使用同源重组改造间充质干细胞的制作方法

文档序号：13348201阅读：326来源：国知局

本申请享有2014年11月11日提交的美国临时专利申请号62/078,000的优先权，其教导通过整体引用并入本申请。

发明领域

本发明涉及间充质干细胞(msc)领域，特别涉及用于修饰间充质干细胞的基因组和/或基因组dna的方法和组合物。

发明背景

干细胞根据其来源组织可以分为胚胎干细胞或成体干细胞。成体干细胞的作用是在生物体一生中将已建立的成熟细胞类型库维持在基本稳定状态的数量。虽然具有高流失率的成体组织(例如血液、皮肤和肠上皮)通过组织特异性干细胞得到维持，但是干细胞本身很少分裂。然而，在某些情况下，例如在损伤后或移植后的组织修复期间，干细胞分裂可能变得更加频繁。造血干细胞作为成体干细胞的典型例子，已被证明在基因治疗中具有实用价值。虽然其在人体中相对稀少，但是这些细胞可以容易地从骨髓中分离出来，或者在流动到外周血中后分离出来。特异性表面标志物允许从骨髓或外周血细胞的混合群体中鉴定和富集造血干细胞。

在体外操作之后，这些细胞可以通过注射进血液而再次移植到患者体内，在那里其响应于内源性刺激而行进到骨髓中其功能活跃的位置。已经外植的、体外操作过的以及再次移植进同一个患者(自体移植)或不同的患者(同种异体移植)中的造血干细胞在延长的时间内保留了能成为所述接受体的所有成熟血细胞类型的能力。

另一种能潜在用作基因转移载体的成体骨髓源干细胞类型是间充质干细胞，其具有形成软骨、骨、脂肪组织和骨髓基质的能力。还已经描述了相关干细胞类型，例如：已经从骨髓中分离出来的并且可以分化成多个谱系的多能成体祖细胞，其可以包括神经元、肝细胞、内皮细胞和其他细胞类型；mesoblast有限公司描述的间充质祖细胞；和celgene，inc描述的来源于胎盘组织的多能细胞。已经鉴定了其他成体干细胞，例如在中枢神经系统和心脏中的成体干细胞，但是对这些细胞的表征不够完全并且这些细胞并不容易获得。

用于将治疗性基因导入进来自骨髓或外周血的造血干细胞中的传统方法涉及使用衍生自某类病毒(称之为逆转录病毒)的载体。一种逆转录病毒载体最初被用于显示原理论证。由于大多数成体干细胞以相对较慢的速度分裂，因此效率相当低。来源于其他类型逆转录病毒(慢病毒)和腺病毒的载体，由于其也靶向非分裂的细胞，因此具有克服这一局限的潜力。这些方法的主要缺点是治疗性基因频繁地、多少带有随机性地整合进靶细胞的染色体中。从原则上来说，这比较危险，因为基因治疗载体可以潜在地修饰紧邻插入位点的相邻基因的活性(正向修饰或负向修饰)，或者甚至通过整合进宿主基因中来使其灭活。这些现象被称为“插入诱变”。在极端情况下，例如在x连锁的scid基因治疗试验中，这些突变促成靶细胞的恶性转化，最终导致癌症。

安全港基因座为外源dna(例如微型基因和报告表达盒)提供了明确的插入位点，所述安全港基因座允许稳健表达整合进细胞基因组中的转基因。例如，通过常规的基因靶向或者核酸酶增强的基因靶向，已将ppp1r12c/aavs1和hrosa26安全港用于人全能干细胞的基因组改造工程(irion,s.等.naturebiotechnology25,1477-1482(2007)和zou,j等,blood117,5561-5572(2011))。虽然锌指核酸酶(zfn)、转录激活子样效应因子核酸酶(talen)和成簇的规律间隔的短回文重复序列(crispr)rna引导的cas核酸酶(crispr/cas)已被用来显示能够在全能干细胞中进行有效的基因编辑(hockmeyer,d.等,naturebiotechnology29,731-734(2011)；mali,p.等,science339,823-826(2013)；zou,j.等,cellstemcell5,97-110(2009))，直到最近才通过非同源末端连接(nhej)或同源性定向修复(hdr)在小鼠胚胎干细胞(esc)和胚胎中证实了在干细胞中能一步修饰多个基因座(wang,h.等,cell153,910-918(2013)和yang,h,等,cell154,1370-1379(2013))。虽然改造过的人干细胞对于多谱系标记、药物筛选和基因治疗非常有价值，但是迄今为止，尚未在人全能(pluripotent)或多能(multi-potent)干细胞中报道过多重敲入或转移大dna片段。

虽然有可能在全能干细胞中进行基因改造和同源重组，但其在成体细胞中困难重重。其原因之一是同源重组的低效率以及成体干细胞和祖细胞有限的复制潜力。已经努力尝试开发了这种技术，但是同源重组一直局限在具有无限复制潜力的永生细胞系和自发永生细胞。

使用成体干细胞的另一局限是在离体操作过程中较难维持干细胞的状态。在目前的次优条件下，成体干细胞倾向于丧失其干细胞特性并且变得更加特化，由此通过被称为分化的过程产生成熟的细胞类型。在小鼠造血干细胞的支持性培养条件方面的最新进展可能最终有助于在基因治疗应用中更有效地使用人造血干细胞。

第三个局限是成体干细胞和祖细胞会经历衰老。

发明概述

本发明一方面涉及用于修饰msc基因组的方法。

本发明另一方面涉及使msc分化的方法。

本发明另一方面涉及治疗受试者的方法，所述方法包括施用有效量的通过本文公开的方法产生的msc或者从通过本文公开的方法产生的msc分化而来的细胞。

在一个实施方案中，提供了一种将目的多核苷酸引入msc基因组中安全港基因座的方法。所述方法包括将以下引入到所述msc中：(a)上游的转录激活子样效应因子核酸酶(talen)，其包括与dna切割结构域连接的上游dna结合结构域，其中所述上游dna结合结构域特异性结合所述间充质干细胞基因组中在基因组插入位点的上游位点处的安全港基因座，(b)下游的转录激活子样效应因子核酸酶(talen)，其包括与dna切割结构域连接的下游dna结合结构域，其中所述下游dna结合结构域特异性地结合所述间充质干细胞基因组中在基因组插入位点的下游位点处的安全港基因座，和(c)单链或双链供体多核苷酸，其包括正义链多核苷酸突出端和/或反义链多核苷酸突出端，当在所述基因组插入位点处切割时，其与相应的被切割的基因组dna的多核苷酸突出端互补。所述互补的突出端促进所述供体多核苷酸与所述被切割的基因组dna的同源重组，从而将所述多核苷酸引入到所述msc的基因组中。

在另外的实施方案中，提供了一种用于诱导msc分化成选定的成熟细胞类型的方法。所述方法包括将以下引入到所述间充质干细胞中：(a)上游的转录激活子样效应因子核酸酶(talen)，其包括与dna切割结构域连接的上游dna结合结构域，其中所述上游dna结合结构域特异性结合所述间充质干细胞基因组中在基因组插入位点的上游位点处的安全港基因座，(b)下游的转录激活子样效应因子核酸酶(talen)，其包括与dna切割结构域连接的下游dna结合结构域，其中所述下游dna结合结构域特异性地结合所述间充质干细胞基因组中在基因组插入位点的下游位点处的安全港基因座，和(c)单链或双链供体多核苷酸，其包括正义链多核苷酸突出端和/或反义链多核苷酸突出端，当在所述基因组插入位点处切割时，其与相应的被切割的基因组dna的多核苷酸突出端互补。所述互补的突出端促进所述供体多核苷酸与所述被切割的基因组dna的同源重组，从而将所述供体多核苷酸引入到所述msc的基因组中。所述供体多核苷酸编码一个或多个足以使所述msc分化成选定的成熟细胞类型的因子。

