用于分层对阻断PD1/PDL1轴的疗法的无响应者的方法与流程

本申请要求2014年11月5日提交的美国临时专利申请62/075,503和2014年11月25日提交的62/084,484的优先权，其全部内容通过引用并入本文。关于联邦资助研究的声明本发明是由国立卫生研究院授予的基金no.ai091663的政府支持下进行的。政府对发明有一定的权利。发明的
技术领域：
本发明一般涉及癌症和适应性免疫耐受性的检测、监测和治疗。本发明涉及分析可应用于诊断、监测、临床实践、临床试验设计、药物发现、药物开发等的肿瘤样品。本发明还涉及用于预测和鉴定可能响应于阻断pd-1/pd-l1途径的治疗的患者的材料和方法，以及对不响应于这样的治疗的患者进行分层，以及基于响应者/非响应者特性来治疗患者的方法。背景派姆单抗(pembrolizumab)是阻断程序性死亡1(pd-1)分子(一种在活化的t细胞上发现的细胞表面受体)的活性的免疫治疗剂。这种受体被归为存在于免疫细胞中/上的“免疫检查点”受体家族，并且通过控制t细胞活性的量级和持续时间来控制对干扰的免疫应答。当存在于其他细胞(旁分泌调节)或相同t细胞(自分泌调节)上的另一分子程序性死亡1配体(pd-l1)与pd-1结合时，发生pd-1分子的活化。当t细胞分泌细胞因子或其他分子到外部环境中时，pd-l1上调。所述区域中的细胞然后引起其pd-l1转录物翻译成蛋白质并且定位到其细胞表面。这些细胞然后与局部活化的t细胞相互作用并且使t细胞惰性。因此，pd-l1表达是组织部位处活化的t细胞的直接下游反应过程(taube等.scitranslmed2012)。这种相互作用有助于调节t细胞对各种病症(包括炎症和感染)的免疫应答。已经显示癌细胞募集(或劫持)这种机制以逃避免疫监视和杀伤。在黑素瘤患者的最近的早期临床试验中，阻断pd-1和/或pd-l1(最终导致中断被癌细胞劫持的途径)的多种治疗性抗体已经显示出前所未有的百分比的经历客观临床响应的患者，如由recist1.1标准定义的。一个尚未知的重要问题是为什么有些患者响应于抗pd1(或抗pd-l1)，而另一些患者则不响应。第一代免疫检查点阻断剂抗ctla4表现出响应者和非响应者中t细胞的非特异性增加。这一得到确认的现象和大量支持pd-l1是活化的t细胞的直接下游反应过程的数据使得本领域专家集中精力检测pd-l1的表达。由于关于活化的t细胞的不明确的发现在之前利用免疫检查点阻断得到确认，所以基于检测pd-l1的间接测量在很大程度上决定了进展。不幸的是，pd-l1表达显示是被强响应者中的可变表达和实质的非黑素瘤正常细胞的强表达限制的策略。虽然70％的患者不响应，但是没有已知的手段来表征非响应者。因此，对基于它们对抗pd1/pd-l1疗法的响应性来开发用于鉴定和治疗患者的改进和有效的方法仍存在显著的未满足的临床需求。如下所述，本发明直接解决了这种和其他需求。概述本发明提供了一种用于转移性病灶的肿瘤微环境内的cd8+t细胞组织的微观解剖学定量作图方法，以预测对靶向免疫疗法的响应。pd-l1表达的预测价值直接取决于用于识别肿瘤抗原的特异性t细胞受体(tcr)的肿瘤微环境中的cd8+t细胞组织(通过增加的tcrvb克隆性证实)。本发明提供了一种识别肿瘤微环境中t细胞的特征的方法，其不依赖于任何之前的疗法并且被发现与t细胞活性和预测对抗pd-1疗法的响应的能力直接相关。本公开描述了分析可应用于诊断、监测、临床实践、临床试验设计、药物发现、药物开发等的肿瘤样品的方法。本公开的一些实施方案涉及分析来自患有肿瘤或癌症的受试者的生物样品的方法，包括：(1)对于具有目标表型的靶细胞，确定：(a)样品的肿瘤微环境中靶细胞的位置(靶细胞的空间分辨率)；(b)样品中空间分辨的靶细胞的密度；以及(c)样品中空间分辨的目标靶细胞之间的接近度；以及(2)至少部分地基于参数(a)至(c)确定总分数。在某些实施方案中，在治疗前或治疗期间从受试者获得生物样品。短语“在治疗前从受试者获得”可能意味着例如从先前已经用抗肿瘤剂治疗并且在用不同的抗肿瘤剂治疗之前的受试者获得，或者从初次治疗(treatment-naive)受试者获得。在一些实施方案中，所述方法还包括确定样品中空间分辨的靶细胞的密度的分数(密度分数)和/或样品中空间分辨的目标靶细胞之间的接近度的分数(接近度分数)，并且其中至少部分地基于样品中特定类型的空间分辨的靶细胞的密度的加权来确定密度分数；至少部分地基于样品中特定类型的空间分辨的目标靶细胞之间的接近度的加权来确定接近度分数；以及至少部分地基于密度分数和/或接近度分数的加权来确定总分数。本发明提供了鉴定患者为单一药剂抗pd-1或抗pd-l1疗法的响应者的方法。在一个实施方案中，所述方法包括使来自患者的组织样品与检测cd8+t细胞的测定试剂接触。所述方法还包括测定患者组织样品中cd8+t细胞的存在，以及将患者组织样品中存在的cd8+t细胞的量与癌症活检组织的对照样品进行比较。相对于对照(例如来自已知的非响应者样品)，患者样品中cd8+t细胞数量的增加指示抗pd-1疗法的响应者。任选地，所述方法可以包括使组织样品与检测cd8表达的测定试剂接触，以及使组织样品(通常是相同组织样品的相邻切片)与检测s100表达的测定试剂接触。所述方法还包括测定来自患者样品的相邻(或几乎相邻)组织切片中cd8和s100(或其他肿瘤标志物)的存在。使用肿瘤标志物如s100允许在组织样品中描述肿瘤内和肿瘤周围区域。所述方法任选地还包括组织样品的微观解剖学比对，例如通过使用新开发的算法以定义肿瘤微环境中的亚区域。样品的比对(或比较测定样品的其他方法)允许分析肿瘤中cd8+t细胞的数量。在一个实施方案中，测定试剂包括特异性检测cd8+细胞的抗体。测定通常包括进行免疫测定。免疫测定通常是免疫组织化学，但可以是例如elisa、放射免疫测定或本领域技术人员已知的其他免疫测定。cd8+t细胞的增加可以包括相对于对照，患者样品中cd8+细胞的密度增加。在一些实施方案中，测定包括分析cd8+t细胞肿瘤浸润，分析肿瘤内、肿瘤周围和/或血管周围cd8+t细胞位置、cd8+t细胞密度和/或cd8+t细胞表型。在特定实施方案中，测定包括将患者组织样品中的肿瘤内和/或肿瘤周围区域的cd8+t细胞密度与对照(非响应者肿瘤)样品进行比较。相对于对照，肿瘤内和/或肿瘤周围cd8+t细胞更大的密度指示抗pd-1疗法的响应者。本发明提供了一种鉴定患者为单一药剂抗pd-1或抗pd-l1疗法的响应者的方法。在一个实施方案中，所述方法包括使来自患者的样品与检测骨髓来源的细胞(mdc)的测定试剂接触。所述方法还包括测定患者组织样品中pdl1+和pdl2+mdc的存在，以及任选地将患者样品中存在的mdc的量与癌症活检组织的对照样品进行比较。相对于对照(例如来自已知的非响应者样品)，患者样品中mdc的数量增加指示抗pd-1疗法的响应者。提供了类似的方法用于检测适应性免疫耐受性、患者样品中癌症的存在，确定癌症疗法的效力，以及确定对癌症疗法的响应和监测癌症疗法的效力。本发明还提供了一种检测肿瘤样品中的适应性免疫耐受性的方法。在一个实施方案中，所述方法包括使肿瘤样品与检测pd-l1+或pd-l2+骨髓来源的细胞(mdc)的测定试剂接触；以及测定肿瘤样品中pd-l1+或pd-l2+mdc的存在。pd-l1+或pd-l2+mdc的存在指示肿瘤样品中的适应性免疫耐受性。肿瘤样品(例如侵袭性肿瘤边缘)中pd-l1+或pd-l2+mdc的存在指示适应性免疫耐受性以及响应于抗pd1或抗pdl1疗法的可能性。本发明另外提供了克服患有肿瘤的受试者中适应性免疫耐受性的方法。在一个实施方案中，所述方法包括使包含肿瘤的样品与检测pd-l1+或pd-l2+骨髓来源的细胞(mdc)的测定试剂接触；以及测定肿瘤样品中pd-l1+或pd-l2+mdc的存在。所述方法还包括如果在肿瘤样品中检测到pd-l1+或pd-l2+mdc，则向受试者施用抗pd-1或抗-pd-l1治疗剂。在前述方法中，测定任选地还包括测定肿瘤样品中cd8+、pd1+和/或cd68+细胞的存在。本发明还提供了一种鉴定患者为抗pd-1或抗pd-l1疗法的响应者的方法。在一个实施方案中，所述方法包括使来自患者的样品与检测pd-l1+或pd-l2+骨髓来源的细胞(mdc)的测定试剂接触；以及测定患者样品中pd-l1+或pd-l2+mdc的存在。pd-l1+或pd-l2+mdc的存在指示抗pd-1或pd-l1阻断疗法的响应者。还提供了一种检测受试者中的癌症的方法。在一个实施方案中，所述方法包括使来自患者的样品与检测pd-l1+或pd-l2+骨髓来源的细胞(mdc)的测定试剂接触；以及测定患者样品中pd-l1+或pd-l2+mdc的存在。pd-l1+或pd-l2+mdc的存在指示癌症。本发明还提供了确定患者中抗pd-1或抗pd-l1疗法的效力的方法。在一个实施方案中，所述方法包括使来自患者的样品与检测pd-l1+或pd-l2+骨髓来源的细胞(mdc)的测定试剂接触；以及测定患者样品中pd-l1+或pd-l2+mdc的存在。pd-l1+或pd-l2+mdc的存在指示抗pd-1或pd-l1阻断疗法的响应者。在一个实施方案中，在向患者施用抗pd-1或抗pd-l1疗法之后重复测定，并且相对于先前测定的样品，患者样品中pd-l1+或pd-l2+mdc的存在的增加指示有效的抗pd-1或抗pd-l1疗法。在本文所述的方法中，样品可以是包含细胞的样品或包含流体的样品。样品可以包含细胞外的、细胞解离的和/或细胞衍生的产物。肿瘤样品可以是例如肿瘤活检。通常，肿瘤样品包括侵袭性肿瘤边缘。在一个实施方案中，肿瘤样品是从转移性病灶获得的。在一个实施方案中，样品包括外周血。在一个实施方案中，患者被怀疑患有转移性癌症。上述方法可以任选地还包括如果鉴定为响应者，则用抗pd-1疗法治疗患者，并且如果未鉴定为响应者，则使用组合疗法治疗患者。pd-l1+mdc的实例包括但不限于具有选自以下的表型的mdc：pd-l1+cd11b+；pd-l1+cd11c+；pd-l1+cd14+；pd-l1+cd33+；pd-l1+cd38+；pd-l1+cd34+；pd-l1+cd36/sr-b3+；pd-l1+cd59+；pd-l1+cd68+；pd-l1+cd163+；pd-l1+cd164+；pd-l1+ham-56+；pd-l1+cd66a+；pd-l1+cd66b+；pd-l1+cd66c+；pd-l1+cd66d+；pd-l1+cd68/sr-d1+；pd-l1+cd42b/gpibα+；pd-l1+cdcxcr3+；和pd-l1+f4/80/emr1+。pd-l2+mdc的实例包括但不限于具有选自以下的表型的mdc：pd-l2+cd11b+；pd-l2+cd11c+；pd-l2+cd24+；pd-l2+cd33+；pd-l2+cd38+；pd-l2+cd34+；pd-l2+cd36/sr-b3+；pd-l2+cd59+；pd-l2+cd68+；pd-l2+cd163+；pd-l2+cd164+；pd-l2+ham-56+；pd-l2+cd66a+；pd-l2+cd66b+；pd-l2+cd66c+；pd-l2+cd66d+；pd-l2+cd68/sr-d2+；pd-l2+cd42b/gpibα+；pd-l2+cdcxcr3+；和pd-l2+f4/80/emr2+。在本发明方法的典型实施方案中，测定试剂包含抗体。抗体的实例包括但不限于特异性结合pd-l1+和/或pd-l2+的抗体以及结合mdc标志物的抗体。在一个实施方案中，测定试剂包含特异性结合pd-l1+的抗体和特异性结合以下的抗体：cd11b+；cd11c+；cd14+；cd33+；cd38+；cd34+；cd36/sr-b3+；cd59+；cd68+；cd163+；cd164+；ham-56+；cd66a+；cd66b+；cd66c+；cd66d+；cd68/sr-d1+；cd42b/gpibα+；cdcxcr3+；或f4/80/emr1+。在一个实施方案中，测定试剂包含特异性结合pd-l2+的抗体和特异性结合以下的抗体：cd11b+；cd11c+；cd24+；cd33+；cd38+；cd34+；cd36/sr-b3+；cd59+；cd68+；cd163+；cd164+；ham-56+；cd66a+；cd66b+；cd66c+；cd66d+；cd68/sr-d2+；cd42b/gpibα+；cdcxcr3+；或f4/80/emr2+。代表性的测定包括但不限于免疫测定、聚合酶链式反应、测序(包括下一代测序)和mdc表型的分析。免疫测定的实例包括免疫组织化学和免疫荧光，包括定量免疫组织化学和定量免疫荧光。这些测定可以以单一和多重形式进行。还提供了一种分析可应用于诊断、监测、临床实践、临床试验设计、药物发现、药物开发等的肿瘤样品的方法。本公开的一些实施方案涉及分析来自患有肿瘤或癌症的受试者的生物样品的方法。在一个实施方案中，所述方法包括：(1)对于具有目标表型的靶细胞，确定：(a)样品的肿瘤微环境中靶细胞的位置(靶细胞的空间分辨率)；(b)样品中空间分辨的靶细胞的密度；以及(c)样品中空间分辨的目标靶细胞之间的接近度；以及(2)至少部分地基于参数(a)至(c)确定总分数。在一些实施方案中，所述方法还包括确定样品中空间分辨的靶细胞的密度的分数(密度分数)和/或样品中空间分辨的目标靶细胞之间的接近度的分数(接近度分数)。通常，至少部分地基于样品中特定类型的空间分辨的靶细胞的密度的加权来确定密度分数；至少部分地基于样品中特定类型的空间分辨的目标靶细胞之间的接近度的加权来确定接近度分数；以及至少部分地基于密度分数和/或接近度分数的加权来确定总分数。在另外的实施方案中，基于使用阻断pd-1/pd-l1/pd-l2途径的特定单一药剂或使用特定抗pd-1/pd-l1/pd-l2药剂和特定的另外的抗肿瘤剂(组合疗法)治疗具有特定类型的肿瘤或癌症(任选地还考虑疾病严重性)的其他受试者的治疗结果来调节密度分数(例如加权以确定密度分数)、接近度分数(例如加权以确定接近度分数)或总分数(例如加权以确定总分数)或其任何组合或全部。本发明还提供了一种治疗患者中的癌症的方法。在一个实施方案中，所述方法包括根据本文所述的方法鉴定患者为抗pd-1或抗pd-l1疗法的响应者；以及如果鉴定为响应者，则使用抗pd-1疗法治疗患者，如果未鉴定为响应者，则使用组合疗法或其他替代疗法治疗患者。在一个实施方案中，本发明提供了用于对抗pd-1或抗pd-l1疗法的非响应者进行分层的方法。所述方法包括转移性病灶的肿瘤微环境的侵袭性边缘内的cd8+、pd-1、pd-l1和cd68细胞组织的微观解剖学定量细胞作图。这使得能够预测表现为哪一种亚型的非响应者，以及计划有效的治疗策略。在侵袭性边缘处缺少任一种组分：与cd68pdl1细胞交界(interfacing)的cd8、pd1细胞，指示非响应者。如本文所述，非响应者可以可靠地分层为亚型。然后可以为特定亚型的非响应者定制治疗，例如将其肿瘤转化为抗pd1响应性肿瘤。下面列出了可以在侵袭性肿瘤边缘观察到的相关特征的实例：·表达或不表达pdl1的cd68+巨噬细胞的位置、密度和表型；·表达或不表达pd1的cd8+t细胞的位置、密度和表型；·一类非响应者在侵袭性肿瘤边缘处为cd8低-pd1低-cd68低-pdl1低；·另一类非响应者在侵袭性肿瘤边缘处为cd8高-pd1高-cd68低-pdl1低；·另一类非响应者在侵袭性边缘处为cd8低-pd1低-cd68低-pdl1高；以及●另一类非响应者在侵袭性边缘处为cd8低-pd1低-cd68高-pdl1高。用于治疗非响应者的药物或疗法可以基于其调节肿瘤以在侵袭性肿瘤边缘实现细胞标签(cellularsignature)的能力来选择，所述细胞标签是实现对抗pd1疗法的响应所需的。本发明还包括可用于实践本文所述方法的试剂盒。试剂盒可以包括一种或多种抗体、寡核苷酸探针或寡核苷酸探针对，或选自本文所述的其他测定试剂。试剂可以任选地用可检测标志物标记。该试剂盒还可以包括用于容纳用于所述方法的抗体、引物、探针和其他试剂的容器。附图简述图1是本文所述的分析肿瘤样品的方法的实施方案的流程图。图2是可以用于实现分析肿瘤样品的方法的计算机系统的实施方案的框图。图3是对s100(左图)和cd8(右图)染色的肿瘤活检的连续切片的一对数字显微照片。线条表示肿瘤周围和肿瘤内区域之间的界限。图4a-4c是基于ihc和ct扫描的一系列图，其显示基线cd8+t细胞组织的定量预测了对疗法的响应。图4a示出了响应者(左图)、延迟响应者(中间图)和进展者(右图)随时间(基线、20-60天、8-120天、＞120天)的cd8+t细胞密度，以细胞/mm2计。图4b示出了基线处这些相同的三种响应特征的肿瘤周围(左图)和肿瘤内(右图)微环境中的cd8+t细胞密度。图5示出了相对于进展者，对于响应者在基线处观察到更高的t细胞克隆性。图6a-6d是描述抗pd1治疗之前和期间肿瘤样品中cd8+t细胞的定量分析的图。在响应(图6a；n＝14)和进展(图6b；n＝13)组中的连续活检匹配的肿瘤中测量随时间(基线、20-60天、8-120天、＞120天)的cd8+t细胞密度。在用抗pd1疗法的治疗前(图6c)和治疗期间(图6d)，将响应组和进展组的这些测量进行比较，与进展组相比，响应组表现出显著更高的cd8+t细胞密度；***p＜0.0001。图7a-7b示出了基于双荧光免疫组织化学染色进行的定量图像分析，以检查pd1+和pdl1+细胞之间的空间关系。评估每个载玻片的10,000个分离区域的红色和绿色像素(对于每种染色一种颜色)的存在。