乎没有携带可检测水平的可以由ecorv切割的等位基因，表明来自所有11只首建者小鼠的nhej突变的存在。在11个样品暴露于ecor1时，显示来自样品86ep11和86ep14的等位基因中的一些被ecori部分消化，表明来自这两个样品的hdr等位基因的存在。然后将pcr产物从首建者86ep11和86ep14克隆到pcr2.1-topo载体中，并对个体克隆体进行测序。如图3，小图b所示，样品86ep11-4和86ep14-4携带ecori位点，表明通过crispr/cas介导从供体ssdna成功引入该位点。在一系列实验中进一步测试了大量不同电穿孔设置参数，其结果总结如下：1.20v、2个脉冲、100ms间隔、0次洗涤a.cas9mrna200ng/ul+tet2sgrna100ng/μlb.结果：12％达到囊胚期(2/17)，未观察到基因靶向2.20v、2个脉冲、100ms间隔、3次洗涤a.cas9/tet2:500/250、400/200、200/100ng/μlb.结果：平均91％的囊胚(50/55)3.20v、2个脉冲、1s间隔、3次洗涤a.cas9/tet2:800、600、400、300、200、100ng/μlb.200ng/μl的结果(批次1)：100％囊胚(16/16)，14.3％靶向(1/7)c.200、300、400ng/μl的结果(批次2)：95.8％囊胚(46/48)，结果未定d.结果(批次3)：多次洗涤，胚胎转移到假孕雌性小鼠，出生未定4.20v、3个脉冲、1s间隔、1次洗涤a.cas9/tet2:400、200ng/μlb.200ng/μl的结果(批次1)：82.3％囊胚(14/17)，无靶向c.400和200ng/μl的结果(批次2)：93.8％囊胚(30/32)，结果未定5.20v、3个脉冲、1s间隔、3次洗涤a.cas9/tet2:200ng/μlb.结果：88.9％囊胚(16/18)，无靶向6.30v、2个脉冲、1s间隔、3次洗涤a.cas9/tet2:400、300、200ng/μlb.200ng/μl结果：94％囊胚(15/18)，无靶向c.300ng/μl结果：84％囊胚(16/19)，16％靶向(3/19)，400ng/μl无靶向总之，结果表明使用电穿孔的crispr/cas系统的成功遗传修饰取决于所用crispr/cas试剂的浓度。在电穿孔实验中，与传统显微注射实验相比，试剂浓度停止作为限制因素，并且发现使用较高浓度的试剂(例如，对于cas9mrna为400ng/μl以上，且对于sgrna为200ng/μl以上)产生基因编辑小鼠。数据还表明，例如通过at处理，弱化透明带可以有益于合子电穿孔。然而，应避免长时间处理。最后，使用本发明方法的crispr介导的基因靶向可以成功进行，并且在实验设置具有某些参数变化。为了确保电穿孔的合子的成功发育，可以需要在电穿孔完成时用对胚胎发育而言最佳的生理溶液或培养基冲洗电穿孔的合子一次或多次(例如2、3、4次)。例如，电穿孔的合子可以连续通过预加温的m2培养基的(100μl)液滴，以在合子置入培养或转移到子宫环境之前洗掉任何剩余电穿孔溶液(例如1:1的te缓冲液与)。下文提供了本发明方法的详细说明(但非限制性)实施方式：1.将补充有1mg/ml的bsa(p/na2153,sigma-aldrich)的100μlksomaaevolve(p/nzeks-050,zenithbiotech)的等分试样沉积在96孔平底组织培养板上并在heracell培养箱中在37℃/5％co2下平衡，之后接受单细胞合子。2.对b6d2f1雌性小鼠腹腔(i.p.)注射5个国际单位(iu)的孕马血清促性腺激素(pmsg，p/nhor-272，prospec，rehovot，israel)，随后在48小时后腹腔(i.p.)注射人绒毛膜促性腺激素(hcg，p/nhor-250，prospec，rehovot，israel)。然后使雌性小鼠与b6d2f1雄性小鼠交配。使交配塞阳性的那些通过颈椎脱位(cd)进行安乐死。从切除的生殖系统冲出受精胚胎。3.收集来自b6d2f2小鼠的单细胞合子，在酸性台氏溶液中处理10秒(例如，sigma-aldrich,cat.no.t1788；或等同物，如p/nmr-004-d,emdmillipore)，用ksomaaevolve洗涤两次，并置入组织培养皿或板(35mm，p60，96孔)中的预加温的培养基(p/n31985,gibco)的10μl液滴中。4.用10mmtris(ph7.5)和0.1mmedta将“生物材料”(对于crispr，其基本上由cas9mrna、sgrna和任选的供体寡核苷酸组成；或者作为替代方案，由编码它们的dna组成)重构成10μl体积，并加入到培养基中合子的10μl液滴中。.5.