在另外的实施方案中，提供了一种用于治疗受试者的疾病或病症的方法。所述方法包括选择具有所选疾病或病症的受试者以及生成msc，所述msc产生可用于治疗所述疾病或病症的多肽。所述间充质干细胞通过对所述间充质干细胞引入以下而获得：(a)上游的转录激活子样效应因子核酸酶(talen)，其包括与dna切割结构域连接的上游dna结合结构域，其中所述上游dna结合结构域特异性结合所述间充质干细胞基因组中在基因组插入位点的上游位点处的安全港基因座，(b)下游的转录激活子样效应因子核酸酶(talen)，其包括与dna切割结构域连接的下游dna结合结构域，其中所述下游dna结合结构域特异性地结合所述间充质干细胞基因组中在基因组插入位点的下游位点处的安全港基因座，以及任选地(c)单链或双链供体多核苷酸，其包括正义链多核苷酸突出端和/或反义链多核苷酸突出端，当在所述基因组插入位点处切割时，其与相应的被切割的基因组dna的多核苷酸突出端互补，其中所述互补的突出端促进所述供体多核苷酸与所述被切割的基因组dna的同源重组，从而将所述供体多核苷酸引入到所述msc的基因组中。可以向所述受试者施用治疗有效量的所述msc，或者从所述msc分化得到的一种或多种细胞，从而治疗所述疾病或病症。

在一个非限制性实施方案中，所述疾病或病症是炎症或免疫性疾病或病症、神经系统疾病或病症、癌症、或者心血管疾病或病症。

在一个非限制性实施方案中，所述疾病或病症涉及蛋白质的缺失，例如溶酶体储存障碍中的酶，例如可用于增强骨再生和/或加速溃疡修复或肢体缺血的生长因子，或者可用于减轻与类风湿性关节炎等免疫疾病相关的疼痛的细胞因子。

在另一个非限制性实施方案中，所述msc生产抗体，所述抗体可用于治疗抗体治疗是必要的疾病或病症。

在另外的实施方案中，提供了一种修饰msc的基因组dna的方法。所述方法包括将以下引入所述细胞：(a)上游的转录激活子样效应因子核酸酶(talen)，其包括与dna切割结构域连接的上游dna结合结构域，其中所述上游dna结合结构域特异性地结合目的基因组序列的上游位点，和(b)下游的转录激活子样效应因子核酸酶(talen)，其包括与dna切割结构域连接的下游dna结合结构域。所述下游dna结合结构域特异性地结合目的基因组序列的下游位点，并且所述转录激活子样效应物核酸酶切割所述基因组dna并切除所述目的基因组序列，从而修饰所述msc的基因组dna。

在另一实施方案中，提供了一种用于治疗病症(例如由显性突变引起的疾病)的方法。所述方法包括选择具有由显性突变引起的疾病的受试者以及生成产生目的多肽的msc。所述间充质干细胞通过将以下引入该细胞而获得：(a)上游的转录激活子样效应因子核酸酶(talen)，其包括与dna切割结构域连接的上游dna结合结构域，其中所述上游dna结合结构域特异性结合目的基因组序列的上游位点处的安全港基因座，(b)下游的转录激活子样效应因子核酸酶(talen)，其包括与dna切割结构域连接的下游dna结合结构域。所述下游dna结合结构域特异性地结合目的基因组序列的下游位点，并且所述转录激活子样效应物核酸酶切割所述基因组dna并切除所述目的基因组序列，从而修饰所述msc的基因组dna。

从以下参照附图进行的几个实施方案的详细描述中来看，本发明的前述和其它特征和优点将变得更加明显。

附图简述

图1.靶向第19号染色体上的aavs安全港基因座的aavs-copgfp供体载体。生成aavs1-copgfp系的实验方案。实心黑色三角形代表loxp位点，以及填充有对角线的三角形代表rmce的lox位点。还示出了用于5'(左臂整合测试)、3'(右臂整合测试)和“orf”(wtorf测试)的测试引物组。

图2a-2d稳定表达aavs-copgfp的msc系的生成。流程图(图2a)示出了生成稳定的aavs-copgfpmsc系的过程。在用aavs-copgfp进行核转染一天后，观察到～60％的msc含有瞬时绿色质粒(图2b)。经过两周的药物选择后，大多数(>98％)msc稳定表达绿色荧光(图2c)。通过接头pcr(junctionpcr)证实了质粒在该混合细胞群中的成功整合(图2d)。

序列表

如37c.f.r.1.822所定义，以下列出的核酸和氨基酸序列以核苷酸碱基的标准字母缩写，以及氨基酸的三字母代码显示。仅显示每个核酸序列的一条链，但是互补链被理解为包括在所显示的链的任何引用中。如序列表中所示的seqidno:1-21序列名称如以下表示：

发明详述

本发明提供了用于靶向间充质干细胞(msc)中的安全港基因座从而修饰所述msc的基因组的策略。在该策略中，由于掺入了绝缘子(insulators)因此没有沉默所述插入的基因。此外，可以使用本文鉴别的针对该基因座的基因编辑工具重复地靶向所述相同的位点。在本发明中，已经设计了独特的成功靶向间充质干细胞的talens。预计该策略可用于靶向任何具有与msc相同或相似的复制潜能的干细胞和/或祖细胞。

很多方法用于设计talen(bogdanove和voytas,science.2011sep30；333(6051):1843-6.doi:10.1126/science.1204094)，并且talen介导的基因靶向在人胚胎干细胞(hesc)和ipsc中与zfn一样有效(hockenmeyer等,natbiotechnol29:731–734)。使用talen和zfn进行的基因组编辑可以利用细胞在诱导和靶向双链dna断裂(dsb)之后能够进行同源性定向修复(hdr)的能力。在此期间，可以向所述细胞提供供体dna模板以在dsb位点插入新的转基因或者删除dna序列(cheng等,genescells.2012jun；17(6):431-8.doi:10.1111/j.1365-2443.2012.01599.x.epub2012apr4)。

术语

除非另有说明，否则按照常规用途使用技术术语。分子生物学常用术语的定义见于牛津大学出版社1994年出版的benjaminlewin,genesv,(isbn0-19-854287-9)；blackwellscienceltd.在1994年出版的kendrewetal.(eds.),theencyclopediaofmolecularbiology(isbn0-632-02182-9)；和vch出版公司在1995年出版的roberta.meyers(ed.),molecularbiologyandbiotechnology:acomprehensivedeskreference(isbn1-56081-569-8)。为了便于审阅本公开物的各种实施方案，提供了以下关于具体术语的说明：

动物：是指活的多细胞脊椎生物体，此类包括，例如，哺乳动物和鸟类。术语哺乳动物包括人和非人哺乳动物。类似地，术语“受试者”包括人和兽类受试者。

细胞培养：是指细胞在受控条件下生长。原代细胞培养物是直接取自生物体的并且在第一次传代培养之前的细胞、组织或器官的培养物。在促进细胞生长和/或分裂的条件下将细胞放置在生长培养基中时，其在培养物中扩增，导致更大的细胞群。当细胞在培养物中扩增时，通常通过所述细胞数量倍增所需的时间量(或者称为倍增时间)来测量细胞增殖的速度。

分化：是指相对非特异性的细胞(例如胚胎细胞或干细胞)获得成熟细胞特征性的特化的结构特征和/或功能特征的过程。同样地，“分化”是指这个过程。通常，在分化期间，细胞结构发生改变并且出现组织特异性蛋白和性质。

分化培养基：是指一套合成性的培养条件，其具有支持微生物或培养细胞的生长或存活所必需的营养物，并且其允许细胞(例如间充质干细胞)分化。

供体多核苷酸：是指一种能够特异性插入到基因组位点中的多核苷酸。

下游：是指多核苷酸上的相对位置，其中所述“下游”位置比参照点更接近所述多核苷酸的3'末端。在双链多核苷酸的情况下，5'和3'末端的取向以正义链为准，和反义链相反。