例如，当评估载玻片的5个区域(图7a)时，量化红色和绿色像素的总计数以产生接近度呼叫(proximitycall)(图7b)。图8a-8f是来自一位患有消退肿瘤(图8a-8c)、一位患有进展肿瘤(图8d-8f)的两位患者的pd1(图8a、8d)、pdl1(图8c、8f)和cd68(图8b、8e)的ihc分析的数字显微照片。2μm连续切片显示用抗pd1疗法使pdl1表达损失。图9a-9d示出了在派姆单抗治疗之前和期间获得的样品中cd8+t细胞的免疫组织化学分析。图9a和9b是显示来自响应(图9a)和进展(图9b)组中的患者的pd-1阻断治疗之前(tx，图的左列)和治疗开始后20-60天(天+20-60，图的右列)连续活检的黑素瘤肿瘤中cd8表达的实例的数字显微照片。粗线分隔开肿瘤实质(线下)和侵袭性边缘(线上)。放大倍数，×20。图9c和9d绘制了来自治疗前和治疗期间的接收活检的全部响应者(图9c，n＝13)和进展者(图9d，n＝12)的样品中肿瘤中心(左图)和侵袭性边缘(右图)的cd8+细胞密度。·完全响应，。＝部分响应，δ＝延迟响应。图10a-10b是数字显微照片，显示在治疗期间消退肿瘤与定位于肿瘤的增殖性cd8+t细胞相关。图10a，在肿瘤消退期间获得的样品中cd8/ki67发色团双染色的代表性实例显示了位于肿瘤实质的双阳性cd8细胞。粗线分隔开侵袭性边缘(线上)和肿瘤(线下)。图10b，上：来自侵袭性边缘的代表性单阳性静止cd8+细胞(核中无ki-67标记)。下：具有与有丝分裂的子阶段相关的特征性染色质模式的代表性的双阳性细胞(标记的ki67核，cd8标记的膜)。放大倍数，×40。图11是显示根据治疗结果cd8+和cd4+细胞的基线密度和位置的一组图。通过肿瘤区室中和侵袭性边缘处的定量免疫组织化学来评估在用pd-1阻断疗法治疗之前收集的黑素瘤样品的cd8(响应n＝22，进展n＝24)和cd4(响应n＝19，进展n＝18)密度。**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。图12是一系列数字显微照片，显示了使用s100和cd8发色团染色的侵袭性边缘和肿瘤实质的分割。示出了低放大倍数(上排)和高放大倍数(下排)。线条示出了s100+肿瘤(线左侧)和s100-基质(线右侧)。从s100染色图像(第1列)产生侵袭性边缘和肿瘤实质的坐标，随后导入cd8染色图像(第2列)。这之后是cd8染色图像的去卷积成像算法，其中首先鉴定和量化所有核(第3列)，而不管是什么类型的细胞。然后鉴定cd8+膜(第4列)用于细胞定量和分析。图13是一系列数字图像，其示出了响应于pd-1阻断疗法的连续取样的肿瘤中肿瘤微环境内的cd8+t细胞动力学。从具有延迟响应的患者获得的左胸壁的连续取样的黑素瘤肿瘤中的放射照相、临床和cd8ihc的实例。在+20天，临床和放射照相检查指示进行性疾病；在侵袭性边缘处的cd8t细胞表达密度增加时。图14是示出了消退肿瘤中cd8+t细胞的增殖的一系列图。左图，使用定量免疫组织化学和ct扫描测量(n＝18，spearmanr＝-0.75，p＝0.0002)评估的连续取样的肿瘤中cd8+细胞密度的变化和肿瘤大小的最佳百分比变化的关系。中图和右图，治疗前(n＝11，空心圆)和治疗期间(n＝17，实心圆)响应组以及治疗前(n＝9，空心三角形)和治疗期间(n＝15，实心三角形)进展组中cd8+细胞密度和ki67+/cd8+细胞密度。图15a-15d示出了临床响应方面治疗前和治疗期间粒酶b和pstat1表达的免疫组织化学分析。图15a，根据临床响应的粒酶b表达的代表性实例。图15b，使用定量免疫组织化学评估在pd-1阻断疗法期间收集的样品的粒酶b信号(响应n＝13，进展n＝12)。****p＜0.0001。图15c，在治疗前获自响应者和两个进展者(+/-cd8存在)的样品中cd8+和pstat1+细胞的定位。具有cd8细胞的中度存在的进展者在该区域中未显示pstat1表达。图15d，使用定量ihc分析，响应组与治疗前和治疗期间侵袭性边缘处pstat1+的显著较高表达相关(对于治疗前活检，响应n＝16，进展n＝18，p＝0.002，对于治疗后活检，响应n＝13，进展n＝12，p＜0.0001)。图16是显示sox-10和pd-l1的多重发色团染色的一组数字显微照片。使用sox-10(染色核)和pd-l1(染色膜)的多重发色团染色来评估肿瘤微环境内黑素瘤细胞、淋巴细胞和巨噬细胞上的pd-l1表达。sox-10是黑素瘤细胞特异性的转录因子。双阳性细胞(dp箭头)的代表性高倍视野显示来自肿瘤消退期间获得的样品的三个响应者中表达pd-l1的黑素瘤细胞和包含淋巴细胞(高核：质比，sp箭头)和巨噬细胞(低核：质比，m箭头)的单阳性pd-l1细胞。放大倍数，×40。详述本发明基于以下发现：浸润肿瘤的免疫细胞上pd1和pd-l1的表达及其在肿瘤微环境中的位置是对疗法的响应的关键预测因素。使用来自用抗pd-1疗法治疗的黑素瘤患者的样品，本文描述的数据显示某一组条件能够使用pd-1阻断介导肿瘤消退。这些是在肿瘤边缘表达pd-1和pd-l1的cd8+t细胞和免疫细胞(包括巨噬细胞)以及具有较少多样性的抗原特异性的t细胞群体的存在下。已经被免疫系统识别并且包含具有pd-1和pd-l1的浸润性免疫细胞的肿瘤对免疫检查点的阻断特别敏感。定义除非另有说明，否则本申请中使用的所有科学和技术术语均具有本领域常用的含义。如本申请中使用的，以下词语或短语具有指定的含义。如本文所使用，“对照活检组织”或“对照样品”是指代表非转移性的或不响应于抗pd1疗法的典型癌组织的癌症组织的样品。如本文所用，术语“肿瘤细胞”包括癌细胞，术语“原发性肿瘤”包括原发性癌症，术语“继发性(转移性)肿瘤”包括继发性(转移性)癌症，术语“实体肿瘤”包括实体癌症，术语“肿瘤样品”包括癌症样品，术语“肿瘤微环境”包括癌症微环境，术语“侵袭性肿瘤边缘”包括侵袭性癌症边缘，术语“肿瘤实质”包括癌实质，术语“抗肿瘤剂”包括抗癌剂。如本文所用，“寡核苷酸探针”是具有与其靶核酸序列足够互补的核苷酸序列的寡核苷酸，以能够在高严格杂交条件下形成可检测的杂交探针：靶双链体。寡核苷酸探针是分离的化学物质，并且可包含靶区域外的另外的核苷酸，只要这些核苷酸不阻止在高严格杂交条件的杂交即可。可以使用非互补序列，例如启动子序列、限制性内切核酸酶识别位点或赋予期望的二级结构或三级结构如催化活性位点的序列，以有助于使用本发明的探针的检测。任选地可以用可检测标记如放射性同位素、荧光部分、化学发光部分、酶或配体标记寡核苷酸探针，其可用于检测或确认与其靶序列的探针的杂交。“探针特异性”是指探针区分靶序列和非靶序列的能力。术语“核酸”、“寡核苷酸”或“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，除非另有限定，否则包括以类似于天然存在的核苷酸的方式与核酸杂交的天然核苷酸的已知类似物。如本文所用，“可检测标志物”或“标记”是附着于试剂或作为试剂的一部分合成的分子。该分子应该是唯一可检测的，并且将允许作为结果检测试剂。这些可检测部分通常是放射性同位素、化学发光分子、酶、半抗原或甚至唯一的寡核苷酸序列。如本文所用，“杂交体”或“双链体”是通过互补碱基之间的watson-crick碱基配对或非经典碱基配对在两个单链核酸序列之间形成的复合物。如本文所用，“杂交”是核酸的两条互补链结合形成双链结构(“杂交体”或“双链体”)的过程。“严格性”用于描述杂交过程中以及随后的处理步骤中存在的温度和溶剂组成。在高严格条件下，将形成仅高度互补的核酸杂交体；没有足够的互补性程度杂交体将不能形成。因此，测定条件的严格性决定了形成杂交体的两条核酸链之间所需的互补性的量。选择严格条件以最大化与靶核酸和非靶核酸形成的杂交体之间的稳定性差异。示例性严格条件在下文中描述。如本文所用，“互补性”是由dna或rna的单链的碱基序列赋予的性质，所述单链可以通过各链上watson-crick碱基对之间的氢键形成杂交体或双链dna：dna、rna：rna或dna：rna。腺嘌呤(a)通常与胸腺嘧啶(t)或尿嘧啶(u)互补，而鸟嘌呤(g)通常与胞嘧啶(c)互补。当相对于其靶序列描述探针时，“完全互补”是指沿着探针全长存在互补性。如本文所用，在核苷酸序列和寡核苷酸的背景下，“相邻”是指彼此紧邻(端到端)，使得两个相邻分子彼此不重叠，并且它们之间没有间隙。例如，与靶核酸分子的相邻区域杂交的两个寡核苷酸探针在它们之间没有靶序列的核苷酸(不与两个探针中的任一个配对)。“足够互补”或“充分互补”是指核酸具有足够量的连续互补核苷酸以在高严格杂交条件下形成稳定的用于检测的杂交体。“优先杂交”是指在高严格杂交条件下，寡核苷酸探针可以与其靶核酸杂交以形成稳定的探针：靶杂交体(从而表明存在靶核酸)，而不形成稳定的探针：非靶杂交体(将表明存在来自其他生物体的非靶核酸)。因此，与非靶核酸相比，探针与靶核酸充分地较大程度地杂交以，使得本领域技术人员能够精确地检测相关细菌的存在并区分它们的存在与其他生物体的存在。可以使用本领域已知的和本文描述的技术来测量优先杂交。如本文所用，“室温”意指约20-25℃。如本文所用，除非另有明确说明，“一个”或“一种”意指至少一个/一种。“表达”包括细胞内mrna表达；细胞内蛋白表达；细胞外细胞表面锚定蛋白表达；细胞外的、细胞解离的但是细胞衍生的mrna；细胞外的、细胞解离的但是细胞衍生的蛋白质。表达可以包括完整的mrna序列，完整的蛋白质，或者可以识别的序列或蛋白质的部分。“骨髓来源的细胞(mdc)”是指表达以下一种或多种的细胞：cd11b+；cd11c+；cd14+；cd33+；cd38+；cd34+；cd36/sr-b3+；cd59+；cd68+；cd163+；cd164+；ham-56+；cd66a+；cd66b+；cd66c+；cd66d+；cd68/sr-d1+；cd42b/gpibα+；cdcxcr3+；f4/80/emr1+和其他骨髓特异性标志物。“表达pd-l1的骨髓来源的细胞(pd-l1+mdc)”是指表现以下组的细胞内mrna表达，细胞内蛋白质表达(包括共表达)的完整细胞：pd-l1+cd11b+；pd-l1+cd11c+；pd-l1+cd14+；pd-l1+cd33+；pd-l1+cd38+；pd-l1+cd34+；pd-l1+cd36/sr-b3+；pd-l1+cd59+；pd-l1+cd68+；pd-l1+cd163+；pd-l1+cd164+；pd-l1+ham-56+；pd-l1+cd66a+；pd-l1+cd66b+；pd-l1+cd66c+；pd-l1+cd66d+；pd-l1+cd68/sr-d1+；pd-l1+cd42b/gpibα+；pd-l1+cdcxcr3+；pd-l1+f4/80/emr1+。“表达pd-l2的骨髓来源的细胞(pd-l2+mdc)”是指表现以下组的细胞内mrna表达或细胞内蛋白质表达(包括共表达)的完整细胞：pd-l2+cd11b+；pd-l2+cd11c+；pd-l2+cd24+；pd-l2+cd33+；pd-l2+cd38+；pd-l2+cd34+；pd-l2+cd36/sr-b3+；pd-l2+cd59+；pd-l2+cd68+；pd-l2+cd163+；pd-l2+cd164+；pd-l2+ham-56+；pd-l2+cd66a+；pd-l2+cd66b+；pd-l2+cd66c+；pd-l2+cd66d+；pd-l2+cd68/sr-d2+；pd-l2+cd42b/gpibα+；pd-l2+cdcxcr3+；pd-l2+f4/80/emr2+。如本文所用，“包含细胞的样品”是指来自以下的从人或动物获得的细胞：外周血、外周静脉血、外周动脉血、外周全血单核细胞、外周单核细胞富集的单核细胞、全外周血红细胞裂解物、血清、血浆、眼泪、毛发、痰液、支气管肺泡、脑脊液、心包液、胸膜液、腹膜液、滑液、阴道液、尿道液、心包液、胸腔积液、腹水、唾液、汗液、肿瘤、淋巴、淋巴管、淋巴结组织、腺样组织、脾脏、脾细胞或癌组织。如本文所用，“细胞来源的细胞外产物”是指来源于细胞的产物，其是从细胞解离的并且是细胞外形式，且包括核酸、蛋白质、脂质、碳水化合物、纳囊泡、微囊泡、糖基化终产物、酶、代谢的化学产物、代谢的化学副产物、阳离子和阴离子。如本文所用，“骨髓细胞来源的细胞产物”旨在意指细胞来源的产物，其是从细胞解离的并且是细胞外的，其中包括核酸、蛋白质、脂质、碳水化合物、纳囊泡、微囊泡、糖基化终产物、酶、代谢的化学产物、代谢的化学副产物、阳离子和阴离子的产物可以唯一地识别骨髓细胞。“包含独立于或依赖于细胞解离的细胞外的、细胞解离的、细胞来源的产物的样品”是指包含在同一样品中共存在的以下之一的样品：pd-l1+和cd11b+；pd-l1+和cd11c+；pd-l1+和cd14+；pd-l1+和cd33+；pd-l1+和cd38+；pd-l1+和cd34+；pd-l1+和cd36/sr-b3+；pd-l1+和cd59+；pd-l1+和cd68+；pd-l1+和cd163+；pd-l1+和cd164+；pd-l1+和ham-56+；pd-l1+和cd66a+；pd-l1+和cd66b+；pd-l1+和cd66c+；pd-l1+和cd66d+；pd-l1+和cd68/sr-d1+；pd-l1+和cd42b/gpibα+；pd-l1+和cdcxcr3+；pd-l1+和f4/80/emr1+或者pd-l2+和cd11b+；pd-l2+和cd11c+；pd-l2+和cd14+；pd-l2+和cd33+；pd-l2+和cd38+；pd-l2+和cd34+；pd-l2+和cd36/sr-b3+；pd-l2+和cd59+；pd-l2+和cd68+；pd-l2+和cd163+；pd-l2+和cd164+；pd-l2+和ham-56+；pd-l2+和cd66a+；pd-l2+和cd66b+；pd-l2+和cd66c+；pd-l2+和cd66d+；pd-l2+和cd68/sr-d1+；pd-l2+和cd42b/gpibα+；pd-l2+和cdcxcr3+；pd-l2+和f4/8q/emr1+。如本文所用，“抗pd-1”或“抗pd-l1疗法”是指靶向程序性死亡1(pd-1)分子或其配体pd-l1和pd-l2的治疗策略，例如通过破坏pd-1和pd-l1或pd-l2之间已建立的当前的相互作用，或阻断pd-1和pd-l1之间或pd-1和pd-l2之间的未来相互作用，阻断不依赖于是否与pd-l1或pd-l2相互作用的pd-1的活化，或阻断在pd-l1或pd-l2与pd-1相互作用时引起的pd-l1或pd-l2信号传导途径。这些治疗策略包括，例如针对pd-1或pd-l1的免疫疗法，并且包括小分子、肽、单克隆抗体、多克隆抗体、干扰rna寡核苷酸和干扰dna寡核苷酸。抗pd-1免疫治疗剂的实例包括但不限于，派姆单抗、纳武单抗(nivolumab)和皮地利珠单抗(pidilizumab)。抗pd-l1免疫治疗剂的实例包括但不限于bms-936559和阿特珠单抗(atezolizumab)。如本文所用，“有效量”旨在意指足以获得有益结果的量、剂量、施用时间表。如本文所用，“治疗”患者的疾病是指(1)预防未显示疾病的症状的人或动物中出现症状或疾病；(2)抑制疾病或阻止其进展；或(3)改善疾病或与疾病相关的症状或者使其消退。如本文所用，术语“核酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸序列，除非另有限定，包括以类似于天然存在的核苷酸的方式与核酸杂交的天然核苷酸的已知类似物。cd33或siglec-3是在骨髓谱系细胞上表达的跨膜受体。通常认为cd33是骨髓特异性的，但其也可以在一些淋巴细胞上发现。以下genbankdna登录号代表cd33蛋白序列：np001763.3、np001171079.1、np001076087.1、p20138.2、cad36509.1、aah28152.1、aak83654.1、eaw71996.1、eaw71995.1和eaw71994.1。由这些genbank登录号中的每一个表示的序列通过引用并入本文用于所有目的。cd14是体内单核细胞的标志物，单核细胞是在外周血中循环的另一种骨髓来源的群体。以下genbankdna登录号代表cd14蛋白序列：cag33297.1、aaa51930.1、p08571.2、np001167576.1、np001167575.1、np_001035110.1、np000582.1、adx31876.1、aac83816.1、eaw62037.1、aah10507.1和bag55282.1。由这些genbank登录号中的每一个表示的序列通过引用并入本文用于所有目的。cd66b是体内粒细胞的标志物，粒细胞是在外周血中循环的另一种骨髓来源的群体。在癌症中，这些骨髓群体可能被诱导成为抑制性mdsc。以下genbankdna登录号代表cd66b蛋白质序列：aah26263.1、p31997.2、np001806.2、aac13659.1和cab08298.1。由这些genbank登录号中的每一个表示的序列通过引用并入本文用于所有目的。方法本发明提供了一种用于鉴定患者为单一药剂抗pd-1或抗pd-l1疗法的响应者的方法。在一个实施方案中，所述方法包括使来自患者的样品与检测骨髓来源的细胞(mdc)的测定试剂接触。所述方法还包括测定患者组织样品中pdl1+和pdl2+mdc的存在，以及任选地将患者样品中存在的mdc的量与癌症活检组织的对照样品进行比较。