将浸入在“生物材料”中的合子移出并沉积到用于btx610型(p/n450124,harvardapparatus)的2-mm电击杯的室中。轻敲电击杯以确保聚核苷酸/合子溶液或悬浮液移动到电击杯的两根导体之间，且没有气泡滞留在混合物中。6.将电击杯放入btx电击杯室(ecm830)中，并使用以下设置(或其变化，例如本文公开的那些)进行电穿孔：a.电压：30vb.脉冲间隔：125-130msc.脉冲持续时间：1msd.#脉冲:27.使用从电击杯包装提供的塑料移液器，从96孔板的相应孔中移出80-100μl预加温的培养基(例如ksomaa/bsa培养基)，并将培养基轻轻加入到电击杯中。从电击杯中移出所有的内容物，并将混合物排到孔中。8.使电穿孔的合子连续通过预加温的m2培养基的两至三个100μl液滴以洗掉任何剩余电穿孔溶液。9.立即将携带洗涤的合子的96孔板放回培养箱中。10.将胚胎在37℃/5％co2下培养3.5天以达到发育的囊胚期，然后收获用于分析。11.使用单细胞全基因组扩增试剂盒(p/nga4,sigma-aldrich)扩增胚胎的基因组。然后将扩增的基因组用作使用包含靶位点的引物对的pcr反应的模板(accuprimetmtaqdnapolymerasesystem,p/n12339-016,lifetechnologies；或primestargxl,p/nr050b,clontech)。清洁pcr产物，并通过sanger测序分析核苷酸序列。12.合成cas9mrna、sgrna和任选的dna供体，并如前所述制备注射混合物(wang等,2013；yang等,2013)。参考文献bogdanove,a.j.和voytas,d.f.,"taleffectors:customizableproteinsfordnatargeting,"science,333:1843-1846(2011).brown,a.j.,fisher,d.a.,kouranova,e.,mccoy,a.,forbes,k.,wu,y.,henry,r.,ji,d.,chambers,a.,warren,j.等,"whole-ratconditionalgeneknockoutviagenomeediting,"nat.methods,10:638-640(2013).capecchi,m.r.,"genetargetinginmice:functionalanalysisofthemammaliangenomeforthetwenty-firstcentury,"nat.rev.genet.,6:507-512(2005).carbery,i.d.,ji,d.,harrington,a.,brown,v.,weinstein,e.j.,liaw,l.和cui,x.,"targetedgenomemodificationinmiceusingzinc-fingernucleases,"genetics,186:451-459(2010).chang,n.,sun,c.,gao,l.,zhu,d.,xu,x.,zhu,x.,xiong,j.w.和xi,j.j.,"genomeeditingwithrna-guidedcas9nucleaseinzebrafishembryos,"cellres.,23:465-472(2013).cui,x.,ji,d.,fisher,d.a.,wu,y.,briner,d.m.和weinstein,e.j.,"targetedintegrationinratandmouseembryoswithzinc-fingernucleases,"nat.biotechnol.,29:64-67(2011).geurts,a.m.,cost,g.j.,freyvert,y.,zeitler,b.,miller,j.c.,choi,v.m.,jenkins,s.s.,wood,a.,cui,x.,meng,x.等"knockoutratsviaembryomicroinjectionofzinc-fingernucleases,"science,325:433(2009).hai,t.,teng,f.,guo,r.,li,w.和zhou,q.,"one-stepgenerationofknockoutpigsbyzygoteinjectionofcrispr/cassystem,"cellres.,24:372-375(2014).hsu,p.d.,lander,e.s.和zhang,f.,"developmentandapplicationsofcrispr-cas9forgenomeengineering,"cell,157: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