胚胎干(es)细胞：是指从发育中的囊胚的内细胞团块分离出来的全能细胞，或者这些细胞的后代。“es细胞”可以来源于任何生物体。es细胞可以来源于哺乳动物，包括小鼠、大鼠、兔、豚鼠、山羊、猪、牛、猴和人。在具体的非限制性实例中，所述细胞是人或鼠。在不受理论约束的条件下，es细胞可以生成体内存在的多种细胞(骨细胞、肌细胞、脑细胞等)，前提是其暴露在有利于发展成这些细胞类型的条件下。用于产生鼠es细胞的方法可以在美国专利号5,670,372中找到，其通过引用并入本文。用于产生人es细胞的方法可以在美国专利号6,090,622、wo00/70021和wo00/27995中找到，其通过引用并入本文。

有效量或治疗有效量：是指试剂例如细胞(例如msc)的量，所述量足以预防、治疗、减少和/或改善任何病症或疾病的症状和/或潜在诱因，或者是足以对细胞产生所想要的效应的试剂量。在一个实施方案中，“治疗有效量”是足以减少或消除疾病症状的量。在另一实施方案中，治疗有效量是足以克服所述疾病本身的量。

外源性：是指通常在细胞中不存在，但是可以通过遗传方法、生化方法或者其他方法引入。外源性核酸包括dna和rna，其可以是单链或双链；直链、支链或环状；并且可以是任意长度。相比之下，“内源性”分子是指在特定环境条件下在特定的发育阶段通常存在于特定细胞中的分子。

扩增：培养物中细胞的数量或量经由细胞分裂而增加的过程。类似地，术语“扩增(expansion)”或“扩增的(expanded)”是指这一过程。术语“增殖”(proliferate)、“增殖”(proliferation)或“增殖的”(proliferated)可以与“扩增”(expand)、“扩增”(expansion)或“扩增的”(expanded)等词互换使用。通常，在扩增阶段，所述细胞不分化形成成熟细胞。

扩增培养基：是指适合细胞(例如间充质干细胞)扩增的一套合成性的培养条件。组织培养基通常包括碳源、氮源和用于保持ph的缓冲液。在一个实施方案中，培养基含有最低必需培养基，例如dmem，所述最低必需培养基补充有各种营养物质以增强间充质干细胞的生长。此外，所述最低必需培养基可以补充有添加剂(例如马血清、小牛血清或胎牛血清)。

foki核酸酶：是指天然存在于海床黄杆菌(flavobacteriumokeanokoites)中的非特异性dna核酸酶。所述术语包括保留有核酸酶活性的所述foki核酸酶蛋白的片段，所述片段与dna结合多肽融合或者可能与其融合。

基因组插入位点：是指基因组位点，其是用于插入外源性多核苷酸的靶点或者已经经历了外源多核苷酸的插入。

生长因子：是指促进细胞生长、存活和/或分化的物质。生长因子包括用作生长刺激因子(有丝分裂原)的分子，用作刺激细胞迁移的生长抑制因子(例如负增长因子)的因子，用作趋化剂的因子或者抑制细胞迁移或者抑制肿瘤细胞侵袭的因子，调节细胞分化的功能的因子，参与凋亡的因子，或者促进细胞存活而不影响生长和分化的因子。生长因子的实例是bfgf、表皮生长因子(egf)、cntf、hgf、神经生长因子(ngf)和肌动蛋白-a。

异源性的：异源序列是这样的序列：其在正常情况下(即在野生型序列中)不与第二序列相邻。在一个实施方案中，所述序列来自不同于第二序列的遗传源(例如病毒或生物体)。

诱导的全能干细胞(“ips”细胞或“ipsc”)：是指以人工手段通过在非全能细胞(通常为成年体细胞)中重组表达特异性因子而从所述非全能细胞衍生出来的全能干细胞。如本领域当前知识所定义的，可用于ipsc的因子包括，但不限于以下一个或多个：oct-3/4、sox基因家族(sox1、sox2、sox3和sox15)中的某些成员、klf家族成员(klf1、klf2、klf4和klf5)、myc家族(c-myc、l-myc和n-myc)的因子、nanog和lin28。其他用于产生ipsc的因子或方法在本领域中也是已知的，并且被认为产生该定义范围之内的细胞。

分离的：“分离的”生物学组分(例如核酸、肽或细胞)基本上已经从天然存在有所述组分的生物体的其他生物学组分或者细胞(即，其他染色体和染色体外的dna和rna、细胞和蛋白质)分开来，从其中产生出来，或者从其中纯化出来。因此，已经被“分离的”核酸、肽和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白质。所述术语还包括通过在宿主细胞中重组表达而制备的核酸、肽和蛋白质以及化学合成的核酸。

谱系特异性的：是指细胞的特征，所述特征表明所述细胞将成为数量有限的相关细胞类型中的一类或者特定的细胞类型，例如已经分化的细胞或者正在经历分化成特定细胞类型或成熟细胞类型的过程的细胞。

间充质干细胞(msc)：也称为多能基质细胞并且不仅包括msc，还包括具有与其相似的复制潜力的细胞，其可以分化成多种细胞类型。本文中所述术语msc和/或间充质干细胞应当包括的另外的细胞实例包括，但不限于，间充质前体细胞或mpc，间充质祖细胞(例如由mesoblast，ltd描述的间充质祖细胞)，以及其他成体衍生的干细胞例如multistem(athersys，inc.)。虽然这些多能干细胞传统上存在于骨髓中，但是其也可以分离自其他组织，包括，但不限于，脐带血、外周血、输卵管、胎肝和胎肺、胎盘和脂肪。根据本发明，可以使用的msc和其他成体干细胞分化以形成细胞和/或组织，所述细胞和/或组织包括，但不限于，脂肪细胞、软骨、骨、肌腱、肌肉和皮肤以及肌细胞、神经元和神经胶质细胞。

调节：是指基因组dna基因的含量的变化。调节可以包括，但不限于，基因激活、基因抑制、基因缺失、多核苷酸插入和多核苷酸切除。

药学上可接受的载体：可用于本发明的药学上可接受的载体是常规载体。由e.w.martin撰写的evington'spharmaceuticalsciences(mack出版公司，easton，pa，第15版(1975))描述了适用于本文所公开的融合蛋白的药物递送的组合物和制剂。

一般地，所述载体的性质将取决于所采用的具体的施用模式。例如，肠胃外制剂通常包括可注射液体，所述可注射液体包括药学和生理学上可接受的流体例如水、生理盐水、平衡盐溶液、葡萄糖水溶液、甘油等作为佐剂。对于固体组合物(例如，粉末、丸剂、片剂或胶囊形式)，常规的无毒固体载体可以包括，例如，药用级的甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除了生物中性的载体之外，待施用的药物组合物还可以含有少量的无毒辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂和ph缓冲剂等，例如乙酸钠或脱水山梨糖醇单月桂酸酯。

药剂或“药物”：是指当以适当的方式施用给受试者或细胞时能够诱导所想要的治疗效应或预防效应的化合物或组合物。“孵育”包括药物有足够的时间量来与细胞相互作用。“接触”包括将固体或液体形式的药物与细胞一起孵育。

多核苷酸：是指任何长度的核酸序列(例如线性序列)。因此，多核苷酸包括寡核苷酸，以及存在于染色体中的基因序列。“寡核苷酸”是指多个连接的核苷酸，其通过天然磷酸二酯键连接。寡核苷酸是长度在6到300个核苷酸之间的多核苷酸。寡核苷酸类似物是指与寡核苷酸作用相似但是具有非天然存在的部分的部分。例如，寡核苷酸类似物可以含有非天然存在的部分，例如改变的糖部分或者糖间键(例如硫代磷酸寡脱氧核苷酸)。天然存在的多核苷酸的功能类似物可以结合rna或dna，并且包括肽核酸(pna)分子。

多肽：是指三个或更多个共价连接的氨基酸。所述术语包括蛋白质、蛋白质片段和蛋白质结构域。“dna结合”多肽是具有特异性结合dna的能力的多肽。

所述术语“多肽”特别用于涵盖天然存在的蛋白质，以及以重组或合成的方式产生的蛋白质。所述术语“多肽的功能片段”是指多肽的保留了所述多肽的活性的所有片段。例如，生物功能片段的大小可以变化，从能够结合抗体分子的表位的小的多肽片段，到能够参与特征性诱导或编程细胞内表型变化的大的多肽。“表位”是多肽区域，其能够结合与抗原接触下响应产生的免疫球蛋白。因此，可以使用含有胰岛素生物学活性的较小肽，或者所述胰岛素的保守型变体。