相对于对照(例如来自已知的非响应者样品)，患者样品中mdc的数量增加指示抗pd-1疗法的响应者。这些方法步骤可以适于检测患者样品中癌症的存在，确定癌症治疗的功效，以及确定对癌症疗法的响应和检测癌症疗法的效力。本发明还提供了一种检测肿瘤样品中适应性免疫耐受性的方法。在一个实施方案中，所述方法包括使肿瘤样品与检测pd-l1+或pd-l2+骨髓来源的细胞(mdc)的测定试剂接触；以及测定肿瘤样品中pd-l1+或pd-l2+mdc的存在。pd-l1+或pd-l2+mdc的存在指示肿瘤样品中的适应性免疫耐受性。肿瘤样品中，例如在侵袭性肿瘤边缘中pd-l1+或pd-l2+mdc的存在指示适应性免疫耐受性以及相应于抗pd1或抗pdl1疗法的可能性。本发明另外地提供了克服患有肿瘤的受试者中适应性免疫耐受性的方法。在一个实施方案中，所述方法包括使包含肿瘤的样品与检测pd-l1+或pd-l2+骨髓来源的细胞(mdc)的测定试剂接触；以及测定肿瘤样品中pd-l1+或pd-l2+mdc的存在。所述方法还包括如果在肿瘤样品中检测到pd-l1+或pd-l2+mdc，则向受试者施用抗pd-1或抗-pd-l1治疗剂。在上述方法中，测定任选地还包括测定肿瘤样品中cd8+、pd1+和/或cd68+细胞的存在。本发明还提供了一种鉴定患者为抗pd-1或抗-pd-l1疗法的响应者的方法。在一个实施方案中，所述方法包括使来自患者的样品与检测pd-l1+或pd-l2+骨髓来源的细胞(mdc)的测定试剂接触；以及测定患者样品中pd-l1+或pd-l2+mdc的存在。pd-l1+或pd-l2+mdc的存在指示抗pd-1或pd-l1阻断疗法的响应者。还提供了一种检测受试者中的癌症的方法。在一个实施方案中，所述方法包括使来自患者的样品与检测pd-l1+或pd-l2+骨髓来源的细胞(mdc)的测定试剂接触；以及测定患者样品中pd-l1+或pd-l2+mdc的存在。pd-l1+或pd-l2+mdc的存在指示癌症。本发明还提供了确定患者中抗pd-1或抗pd-l1疗法的效力的方法。在一个实施方案中，所述方法包括使来自患者的样品与检测pd-l1+或pd-l2+骨髓来源的细胞(mdc)的测定试剂接触；以及测定患者样品中pd-l1+或pd-l2+mdc的存在。pd-l1+或pd-l2+mdc的存在指示抗pd-1或pd-l1阻断疗法的响应者。在一个实施方案中，在向患者施用抗pd-1或抗pd-l1疗法之后重复测定，并且相对于之前测定的样品，患者样品中pd-l1+或pd-l2+mdc的存在的增加指示有效的抗pd-1或抗pd-l1疗法。在本文所述的方法中，样品可以是包含细胞的样品或包含流体的样品。样品可以包含细胞外的、细胞解离的和/或细胞衍生的产物。肿瘤样品可以是例如肿瘤活检。通常，肿瘤样品包括侵袭性肿瘤边缘。在一个实施方案中，肿瘤样品从转移性病灶获得。在一个实施方案中，样品包含外周血。在一个实施方案中，患者被怀疑患有转移性癌症。上述方法可以任选地还包括如果鉴定为响应者，则用抗pd-1疗法治疗患者，并且如果未鉴定为响应者，则用组合疗法治疗患者。pd-l1+mdc的实例包括但不限于具有选自以下的表型的mdc：pd-l1+cd11b+；pd-l1+cd11c+；pd-l1+cd14+；pd-l1+cd33+；pd-l1+cd38+；pd-l1+cd34+；pd-l1+cd36/sr-b3+；pd-l1+cd59+；pd-l1+cd68+；pd-l1+cd163+；pd-l1+cd164+；pd-l1+ham-56+；pd-l1+cd66a+；pd-l1+cd66b+；pd-l1+cd66c+；pd-l1+cd66d+；pd-l1+cd68/sr-d1+；pd-l1+cd42b/gpibα+；pd-l1+cdcxcr3+；和pd-l1+f4/80/emr1+。pd-l2+mdc的实例包括但不限于具有选自以下的表型的mdc：pd-l2+cd11b+；pd-l2+cd11c+；pd-l2+cd24+；pd-l2+cd33+；pd-l2+cd38+；pd-l2+cd34+；pd-l2+cd36/sr-b3+；pd-l2+cd59+；pd-l2+cd68+；pd-l2+cd163+；pd-l2+cd164+；pd-l2+ham-56+；pd-l2+cd66a+；pd-l2+cd66b+；pd-l2+cd66c+；pd-l2+cd66d+；pd-l2+cd68/sr-d2+；pd-l2+cd42b/gpibα+；pd-l2+cdcxcr3+；和pd-l2+f4/80/emr2+。在本发明方法的一个典型实施方案中，测定试剂包含抗体。抗体的实例包括但不限于特异性结合pd-l1+和/或pd-l2+的抗体以及结合mdc的标志物的抗体。在一个实施方案中，测定试剂包含特异性结合pd-l1+的抗体和特异性结合以下的抗体：cd11b+；cd11c+；cd14+；cd33+；cd38+；cd34+；cd36/sr-b3+；cd59+；cd68+；cd163+；cd164+；ham-56+；cd66a+；cd66b+；cd66c+；cd66d+；cd68/sr-d1+；cd42b/gpibα+；cdcxcr3+；或f4/80/emr1+。在一个实施方案中，测定试剂包含特异性结合pd-l2+的抗体和特异性结合以下的抗体：cd11b+；cd11c+；cd24+；cd33+；cd38+；cd34+；cd36/sr-b3+；cd59+；cd68+；cd163+；cd164+；ham-56+；cd66a+；cd66b+；cd66c+；cd66d+；cd68/sr-d2+；cd42b/gpibα+；cdcxcr3+；或f4/80/emr2+。代表性的测定包括但不限于免疫测定、聚合酶链式反应、测序(包括下一代测序)和mdc表型的分析。免疫测定的实例包括免疫组织化学和免疫荧光，包括定量免疫组织化学和定量免疫荧光。这些测定可以以单一和多重形式进行。本发明还提供了一种治疗患者中的癌症的方法。在一个实施方案中，所述方法包括根据本文所述的方法鉴定患者为抗pd-1或抗pd-l1疗法的响应者；以及如果鉴定为响应者，则用抗pd-1疗法治疗患者，如果未鉴定为响应者，则使用组合疗法治疗患者。在一个实施方案中，本发明提供了用于对抗pd-1或抗pd-l1疗法的非响应者进行分层的方法。所述方法包括转移性病灶的肿瘤微环境的侵袭性边缘内的cd8+、pd-1、pd-l1和cd68细胞组织的微观解剖学定量细胞作图。这使得能够预测表现为哪一种亚型的非响应者，以及计划有效的治疗策略。在侵袭性边缘处缺少任一种组分：与cd68pdl1细胞交界的cd8、pd1细胞，指示非响应者。如本文所述，非响应者可以可靠地分层为亚型。然后可以为特定亚型的非响应者定制治疗，例如将其肿瘤转化为抗pd1响应性肿瘤。下面列出了可以在侵袭性肿瘤边缘观察到的相关特征的实例：·表达或不表达pdl1的cd68+巨噬细胞的位置、密度和表型；·表达或不表达pd1的cd8+t细胞的位置、密度和表型；·一类非响应者在侵袭性肿瘤边缘处为cd8低-pd1低-cd68低-pdl1低；·另一类非响应者在侵袭性肿瘤边缘处为cd8高-pd1高-cd68低-pdl1低；·另一类非响应者在侵袭性肿瘤边缘处为cd8低-pd1低-cd68低-pdl1高；以及·另一类非响应者在侵袭性肿瘤边缘处为cd8低-pd1低-cd68高-pdl1高。用于治疗非响应者的药物或疗法可以基于其调节肿瘤以在侵袭性肿瘤边缘实现细胞标签的能力来选择，所述细胞标签是实现对抗pd1疗法的响应所需的。样品通常是肿瘤样品，例如从患者获得的活检或手术切除物。通常，肿瘤样品是从转移性病灶获得的。患者可能是被怀疑患有转移性癌症的患者。癌症的实例包括但不限于黑素瘤、肺癌(包括例如非小细胞肺癌)、乳腺癌、头颈癌、泌尿道上皮癌。癌症的其他实例包括肾上腺皮质癌、肛门癌、膀胱癌、血癌、脑肿瘤、脑干神经胶质瘤、脑肿瘤、小脑星形细胞瘤、脑肿瘤、脑星形细胞瘤、室管膜瘤、乳腺癌、类癌瘤、未知原发癌、宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、食道癌、肝外胆管癌、尤文氏肿瘤家族(pnet)、颅外生殖细胞肿瘤、眼癌、眼内黑素瘤、胆囊癌、胃癌、生殖细胞肿瘤、性腺外、妊娠滋养细胞瘤、头颈癌、下咽癌、胰岛细胞癌、肾癌(肾细胞癌)、喉癌、急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、毛细胞白血病、唇和口腔癌、肝癌、肺癌(非小细胞和小细胞)、淋巴瘤、皮肤t细胞淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金病、多发性骨髓瘤和其他浆细胞肿瘤、蕈样真菌病、骨髓增生异常综合征、骨髓增生性疾病、鼻咽癌、成神经细胞瘤、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、胰腺癌、胰岛细胞癌、鼻旁窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、垂体癌、浆细胞肿瘤、前列腺癌、横纹肌肉瘤、直肠癌、肾细胞癌、唾液腺癌、塞扎莱综合征、皮肤癌、卡波斯肉瘤(kaposi′ssarcoma)、黑素瘤、小肠癌、软组织肉瘤、胃癌、睾丸癌、胸腺瘤、恶性肿瘤、甲状腺癌、尿道癌、子宫癌、肉瘤、阴道癌、外阴癌和威尔姆斯氏肿瘤(wilms′tumor)。所述方法可以任选地进一步包括如果鉴定为响应者，则用抗pd-1疗法治疗患者。鉴定为非响应者(或“进展者”或未鉴定为响应者)的患者可以用组合疗法治疗。组合疗法的实例包括本领域已知的那些，并且将在治疗医师的判断下进行选择。疗法可以是抗pd-1疗法与常规癌症疗法的组合，例如化学治疗剂和/或其他免疫治疗剂，例如抗ctla4，以及放射疗法，包括局部放射疗法和小分子治疗剂。化学治疗剂的一些代表性实例包括顺铂、培美曲塞、卡铂、紫杉醇、达卡巴嗪、替莫唑胺及其组合。还提供了一种治疗患者的癌症的方法。在一个实施方案中，所述方法包括根据本文所述的方法鉴定患者为抗pd-1或抗-pd-l1疗法的响应者，以及如果鉴定为响应者，则用抗pd-1疗法治疗患者。或者，如果未鉴定为响应者，则用组合疗法治疗患者。试剂盒本发明还包括可用于实践本文所述方法的试剂盒。试剂盒可以包含一种或多种抗体、寡核苷酸探针或寡核苷酸探针对，或选自本文所述的其他测定试剂。试剂可以任选地用可检测标志物标记。该试剂盒还可以包含用于容纳用于所述方法的抗体、引物、探针和其他试剂的容器。分析肿瘤样品的方法及其应用本公开描述了一种分析分析肿瘤样品的方法，其可应用于诊断、监测、临床实践、临床试验设计、药物发现、药物开发等。本公开的一些实施方案涉及分析来自患有肿瘤或癌症的受试者的生物样品的方法，包括：(1)对于具有目标表型的靶细胞，确定：(a)样品的肿瘤微环境中靶细胞的位置(靶细胞的空间分辨率)；(b)样品中空间分辨的靶细胞的密度；以及(c)样品中空间分辨的目标靶细胞之间的接近度；以及(2)至少部分地基于参数(a)至(c)确定总分数。位置考虑包括侵袭性肿瘤边缘、基质(结缔组织)、肿瘤实质、血管周区域(血液和淋巴)以及血管内(血液和淋巴)。接近度可以是例如基于像素、基于细胞内、基于细胞间和/或基于细胞外。多参数考虑包括基于像素、基于细胞、基于位置和基于整个载玻片的分析。密度分析可以是例如基于像素、基于区域、基于细胞和/或基于整个载玻片。阳性像素的密度可以基于每平方毫米的阳性像素的数目，每单位面积的每像素总数的阳性像素的数目，以及每像素总数的阳性像素的数目。在一个实施方案中，确定1至1,000个阳性像素的阳性像素的密度。阳性细胞的密度例如可以基于每平方毫米的阳性细胞的数目，或每有核细胞总数的阳性细胞的数目。在一个实施方案中，确定一个细胞上最多十个靶标的阳性细胞的密度。靶标可以包括例如细胞内蛋白质或衍生物，包括细胞质(或可溶性)、细胞器内、细胞器膜附着或细胞器膜内靶标。还包括膜蛋白和/或衍生物，包括周围蛋白和整合蛋白，以及细胞外蛋白和/或衍生物，包括膜结合、分泌、排泄、囊泡、裸露、起泡、胞吐小泡、溶酶体、孔衍生、坏死细胞衍生和血管衍生的蛋白质及其衍生物。在一些实施方案中，生物样品在治疗前或治疗期间从受试者获得。短语“在治疗前从受试者获得”可意指例如从先前已经用抗肿瘤剂治疗并且在用不同的抗肿瘤剂治疗之前的受试者获得，或者从初次治疗受试者获得。在一些实施方案中，所述方法还包括确定样品中空间分辨的靶细胞的密度的分数(密度分数)和/或样品中空间分辨的目标靶细胞之间的接近度的分数(接近度分数)，并且其中：至少部分地基于样品中特定类型的空间分辨的靶细胞的密度的加权来确定密度分数；至少部分地基于样品中特定类型的空间分辨的目标靶细胞之间的接近度的加权来确定接近度分数；以及至少部分地基于密度分数和/或接近度分数的加权来确定总分数。可以基于任何一个或多个适当因素来调整密度分数、接近度分数或总分数，或其任何组合或全部。在某些实施方案中，基于所述样品在治疗前或是在治疗期间从所述受试者获得来调整所述密度分数(例如加权以确定所述密度分数)、所述接近度分数(例如加权以确定所述接近度分数)或所述总分数(例如加权以确定所述总分数)，或其任何组合或全部。在另一些实施方案中，基于所述受试者患有的特定类型的肿瘤或癌症(和任选的疾病严重性[例如，疾病的阶段])来调整所述密度分数(例如加权以确定所述密度分数)、所述接近度分数(例如加权以确定所述接近度分数)或所述总分数(例如加权以确定所述总分数)，或其任何组合或全部。在另一些实施方案中，基于原发性肿瘤的位置和/或任何继发性(转移性)肿瘤的位置来调整所述密度分数(例如加权以确定所述密度分数)、所述接近度分数(例如加权以确定所述接近度分数)或所述总分数(例如加权以确定所述总分数)，或其任何组合或全部。在另一些实施方案中，基于与所述受试者有关的信息，例如所述受试者的人种、种族、性别、年龄、体重指数、饮食、危险因素(饮酒、吸烟、压力和/或不活动性)、(个人和/或家族)病史或总体健康或其任何组合或全部来调整所述密度分数(例如加权以确定所述密度分数)、所述接近度分数(例如加权以确定所述接近度分数)或所述总分数(例如加权以确定所述总分数)，或其任何组合或全部。在另一些实施方案中，基于使用阻断pd-1/pd-l1/pd-l2途径的特定单一药剂或使用特定抗pd-1/pd-l1/pd-l2药剂和特定的另外的抗肿瘤剂(组合疗法)治疗具有特定类型的肿瘤或癌症(并且任选考虑疾病严重性)的其他受试者的治疗结果来调整所述密度分数(例如加权以确定所述密度分数)、所述接近度分数(例如加权以确定所述接近度分数)或所述总分数(例如加权以确定所述总分数)，或其任何组合或全部。在一些实施方案中，具有目标表型的靶细胞包括表达(例如在表面上或在细胞内表达或分泌)一种或多种生物标志物(例如蛋白质标志物)的细胞。在某些实施方案中，靶细胞表达选自以下的生物标志物：cd4、cd8、cd11b、cd11c、cd15、cd16、cd19、cd25、cd56、cd68、cd80、cd123、cd138、cd163、ctla-4、foxp3、粒酶b、hla-a、hla-b、hla-c、hla-dr、igg-κ、igg-λ、ki67、ldh、mpo、ox40(cd134)、pd-1、pd-l1、pd-l2和pstat1。在一些实施方案中，靶细胞表达本文所述的至少5、10、15、20或25种或全部生物标志物。在一些实施方案中，靶细胞包括免疫细胞(例如适应性免疫细胞和/或先天免疫细胞)和/或肿瘤细胞或其全部。在某些实施方案中，靶细胞包括至少5种或全部以下类型的细胞：(1)表达cd4、cd8、cd25、ctla-4、foxp3、粒酶b、ki67、ox40、pd-1或pstat1或其任何组合或全部的t细胞(例如细胞毒性和/或调节性t细胞)；(2)表达cd19和/或cd80的b细胞；(3)表达cd138的浆细胞(血浆/效应b细胞)；(4)表达cd11b、cd16、cd68、cd163、pd-l1或pd-l2或其任何组合或全部的巨噬细胞；(5)表达cd11c、cd68、cd123、pd-l1或pd-l2或其任何组合或全部的树突状细胞；(6)表达cd16、cd56或粒酶b或其任何组合或全部的自然杀伤(nk)细胞；(7)表达cd15、cd16或mpo或其任何组合或全部的粒细胞(例如嗜中性粒细胞)；(8)表达cd16和/或cd80的单核细胞；以及(9)表达pd-l1、pd-l2或cd15或其任何组合或全部的肿瘤细胞。可以使用任何合适的方法和试剂检测生物标志物或表达生物标志物的靶细胞。在某些实施方案中，通过使用特异性结合生物标志物的抗体染色来检测生物标志物或表达生物标志物的靶细胞。在一些实施方案中，样品的肿瘤微环境中靶细胞的位置包括在侵袭性肿瘤边缘(例如在肿瘤周围的结缔组织中)的位置和/或在肿瘤实质(肿瘤内)内的位置。在某些实施方案中，s100的染色用于从肿瘤实质(s100阳性)中描绘出侵袭性肿瘤边缘(s100阴性)。可以通过肿瘤微环境中具有目标表型的细胞的密度和接近度显著影响免疫系统攻击肿瘤细胞的能力。例如，免疫细胞可以基于它们与其他免疫细胞和/或肿瘤细胞的接近度而改变它们的活性。在某些实施方案中，样品中空间分辨的靶细胞的密度包括侵袭性肿瘤边缘处和肿瘤实质内表达cd8、cd11b、cd68、粒酶b、ki67、pd-1、pd-l1、pd-l2和pstat1的细胞的密度。在另一些实施方案中，样品中空间分辨的目标靶细胞之间的接近度包括在侵袭性肿瘤边缘处和肿瘤实质内表达pd-1的细胞(例如，t细胞)和表达pd-l1的细胞(例如，免疫细胞和/或肿瘤细胞)之间的接近度。在一些实施方案中，可以进行以下短语的代替：短语“具有目标表型的靶细胞”可以用短语“目标生物标志物”代替；短语“样品的肿瘤微环境中靶细胞的位置(靶细胞的空间分辨率)”可以用“样品的肿瘤微环境中生物标志物的位置(生物标志物的空间分辨率)”代替；短语“样品中空间分辨的靶细胞的密度”可以用短语“样品中空间分辨的生物标志物的密度”代替；以及短语“样品中空间分辨的目标靶细胞之间的接近度”可以用短语“样品中空间分辨的目标生物标志物之间的接近度”代替。因此，在某些实施方案中，样品中的空间分辨的靶细胞的密度包括在治疗前或治疗期间从受试者获得的样品中侵袭性肿瘤边缘处和肿瘤实质内目标生物标志物的细胞密度(例如以细胞/mm2计)。在一些实施方案中，生物样品包括组织和/或血液。在某些实施方案中，生物样品包括在切片之前用福尔马林固定并包埋在石蜡中的组织，并且其中在免疫组织化学染色之前将福尔马林固定、石蜡包埋(ffpe)的组织切片脱石蜡并且处理(例如加热)用于抗原修复。在其他实施方案中，生物样品包括肿瘤样品。在某些实施方案中，肿瘤样品包括侵袭性肿瘤边缘和/或肿瘤实质。在另一些实施方案中，肿瘤样品包括原发性肿瘤和/或继发性(转移性)肿瘤。在某些实施方案中，受试者的肿瘤或癌症是实体肿瘤。在另一些实施方案中，受试者的肿瘤或癌症是血液恶性肿瘤，在另一些实施方案中，受试者的肿瘤或癌症是以下的肿瘤或癌症：脑(例如胶质瘤或胶质母细胞瘤)、头或颈部(例如口腔、咽喉或甲状腺)、胃肠道(例如食道、胃、小肠或大肠、结肠或直肠)、肺(例如小细胞肺癌[sclc]或非小细胞肺癌[nsclc]，如鳞状nsclc或非鳞状nsclc)、胰腺、肝、肾(例如肾细胞癌)、膀胱、乳腺(例如三阴性乳腺癌)、子宫、子宫颈、卵巢、前列腺(例如去势抗性前列腺癌)、睾丸、皮肤(例如黑素瘤，如转移性黑素瘤)、上皮组织或细胞(例如、胃癌、结肠直肠癌、肝细胞癌、肾细胞癌、泌尿道上皮膀胱癌、子宫内膜癌或鳞状细胞癌[例如，头颈部])或造血或淋巴组织或细胞(例如白血病[例如急性骨髓性白血病或慢性淋巴细胞白血病]、淋巴瘤[例如霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤]、骨髓瘤[例如多发性骨髓瘤]或骨髓增生综合征)。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物，例如灵长类动物(例如人、黑猩猩或猴)、啮齿动物(例如大鼠、小鼠、沙鼠或仓鼠)、兔科动物(例如兔)、猪科动物(例如猪)、马科动物(例如马)，犬科动物(例如狗)或猫科动物(例如猫)。在某些实施方案中，受试者是人(人受试者也可以称为“患者”)。在另一些实施方案中，受试者是非人哺乳动物。非人受试者可以在例如药物发现或开发中研究，或者可以是兽医学中的患者。在一些实施方案中，总分数与所述受试者的免疫系统攻击肿瘤细胞的强度或能力相关。在另一些实施方案中，总分数与所述受试者将响应于用阻断免疫检查点的单一药剂治疗的概率或可能性相关。在某些实施方案中，总分数与所述受试者将响应于用阻断pd-1/pd-l1/pd-l2途径的单一药剂的治疗的概率或可能性相关。在一些实施方案中：(1)如果总分数等于或大于阈值分数，则总分数指示或预测受试者将响应于用阻断pd-1/pd-l1/pd-l2途径的单一药剂的治疗(预测受试者是pd-1/pd-l1/pd-l2阻断疗法的响应者)；或(2)如果总分数小于阈值分数，则总分数指示或预测受试者将不响应于用阻断pd-1/pd-l1/pd-l2途径的单一药剂的治疗(预测受试者是pd-1/pd-l1/pd-l2阻断疗法的进展者或非响应者)。在某些实施方案中，所述方法正确地预测受试者将在至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％(例如至少约90％或95％)时间响应于用阻断pd-1/pd-l1/pd-l2途径的单一药剂的治疗(预测的精度)。在另一些实施方案中，所述方法正确地预测受试者将在至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％(例如至少约90％或95％)时间不响应于用阻断pd-1/pd-l1/pd-l2途径的单一药剂的治疗(预测的精度)。在另一些实施方案中，所述方法还包括：(1)如果总分数等于或大于阈值分数：(a)基于在治疗前从受试者获得的样品的总分数，向受试者施用有效量的阻断pd-1/pd-l1/pd-l2途径的单一药剂；或(b)如果最初用抗pd-1/pd-l1/pd-l2药剂治疗受试者，则基于在治疗期间从受试者获得的样品的总分数，继续施用阻断pd-1/pd-l1/pd-l2途径的相同的单一药剂；或(c)如果最初向受试者提供组合疗法，则基于在治疗期间从受试者获得的样品的总分数，停止施用至少一种其他抗肿瘤剂并且继续施用阻断pd-1/pd-l1/pd-l2途径的相同的药剂；或(2)如果总分数小于阈值分数：(a)基于在治疗前从受试者获得的样品的总分数，向受试者施用有效量的阻断pd-1/pd-l1/pd-l2途径的药剂和有效量的至少一种其他抗肿瘤剂(组合疗法)；或(b)如果最初用抗pd-1/pd-l1/pd-l2药剂治疗受试者，则基于在治疗期间从受试者获得的样品的总分数，向受试者施用有效量的至少一种其他抗肿瘤剂，并且施用阻断pd-1/pd-l1/pd-l2途径的相同的药剂(其剂量和/或给药频率可以调整(例如增加))或不同的药剂；或(c)如果最初向受试者提供组合疗法，则基于在治疗期间从受试者获得的样品的总分数，施用阻断pd-1/pd-l1/pd-l2途径的相同的药剂(剂量和/或给药频率可以调整(例如增加))或不同的药剂，并且施用至少一种其他抗肿瘤剂，至少一种其他抗肿瘤剂可以与最初提供的至少一种其他抗肿瘤剂相同(剂量和/或给药频率可以调整(例如增加))或不同。本文描述的方法可以在初始决定点进行，以指导选择患有肿瘤或癌症的受试者的治疗，和/或在治疗期间进行以监测受试者对当前治疗方案的响应。图1是本发明方法的实施方案的流程图。在一些实施方案中，在以下上进行所述方法：(1)在治疗前从受试者获得的生物样品上，以指导选择用阻断pd-1/pd-l1/pd-l2途径的单一药剂或者用阻断pd-1/pd-l1/pd-l2途径的药剂和至少一种其他抗肿瘤剂(组合疗法)进行治疗的决定；以及(2)在治疗期间从受试者获得的至少一种生物样品上，以监测受试者对当前治疗方案的响应，并且指导选择用单一药剂pd-1/pd-l1/pd-l2阻断疗法或用组合疗法进行治疗的决定。可以将来自受试者的样品的分析结果与存储在数据库中的信息进行比较。存储在数据库中的信息可以包括但不限于患有广泛肿瘤和癌症的受试者的空间分辨的具有某些表型(例如表达某些生物标志物)的免疫细胞和肿瘤细胞的特性(例如密度和接近度特性)，以及使用阻断pd-1/pd-l1/pd-l2途径的特定单一药剂或者使用特定的抗pd-1/pd-l1/pd-l2药剂和特定的另外的抗肿瘤剂(组合疗法)治疗具有特定类型的肿瘤或癌症的其他受试者的治疗结果。这些信息可以在临床前测试(非人试者)、临床试验或临床实践或其任何组合或全部中获得。本发明方法可用于将患有不同类型的肿瘤和癌症的受试者的涉及不同表型(例如不同的生物标志物)的免疫和肿瘤细胞特性(例如密度和接近度特性)与对单一药剂(或特定单一药剂)疗法或组合(或特定组合)疗法的不同响应相关联。在某些实施方案中，总分数与以下的概率有关或者预测以下：所述受试者是否将响应于用阻断pd-1/pd-l1/pd-l2途径的特定单一药剂或者用特定抗pd-1/pd-l1/pd-l2药剂和特定的另外的抗肿瘤剂的治疗。在一些实施方案中，所述方法还包括：(1)将受试者的密度和接近度特性和总分数与存储在数据库中的患有相同类型的肿瘤或癌症(任选地基本上相同的疾病严重性)的其他受试者的密度和接近度特性和总分数进行比较，其中所述数据库还存储有用阻断pd-1/pd-l1/pd-l2途径的特定单一药剂或者用特定的抗pd-1/pd-l1/pd-l2药剂和特定的另外的抗肿瘤剂治疗所述其他受试者的治疗结果；以及(2)基于所述比较，向受试者施用：(a)有效量的阻断pd-1/pd-l1/pd-l2途径的单一药剂或特定单一药剂；或(b)有效量的阻断pd-1/pd-l1/pd-l2途径的药剂或特定药剂，以及有效量的另外的抗肿瘤剂或特定的另外的抗肿瘤剂(组合疗法)。来自受试者的样品的分析结果和用所选的单一药剂疗法或组合疗法的受试者治疗结果可以存储在数据库中，并且可以用于改进本文所述的方法。例如，这样的结果和结果可用于改进用于计算密度分数、接近度分数和总分数的算法，并且预测具有特定类型的肿瘤或癌症的受试者是否将响应于单一药剂(或特定单一药剂)疗法或组合(或特定组合)疗法。从治疗过程开始，本发明方法有助于选择最佳疗法，无论是单一药剂疗法还是组合疗法。患有晚期癌症的患者(例如iii期或iv期)可能被给予有限量的生活时间的预后，并且可能仅具有疗法的单一疗程的时间。此外，癌症患者的生存期与一线(初始)疗法的效力相关。本文描述的方法具有一系列应用。本发明方法可以应用于例如诊断(例如鉴定用于单一药剂免疫检查点[例如pd-1/pd-l1/pd-l2]阻断疗法或组合疗法的候选物，以及确定是否发生了肿瘤或癌症的复发或抗性)、监测(例如确定是否应使用相同或不同的单一药剂免疫检查点[例如pd-1/pd-l1/pd-l2]阻断疗法或组合疗法)、临床实践(例如选择单一药剂(或特定单一药剂)疗法或组合(或特定组合)疗法用于特定类型的肿瘤或癌症)、临床试验设计(例如患者的分层和选择以及在临床试验中选择具有最大机会成功的单一药剂或组合疗法)、药物发现(例如鉴定新的生物标志物以及验证除pd-1/pd-l1/pd-l2途径以外的癌症免疫治疗靶标)和药物开发(例如开发用于特定类型的肿瘤和癌症的有效的免疫检查点[例如pd-1/pd-l1/pd-l2]阻断剂和组合疗法)。作为非限制性实例，在施用疫苗之前，本发明方法可用于预测受试者是否将响应于癌症疫苗的治疗。此外，在施用癌症疫苗之后，所述方法可用于观察受试者是否具有增加的机会响应于癌症疫苗的治疗。在某些实施方案中，本发明方法用于将受试者分层为pd-1/pd-l1/pd-l2阻断疗法的响应者或非响应者，并在临床实践、临床试验或药物发现或开发中选择受试者，无论涉及单一药剂(或特定单一药剂)疗法或组合(或特定组合)疗法。在其他实施方案中，所述方法用于在临床实践、临床试验或药物发现或开发中指导或产生治疗决定，无论是涉及单一药剂(或特定单一药剂)疗法或组合(或特定组合)疗法。所述方法可以用于鉴定将响应于用特定的单一抗pd-1/pd-l1/pd-l2药剂(单一药剂疗法)或用特定抗pd-1/pd-l1/pd-l2药剂和特定的另外的抗肿瘤剂(组合疗法)的治疗的具有特定类型的肿瘤或癌症的受试者。阻断pd-1/pd-l1/pd-l2途径的药剂可以抑制pd-1、pd-l1或pd-l2或其任何组合。在一些实施方案中，阻断pd-1/pd-l1/pd-l2途径的药剂选自抗pd-1抗体(例如纳武单抗[bms-936558、mdx-1106或ono-4538]、派姆单抗[拉姆单抗(lambrolizumab)或mk-3475]、皮地利珠单抗[ct-011]和medi-0680[amp-514])、抗pd-1融合蛋白(例如，amp-224[含有fc抗体结构域和pd-l2])、抗pd-l1抗体(例如bms-936559[mdx-1105]、medi-4736、mpdl3280a[rg7446]和msb0010718c)及其类似物、衍生物、片段和盐。在某些实施方案中，阻断pd-1/pd-l1/pd-l2途径的药剂是抗pd-1药剂(例如，抗pd-1抗体，例如纳武单抗或派姆单抗)。在一些实施方案中，所述至少一种其他抗肿瘤剂或另外的抗肿瘤剂选自细胞毒性剂、免疫系统刺激剂、其他免疫检查点抑制剂、血管生成抑制剂、靶向抗肿瘤治疗剂(包括免疫治疗剂)和其他类型的抗肿瘤剂(包括癌症疫苗)。在某些实施方案中，所述至少一种其他抗肿瘤剂或另外的抗肿瘤剂包含另一种免疫检查点抑制剂(例如，ctla-4抑制剂，如伊匹单抗)和/或免疫系统刺激剂(例如，tlr9激动剂，如agatolimod)。在一些实施方案中，所述至少一种其他抗肿瘤剂或另外的抗肿瘤剂选自：(1)细胞毒性剂，包括但不限于：(i)烷化剂，例如氮丙啶(例如地吖醌(diaziquone)、丝裂霉素和噻替哌(thiotepa))、氮芥(例如甘露莫氮芥、盐酸氮芥[二氯甲基二乙胺]、苯胺氮芥、苯达莫司汀、苯甲酸氮芥、苯丁酸氮芥、c6-半乳糖氮芥、美法仑、ossichlorin[氧氮芥]、泼尼氮芥、尿嘧啶氮芥、氮芥氨基甲酸酯[例如雌莫司汀]和氧氮环磷类(oxazaphosphorines)[例如环磷酰胺、异环磷酰胺、马磷酰胺(mafosfamide)和三芥环磷酰胺(trofosfamide)])、亚硝基脲(例如卡莫司汀、福莫司汀、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀、n-亚硝基-n-甲基脲、雷莫司汀、司莫司汀(semustine)和链脲佐菌素)、含铂化合物(例如顺铂、卡铂和奥沙利铂)、烷基磺酸盐(例如白消安、甘露舒凡(mannosulfan)和苏消安)、肼(例如达卡巴嗪和丙卡巴肼)、咪唑并四嗪(例如米托唑胺(mitozolomide)和替莫唑胺)和三嗪(例如六甲基三聚氰胺[六甲蜜胺])。(ii)细胞毒性抗生素，如蒽环类药物(例如阿柔比星、柔红霉素、多柔比星、表柔比星、伊达比星、米托蒽醌、吡柔比星和戊柔比星)、放线菌素(例如放线菌素d)、博莱霉素(如博来霉素a2和b2)、丝裂霉素(丝裂霉素c)和普卡霉素(plicamycin)；(iii)抗代谢物，例如抗叶酸剂(例如氨蝶呤、甲氨蝶呤和培美曲塞)、脱氧核苷类似物(例如5-氮杂胞苷[阿扎胞苷]、5-氮杂-2′-脱氧胞苷[地西他滨]、克拉屈滨、氯法拉滨、阿糖胞苷、地西他滨、氟达拉滨、吉西他滨、奈拉滨和喷司他丁)、氟嘧啶(例如5-氟尿嘧啶、5-氟-5′-脱氧尿苷[去氧氟尿苷]和卡培他滨)和硫嘌呤(例如硫鸟嘌呤、硫唑嘌呤和巯嘌呤)；(iv)抗微管剂，如多拉司他汀(例如多拉司他汀15)、埃坡霉素(例如埃坡霉素a-f)、紫杉烷类(例如紫杉醇和多西紫杉醇)、长春花碱生物碱(例如长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春氟宁和长春瑞滨)、秋水仙碱、诺考达唑、鬼臼毒素和根霉素；(v)组蛋白脱乙酰酶抑制剂，例如曲古抑菌素(例如曲古抑菌素a)、罗米地辛(romidepsin)和伏立诺他；(vi)激酶抑制剂，例如姜黄素、环己酸、鱼藤素、福司曲星(fostriecin)、hispidin、酪氨酸磷酸化抑制剂(tyrphostin)(例如酪氨酸磷酸化抑制剂ag34和ag879)、硼替佐米、厄洛替尼、吉非替尼、伊马替尼、维罗非尼(vemurafenib)和维莫德吉(vismodegib)；(vii)拓扑异构酶i抑制剂，如喜树碱、伊立替康和托扑替康；(viii)拓扑异构酶ii靶向剂，例如拓扑异构酶ii毒物(例如依托泊苷、塔非布苷(tafluposide)、替尼泊苷、多柔比星和米托蒽醌)和拓扑异构酶ii抑制剂(例如新生霉素、merbarone和阿柔比星)；(ix)dna或rna合成抑制剂，如3-氨基-1，2，4-苯并三嗪1，4-二氧化氮，胞嘧啶β-d-阿拉伯呋喃糖苷、5，6-二氯苯并咪唑1-β-d-呋喃核糖苷、更昔洛韦和羟基脲；(x)蛋白质合成抑制剂，如高三尖杉酯碱；(xi)细胞生长和分化调节剂，例如类视黄醇(例如全反式视黄醇[维生素a]、11-顺式视黄醇、全反式视黄醛[维生素a醛]、11-顺式视黄醛、全反式视黄酸[维甲酸]、9-顺式视黄酸[阿利维甲酸]、11-顺式视黄酸、13-顺式视黄酸[异维甲酸]、全反式视黄酯、依曲替酯、阿昔曲汀、阿达帕林、蓓萨罗丁和他扎罗汀)(xii)细胞增殖抑制剂，例如mtor抑制剂(例如雷帕霉素[西罗莫司])、芹菜素、胆钙化醇(维生素d3)和性激素结合球蛋白；(xiii)凋亡诱导物，例如17-烯丙基氨基-17-脱甲氧基格尔德霉素、褪黑素、洛伐他汀、补骨脂素、毒胡萝卜素和曲格列酮；以及其类似物、衍生物和盐；(2)刺激免疫系统的药剂，包括但不限于：(i)肿瘤坏死因子受体超家族成员4(tnfrsf4、ox40或cd134)的激动剂/活化剂，例如ox40靶向抗体(例如medi-6469和9b12)和ox40的配体(例如ox40l)；(ii)tnfrsf成员5(tnfrsf5或cd40)的激动剂/活化剂，例如cd40靶向抗体(例如达西珠单抗(dacetuzumab)和cp-870，893)和cd40的配体(例如cd40l[cd154])；(iii)tnfrsf成员9(tnfrsf9、4-1bb或cd137)的激动剂/活化剂，例如4-1bb靶向抗体(例如乌瑞鲁单抗(urelumab)[bms-663513]和pf-05082566)和4-1bb的配体(例如4-1bbl)；(iv)tnfrsf成员18(tnfrsf18，糖皮质激素诱导的tnfr相关蛋白[gitr]或cd357)的激动剂/活化剂，例如gitr靶向抗体(例如dta-1和trx518)和gitr的配体(例如gitrl)；(v)toll样受体(tlr)的激动剂/活化剂，例如tlr9的配体(例如未甲基化的cpg寡脱氧核苷酸[cpgodn]，如agatolimod)；以及其类似物、衍生物、片段和盐；(3)阻止免疫检查点的其他药剂，包括但不限于：(i)细