本文所用的术语“基本上纯化的多肽”是指基本上不含其他蛋白质、脂质、碳水化合物或其他与其天然结合的物质的多肽。在一个实施方案中，所述多肽至少有50％(例如至少有80％)不含其他蛋白质、脂质、碳水化合物或其他与其天然结合的物质。在另一个实施方案中，所述多肽至少有90％不含其他蛋白质、脂质、碳水化合物或其他与其天然结合的物质。在另一个实施方案中，所述多肽至少有95％不含其他蛋白质、脂质、碳水化合物或其他与其天然结合的物质。

保守取代是指将一个氨基酸用另一个在大小、疏水性等方面相似的氨基酸进行取代。保守取代的实例如下所示。

无论导致氨基酸变化的cdna序列变化是否保守，都应该使其最小化以便保持所编码的蛋白质的功能和免疫学特性。可以通过确定所述蛋白质是否被抗体识别来评估其免疫学特性；被这种抗体识别的变体是免疫保守的。任何cdna序列变体将优选在编码的多肽中引入不超过二十个氨基酸取代，优选少于十个氨基酸取代。变体氨基酸序列可以，例如，与所述天然氨基酸序列80％、90％、或者甚至95％或98％相同。

启动子：启动子是一批核酸控制序列，其指导核酸的转录。启动子包括位于转录起始位点附近的必需核酸序列，例如，在聚合酶ii型启动子情况下的tata元件。启动子还任选地包括远端增强子或抑制元件，其可以位于距转录起始位点多达数千个碱基对的位置。

重组的：重组的核酸是这样的核酸：其具有非天然存在的序列或者具有通过人工组合两个分离的序列段而制成的序列。这种人工组合通常通过化学合成或者更常见地，通过对分离的核酸片段进行人工操作(例如，通过遗传工程技术)来实现。类似地，重组蛋白是由重组的核酸分子编码的蛋白质。

重组：是指在两个多核苷酸之间交换遗传信息的过程。“同源重组(hr)”是指特化形式的交换，所述交换发生在，例如，修复细胞中双链断裂的过程中。重组过程中利用了核苷酸序列的同源性，例如使用“供体”分子对“靶”分子(即，经历过双链断裂的分子)进行模板修复，并且因为其导致遗传信息从所述供体转移到所述靶点，因此被称为“非交换基因转化”或“短道基因转化(shorttractgeneconversion)”。

安全港：是指基因组中的基因座，其中可以插入多核苷酸而不会对所述宿主细胞造成有害效应。已知存在于哺乳动物细胞内的安全港基因座的实例可见于aavs1基因、cybl基因和ccr5基因中。

可选标记：是指引入细胞(例如培养的哺乳动物细胞如msc)的基因，其赋予适合于从不具有所述基因的细胞中人工选择的性状。

序列同一性：氨基酸序列之间的相似性以所述序列之间的相似性表示，也称为序列同一性。序列同一性通常以同一性百分比(或者相似性或同源性)来衡量；百分比越高，所述两个序列越相似。当使用标准方法进行比对时，fgf多肽的同源物或变体将具有相对高度的序列同一性。

用于比较的序列比对的方法是本领域公知的。在smith和waterman,adv.appl.math.2:482,1981；needleman和wunsch,j.mol.biol.48:443,1970；pearson和lipman,proc.natl.acad.sci.usa85:2444,1988；higgins和sharp,gene73:237,1988；higgins和sharp,cabios5:151,1989；corpet等,nucleicacidsresearch16:10881,1988；以及pearson和lipman,proc.natl.acad.sci.usa85:2444,1988.中描述了各种程序和比对算法。在altschul,等,naturegenet.,6:119,1994中提出了关于序列比对方法和同源性计算的详细考虑。

可从一些来源获得ncbi基本局部比对搜索工具(blast)(altschul,等,j.mol.biol.215:403,1990)，包括国家生物技术信息中心(ncbi，bethesda，md)和互联网，用于与序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx结合使用。在互联网的ncbi网站上提供了关于如何使用该程序来确定序列统一性的描述。

通常，fgf多肽的同源物和变体的特征在于，当使用ncbiblast2.0且gappedblastp设置为默认参数时，全长比对计数显示其与所述因子的氨基酸序列具有至少约75％，例如至少约80％的序列同一性。当比较大于约30个氨基酸的氨基酸序列时，利用blast2序列功能，所述blast2序列功能使用被设置成默认参数的默认blosum62矩阵(间隙存在成本为11，并且每个残基间隔成本为1)。当比对短肽(少于约30个氨基酸)时，应使用blast2序列功能执行比对，所述blast2序列功能使用设置成默认参数的pam30矩阵集(开放间隙罚分为9，延伸间隙罚分为1)。当通过该方法进行评估时，与所述参考序列具有更大相似性的蛋白质将显示出上升的同一性百分比，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或者至少99％的序列同一性。当进行少于整体序列的序列同一性比较时，同源物和变体通常在10-20个氨基酸的短窗口上具有至少80％的序列同一性，并且可以具有至少85％或者至少90％或者95％的序列同一性，取决于其与所述参考序列的相似性。用于在这样的短窗口上确定序列同一性的方法可以在互联网的ncbi网站上获得。本领域技术人员将理解，这些序列同一性的范围仅用于指导；完全有可能获得超出所提供范围的强显著性同源物。

特异性结合：是指大分子之间(例如，多肽和多核苷酸之间)的序列特异性的非共价相互作用。只要相互作用在整体上是序列特异性的，那么并非结合性相互作用的所有组分都需要是序列特异性的(例如，与dna骨架中的磷酸酯残基接触)。所述术语不应被解释成表示以下内容：被描述成参与特异性结合的或者对另一给定的大分子具有特异性的大分子不能结合另一大分子，相反地，应为相对于非特异性或随机结合更显著地倾向于特异性的相互作用的性质。这种“特异性结合”的相互作用通常以10^-6m^-1或更低的解离常数(kd)表征。

受试者：是指人和非人动物(包括所有脊椎动物)，例如哺乳动物和非哺乳动物(例如非人灵长类动物、小鼠、兔、羊、狗、猫、马、牛、鸡、两栖类动物和爬行类动物)。在所述方法的许多实施方案中，所述受试者是人。

突触：是指神经元之间的以及神经元和效应细胞之间的高度特化的细胞间连接，在其间传导神经冲动(有突触活性)。通常，通过从一个神经元(突触前神经元)释放化学递质(例如多巴胺或5-羟色胺)来传导所述神经冲动，所述化学递质穿过狭窄的细胞间隙扩散到另一个神经元或效应细胞(突触后神经元)。通常，神经递质通过与并入所述突触后细胞中的特异性受体相互作用来介导其效应。“有突触活性的”是指接收并传播成熟神经元特征性的动作电位的细胞(例如分化的神经元)。

转导、转化和转染：当病毒或载体将核酸转移进细胞中时，认为其“转导”所述细胞。当通过将所述核酸并入细胞基因组中，或者通过游离型复制使所述dna被所述细胞稳定复制时，则认为被转导进所述细胞的核酸“转化”或“转染”了所述细胞。

许多转染方法是本领域技术人员已知的，例如：化学方法(例如，磷酸钙转染)，物理方法(例如电穿孔，显微注射，粒子轰击)，融合(例如，脂质体)，受体介导的内吞作用(例如，dna-蛋白复合物，病毒包膜/衣壳–dna复合物)以及病毒(例如重组病毒)的生物感染(wolff,j.a.,ed,genetherapeutics,birkhauser,boston,usa,1994)。在逆转录病毒感染的情况下，所述靶细胞吸收感染性逆转录病毒颗粒，导致所述逆转录病毒rna基因组的逆转录以及所得到的前病毒整合进所述细胞dna中。用于将基因引入细胞的方法是已知的(例如，参见美国专利号6,110,743，其通过引用并入本文)。这些方法可用于转导通过本文所述方法产生的msc或细胞。