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4(ctla-4)受体或其配体的抑制剂，例如抗gtla-4抗体(例如伊匹单抗(ipilimumab)和tremelimumab)；(ii)杀伤细胞免疫球蛋白样受体(kir)或其配体的抑制剂，例如抗kir抗体(例如lirilumab[iph2102或bms-986015])；(iii)淋巴细胞活化基因3(lag-3)受体或其配体的抑制剂，例如抗lag-3抗体(例如bms-986016)；(iv)吲哚胺2，3-双加氧酶抑制剂(ido或ido1)的抑制剂，例如indoximod(1-甲基-d-色氨酸或nlg-8189)、nlg-919、incb024360、α-甲基-色氨酸、β-咔啉(9h-吡啶并[3，4-b]吲哚或去甲哈尔满(norharmane))，以及环氧合酶2(cox-2)抑制剂(例如昔布类(coxibs)[例如阿利考昔(apricoxib)、塞来考昔、依托考昔、罗美考昔、帕瑞考昔、罗非考昔和伐地考昔]，其下调ido的表达)；以及其类似物、衍生物、片段和盐；(4)血管生成抑制剂，包括但不限于血管内皮生长因子(vegf)的抑制剂(例如角鲨胺(squalamine)和抗vegf抗体如贝伐珠单抗)或其受体(vegfr)的抑制剂(例如阿利替尼、帕唑帕尼、索拉非尼和舒尼替尼)，血小板衍生生长因子(pdgf)的抑制剂(例如角鲨胺)或其受体(pdgfr)的抑制剂(例如阿西替尼、帕唑帕尼、索拉非尼和舒尼替尼)，成纤维细胞生长因子(fgf)的抑制剂(例如角鲨胺)或其受体(fgfr)的抑制剂，血管生成素的抑制剂(例如，抗血管生成素抗体，如nesvacumab)或其受体的抑制剂，整合素的抑制剂(例如alg-1001和jsm-6427)、阿奈可他(乙酸阿奈可他)、血管抑素(例如血管抑素k1-3)、αvβ3抑制剂(例如伊瑞西珠(etaracizumab))、小檗碱、博来霉素、疏螺旋体素、羧基氨基三唑、软骨来源的血管生成抑制剂(例如软骨调节蛋白i和肌钙蛋白i)、粟树精胺、cm101、环丙烯脂肪酸(例如苹婆酸)、α-二氟甲基鸟氨酸、内皮抑素、依维莫司、烟曲霉素、染料木素、干扰素-α、白介素-12、伊曲康唑、利诺胺(linomide)、基质金属蛋白酶(mmp)抑制剂(例如巴马司他(batimastat)、西马司他(cipemastat)、伊洛马司他(ilomastat)、马马司他(marimastat)、普啉司他(prinomastat)、rebimastat、坦诺司他(tanomastat)和四环素类[例如多西环素(doxycycline)、incyclinide和米诺环素(minocycline)])、2-甲氧基雌二醇、色素上皮衍生因子(pedf)、血小板因子-4、ppar-γ激动剂(例如噻唑烷二酮类，例如环格列酮(ciglitazone)、洛贝格列酮(lobeglitazone)、尼格列酮(netoglitazone)、吡格列酮(pioglitazone)、来格列酮(rivoglitazone)、罗格列酮(rosiglitazone)和曲格列酮(troglitazone))、催乳素、鞘氨醇-1-磷酸抑制剂(例如sonepcizumab)、角鲨烯、星形孢菌素、血管抑制类固醇(例如四氢皮质醇)加肝素、茋类化合物(stilbenoids)、苏拉明、su5416、他喹莫德(tasquinimod)、tecogalan、四硫钼酸盐、沙利度胺(thalidomide)及其衍生物(例如来那度胺(lenalidomide)和泊马度胺(pomalidomide))、噻苯达唑(thiabendazole)、血小板反应素(例如血小板反应素1)、tnp-470、曲尼司特(tranilast)、withaferina及其类似物、衍生物、片段和盐；以及(5)其他种类的抗肿瘤剂，包括但不限于：(i)药物流出泵抑制剂，例如p-糖蛋白抑制剂(例如米非司酮(mifepristone)和维拉帕米(verapamil))；(ii)细胞粘附抑制剂，如西咪替丁(cimetidine)；(iii)高尔基体破坏剂，如布雷菲德菌素(例如布雷菲德菌素a)；(iv)电离辐射，例如x射线；(v)肿瘤细胞的辐射敏化剂，例如聚(adp-核糖)聚合酶(parp)抑制剂(例如4-氨基-1，8-萘二甲酰亚胺)、小檗碱和吲哚美辛(indomethacin)；(vi)用细胞毒性药物或辐射治疗后的细胞存活的增强剂，例如皮斐松(pifithrin)-α；(vii)疫苗，例如刺激免疫系统识别由肿瘤细胞产生的蛋白质并由此攻击肿瘤细胞的疫苗；以及其类似物、衍生物和盐。特定的抗肿瘤剂可以具有超过一种的作用机制，并且可以分类在超过一个类别中。还可以选择至少一种其他抗肿瘤剂或另外的抗肿瘤剂用于肿瘤和癌症的更加靶向疗法。下表1列出了设计用于靶向疗法的抗肿瘤剂的非限制性实例。表1：用于靶向疗法的代表性抗肿瘤剂本文描述的方法可以是自动化的。因此，在一些实施方案中，所述方法利用包括至少一个处理器的计算机系统(例如，服务器、台式电脑、笔记本电脑、平板电脑或智能电话)来实现。计算机系统可以配置或提供有算法、指令或代码，所述算法、指令或代码用于执行由所述至少一个处理器可执行的所述方法。计算机系统可以生成包含与所述方法有关的任何或者全部方面的信息的报告，包括来自受试者的生物样品的分析结果。本公开还提供了一种用用于执行本发明方法的计算机可执行指令编码的非暂时性计算机可读介质。图2是可以本文所述的用于实现肿瘤样品的分析方法的计算机系统200的实现方案的框图。系统200包括与主要子系统互联的总线208，所述子系统例如一个或多个处理器210、存储器子系统212、数据存储子系统214、输入设备接口216、输出设备接口218和网络接口220。处理器210执行系统200的许多处理功能，并经由总线208与多个外围设备进行通信。存储器子系统212可以包括例如用于存储实现本发明方法的各个方面的代码/指令/算法和数据的ram232和rom234。数据存储子系统214为实现本发明方法的各个方面的程序代码/指令/算法和数据提供非易失性存储器，并且可以包括例如硬盘驱动器242、固态驱动器244和其他存储设备246(例如，cd-rom驱动器、光盘驱动器、移动媒体驱动器等)。存储器子系统212和/或数据存储子系统214可以用于存储例如具有特定类型的肿瘤或癌症的受试者的密度和接近度特性以及总分数，以及用阻断pd-1/pd-l1/pd-l2途径的单一药剂或者用特定抗pd-1/pd-l1/pd-l2药剂和特定的另外的抗肿瘤剂治疗那些受试者的治疗结果。用于实现本发明方法的某些方面的代码/指令/算法可以可操作地设置在存储器子系统212中或存储在数据存储子系统214中。输入设备接口216提供与多种输入设备如键盘252、定点设备254(例如，鼠标、轨迹球、扫描仪、笔、平板电脑、触摸板或触摸屏)和其他输入设备256的接口。输出设备接口218提供与各种输出设备如显示器262(例如，crt或lcd)和其他输出设备264的接口。网络接口220提供计算机系统200与偶联到系统200的网络偶联的其他计算机系统进行通信的接口。其他设备和/或子系统(未示出)也可以偶联到计算机系统200。此外，图2所示的所有设备和子系统没有必要都存在以实施本文描述的方法。此外，设备和子系统可以在不同于图2所示的配置中互连。本领域普通技术人员将理解，本文描述的方法的各个实现方案可以在电子硬件、计算机软件或两者的组合(例如，固件)中实施。本发明方法是否在硬件和/或软件中实现可以取决于例如施加在整个系统上的特定应用和设计约束。普通技术人员可以根据例如特定应用和设计约束以各种方式实现本发明方法，但是这样的实现决定并不脱离本公开的范围。用于执行本发明方法的计算机程序/算法可以用例如通用处理器、数字信号处理器(dsp)、专用集成电路(asic)、现场可编程门阵列(fpga)或设计用于实现本文所述的功能和步骤的其他可编程逻辑设备、离散门或晶体管逻辑、离散硬件组件或其任何组合来执行。通用处理器可以是微处理器，但是替代地，处理器可以是任何常规的处理器、控制器、微控制器或状态机。处理器还可以作为计算设备的组合实现，例如dsp和微处理器的组合，多个微处理器，结合dsp内核的一个或多个微处理器，或任何其他此类配置。本发明方法的步骤或用于执行所述方法的计算机程序/算法可以直接体现在硬件中，在处理器执行的软件模块中，或硬件和软件的组合(例如固件)中。软件模块可以驻留在例如ram存储器、闪速存储器、rom存储器、eprom存储器、eeprom存储器、寄存器、硬盘驱动器、固态驱动器、可移动磁盘或光盘、cd-rom或本领域已知的任何其他存储介质的形式。示例性存储介质偶联到处理器，使得处理器可以从存储介质读取信息和向存储介质写入信息。或者，存储介质可以与处理器成一体。处理器和存储介质可以驻留在例如asic中，asic又可以驻留在例如用户终端中，或者，处理器和存储介质可以作为离散组件驻留在例如用户终端中。在一个或多个示例性设计中，用于执行本文描述的方法的函数可以以硬件、软件、固件或其任何组合来实现，如果以软件实现，则函数可以作为指令或代码存储在计算机可读介质中或经计算机可读介质中传输。计算机可读介质包括但不限于计算机存储介质和通信介质，包括便于将计算机程序/算法从一个地方传送到另一个地方的任何介质。存储介质可以是可由通用或专用计算机或处理器访问的任何可用介质。作为非限制性示例，计算机可读介质可以包括ram、rom、eerrom、cd-rom或其他光盘存储器、磁盘存储器或其他磁存储设备，或者可用于携带或存储指令/代码和/或数据结构形式的计算机程序/算法并且可以由通用或专用计算机或处理器访问的任何其他介质。此外，任何连接被认为是计算机可读介质。例如，如果使用同轴电缆、光纤电缆、双绞线、数字用户线(dsl)或无线技术如红外线、无线电波或微波从网站、服务器或其他远程源传输软件，则同轴电缆、光纤电缆、双绞线、dsl或无线技术如红外线、无线电波或微波是计算机可读介质。光盘和磁盘包括但不限于压缩盘(cd)、激光盘、光盘、数字通用盘(dvd)、蓝光盘、硬盘和软盘，其中光盘通常使用激光光学地再现数据，而磁盘通常正常磁性地再现数据。以上的组合也包括在计算机可读介质的范围内。代表性实施方案本公开的以下实施方案仅以示例的方式提供：1.一种分析来自患有肿瘤或癌症的受试者的生物样品的方法，其包括：(1)对于具有目标表型的靶细胞，确定：(a)样品的肿瘤微环境中靶细胞的位置(靶细胞的空间分辨率)；(b)样品中空间分辨的靶细胞的密度；以及(c)样品中空间分辨的目标靶细胞之间的接近度；以及(2)至少部分地基于参数(a)至(c)确定总分数。2.根据实施方案1所述的方法，其中在治疗前或治疗期间从所述受试者获得所述生物样品。3.根据实施方案1或2所述的方法，其还包括确定所述样品中空间分辨的靶细胞的密度的分数(密度分数)和/或所述样品中空间分辨的目标靶细胞之间的接近度的分数(接近度分数)，并且其中：至少部分地基于所述样品中特定类型的空间分辨的靶细胞的密度的加权来确定所述密度分数；至少部分地基于所述样品中特定类型的空间分辨的目标靶细胞之间的接近度的加权来确定所述接近度分数；以及至少部分地基于所述密度分数和/或所述接近度分数的加权来确定所述总分数。4.根据实施方案3所述的方法，其中基于是在治疗前或是在治疗期间从所述受试者获得所述样品来调整所述密度分数(例如加权以确定所述密度分数)、所述接近度分数(例如加权以确定所述接近度分数)或所述总分数(例如加权以确定所述总分数)，或其任何组合或全部。5.根据实施方案3或4所述的方法，其中基于所述受试者患有的特定类型的肿瘤或癌症(和任选的疾病严重性)来调整所述密度分数(例如加权以确定所述密度分数)、所述接近度分数(例如加权以确定所述接近度分数)或所述总分数(例如加权以确定所述总分数)，或其任何组合或全部。6.根据实施方案3至5中任一项所述的方法，其中基于原发性肿瘤的位置和/或任何继发性(转移性)肿瘤的位置来调整所述密度分数(例如加权以确定所述密度分数)、所述接近度分数(例如加权以确定所述接近度分数)或所述总分数(例如加权以确定所述总分数)，或其任何组合或全部。7.根据实施方案3至6中任一项所述的方法，其中基于与所述受试者有关的信息，例如所述受试者的人种、种族、性别、年龄、体重指数、饮食、危险因素(饮酒、吸烟、压力和/或不活动性)、(个人和/或家族)病史或总体健康或其任何组合或全部来调整所述密度分数(例如加权以确定所述密度分数)、所述接近度分数(例如加权以确定所述接近度分数)或所述总分数(例如加权以确定所述总分数)，或其任何组合或全部。8.根据实施方案3至7中任一项所述的方法，其中基于使用阻断pd-1/pd-l1/pd-l2途径的特定单一药剂或使用特定抗pd-1/pd-l1/pd-l2药剂和特定的另外的抗肿瘤剂(组合疗法)治疗具有特定类型的肿瘤或癌症(并且任选考虑疾病严重性)的其他受试者的治疗结果来调整所述密度分数(例如加权以确定所述密度分数)、所述接近度分数(例如加权以确定所述接近度分数)或所述总分数(例如加权以确定所述总分数)，或其任何组合或全部。9.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中具有目标表型的靶细胞包括表达(例如在表面上或在细胞内表达或分泌)一种或多种生物标志物(例如蛋白质标志物)的细胞。10.根据实施方案9所述的方法，其中所述靶细胞表达选自以下的生物标志物：cd4、cd8、cd11b、cd11c、cd15、cd16、cd19、cd25、cd56、cd68、cd80、cd123、cd138、cd163、ctla-4、foxp3、粒酶b、hla-a、hla-b、hla-c、hla-dr、igg-κ、igg-λ、ki67、ldh、mpo、ox40(cd134)、pd-1、pd-l1、pd-l2和pstat1。11.根据实施方案10所述的方法，其中所述靶细胞表达实施方案10中所述的至少5、10、15、20或25种或全部生物标志物。12.根据实施方案9至11中任一项所述的方法，其中所述靶细胞包括免疫细胞(例如适应性免疫细胞和/或先天免疫细胞)和/或肿瘤细胞，或其全部。13.根据实施方案12所述的方法，其中所述靶细胞包括至少5种或全部以下类型的细胞：(1)表达cd4、cd8、cd25、ctla-4、foxp3、粒酶b、ki67、ox40、pd-1或pstat1或其任何组合或全部的t细胞(例如细胞毒性和/或调节性t细胞)；(2)表达cd19和/或cd80的b细胞；(3)表达cd138的浆细胞(血浆/效应b细胞)；(4)表达cd11b、cd16、cd68、cd163、pd-l1或pd-l2或其任何组合或全部的巨噬细胞；(5)表达cd11c、cd68、cd123、pd-l1或pd-l2或其任何组合或全部的树突状细胞；(6)表达cd16、cd56或粒酶b或其任何组合或全部的自然杀伤(nk)细胞；(7)表达cd15、cd16或mpo或其任何组合或全部的粒细胞(例如嗜中性粒细胞)；(8)表达cd16和/或cd80的单核细胞；以及(9)表达pd-l1、pd-l2或cd15或其任何组合或全部的肿瘤细胞。14.根据实施方案9至13中任一项所述的方法，其中通过使用特异性结合所述生物标志物的抗体染色来检测所述生物标志物或表达所述生物标志物的靶细胞。15.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述样品的肿瘤微环境中所述靶细胞的位置包括在侵袭性肿瘤边缘(例如在肿瘤周围的结缔组织中)的位置和/或在肿瘤实质(肿瘤)内的位置。16.根据实施方案15所述的方法，其中s100的染色用于从肿瘤实质(s100阳性)中描绘出侵袭性肿瘤边缘(s100阴性)。17.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述样品中空间分辨的靶细胞的密度包括侵袭性肿瘤边缘处和肿瘤实质内表达cd8、cd11b、cd68、粒酶b、ki67、pd-1、pd-l1、pd-l2和pstat1的细胞的密度。18.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述样品中空间分辨的靶细胞的密度包括治疗前或治疗期间从所述受试者获得的样品中侵袭性肿瘤边缘处和肿瘤实质内目标生物标志物的细胞密度(例如以细胞/mm2计)。19.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述样品中空间分辨的目标靶细胞之间的接近度包括侵袭性肿瘤边缘处和肿瘤实质内表达pd-1的细胞和表达pd-l1的细胞之间的接近度。20.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中：短语“具有目标表型的靶细胞”可以用短语“目标生物标志物”代替；短语“样品的肿瘤微环境中靶细胞的位置(靶细胞的空间分辨率)”可以用“样品的肿瘤微环境中生物标志物的位置(生物标志物的空间分辨率)”代替；短语“样品中空间分辨的靶细胞的密度”可以用短语“样品中空间分辨的生物标志物的密度”代替；以及短语“样品中空间分辨的目标靶细胞之间的接近度”可以用短语“样品中空间分辨的目标生物标志物之间的接近度”代替。21.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述生物样品包括组织和/或血液。22.根据实施方案21所述的方法，其中所述生物样品包括在切片之前用福尔马林固定并包埋在石蜡中的组织，并且其中在免疫组织化学染色之前将福尔马林固定、石蜡包埋(ffpe)的组织切片脱石蜡并且处理(例如加热)用于抗原修复。23.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述生物样品包括肿瘤样品。24.根据实施方案23所述的方法，其中所述肿瘤样品包括侵袭性肿瘤边缘和/或肿瘤实质。25.根据实施方案23或24所述的方法，其中所述肿瘤样品包括原发性肿瘤和/或继发性(转移性)肿瘤。26.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述肿瘤或癌症是实体肿瘤或血液恶性肿瘤。27.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述肿瘤或癌症是以下的肿瘤或癌症：脑(例如胶质瘤或胶质母细胞瘤)、头或颈部(例如口腔、咽喉或甲状腺)、胃肠道(例如食道、胃、小肠或大肠、结肠或直肠)、肺(例如小细胞肺癌[sclc]或非小细胞肺癌[nsclc]，如鳞状nsclc或非鳞状nsclc)、胰腺、肝、肾(例如肾细胞癌)、膀胱、乳腺(例如三阴性乳腺癌)、子宫、子宫颈、卵巢、前列腺(例如去势抗性前列腺癌)、睾丸、皮肤(例如黑素瘤，如转移性黑素瘤)、上皮组织或细胞(例如、胃癌、结肠直肠癌、肝细胞癌、肾细胞癌、泌尿道上皮膀胱癌、子宫内膜癌或鳞状细胞癌[例如，头颈部])或造血或淋巴组织或细胞(例如白血病[例如急性骨髓性白血病或慢性淋巴细胞白血病]、淋巴瘤[例如霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤]、骨髓瘤[例如多发性骨髓瘤]或骨髓增生综合征)。28.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物，例如灵长类动物(例如人、黑猩猩或猴)、啮齿动物(例如大鼠、小鼠、沙鼠或仓鼠)、兔科动物(例如兔)、猪科动物(例如猪)、马科动物(例如马)，犬科动物(例如狗)或猫科动物(例如猫)。29.根据实施方案28所述的方法，其中所述受试者是人(人“受试者”也可称为“患者”)。30.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述总分数与所述受试者的免疫系统攻击肿瘤细胞的强度或能力相关。31.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述总分数与所述受试者将响应于用阻断免疫检查点的单一药剂治疗的概率或可能性相关。32.根据实施方案31所述的方法，其中所述总分数与所述受试者将响应于用阻断pd-1/pd-l1/pd-l2途径的单一药剂的治疗的概率或可能性相关。33.根据实施方案32所述的方法，其中：(1)如果所述总分数等于或大于阈值分数，则所述总分数指示或预测所述受试者将响应于用阻断pd-1/pd-l1/pd-l2途径的单一药剂的治疗(预测所述受试者是pd-1/pd-l1/pd-l2阻断疗法的响应者)；或(2)如果所述总分数小于阈值分数，则所述总分数指示或预测所述受试者将不响应于用阻断pd-1/pd-l1/pd-l2途径的单一药剂的治疗(预测所述受试者是pd-1/pd-l1/pd-l2阻断疗法的进展者或非响应者)。34.根据实施方案33所述的方法，其还包括：(1)如果所述总分数等于或大于所述阈值分数：(a)基于在治疗前从所述受试者获得的样品的总分数，向所述受试者施用有效量的阻断pd-1/pd-l1/pd-l2途径的单一药剂；或(b)如果最初用抗pd-1/pd-l1/pd-l2药剂治疗所述受试者，则基于在治疗期间从所述受试者获得的样品的总分数，继续施用阻断pd-1/pd-l1/pd-l2途径的相同的单一药剂；或(c)如果最初向所述受试者提供组合疗法，则基于在治疗期间从所述受试者获得的样品的总分数，停止施用至少一种其他抗肿瘤剂并且继续施用阻断pd-1/pd-l1/pd-l2途径的相同的药剂；或(2)如果所述总分数小于所述阈值分数：(a)基于在治疗前从所述受试者获得的样品的总分数，向所述受试者施用有效量的阻断pd-1/pd-l1/pd-l2途径的药剂和有效量的至少一种其他抗肿瘤剂(组合疗法)；或(b)如果最初用抗pd-1/pd-l1/pd-l2药剂治疗所述受试者，则基于在治疗期间从所述受试者获得的样品的总分数，向所述受试者施用有效量的至少一种其他抗肿瘤剂，并且施用阻断pd-1/pd-l1/pd-l2途径的相同的药剂(其剂量和/或给药频率可以调整(例如增加))或不同的药剂；或(c)如果最初向所述受试者提供组合疗法，则基于在治疗期间从所述受试者获得的样品的总分数，施用阻断pd-1/pd-l1/pd-l2途径的相同的药剂(剂量和/或给药频率可以调整(例如增加))或不同的药剂，并且施用至少一种其他抗肿瘤剂，所述至少一种其他抗肿瘤剂可以与最初提供的至少一种其他抗肿瘤剂相同(剂量和/或给药频率可以调整(例如增加))或不同。35.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其在以下上进行：(1)在治疗前从所述受试者获得的生物样品上，以指导选择用阻断pd-1/pd-l1/pd-l2途径的单一药剂或者用阻断pd-1/pd-l1/pd-l2途径的药剂和至少一种其他抗肿瘤剂(组合疗法)进行治疗的决定；以及(2)在治疗期间从所述受试者获得的至少一种生物样品上，以监测所述受试者对当前治疗方案的响应，并且指导选择用单一药剂pd-1/pd-l1/pd-l2阻断疗法或用组合疗法进行治疗的决定。36.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其还包括：(1)将所述受试者的密度和接近度特性和总分数与存储在数据库中的患有相同类型的肿瘤或癌症(任选地基本上相同的疾病严重性)的其他受试者的密度和接近度特性和总分数进行比较，其中所述数据库还存储有用阻断pd-1/pd-l1/pd-l2途径的特定单一药剂或者用特定的抗pd-1/pd-l1/pd-l2药剂和特定的另外的抗肿瘤剂治疗所述其他受试者的治疗结果；以及(2)基于所述比较，向所述受试者施用：(a)有效量的阻断pd-1/pd-l1/pd-l2途径的单一药剂或特定单一药剂；或(b)有效量的阻断pd-1/pd-l1/pd-l2途径的药剂或特定药剂，以及有效量的另外的抗肿瘤剂或特定的另外的抗肿瘤剂(组合疗法)。37.根据实施方案33所述的方法，其用于将受试者分层为pd-1/pd-l1/pd-l2阻断疗法的响应者或非响应者，并在临床实践、临床试验或药物发现或开发中选择受试者，无论涉及单一药剂(或特定单一药剂)疗法或组合(或特定组合)疗法。38.根据实施方案34至36中任一项所述的方法，其用于在临床实践、临床试验或药物发现或开发中指导或产生治疗决定，无论是涉及单一药剂(或特定单一药剂)疗法或组合(或特定组合)疗法。39.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述总分数与以下的概率有关或者预测以下：所述受试者是否将响应于用阻断pd-1/pd-l1/pd-l2途径的特定单一药剂或者用特定抗pd-1/pd-l1/pd-l2药剂和特定的另外的抗肿瘤剂的治疗。40.根据实施方案8至39中任一项所述的方法，其中所述阻断pd-1/pd-l1/pd-l2途径的药剂选自抗pd-1抗体(例如纳武单抗[bms-936558、mdx-1106或ono-4538]、派姆单抗[拉姆单抗或mk-3475]、皮地利珠单抗[ct-011]和medi-0680[amp-514])、抗pd-1融合蛋白(例如，amp-224[含有fc抗体结构域和pd-l2])、抗pd-l1抗体(例如bms-936559[mdx-1105]、medi-4736、mpdl3280a[rg7446]和msb0010718c)及其类似物、衍生物、片段和盐。41.根据实施方案40所述的方法，其中所述阻断pd-1/pd-l1/pd-l2途径的药剂是抗pd-1药剂(例如，抗pd-1抗体，例如纳武单抗或派姆单抗)。42.根据实施方案8至41中任一项所述的方法，其中所述至少一种其他抗肿瘤剂或另外的抗肿瘤剂选自细胞毒性剂、免疫系统刺激剂、其他免疫检查点抑制剂、血管生成抑制剂、靶向抗肿瘤治疗剂(包括免疫治疗剂)和其他类型的抗肿瘤剂(包括癌症疫苗)。43.根据实施方案42所述的方法，其中所述至少一种其他抗肿瘤剂或另外的抗肿瘤剂包含另一种免疫检查点抑制剂(例如，ctla-4抑制剂，如伊匹单抗)和/或免疫系统刺激剂(例如，tlr9激动剂，如agatolimod)。44.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其还包括产生包含与所述方法有关的信息的报告。45.根据前述实施方案中任一实施方案的方法，其利用包括至少一个处理器的计算机系统(例如服务器、台式电脑、笔记本电脑、平板电脑或智能手机)实现。46.根据实施方案45所述的方法，其中所述计算机系统配置或提供有算法、指令或代码，所述算法、指令或代码用于执行由所述至少一个处理器可执行的所述方法。47.一种用于鉴定患有肿瘤或癌症的受试者为利用阻断pd-1/pd-l1/pd-l2途径的治疗的响应者或非响应者的方法，其包括实施方案33的方法，并且其在治疗前或治疗期间从所述受试者获得的生物样品上进行。48.根据实施方案47所述的方法，其在于治疗期间从所述受试者获得的样品上进行，以监测所述受试者对用阻断pd-1/pd-l1/pd-l2途径的单一药剂或用阻断pd-1/pd-l1/pd-l2途径的药剂和至少一种另外的抗肿瘤剂(组合疗法)的响应。49.一种治疗受试者的肿瘤或癌症的方法，其包括实施方案34的方法。50.一种非暂时性计算机可读介质，其用用于执行根据实施方案1至48中任一项所述的方法的计算机可执行指令编码。51.一种体现至少一个程序的非暂时性计算机可读介质，当所述至少一个程序通过包括至少一个处理器的计算设备执行时，使得所述计算设备执行根据实施方案1至48中任一项所述的方法。52.根据实施方案51所述的介质，其中所述至少一个程序包含用于使所述至少一个处理器执行根据实施方案1至48中任一项所述的方法的算法、指令或代码。53.一种存储计算机可读算法、指令或代码的非暂时性计算机可读存储介质，当所述计算机可读算法、指令或代码通过包括至少一个处理器的计算设备执行时，致使或指示所述至少一个处理器执行根据实施方案1至48中任一项所述的方法。54.一种治疗患者的肿瘤或癌症的方法，其包括：(1)如果来自所述患者的侵袭性肿瘤边缘的治疗前(基线)样品具有cd8、pd-1、cd68和pd-l1中任一种的低细胞密度，则向所述患者施用有效量的阻断pd-1/pd-l1/pd-l2途径的药剂和有效量的至少一种其他抗肿瘤剂(组合疗法)；或(2)如果来自所述患者的侵袭性肿瘤边缘的治疗前(基线)样品不具有cd8、pd-1、cd68和pd-l1中的每一种的低细胞密度，则向所述患者施用有效量的阻断pd-1/pd-l1/pd-l2途径的单一药剂。55.根据实施方案54所述的方法，其中如果所述侵袭性肿瘤边缘的治疗前样品具有以下细胞密度，则提供所述组合疗法：(1)cd8低，pd-1低，cd68低和pd-l1低；或(2)cd8低，pd-1低，cd68低和pd-l1高；或(3)cd8低，pd-1低，cd68高和pd-l1高；或(4)cd8中，pd-1中，cd68低和pd-l1低；或(5)cd8中，pd-1中，cd68低和pd-l1高；或(6)cd8高，pd-1高，cd68低和pd-l1低。56.根据实施方案54或55所述的实施方案，其中如果所述侵袭性肿瘤边缘的治疗前样品具有以下细胞密度，则提供所述组合疗法：(1)pd-1低和pd-l1低；或(2)pd-1中和pd-l1低；或(3)pd-1低和pd-l1中；或(4)pd-1低和pd-l1高；或(5)cd8低和pd-l1低。57.根据实施方案54至56中任一项所述的方法，其中如果所述侵袭性肿瘤边缘的治疗前样品表现出多灶性pd-l1表达，则提供所述组合疗法。58.根据实施方案54至57中任一项所述的方法，其中如果所述侵袭性肿瘤边缘的治疗前样品具有不大于约400或500细胞/mm2的cd8细胞密度，则提供所述组合疗法。59.根据实施方案54至58中任一项所述的方法，其中如果所述侵袭性肿瘤边缘的治疗前样品具有低的pd-l2细胞密度，则提供所述组合疗法。60.根据实施方案54至59中任一项所述的方法，其中如果所述侵袭性肿瘤边缘(例如，cd8+t细胞浸润的区域)的治疗前样品具有低表达水平的pstat1(磷酸化信号转导剂和转录活化剂1(phosphorylatedsignaltransducerandactivatoroftranscription1)，则提供所述组合疗法。61.根据实施方案54至60中任一项所述的方法，其中如果所述侵袭性肿瘤边缘的治疗前样品具有低表达水平的粒酶b，则提供所述组合疗法。62.根据实施方案54至61中任一项所述的方法，其中如果所述侵袭性肿瘤边缘的治疗前样品未显示pd-1和pd-l1之间的紧密接近度，则提供所述组合疗法。63.根据实施方案54至62中任一项所述的方法，其中如果所述侵袭性肿瘤边缘的治疗前样品显示更多样的t细胞抗原受体(tcr)库，则提供所述组合疗法。64.根据实施方案54所述的方法，其中如果所述侵袭性肿瘤边缘的治疗前样品具有以下，则仅施用阻断pd-1/pd-l1/pd-l2途径的药剂：(1)具有高的cd8和pd-l1的细胞密度；或(2)不具有低表达水平的pstat1和/或粒酶b；或(3)显示pd-1和pd-l1之间的紧密接近度；或(4)显示更多克隆性tcr库；或(5)(1)至(4)的任何组合或全部。65.根据实施方案54至64中任一项所述的方法，其中在侵袭性肿瘤边缘，cd8和pd-1在t细胞(例如细胞毒性和调节性t细胞)表面表达，cd68和pd-l1在骨髓来源的细胞(mdc)(例如巨噬细胞和树突状细胞)表面表达，pd-l1在肿瘤细胞表面表达。66.根据实施方案65所述的方法，其中表达pd-l1的mdc也表达cd11b。67.根据实施方案54至66中任一项的方法，其中pd-l2在mdc(例如巨噬细胞和树突细胞)和可能的肿瘤细胞的表面表达。68.根据实施方案54至67中任一项所述的方法，其中所述阻断pd-1/pd-l1/pd-l2途径的药剂选自抗pd-1抗体(例如纳武单抗[bms-936558、mdx-1106或ono-4538]、派姆单抗[拉姆单抗或mk-3475]、皮地利珠单抗[ct-011]和medi-0680[amp-514])、抗pd-1融合蛋白(例如，amp-224[含有fc抗体结构域和pd-l2])、抗pd-l1抗体(例如bms-936559[mdx-1105]、medi-4736、mpdl3280a[rg7446]和msb0010718c)及其类似物、衍生物、片段和盐。69.根据实施方案68所述的方法，其中所述阻断pd-1/pd-l1/pd-l2途径的药剂是抗pd-1药剂(例如，抗pd-l抗体，例如纳武单抗或派姆单抗)。70.根据实施方案54至69中任一项所述的方法，其中所述至少一种其他抗肿瘤剂选自细胞毒性剂、免疫系统刺激剂、其他免疫检查点抑制剂、血管生成抑制剂、靶向抗肿瘤治疗剂(包括免疫治疗剂)和其他类型的抗肿瘤剂(包括癌症疫苗)。71.根据实施方案70所述的方法，其中所述至少一种其他抗肿瘤剂包含另一种免疫检查点抑制剂(例如，ctla-4抑制剂，如伊匹单抗)和/或免疫系统刺激剂(例如，tlr9激动剂，如agatolimod)。72.根据实施方案54至71中任一项所述的方法，其中所述肿瘤或癌症是实体肿瘤或血液恶性肿瘤。73.根据实施方案54至72中任一项所述的方法，其中所述肿瘤或癌症是以下的肿瘤或癌症：脑(例如胶质瘤或胶质母细胞瘤)、头或颈部(例如口腔、咽喉或甲状腺)、胃肠道(例如食道、胃、小肠或大肠、结肠或直肠)、肺(例如小细胞肺癌[sclc]或非小细胞肺癌[nsclc]，如鳞状nsclc或非鳞状nsclc)、胰腺、肝、肾(例如肾细胞癌)、膀胱、乳腺(例如三阴性乳腺癌)、子宫、子宫颈、卵巢、前列腺(例如去势抗性前列腺癌)、睾丸、皮肤(例如黑素瘤，如转移性黑素瘤)、上皮组织或细胞(例如、胃癌、结肠直肠癌、肝细胞癌、肾细胞癌、泌尿道上皮膀胱癌、子宫内膜癌或鳞状细胞癌[例如，头颈部])或造血或淋巴组织或细胞(例如白血病[例如急性骨髓性白血病或慢性淋巴细胞白血病]、淋巴瘤[例如霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤]、骨髓瘤[例如多发性骨髓瘤]或骨髓增生综合征)。74.根据实施方案54至73中任一项所述的方法，其中所述患者可以先前已经施用或可以未施用抗肿瘤剂。75.根据实施方案54至74中任一项所述的方法，其还包括如果最初向所述患者提供组合疗法，并且如果在用所述组合疗法进行治疗期间来自所述患者的侵袭性肿瘤边缘和/或肿瘤实质的样品不具有cd8、pd-1、cd68和pd-l1中的每一种的低细胞密度并且表现出以下，则停止施用至少一种其他抗肿瘤剂并且继续施用阻断pd-1/pd-l1/pd-l2途径的药剂：(1)与基线相比cd8、pd1、cd68和pd-l1中的每一种的细胞密度的增加；或(2)侵袭性肿瘤边缘处和/或肿瘤实质中cd8+t细胞的增殖(例如，与基线相比至少在肿瘤实质中cd8/ki67双阳性细胞数量的增加)；或(3)至少在肿瘤实质中的肿瘤-抗原特异性t细胞的累积(例如与基线相比至少在肿瘤实质中更多克隆tcr库)；或(4)与基线相比至少在侵袭性肿瘤边缘(例如，cd8+t细胞浸润的区域)pstat1表达的增加和/或粒酶b表达的增加；或(5)pd-1和pd-l1之间的紧密接近度；或(6)(1)至(5)的任何组合或全部。