对所述靶细胞的遗传修饰是转染成功的标记。“遗传修饰的细胞”是指这样的细胞：其基因型由于细胞通过转染吸收了外源性核苷酸序列而已经改变。提及的转染的细胞或遗传修饰的细胞包括引入了载体或多核苷酸的特定细胞以及该细胞的后代。

转基因：是指外源性基因。

治疗(treating)、治疗(treatment)和疗法(therapy)：是指在减轻或缓解损伤、病理或状况方面取得的任何成功或成功的标志，包括任何客观或主观的参数，如减轻、缓解、减弱症状或者使所述状况对所述患者来说更能忍受，减慢退化或衰退的速度，使在退化到最终点时不那么虚弱，改善受试者的身体或精神健康，或者延长生存期。可以通过客观或主观参数对治疗进行评估；包括身体检查、神经系统检查或精神病学评估的结果。

上游：是指在多核苷酸上的相对位置，其中所述“上游”位置比参考点更接近所述多核苷酸的5'末端。在双链多核苷酸情况下，5'和3'末端的取向以正义链为基础，与反义链相反。

载体：是指被引入宿主细胞的、从而产生转化的宿主细胞的的核酸分子。载体可以包括允许其在所述宿主细胞中复制的核酸序列，例如复制起点。载体还可以包括本领域已知的一种或多种治疗基因和/或选择性标记基因和其他遗传元件。载体可以转导、转化或感染细胞，从而使所述细胞表达除所述细胞天然存在的核酸和/或蛋白质之外的核酸和/或蛋白质。任选地，载体包括有助于实现所述核酸进入所述细胞的物质，例如病毒颗粒、脂质体、蛋白质包被等。

锌指dna结合结构域：是指以序列特异性的方式通过一个或多个锌指结合dna的多肽结构域，所述锌指是在所述结合结构域内的氨基酸序列区域，所述结合结构域的结构通过配位锌离子而稳定。

可以将锌指结合结构域(例如锌指的识别螺旋)“改造”成结合预定的核苷酸序列。锌指结合结构域的合理的设计标准包括应用取代规则和计算机算法来处理数据库中的信息，所述数据库存储关于现有的zfp设计和结合数据的信息，参见例如美国专利号5,789,538；美国专利号5,925,523；美国专利号6,007,988；美国专利号6,013,453；美国专利号6,140,081；美国专利号6,200,759；美国专利号6,453,242；和美国专利号6,534,261；和pct公开号wo95/19431；wo96/06166；wo98/53057；wo98/53058；wo98/53059；wo98/53060；wo98/54311；wo00/27878；wo01/60970；wo01/88197；wo02/016536；wo02/099084和wo03/016496。

当涉及可测量值(例如量、持续时间等)时，本文使用的术语“约”意在涵盖与具体值高达±10％的变化。除非另有说明，否则在说明书和权利要求书中使用的所有表示成分数量、分子量等性质、反应条件等的数字应被理解为在所有情况下都被所述术语“约”修饰。因此，除非指示相反情况，否则以下说明书和所附权利要求所示的数值参数是近似值，其可以根据所公开的主题寻求获得的期望性质而变化。至少，并且在不试图将等同原则的适用范围限制在所述权利要求的范围内的前提下，至少应该根据所报告的有效数字的数量以及通过应用普通的四舍五入来解释每个数值参数。

尽管示出本发明的广泛范围的数值范围和参数是近似值，但是尽可能精确地报告具体实施例中示出的数值。然而，任何数值固有地包含某些误差，所述误差必定由其各自测试性测量中的标准偏差导致。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开物所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。除非上下文另有明确说明，否则单数术语“一”、“一个”和“所述”包括复数指代。同样地，除非上下文另有明确说明，否则“a或b”意图包括“a”、“b”以及“a和b”。还应当理解，针对核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小以及所有分子量或分子质量值是近似值，并且也用于描述。尽管与本文所述相似或等同的方法和材料可用于本公开物的实践或测试中，但是下文描述了合适的方法和材料。术语“包括(comprises)”是指“包括(includes)”。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用整体并入。在发生冲突的情况下，以本说明书(包括对术语的解释)为准。此外，所述材料、方法和实施例仅用于说明而不用于限制。

用于靶向msc的组合物

以下公开了组合物，所述组合物可用于遗传修饰msc和其他具有相同或相似复制潜能的干细胞和/或祖细胞。这些组合物可以用于本文公开的方法中的任一种。

dna结合多肽

在本文公开的方法中使用的重组的多核苷酸结合多肽可以以各种形式存在。在一些实施方案中，所述重组的多核苷酸结合多肽是与间充质干细胞中的基因组靶序列特异性结合的dna结合重组多肽。在一个实施方案中，与所述dna结合重组多肽结合的靶向基因组序列在seqidno：19所示的序列内，或在其对应的反义序列内。在另一实施方案中，在所述间充质干细胞的基因组中与所述dna结合重组多肽结合的靶向序列包括seqidno：1所示的序列。在另一实施方案中，与所述dna结合重组多肽结合的靶序列是seqidno：1所示的序列。或者，与所述dna结合重组多肽结合的靶序列可以包括与seqidno：1所示的序列反义或互补的序列。在一个实施方案中，与所述dna结合重组多肽结合的靶序列是与seqidno：1所示的序列反义或互补的序列。在另一实施方案中，与所述dna结合重组多肽结合的靶序列包括seqidno：3所示的序列。在另一实施方案中，与所述dna结合重组多肽结合的靶序列是seqidno：3所示的序列。或者，与所述dna结合重组多肽结合的靶序列可以包括与seqidno：3所示的序列反义或互补的序列。在一个实施方案中，与所述dna结合重组多肽结合的靶序列是与seqidno：3所示的序列反义或互补的序列。

在一些实施方案中，所述dna结合重组多肽包括锌指结构域或转录激活子样效应因子(tale)结构域，或其多肽片段，所述多肽片段保留了所述tale结构域或所述锌指结构域的dna结合功能。此外，还可以将所述dna结合重组多肽与具有核酸酶活性的多肽(例如与核酸酶蛋白融合的锌指结构域或转录激活子样效应因子(tale)结构域，或其片段)组合。示例性的核酸酶包括，但不限于，s1核酸酶、绿豆核酸酶、胰腺dna酶i、微球菌核酸酶和酵母ho内切核酸酶(参见linn等(eds.)nucleases,coldspringharborlaboratory出版社,1993)。

限制性内切核酸酶(限制性酶)存在于许多物种中，并且能够与dna(在识别位点)进行序列特异性结合，并在所述结合位点处或附近切割dna。某些限制性酶(例如，iis型限制性酶)在所述识别位点之外的位点处切割dna，并且具有可分离的结合和切割结构域。例如，所述iis型酶foki在dna一条链上距其识别位点9个核苷酸处以及在另一条链上距其识别位点13个核苷酸处的位点，催化dna的双链切割(参见，例如，美国专利号5,356,802；5,436,150和5,487,994；li等(1992)proc.natl.acad.sci.usa89:4275-4279；li等(1993)proc.natl.acad.sci.usa90:2764-2768；kim等(1994a)proc.natl.acad.sci.usa91:883-887；kim等(1994b)j.biol.chem.269:31,978-31,982)。因此，在一个实施方案中，使用了来自至少一种iis型限制性酶的核酸酶结构域。切割结构域可以从所述结合结构域分离的示例性iis型限制性酶是fok1。该特定酶在二聚体时具有活性。参见bitinaite等(1998)proc.natl.acad.sci.usa95:10,570-10,575。美国专利申请公开号20110027235(其通过引用并入本文)中示出了foki核酸酶的其他形式。

在一些实施方案中，与所述dna结合重组多肽融合的具有核酸酶活性的多肽是foki核酸酶，或其保留有所述核酸酶活性的衍生物或片段。在一些实施方案中，所述fok1核酸酶与seqidno：13至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％至少约99％、或者约100％相同。