76.根据实施方案54至74中任一项所述的方法，其还包括如果最初向所述患者仅施用阻断pd-1/pd-l1/pd-l2途径的药剂并且所述患者不响应于这样的治疗，则施用有效量的至少一种其他抗肿瘤剂。77.一种鉴定患者为抗pd-1或抗pd-l1疗法的响应者的方法，所述方法包括：(a)使来自所述患者的样品与检测pd-l1+或pd-l2+骨髓来源的细胞(mdc)的测定试剂接触；以及(b)测定所述患者样品中测pd-l1+或pd-l2+mdc的存在；其中pd-l1+或pd-l2+mdc的存在指示抗pd-1或pd-l1阻断疗法的响应者。78.一种检测患者中的癌症的方法，所述方法包括：(a)使来自所述患者的样品与检测pd-l1+或pd-l2+骨髓来源的细胞(mdc)的测定试剂接触；以及(b)测定所述患者样品中pd-l1+或pd-l2+mdc的存在，其中pd-l1+或pd-l2+mdc的存在指示癌症。79.一种确定患者中抗pd-1或抗pd-l1疗法的效力的方法，所述方法包括：(a)使来自所述患者的样品与检测pd-l1+或pd-l2+骨髓来源的细胞(mdc)的测定试剂接触；以及(b)测定所述患者样品中测pd-l1+或pd-l2+mdc的存在；其中pd-l1+或pd-l2+mdc的存在指示抗pd-1或pd-l1阻断疗法的响应者。80.根据实施方案79所述的方法，其中在向所述患者施用抗pd-1或pd-l1疗法之后重复所述测定，其中相对于之前测定的样品，所述患者样品中存在的pd-l1+或pd-l2+mdc的增加指示有效的抗pd-1或pd-l1疗法。81.根据实施方案77至79中任一项所述的方法，其中所述样品是包含细胞的样品或包含流体的样品。82.根据实施方案77至79中任一项所述的方法，其中所述样品包含细胞外的、细胞解离的和/或细胞衍生的产物。83.根据实施方案77至79中任一项所述的方法，其中所述pd-l1+mdc具有选择以下的表型：pd-l1+cd11b+；pd-l1+cd11c+；pd-l1+cd14+；pd-l1+cd33+；pd-l1+cd38+；pd-l1+cd34+；pd-l1+cd36/sr-b3+；pd-l1+cd59+；pd-l1+cd68+；pd-l1+cd163+；pd-l1+cd164+；pd-l1+ham-56+；pd-l1+cd66a+；pd-l1+cd66b+；pd-l1+cd66c+；pd-l1+cd66d+；pd-l1+cd68/sr-d1+；pd-l1+cd42b/gpibα+；pd-l1+cdcxcr3+；和pd-l1+f4/80/emr1+。84.根据实施方案77至79中任一项所述的方法，其中所述pd-l2+mdc具有选择以下的表型：pd-l2+cd11b+；pd-l2+cd11c+；pd-l2+cd24+；pd-l2+cd33+；pd-l2+cd38+；pd-l2+cd34+；pd-l2+cd36/sr-b3+；pd-l2+cd59+；pd-l2+cd68+；pd-l2+cd163+；pd-l2+cd164+；pd-l2+ham-56+；pd-l2+cd66a+；pd-l2+cd66b+；pd-l2+cd66c+；pd-l2+cd66d+；pd-l2+cd68/sr-d2+；pd-l2+cd42b/gpibα+；pd-l2+cdcxcr3+；和pd-l2+f4/80/emr2+。85.根据实施方案77至79中任一项所述的方法，其中所述测定试剂包含特异性结合pd-l1+的抗体和特异性结合以下的抗体：cd11b+；cd11c+；cd14+；cd33+；cd38+；cd34+；cd36/sr-b3+；cd59+；cd68+；cd163+；cd164+；ham-56+；cd66a+；cd66b+；cd66c+；cd66d+；cd68/sr-d1+；cd42b/gpibα+；cdcxcr3+；或f4/80/emr1+。86.根据实施方案77至79中任一项所述的方法，其中所述测定试剂包含特异性结合pd-l2+的抗体和特异性结合以下的抗体：cd11b+；cd11c+；cd24+；cd33+；cd38+；cd34+；cd36/sr-b3+；cd59+；cd68+；cd163+；cd164+；ham-56+；cd66a+；cd66b+；cd66c+；cd66d+；cd68/sr-d2+；cd42b/gpibα+；cdcxcr3+；或f4/80/emr2+。87.根据实施方案77至79中任一项所述的方法，其中所述测定包括进行免疫测定。88.根据实施方案87所述的方法，其中所述免疫测定包括免疫组织化学。89.根据实施方案77至79中任一项所述的方法，其中所述测定包括聚合酶链式反应。90.根据实施方案77至79中任一项所述的方法，其中所述测定包括mdc表型的分析。91.根据实施方案77至79中任一项所述的方法，其中所述样品包括组织和/或外周血。92.根据实施方案77至79中任一项所述的方法，其中所述样品是肿瘤样品。93.根据实施方案92所述的方法，其中所述肿瘤样品包括侵袭性肿瘤边缘和/或肿瘤实质。94.根据实施方案92所述的方法，其中所述肿瘤样品是从转移性病灶获得的。95.根据实施方案77至79中任一项所述的方法，其中所述患者被怀疑患有转移性癌症。96.根据实施方案77所述的方法，其还包括如果鉴定为响应者，则用抗pd-1疗法治疗所述患者，并且如果未鉴定为响应者，则用组合疗法治疗所述患者。97.一种治疗患者中的癌症的方法，所述方法包括：(a)根据实施方案77所述的方法将所述患者鉴定为抗pd-1或抗pd-l1疗法的响应者；以及(b)如果鉴定为响应者，则用抗pd-1疗法治疗所述患者，并且如果未鉴定为响应者，则用组合疗法治疗所述患者。实施例给出以下实施例以说明本发明并帮助普通技术人员制造和使用本发明。这些实施例不以任何方式限制本发明的范围。实施例1：肿瘤内的基线cd8+t细胞组织预测抗pd-1响应分析组织切片以揭示在继续响应于抗pd-1疗法的患者中发现的转移性病灶的肿瘤微环境中独特的基线cd8+t细胞组织。在ihc和ct扫描上发现基线cd8+t细胞组织的定量预测了对疗法的响应。通过肿瘤微环境内的流行率、分布和表型的微结构作图和分析确定t细胞组织。图3显示了如何可以利用能够对肿瘤微环境中cd8+t细胞的流行率、分布和位置进行全切片共定位和微结构作图的算法评估组织切片中的cd8+t细胞组织。分别用s100(左图)和cd8(右图)对2-3μm厚的连续组织切片染色。x和y轴以10μm的增量进行缩放，提供了用于组织切片的并排比对和肿瘤中区域的分析的坐标。“pr”是指部分响应者，“pd”是指进行性疾病。在对疗法的抗肿瘤响应与基线cd8+t细胞的位置和密度之间发现了直接相关性。在同一就诊日在同一患者的不同和分离的肿瘤上进行两次活检，证明了治疗前和治疗后肿瘤微环境中可比较的定性和定量的cd8+t细胞组织。图4a-4c示出了通过免疫组织化学和ct扫描分析的基线和治疗响应/进展的定量，以及这些测量与对疗法的响应之间的关系。图4a中的曲线显示了响应者(左图)、延迟响应者(中间)和进展者(右图)在基线时和治疗过程中肿瘤微环境中cd8+t细胞密度的趋势。如图4b和4c所示，肿瘤周围和肿瘤内环境两者在组之间表现出t细胞密度的显著差异。肿瘤微环境中cd8+t细胞组织的差异与初次治疗和先前治疗的响应者中的相当。在治疗前(基线)和治疗样品之间进行比较的显微照片的分析显示响应者肿瘤中的cd8+t细胞独特地能够进行晚期效应阶段末端器官t细胞的活化和复制。结果还显示，与对疗法显示进展的那些相比，对疗法响应的那些中基线时(治疗前)肿瘤内的t细胞群体显示更高的克隆性(p＜0.01)。参见图5。实施例2：确定pd1阻断抗体对响应于抗pd1的肿瘤中pdl1+骨髓细胞转录程序的影响。我们分析了派姆单抗(mk-3475)(抗pd1)治疗之前和期间从40位患者获得的85个肿瘤样品。使用定量免疫组织化学(qihc)，我们调查了就响应而言(85个样品，图6)的cd8+分布以及pd1和pdl1表达。在治疗后样品中，我们发现了cd8+密度和临床响应之间的相关性(p＜0.001)。在治疗前样品中，在与进展组相比时，响应组与显著更高的cd8+密度显著相关(p＜0.0001)。进一步调查显示cd8+t细胞表达大多数pd1表达。出人意料地，cd11b+mdc占所有肿瘤消退样品中保持的表达pdl1的细胞的较大百分比。在具有混合响应的患者中，pdl1+mdc的密度在进展期间高，在复发期间低。我们的发现表明pdl1+mdc是利用抗pd1疗法实现持久肿瘤消退所必需的。此外，在响应的肿瘤中，pdl1+mdc可能经历转录和功能演变，其特征在于“抗炎”程序并抑制t细胞(pd1阻断之前)演变成“促炎症”程序并刺激t细胞(pd1阻断期间)。为了证实这一假设，我们建立了rna保存的石蜡包埋的肿瘤库，其包含抗pd1疗法之前和期间从匹配的肿瘤获得的样品。可以使用激光捕获显微解剖(lcm)来富集mdc，然后使用人免疫阵列面板进行靶基因表达谱分析。我们已经建立了从这些样品中高质量和产量提取rna的能力。我们假设pdl1+mdc将在治疗前以“抗炎”标签开始，并在抗pd1疗法期间切换为“促炎”标签。因此，我们可以从其天然微环境中分离出pdl1+mdc，并提取高质量的rna，并证实在响应性肿瘤中，pdl1+mdc经历转录重编程，其特征在于“抗炎”标签(pd1之前)切换为“促炎”标签(pd1阻断下)。保存rna和形态的组织固定系统-创新的方法：为了鉴定肿瘤响应的细胞介质，我们建立了一种能够进行空间分辨的rna的表达水平分析的方法。我们使用不含福尔马林、醇固定石蜡包埋(afpe)保存方案的初步数据显示与福尔马林固定方法相比较更优的rna的保存。我们系统地获得肿瘤样品，并按照recist1.1标准进行分类，包括：(1)响应：客观肿瘤大小减少＞30％(2)进展：客观肿瘤大小增加＞20％(3)混合：肿瘤大小在16周时显示＞30％减小，但随后在较晚的时间点反转轨迹，并显示出大小的增加。使用具有配准能力的经fda批准的体外诊断(ivd)抗体qihc，我们表征了肿瘤微环境中以下细胞类型的演变：淋巴来源的：t细胞(cd8、cd4、foxp3)、b细胞(cd20)、自然杀伤细胞(cd56)；骨髓来源的：(cd11b、cd163、cd68、cd14、cd15)；黑素瘤：(s100、mart1、hmb-45)。我们应用了接近度测定，其涉及pd1和pdl1的双荧光免疫组织化学染色的定量图像分析算法(图7)。该测定允许我们鉴定仅与pd1+/cd8+t细胞交界的pdl1+mdc。在客观响应的患者中，这种关系在pd1阻断之前和期间总是存在，两种细胞类型的密度和相对％流行率随时间增加。在响应但后来进展的患者中，这些空间限定的mdc失去了pdl1的表达(图8)。肿瘤中的mdc，由其表达谱系标志物cd11b和/或cd33所定义，代表肿瘤中最普遍的免疫细胞。mdc的标志包括两个生物学能力：i)可塑性；即，响应于来自微环境的信号的功能变化的能力，以及ii)抑制t细胞活性。6，7可塑性是所有mdc亚型中保持的能力的发现表明，这可能是调节适应性免疫的常见的机制。在与肿瘤中的其他细胞类型交界的mdc中，越来越多的证据表明mdc与适应性淋巴样亚型交界并且参与复杂的双向通信。8为了鉴定使用抗pd1疗法实现持久的肿瘤消退所需的细胞类型，使用从在我们mk-3475(抗pd1)i期临床试验中登记的患者获得的不含福尔马林、保藏分子内容物、石蜡包埋的肿瘤库研究pdl1+mdc的转录程序。我们将发现pdl1+mdc是利用抗pd1疗法实现肿瘤排斥所必需的。另外，它们的表型和功能从具有t细胞抑制功能(pd1阻断前)的“抗炎”演变为具有t细胞刺激功能的“促炎”(pd1阻断期间)。“抗炎”mdc的特征在于促进肿瘤生长，cd163、cd206、ccl18、ccl22和e-钙粘蛋白的表达，抗炎细胞因子(il-10和il1ra)的释放，促血管生成因子(il-8、vegf、efg)的上调，以及arg1、ym1、fizz1和mgl的上调。“促炎”mdc的特征在于破坏肿瘤的能力，mhcii类和共刺激分子的更高表达水平，有效的抗原呈递，促炎细胞因子(il-23、il-12、tnf、cxcl9、cxcl10)的释放和活性氧/氮物质。lcm用于富集这种细胞类型，并定量实时pcr(qrt-pcr)用于使用人免疫阵列面板进行靶基因表达分析。为了分离具有高质量和产量的rna以进行下游靶向基因表达研究，我们将使用lcm从我们的afpe样品中分离出该群体。基于可行性研究，我们建立了分离具有以下质量和产量的rna的能力：rin值：6-8，a260/a280：＞1.9，以及a260/a230：＞2.0，产量：1.2-3.0ng。使用lcm分离此空间限定的细胞群体，我们可重复地产生1皮克(pg)的rna/细胞。这翻译成需要1000个细胞以得到1.0ngrna；这是可以基于qihc实现的，其产生1000pdl1+细胞/mm2的密度计数。迄今为止，尚未从交界pd1+cd8+t细胞(n＝120个样品)的外部鉴定出表达pdl1的mdc。在所有实验组中，将分离仅一个空间限定的mdc亚群用于基因表达研究：与pd1+cd8+t细胞交界的mdc。在响应组(n＝18)中，该mdc亚群总是表达pdl1。在进展组和混合响应组中，该mdc亚群保持与cd8+t细胞共定位，但是pdl1表达不同：(i)pdl1+mdc或(ii)pdl1-mdc。将包括以下组：响应组(a，b)：(a)治疗前：pdl1+mdc，(b)治疗后：pdl1+mdc；进展组(c，d，e)：(c)治疗前：pdl1+mdc，(d)治疗后：pdl1+mdc，(e)治疗后：与pd1+cd8+t细胞交界的pdl1阴性mdc；以及混合响应组(f，g，h，i)：(f)治疗前：pdl1+mdc，(g)治疗后肿瘤消退期间：pdl1+mdc，(h)治疗后肿瘤复发和进展期间：pdl1+mdc，(i)治疗后肿瘤复发和进展期间：与pd1+cd8+t细胞交界的pdl1阴性mdc。使用qrt-pcr，我们将检查先前建立的代表不同的mdc转录程序(抗炎和促炎)的基因的组，其编码细胞因子、趋化因子、趋化因子受体、炎性介质和共刺激分子。9将设置≥2倍的阈值来确定已上调的基因。我们将分离出满足以下标准的富含pdl1+mdc的rna：rin值＞6，a260/a280比＞1.9，260/230比＞2，且产量＞1ng。根据我们的lcm可行性研究，1000个细胞翻译成约1×105um2的组织面积。使用8mm穿刺活检或更大从肿瘤获得每个样品，提供至少10×106um2的组织面积用于解剖，远超过所需面积量。我们还将产生pdl1+mdc的转录标签。rt-q-pcr对样品降解高度敏感。如果平均rin值＜5，我们将进行nanostring，在降解的rna的样品上具有优异性能的基于多路复用引物的技术。10将收获时的每个肿瘤样品横切并用快速冷冻、rnalater和福尔马林固定。如果发生意外的挑战，我们将在ffpe样品上进行lcm，然后进行nanostring。实施例2中引用的参考文献：1.hamido，etal.newenglandjournalofmedicine2013；369：134-44.2.topaliansl，etal.newenglandjournalofmedicine2012；366：2443-54.3.rileyjl.newenglandjournalofmedicine2013；369：187-9.4.pardolldm.naturereviewscancer2012；12：252-64.5.gallisj，etal.natureimmunology2011；12：1035-44.6.talmadgeje，gabrilovichdi.naturereviewscancer2013；13：739-527.condaminet，gabrilovichdi.trendsinlmmunology2011；32：19-25.8.biswassk，mantovania.natureimmunology2010；11：889-96.9.kerkarsp，etal.journalofclinicalinvestigation2011；121：4746-57.10.geissgk，etal.natbiotechnol2008；26：317-25.11.lechnermg，etal.journaloftranslationalmedicine2011；9.实施例3：抗pd1治疗失败的表型分析本实施例描述了用于分层非响应者的方法，如在接受pd1疗法之前来自治疗前活检的32位患者中非响应者的临床样品的蛋白质水平上验证的。发现四种成分的存在与对抗pd1疗法的响应有关：cd8+t细胞、表达pd-1抑制性受体的cd8+t细胞、cd68+巨噬细胞和表达pd-l1抑制性配体的cd68+巨噬细胞。一种非响应者是在侵袭性肿瘤边缘的cd8低-pd1低-cd68低-pdl1低；另一种是在侵袭性肿瘤边缘的cd8高-pd1高-cd68低-pdl1低；另一种是在侵袭性肿瘤边缘的cd8低-pd1低-cd68低-pdl1高；以及另一种是在侵袭性肿瘤边缘的cd8低-pd1低-cd68高-pdl1高。实施例4：pd-1阻断通过抑制适应性免疫耐受性诱导响应本实施例显示，明显位于侵袭性肿瘤边缘处的预先存在的cd8t细胞与pd-1/pd-l1免疫抑制轴的表达相关并预测对疗法的响应。