在由tale结构域产生dna结合重组多肽的情况下，与具有核酸酶活性的多肽的融合形成转录激活子样效应因子核酸酶(talen)。本文描述的一些talen的实施方案被设计成特异性靶向seqidno：19所示的序列范围内的基因组序列，或其相应的反义序列范围内的基因组序列(例如，如seqidno：1或3所示的序列)。在一个实施方案中，与所述tale结构域结合的靶序列包括seqidno：1所示的序列。在一个实施方案中，与所述tale结构域结合的靶序列是seqidno：1所示的序列。或者，与所述tale结构域结合的靶向序列可以包括与seqidno：1所示的序列反义或互补的序列。在一个实施方案中，与所述tale结构域结合的靶向序列可以是与seqidno：1所示的序列反义或互补的序列。在另一实施方案中，与所述tale结构域结合的靶序列包括seqidno：3所示的序列。在一个实施方案中，与所述tale结构域结合的靶序列是seqidno:3所示的序列。或者，与所述tale结构域结合的靶向序列可以包括与seqidno：3所示的序列反义或互补的序列。在一个实施方案中，与所述tale结构域结合的靶向序列是与seqidno：3所示的序列反义或互补的序列。

在本文公开的方法中使用的tale结构域可以与具有核酸酶活性的多肽连接以形成talen，其可用于在特定的目的位置切割dna。在一个实施方案中，与所述talen结合的靶序列包括seqidno：1所示的序列。在一个实施方案中，与所述talen结合的靶序列是seqidno：1所示的序列。或者，与所述talen结合的靶向序列可以包括与seqidno：1所示的序列反义或互补的序列。在一个实施方案中，与所述talen结合的靶向序列可以是与seqidno：1所示的序列反义或互补的序列。在另一实施方案中，与所述talen结合的靶序列包括seqidno：3所示的序列。在一个实施方案中，与所述talen结合的靶序列是seqidno:3所示的序列。或者，与所述talen结合的靶向序列可以包括与seqidno：3所示的序列反义或互补的序列。在一个实施方案中，与所述talen结合的靶向序列是与seqidno：3所示的序列反义或互补的序列。

对于本文公开的方法，还可以将所述dna结合重组多肽与具有核酸酶活性的多肽(例如与核酸酶蛋白融合的锌指结构域或转录激活子样效应因子(tale)结构域，或其片段)组合。在一些实施方案中，所述与所述dna结合重组多肽融合的具有核酸酶活性的多肽是foki核酸酶，或其保留有所述核酸酶活性的衍生物或片段。在由tale结构域产生dna结合重组多肽的情况下，与具有核酸酶活性的多肽的融合形成转录激活子样效应因子核酸酶(talen)。

在公开的方法中使用的一些talen实施方案被设计成特异性靶向seqidno：19所示序列范围内的基因组序列，或其相应的反义序列如，例如seqidno：1或3所示的序列。在一个实施方案中，所述tale结构域包括seqidno：7所示的氨基酸序列。在另一实施方案中，所述tale结构域包括seqidno：10所示的氨基酸序列。在另外的实施方案中，tale结构域与具有核酸酶活性的多肽融合以形成talen。在本文公开的方法中使用的一种talen是包括seqidno：7所示的氨基酸序列的tale结构域，所述氨基酸序列已并入具有核酸酶活性的多肽中。在一个这样的实施方案中，将seqidno：7所示的氨基酸序列并入还包括有foki核酸酶的多肽或其片段中。例如，seqidno：7所示的氨基酸序列可以并入还包含seqidno：13所示的氨基酸序列的多肽中。seqidno：8所示的多肽是以下多肽的一个实施方案：其中将seqidno：7所示的氨基酸序列并入seqidno：13所示的氨基酸序列中。在本文公开的方法中使用的一种talen是包括seqidno：10所示的氨基酸序列的tale结构域，所述氨基酸序列已并入具有核酸酶活性的多肽中。在一个这样的实施方案中，将seqidno：10所示的氨基酸序列并入还包括有foki核酸酶的多肽或其保留有核酸酶活性的片段中。例如，seqidno：10所示的氨基酸序列可以并入还包含seqidno：13所示的氨基酸序列的多肽中。seqidno：11所示的多肽是以下的一个多肽实施方案：其中将seqidno：10所示的氨基酸序列并入seqidno：13所示的氨基酸序列。

用于本文所公开方法的tale构建体可用于靶向特定的dna序列，例如msc中的目的基因组序列。当与具有核酸酶活性的多肽结合以形成talen时，这些构建体可用于靶向特定的目的多核苷酸以在所述msc的基因组中进行修饰。在一个实施方案中，所述tale结构域包括可以特异性靶向seqidno：1所示的序列的seqidno：7所示的氨基酸序列。在另一实施方案中，所述tale结构域包括可以特异性靶向seqidno：3所示的序列的seqidno：10所示的氨基酸序列。在另外的实施方案中，所述tale结构域与具有核酸酶活性的多肽融合以形成talen。本文描述的一种talen是tale结构域，所述tale结构域包括并入具有核酸酶活性的多肽中的可以特异性靶向seqidno：1所示的序列的seqidno：7所示的氨基酸序列。在一个这样的实施方案中，将seqidno：7所示的氨基酸序列并入多肽中，所述多肽还包括foki核酸酶或其保留核酸酶活性的片段，并且所述氨基酸序列可以特异性靶向seqidno：1所示的序列以及介导在临近所述多核苷酸结合区段处的dna序列的切割。例如，可以将seqidno：7所示的氨基酸序列并入到还包括seqidno：13所示的氨基酸序列的多肽中，用于特异性靶向seqidno：1所示的序列以及切割靠近所述结合基因座的多核苷酸序列。seqidno：8所示的多肽是以下的一个多肽实施方案：其中将seqidno：7所示的氨基酸序列并入seqidno：13所示的氨基酸序列中，所述seqidno：8所示的多肽可以特异性结合seqidno：1所示的序列并且切割靠近所述结合基因座的所述多核苷酸序列。

在本文公开的方法中使用的另一talen是包括被并入到具有核酸酶活性的多肽中的seqidno：10所示的氨基酸序列的tale结构域，所述氨基酸序列可以特异性靶向seqidno：3所示的序列。在一个这样的实施方案中，将seqidno：10所示的氨基酸序列并入多肽中，所述多肽还包括foki核酸酶或其保留核酸酶活性的片段，并且所述氨基酸序列可以特异性靶向seqidno：3所示的序列以及介导在靠近所述多核苷酸结合区段处的dna序列的切割。例如，可以将seqidno：10所示的氨基酸序列并入到还包括seqidno：13所示的氨基酸序列的多肽中，用于特异性靶向seqidno：3所示的序列以及切割靠近所述结合基因座的多核苷酸序列。seqidno：11所示的多肽是以下的一个多肽实施方案：其中将seqidno：10所示的氨基酸序列并入seqidno：13所示的氨基酸序列，所述seqidno：10所示的多肽可以特异性结合seqidno：3所示的序列并且切割靠近所述结合基因座的所述多核苷酸序列。

可以对所述之物进行修饰，导致产生基本类似的多肽和构建体，其与所述的多核苷酸结合多肽和相关的核酸酶构建体，以基本上相同的方式，实施基本上相同的功能。例如，基于锌指的构建体或者crispr技术可用于靶向本文所述的位点来修饰细胞的基因组或染色体dna。因此，这种变化被认为属于本公开物的范围。

多核苷酸和载体

本文所公开的方法中使用了多核苷酸和载体。所述多核苷酸编码上述多肽。在一些实施方案中，所述多核苷酸和载体编码dna结合重组多肽、锌指或tale结构域、核酸酶蛋白质或多肽、由dna结合多肽和核酸酶蛋白质或多肽的融合产生的融合蛋白，例如talen。在一些实施方案中，由所述载体编码的多肽的表达受诱导型启动子的控制。合适的启动子包括，但不限于，双皮质素(dcx)启动子和胶质细胞原纤维酸性蛋白(gfap)。在其他实施方案中，由所述载体编码的多肽的表达受可阻抑启动子的控制。间充质干细胞可以由所述载体进行修饰，例如转染的细胞或者具有所述载体的表达产物的细胞。

由于遗传密码的简并性，本文所述的多肽可由多种多核苷酸编码。因此，如本领域技术人员将理解的，可以改变本文所提供的多核苷酸以编码本文公开的相同的相应氨基酸序列。因此，应考虑这些不同的多核苷酸序列的使用属于本申请权利要求保护的方法的范围。seqidno：7所示的氨基酸序列可以由具有seqidno：2所示序列的核苷酸编码。seqidno：8所示的氨基酸序列可以由具有seqidno：5所示序列的核苷酸编码。seqidno：10所示的氨基酸序列可以由具有seqidno：4所示序列的核苷酸编码。seqidno：11所示的氨基酸序列可以由具有seqidno：6所示序列的核苷酸编码。seqidno：13所示的氨基酸序列可以由具有seqidno：14所示序列的核苷酸编码。

此外，本文所公开的方法中使用的表达所述多核苷酸或产生所述多肽的载体可被将受益于本公开物的本领域技术人员会理解的其他具有相似的功能能力的载体替代。在一个实施方案中，seqidno：8所示的多肽可以由seqidno：9所示的多核苷酸产生。在另一实施方案中，seqidno：11所示的多肽可由seqidno：12所示的多核苷酸编码。

本文提供了可以插入到间充质干细胞基因组中的供体多核苷酸。在一些实施方案中，所述供体多核苷酸是具有正义和/或反义链多核苷酸突出端的双链多核苷酸，所述多核苷酸突出端与切割的基因组dna的相应的多核苷酸突出端至少部分互补，以促进所述供体多核苷酸插入到所述切割的基因组dna中。在另外的实施方案中，所述供体多核苷酸是具有正义和/或反义链多核苷酸突出端(部分)的单链多核苷酸，所述多核苷酸突出端(部分)与切割的基因组dna的相应的多核苷酸突出端至少部分互补，以促进所述供体多核苷酸插入到所述切割的基因组dna中。在一些实施方案中，所述供体多核苷酸一旦插入到间充质细胞或从其分化出来的细胞的基因组中，便会表达多肽。在一些实施方案中，所表达的多肽可以是这样的蛋白：其能够发挥作用诱导细胞以特定的方式分化或成熟，例如朝特定的细胞谱系分化或成熟。在一些实施方案中，所述供体多核苷酸的多肽表达可以由诱导型启动子(例如在分化的细胞中表达的启动子)来控制。在其他实施方案中，所述供体多核苷酸的多肽表达可以由阻遏启动子(repressiblepromoter)控制。在其他实施方案中，所述供体多核苷酸可以编码多种多肽，例如，所述供体多核苷酸可以包括具有多个基因的表达盒。在所述供体多核苷酸编码多种多肽的某些实施方案中，所述供体多核苷酸可以具有诱导型启动子来调节某些基因的表达，以及具有阻遏启动子用于调节其他基因的表达。

msc

msc可用于本文公开的任意方法中。

在本文中使用时，“msc”意在包括间充质干细胞(通常也称为多潜能基质细胞)，以及具有与之相似的复制潜能的其他成体干细胞，其可以分化形成多种细胞类型和/或组织，包括但不限于，脂肪细胞、软骨、骨、肌腱、肌肉和皮肤以及肌细胞、神经元和神经胶质细胞。本文中所述术语msc和/或间充质干细胞应当包括的另外的实例包括但不限于间充质前体细胞或mpc，间充质祖细胞(例如mesoblast,ltd.所描述的间充质祖细胞)，以及其他成体来源的干细胞细胞如multistem(athersys,inc.)。可以从哺乳动物(包括，但不限于，人)的骨髓中获得msc。这些多能干细胞也可以分离自其他组织，包括，但不限于，脐带血、外周血、输卵管、胎肝和胎肺、胎盘和脂肪。

可以通过商业来源获得msc，例如，但不限于，roosterbio公司(frederick，md)。

msc的标准培养基通常含有细胞活力所需的各种基本组分，包括无机盐、碳水化合物、激素、必需氨基酸、维生素等。在一些实施方案中，使用dmem或f-12作为培养基。两种培养基均可通过商购获得(dmem；gibco,grandisland,n.y.；f-12,gibco,grandisland,n.y.)。dmem/f-12的预混制剂也可通过商购获得。可以使用另外的添加剂，例如谷氨酰胺、肝素、碳酸氢钠和/或n2补充剂(lifetechnologies，gaithersburg，md.)。所述培养基的ph通常在6-8之间，例如约7，例如约7.4。通常在30-40℃之间(例如在35-38℃之间，例如在35-37℃之间，例如在37℃下)培养细胞。

还公开了已被修饰成表达本文公开的一种或多种多核苷酸的msc以及从其分化出来的细胞。所述msc可以表达上文所公开的任何多肽。在一些实施方案中，msc被修饰成包括多核苷酸，所述多核苷酸包括seqidno：2所示的序列。在一个实施方案中，msc被修饰成包括多核苷酸，所述多核苷酸包括seqidno：4所示的序列。在其他实施方案中，msc被修饰成包括多核苷酸，所述多核苷酸包括seqidno：5所示的序列。在其他实施方案中，msc被修饰成包括多核苷酸，所述多核苷酸包括seqidno：6所示的序列。在其他实施方案中，msc被修饰成包括多核苷酸，所述多核苷酸包括seqidno：9所示的序列。在另外的实施方案中，msc被修饰成包括多核苷酸，所述多核苷酸包括seqidno：12所示的序列。msc可以表达由seqidno：2、4、5和/或6中的一个或多个编码的多肽。

用于改造msc的方法

提供了用于修饰msc的基因组的方法。在一些实施方案中，这些方法包括，但不限于，将目的多核苷酸引入msc基因组中的安全港基因座。在另外的实施方案中，所述方法包括从msc切除目的多核苷酸。在另外的实施方案中，所述方法包括将突变引入目的多肽。

所述公开的方法可以靶向任何安全港基因座，例如aavs1、cybl和ccr5。

在一些实施方案中，所述安全港基因座是aavs1。在另外的实施方案中，所述方法允许将dna整合到所述aavs1安全港基因座的内含子中。在所述安全港基因座是aavs1的一个非限制性实施方案中，将dna整合到所述ppp1r12c基因的内含子1中(在外显子1和外显子2之间)。

在一些实施方案中，所述安全港基因座是cybl。在另外的实施方案中，所述方法允许将dna整合到所述cybl安全港基因座的内含子中。在所述安全港基因座是cybl的一个非限制性实施方案中，所述整合位点在所述cycl基因的内含子2处。

如上所述，所述msc可以是任意的目的msc。在一些实施方案中，将第一多肽或talen引入细胞的步骤涉及用编码所述多肽或talen的多核苷酸转染所述msc。在一些实施方案中，将第二多肽或talen引入细胞的步骤涉及用编码所述多肽或talen的多核苷酸转染所述细胞。在一些实施方案中，可以使用单个载体来使编码上游talen的多核苷酸和编码下游talen的核酸转染细胞。

用于将dna引入msc的方法包括化学方法和物理方法。化学方法包括基于脂质体的基因转导或脂质转染，磷酸钙介导的基因转导，deae-葡聚糖转染技术和聚乙烯亚胺(pei)介导的递送。物理方法包括弹道基因转导，显微注射和核转染(amaxabiosystem，2004)。在一些实施方案中，使用核转染来将本文公开的多核苷酸引入msc中。在具体的非限制性实例中，所述核转染涉及使用核转染素d装置。在一些实施方案中，所述核转染使得转染细胞具有至少约60％，至少约65％，至少约70％，至少约75％，至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％的转染效率以包括引入的dna。在具体的非限制性实例中，所述核转染使得转染细胞具有至少约80％，例如至少约85％，至少约90％，或至少约95％，约96％，97％，约98％，或约99％的转染效率以包括引入的dna。

所述方法可以包括使所述间充质干细胞与以约1:1:1比例的所述上游talen，所述下游talen和目的多核苷酸接触。在另外的实施方案中，使用约1:2:1或2:1:1或1:1:2的比例。在其他实施方案中，使用1:3:1或3:1:1或1:1.3的比例。在其它实施方案中，使用1:4:1或4:1:1或1:4:1的比例。在另外的实施方案中，使用1:5:1或5:1:1或1:1:5的比例。