我们使用定量免疫组织化学、定量多重免疫荧光和t细胞受体(tcr)的下一代测序分析了在抗pd1疗法(派姆单抗)之前和期间获得的来自46位患有转移性黑素瘤患者的样品。在连续取样的肿瘤中，响应患者表现出与肿瘤大小的放射照相减小直接相关的肿瘤内cd8+t细胞的增殖。从响应患者获得的治疗前样品表现出侵袭性肿瘤边缘处和肿瘤内更高数目的表达cd8、pd1和pd-l1的细胞，pd-1和pd-l1之间紧密接近，以及更高克隆性的tcr库。使用多变量分析，我们基于侵袭性边缘的cd8表达建立了预测模型，并在15位患者的独立组中验证了该模型。我们的发现表明，治疗性pd-1阻断后的肿瘤消退需要预先存在的cd8+t细胞，其由pd-1/pd-l1介导的适应性免疫耐受性负调节。本实施例建立在表明在肿瘤表达pd-l1的患者中，对于pd-1或pd-l1阻断抗体的响应率更高的证据上。1，15由于pd-l1可以组成型表达或在t细胞识别和干扰素产生后诱导，11，15我们假设对于pd-1阻断的响应将与抗原特异性t细胞存在下诱导型pd-l1表达更紧密地协变，7术语称为适应性免疫耐受性。6实际上，我们发现了响应者的治疗前样品中肿瘤和pd-1阳性t细胞中的接口pd-l1表达细胞。我们的数据表明，pd-l1作为响应于肿瘤抗原特异性t细胞浸润的适应性免疫耐受性的间接标志物，而不是静态组成型生物标志物。因此，诱导i型干扰素炎症反应与pd-l1阻断的组合需要进一步临床研究。11已发现t细胞浸润对原发性癌症的自然病史具有预测价值。13，14，18我们报告了转移性黑素瘤中t细胞的基线密度和位置在接受阻断pd-1/pd-l1轴疗法的患者中具有预测价值。当存在较大密度的受pd-1/pd-l1相互作用负调节的预先存在的肿瘤抗原限制性cd8t细胞时，pd-1免疫检查点的释放导致临床相关的抗肿瘤活性。在1a期临床试验中登记的患者的亚组(登记了411位患者)中获得肿瘤活检；19通过具有足够的肿瘤活检样品和临床随访选择患者用于该分析。在ucla解剖病理学ihc实验室，用苏木精和曙红、s100、cd8、cd4、ki67、ρstat1和粒酶b对载玻片染色。使用leicabond辅助试剂和refine聚合物dab检测系统在leicabondiii自动染色器上进行免疫染色。使用彼此独立的两种读数确定cd8+表达以解释肿瘤异质性：细胞密度(阳性细胞数/mm2)和百分比细胞性(阳性细胞数/有核细胞数)。细胞密度和百分细胞性显著相关(在肿瘤中r2＝0.89和在侵袭性边缘r2＝0.84)。使用的抗体包括兔多克隆s100(dako，1/1500稀释，低ph恢复)、cd8克隆c8/144b(dako，1/100，低ph恢复)和兔单克隆ki67克隆ep5(epitomics，1/50稀释，高ph恢复)。对于数字图像采集和分析，基于模式识别设计算法，定量s100阳性区域(肿瘤)和s100阴性区域(侵入性边缘)内的免疫细胞。基于rgb(红色、绿色、蓝色)光谱的图像分析用于通过用苏木精(蓝色)和dab或坚牢红(fastred)进行复染来检测所有细胞。使用用于顺序或定量变量的kruskal-wallis检验和用于分类变量的费舍尔精确检验在响应者和进展者之间比较人口统计(demographic)、临床和免疫组织化学变量。构建了响应与进展的逻辑回归模型，以评估肿瘤和侵袭性边缘测量的cd8和cd4的预后能力。为了确定模型对外部样品的可推广性，使用我们模型的系数估计在gustaveroussy验证组中计算进展的预测概率。使用graphpadprism、sas和spss进行分析。所有测试是双侧的，并且不假设相等方差，除非另有说明。p值＜0.05被认为具有统计学意义。肿瘤样品研究和验证组中的所有患者在开始治疗30天内进行转移性肿瘤的强制活检，并且在开始pd-1治疗后20-60天、60-120天或大于120天进行一次或多次任选活检。将样品立即固定在福尔马林中，然后石蜡包埋。活检收集和分析由uclairb11-001918和11-003066批准。分析来自ucla的46位患者的初始组中获得的肿瘤样品的cd8(n＝46位患者，45个治疗前样品和31个治疗期间样品)和cd4(n＝37位患者，37个治疗前样品和0个治疗期间样品)的免疫组织化学分析，多重发色团染色(n＝13位患者，12个治疗前样品和17个治疗期间样品)。验证组包括来自gustaveroussy的15名患者的基线活检。治疗结果组在登记了总共411位患者的1期临床试验中，患者在两个位点以三种给药方案之一静脉内接受单一药物派姆单抗：每3周2mg/kg(2q3w)，每3周10mg/kg(10q3w)或每2周10mg/kg(10q2w)。19在首次输注后12和16周以及之后每12周评估对派姆单抗的肿瘤响应。三种给药方案之间的治疗结果是统计学上相同的。实体肿瘤中的响应评估标准(responseevaluationcriteriainsolidtumours，recist)1.1版用于通过独立、中心、盲性放射照相分析来定义客观的临床响应。允许所述方案进行超过在3个月时再分期扫描的初始进展，并且在免疫相关响应标准(immune-relatedresponsecriteria，irrc)之后具有重复的成像扫描4周。20根据该方案专用标准，两位患者被证明在12周时具有增加的靶病灶尺寸，但是在36周时满足客观部分响应的标准，认为在响应组内，但是表示具有延迟响应。免疫组织化学(ihc)染色在ucla解剖病理学ihc实验室，用苏木精和曙红、s100、cd8、cd4、cd80、ki67、pstat1和粒酶b对载玻片染色。使用leicabond辅助试剂和refine聚合物dab检测系统在leicabondiii自动染色器上进行免疫染色。使用的抗体包括兔多克隆s100(dako，1/1500稀释，低ph恢复)、cd8克隆c8/144b(dako，1/100，低ph恢复)、兔单克隆pstat1克隆d3b7(细胞信号传导，1/30030分钟，低ph恢复)。所有染色的载玻片都以一位皮肤病理学家和一位经过研究人员以盲性方式进行评估，以鉴定黑素瘤特征。检查载玻片中肿瘤实质(肿瘤)和肿瘤周围的结缔组织(侵袭性边缘)中cd8、cd4、ki67、粒酶b和pstat1的存在。数字图像采集和分析所有载玻片以绝对放大倍数200×(分辨率为0.5μm/像素)扫描。基于模式识别设计算法，定量s100阳性区域(肿瘤)和s100阴性区域(侵入性边缘)内的免疫细胞。基于rgb(红色、绿色、蓝色)光谱的图像分析用于通过用苏木精(蓝色)和dab或坚牢红进行复染来检测所有细胞。该算法使用indicalabshalo平台计算密度(细胞/mm2)和％细胞性(％阳性细胞/所有有核细胞)。统计分析使用用于顺序或定量变量的wilcoxon检验和用于分类变量的费舍尔精确检验在响应者和进展者之间比较人口统计、临床和免疫组织化学变量。构建了响应与进展的接受者工作特征(receiveroperaingcharacteristic，roc)曲线以评估肿瘤和侵袭性边缘测量的cd8和cd4的预后能力。roc曲线下面积(auc)用于测量模型性能，且wilcoxon检验用于评估auc结果的显著性。使用研究组利用治疗前cd8+(细胞/mm2)对比于临床响应的结果(响应和进展)来构建逻辑回归模型。然后将该固定模型在gustaveroussy验证组中应用于cd8+密度测量中以计算响应于治疗的预测概率。计算灵敏度和特异性。所有测试是双侧的，并且不假设相等方差，除非另有说明。p值＜0.05被认为具有统计学意义。图9a-9d示出了在派姆单抗治疗之前和期间获得的样品中cd8+t细胞的免疫组织化学分析。图9a和9b是显示来自响应(图9a)和进展(图9b)组中的患者的pd-1阻断治疗之前(tx；图的左列)和治疗开始后20-60天(天+20-60；图的右列)连续活检的黑素瘤肿瘤中cd8表达的实例的数字显微照片。粗线分隔开肿瘤实质(线下)和侵袭性边缘(线上)。放大倍数，×20。图9c和9d绘制了来自治疗前和治疗期间的接收活检的全部响应者(图9c，n＝13)和进展者(图9d，n＝12)的样品中肿瘤中心(左图)和侵袭性边缘(右图)的cd8+细胞密度。·完全响应，。＝部分响应，δ＝延迟响应。图10a-10b是数字显微照片，显示在治疗期间消退肿瘤与定位于肿瘤的增殖性cd8+t细胞相关。图10a，在肿瘤消退期间获得的样品中cd8/ki67发色团双染色的代表性实例显示了位于肿瘤实质的双阳性cd8细胞。粗线分隔开侵袭性边缘(线上)和肿瘤(线下)。图10b，上：来自侵袭性边缘的代表性单阳性静止cd8+细胞(核中无ki-67标记)。下：具有与有丝分裂的子阶段相关的特征性染色质模式的代表性的双阳性细胞(标记的ki67核，cd8标记的膜)。放大倍数，×40。图11是显示根据治疗结果cd8+和cd4+细胞的基线密度和位置的一组图。通过肿瘤实质中和侵袭性边缘处的定量免疫组织化学来评估在用pd-1阻断疗法治疗之前收集的黑素瘤样品的cd8(响应n＝22，进展n＝24)和cd4(响应n＝19，进展n＝18)密度。**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。图12是一系列数字显微照片，显示了使用s100和cd8发色团染色的侵袭性边缘和肿瘤实质的分割。示出了低放大倍数(上排)和高放大倍数(下排)。线示出了s100+肿瘤(线左)和s100-基质(线右)。从s100染色图像(第1列)产生侵袭性边缘和肿瘤实质的坐标，随后导入cd8染色图像(第2列)。这之后是cd8染色图像的去卷积成像算法，其中首先鉴定和量化所有核(第3列)，而不管是什么类型的细胞。然后鉴定cd8+膜(第4列)用于细胞定量和分析。图13是一系列数字图像，其示出了响应于pd-1阻断疗法的连续取样的肿瘤中肿瘤微环境内的cd8+t细胞动力学。从具有延迟响应的患者获得的左胸壁的连续取样的黑素瘤肿瘤中的放射照相、临床和cd8ihc的实例。在+20天，临床和放射照相检查指示进行性疾病；在侵袭性边缘的cd8t细胞表达密度增加时。图14是示出了消退肿瘤中cd8+t细胞的增殖的一系列图。左图，使用定量免疫组织化学和ct扫描测量(n＝18，spearmanr＝-0.75，p＝0.0002)评估的连续取样的肿瘤中cd8+细胞密度的变化和肿瘤大小的最佳百分比变化的关系。中图和右图，治疗前(n＝11，空心圆)和治疗期间(n＝17，实心圆)响应组以及治疗前(n＝9，空心三角形)和治疗期间(n＝15，实心三角形)进展组中cd8+细胞密度和ki67+/cd8+细胞密度。图15a-15d示出了临床响应方面治疗前和治疗期间粒酶b和pstat1表达的免疫组织化学分析。图15a，根据临床响应的粒酶b表达的代表性实例。图15b，使用定量免疫组织化学评估在pd-1阻断疗法期间收集的样品的粒酶b信号(响应n＝13，进展n＝12)。****p＜0.0001。图15c，来自响应者和两个进展者(+/-cd8存在)的治疗前获得的样品中cd8+和pstat1+细胞的定位。具有cd8细胞的中度存在的进展者在该区域中未显示pstat1表达。图15d，使用定量ihc分析，响应组与治疗前和治疗期间侵袭性边缘中pstat1+的显著较高表达相关(对于治疗前活检，响应n＝16，进展期n＝18，p＝0.002，对于治疗后活检，响应n＝13，进展n＝12，p＜0.0001)。图15是显示sox-10和pd-l1的多重发色团染色的一组数字显微照片。使用sox-10(染色核)和pd-l1(染色膜)的多重发色团染色来评估肿瘤微环境内黑素瘤细胞、淋巴细胞和巨噬细胞上的pd-l1表达。sox-10是黑素瘤细胞特异性的转录因子。双阳性细胞(dp箭头)的代表性高倍视野显示来自在肿瘤消退期间获得的样品的三个响应者中表达pd-l1的黑素瘤细胞和包含淋巴细胞(高核：质比，sp箭头)和巨噬细胞(低核：质比，m箭头)的单阳性pd-l1细胞。放大倍数，×40。表2：研究和验证组中患者的人口统计和临床特征*使用费舍尔精确检验计算的p值p值代表使用非参数kruskal-wallis检验的估计￥肿瘤负荷代表鉴定的靶病灶的最大测量的总和，如通过recist1.1标准限定的。包括在响应组中的稳定疾病(肿瘤大小降低29％的1位患者)未接受tx前活检的一位患者(进展)表3：在治疗前和治疗期间进行的活检的解剖位置。提供了与图9对应的解剖位置(在pd-1之前和期间活检的肿瘤，响应n＝13，进展n＝12)。术语淋巴结/皮下是指在放射照相成像中鉴定为淋巴结的肿瘤，但在组织学检查中没有淋巴结结构的证据。25名患者中的2名患者具有运输中汇合(metsintransit)，其为在活检时彼此间隔＜1cm的不同淋巴结。表4：在对派姆单抗的临床响应方面治疗之前的cd8和cd4表达以及利用伊匹单抗(抗ctla4)的先前治疗。在治疗结果方面，未发现伊匹单抗的先前治疗与接受pd-1之前标志物的表达水平的显著关系。*p值表示使用非参数mann-whitney测试的估计表5：基于治疗前cd8+和cd4+细胞的临床响应的roc曲线分析。使用roc曲线下面积(auc)来测量治疗前cd8+和cd4+细胞密度(细胞/mm2)的响应预测性能。基于wilcoxon秩和统计计算p值。变量nauc(95％cl)p值肿瘤cd8+密度45.91(0.81，1.00)＜0.001cd4+密度37.66(0.48，0.84)0.095侵袭性边缘cd8+密度45.94(0.88，1.00}＜0.001cd4+密度37.66(0.48，0.84)0.095表6：用于使用cd8+(细胞/mm2)的临床响应的模型的性能。使用研究组用治疗前cd8+(细胞/mm2)对比临床响应的结果(响应对比于进展)来构建逻辑回归模型。然后将该固定模型在验证组中应用于cd8+密度测量中以计算响应于治疗的预测概率。实施例4中引用的参考文献：1topalian，s.l.etal.n.engl.j.med.366，2443-2454(2012).2brahmer，j.r.etal.n.engl.j.med.366，2455-2465(2012).3hamid，o.etal.n.engl.j.med.369，134-144，doi：10.1056/nejmoa1305133(2013).4wolchok，j.d.etal.n.engl.j.med.369，122-133，doi：10.1056/nejmoa1302369(2013).5topalian，s.l.etal.jclinoncol32，1020-1030，doi：10.1200/jco.2013.53.0105(2014).6pardoll.d.m.naturereviewscancer12，252-264(2012).7spranger，s.etal.scitranslmed5，200ra116，doi：10.1126/scitranslmed.3006504(2013).8robert，c.etal.lancet，doi：10.1016/s0140-6736(14)60958-2(2014).9parsa，a.t.etal.natmed13，84-88，doi：10.1038/nm1517(2007).10atefi，m.etal.clin.cancerres.20，3446-3457，doi：10.1158/1078-0432.ccr-13-2797(2014).11bald，t.etal.cancerdiscovery4，674-687，doi：10.1158/2159-8290.cd-13-0458(2014).12duraiswamy，j.，etal.cancerres74，633-634；discussion635，doi：10.1158/0008-5472.can-13-2752(2014).13galon，j.etal.science313，1960-1964，doi：10.1126/science.1129139(2006).14pages，f.etal.n.engl.j.med.353，2654-2666，doi：10.1056/nejmoa051424(2005).15taube，j.m.etal.clin.cancerres.，doi：10.1158/1078-0432.ccr-13-3271(2014).16robins，h.s.etal.blood114，4099-4107，doi：10.1182/blood-2009-04-217604(2009).17carlson，c.s.etal.naturecommunications4，2680，doi：10.1038/ncomms3680(2013).18zhang，l.etal.n.engl.j.med.348，203-213，doi：10.1056/nejmoa020177(2003).19ribas，a.，etal.jclinoncol32，5s(2014).20wolchok，j.d.etal.clin.cancerres.15，7412-7420，doi：10.1158/1078-0432.ccr-09-1624(2009).贯穿本申请引用了多个出版物。这些出版物的公开内容通过引用整体并入本申请中，以便更充分地描述本发明所属领域的现状。本领域技术人员将理解，在前面的描述中公开的概念和具体实施方案可以容易地用作修改或设计用于实现本发明的相同目的的其他实施方案的基础。虽然以上是对本发明的优选实施方案的完整描述，但是可以使用各种替代、修改和等价物。因此，上述描述不应被认为是限制由所附权利要求限定的本发明的范围。当前第1页12