在一些实施方案中，所述供体多核苷酸编码用于诱导间充质干细胞增殖的试剂。在一些实施方案中，所述供体多核苷酸编码用于诱导间充质干细胞分化成选定的成熟细胞和/或组织的试剂，所述成熟细胞和/或组织包括，但不限于，脂肪细胞、软骨、骨、肌腱、肌肉和皮肤以及肌细胞、神经元和胶质细胞。所述试剂可以是营养剂或生长因子。在具体的非限制性实例中，所述试剂是神经生长因子、胰岛素、成纤维细胞生长因子、从神经胶质衍生的神经营养因子、notch配体、delta、脑源性神经营养因子、从胶质细胞衍生的神经营养因子、骨形态发生蛋白-2或4(bmp-2/4)、睫状神经营养因子(cntf)、heregulin1-1β、血小板衍生生长因子(pdgf)-1或pdgf-b。在另外的实施方案中，所述供体多核苷酸编码可选的标志物和/或可检测标记。合适的可检测标记包括，但不限于，酶(例如辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶)和荧光蛋白(例如绿色荧光蛋白)。

所述供体多核苷酸可以包括可操作的连接的异源性核酸(例如编码目的试剂和/或可选择标志物和/或可检测标记的核酸)的启动子。所述启动子可以是组成型或诱导型。所述启动子可以是谱系特异性启动子，例如适用于在脂肪细胞、软骨、骨、肌腱、肌肉和/或皮肤以及肌细胞、神经元和胶质细胞中表达的启动子。在具体的非限制性实例中，所述启动子是双皮质素(dcx)或gfap启动子。

在一些实施方案中，所述供体多核苷酸是具有正义链多核苷酸突出端和/或反义链多核苷酸突出端的单链或双链供体多核苷酸，当在所述基因组插入位点处切割时，其与相应的被切割的基因组dna的多核苷酸突出端互补。在一个非限制性实例中，所述供体多核苷酸是单链的。

在另一个非限制性实例中，所述供体多核苷酸是双链，其具有正义链单链多核苷酸突出端和/或反义链单链多核苷酸突出端，其与相应的被切割的基因组dna的多核苷酸突出端互补。所述互补的突出端促进所述供体多核苷酸与所述切割的基因组dna的同源重组，使得将所述多核苷酸引入所述细胞的基因组中。在一些实施方案中，所述突出端的长度为至少15个核苷酸，例如20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、或1,000个碱基对。所述互补不需要100％互补。例如，所述互补的突出端可以与所述切割的dna的突出端95％、96％、97％、98％或99％互补。在另外的实施方案中，所述互补的突出端与所述切割的dna的突出端至少98％或至少99％同源。

在一些实施方案中，所述方法包括将供体多核苷酸插入到msc的基因组中。所述供体序列可以是任何长度，例如长度在2到30,000个核苷酸之间(或其间的任意整数值)，例如长度为50到5,00个核苷酸之间，例如长度在约100到1,000个核苷酸之间(或其间的任意整数值)，或长度为约200到500个核苷酸(或其间的任意整数值)。用于确定核酸和氨基酸序列的同一性的技术是本领域已知的。

在一些实施方案中，所述方法包括将以下引入到所述间充质干细胞中：(a)上游的转录激活子样效应因子核酸酶(talen)，其包括与dna切割结构域连接的上游dna结合结构域，其中所述上游dna结合结构域特异性结合在所述间充质干细胞基因组中基因组插入位点的上游位点处的安全港基因座，(b)下游的转录激活子样效应因子核酸酶(talen)，其包括与dna切割结构域连接的下游dna结合结构域，其中所述下游dna结合结构域特异性地结合在所述间充质干细胞基因组中基因组插入位点的下游位点处的安全港基因座，和(c)单链或双链供体多核苷酸，其包括正义链多核苷酸突出端和/或反义链多核苷酸突出端，当在所述基因组插入位点处切割时，其与相应的被切割的基因组dna的多核苷酸突出端互补。所述互补突出端促进所述供体多核苷酸与所述切割的基因组dna的同源重组，以允许将所述多核苷酸引入所述细胞的基因组中。这些方法使得能够将所述供体多核苷酸引入所述间充质干细胞的基因组中的所述安全港基因座中的基因组插入位点。在一些实施方案中，所述上游talen与所述位于所述插入位点侧翼的基因组dna基因座的正义链结合，并且所述下游talen与所述位于所述插入位点侧翼的基因组dna基因座的反义链结合。

在一些实施方案中，所述上游talen包括seqidno：8。在另外的实施方案中，所述下游talen包括seqidno：11。在另外的实施方案中，所述dna切割结构域包括foki核酸酶结构域，例如，但不限于，seqidno：13。在一些实施方案中，与所述上游talen结合的基因组正义链基因座包括seqidno：1。在其他实施方案中，与所述下游talen结合的基因组反义链基因座包括seqidno：3。在另外的实施方案中，将所述供体多核苷酸插入同一染色体(例如第13号染色体)的两个拷贝中，例如插入第13号染色体的内含子中，例如cybl基因中第13号染色体的内含子2。在一些实施方案中，将所述多核苷酸插入到所述同一染色体的两个拷贝中。

一个应用是通过向msc中引入具有dna结合结构域的第一多肽(所述第一多肽具有特异性针对目的基因组序列上游的dna序列的seqidno：7所示的序列)，和具有dna结合结构域的第二多肽(所述第二多肽具有特异性针对目的基因组序列下游的dna序列的seqidno：10所示的序列)来修饰所述msc的基因组dna的方法，其中所述第一和第二多肽介导所述基因组dna的切割并切除所述目的基因组序列，由此修饰所述msc的基因组dna。另一个应用是通过向msc中引入具有dna结合结构域的第一多肽(所述dna结合结构域特异性针对目的基因组序列上游的seqidno：19所示的序列内的dna序列)，和具有dna结合结构域的第二多肽(所述dna结合结构域特异性针对目的基因组序列下游的seqidno：19所示的序列内的dna序列)来修饰所述msc的基因组dna的方法，其中所述第一和第二多肽介导所述基因组dna的切割并切除所述目的基因组序列，进而修饰所述msc的基因组dna。另一个应用是通过向msc中引入第一talen(所述第一talen具有特异性针对人第13号染色体内的dna序列的dna结合结构域，所述dna结合结构域结合目的基因组序列的上游)，和第二talen(所述第二talen具有特异性针对人第13号染色体内的dna序列的dna结合结构域，所述dna结合结构域结合目的基因组序列的下游)，来修饰所述msc的基因组dna的方法，由此所述talen切割所述基因组dna并切除所述目的基因组序列，进而修饰所述msc的基因组dna。

另一个应用是修饰msc的基因组dna的方法，所述方法包括将第一talen(所述第一talen具有特异性针对所述clybl安全港基因座内的dna序列的dna结合结构域，所述dna结合结构域结合目的基因组序列的上游)和第二talen(所述第二talen具有特异性针对所述clybl安全港基因座内的dna序列的dna结合结构域，所述dna结合结构域结合目的基因组序列的下游)引入所述细胞，由此所述talen切割所述基因组dna并切除所述目的基因组序列，进而修饰所述msc的基因组dna。

在一些实施方案中，所述方法包括将具有正义链多核苷酸突出端和/或反义链多核苷酸突出端的单链或双链供体多核苷酸引入所述msc，所述正义链多核苷酸突出端和/或反义链多核苷酸突出端与相应的基因组dna的多核苷酸突出端互补。在其它实施方案中，所述方法包括将具有正义链多核苷酸突出端和/或反义链多核苷酸突出端(或区)的单链供体多核苷酸引入所述msc，所述正义链多核苷酸突出端和/或反义链多核苷酸突出端与相应的基因组dna的多核苷酸突出端互补，其中所述突出端长度为至少15个核苷酸，例如长度为20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1,000个碱基对。所述互补不需要100％互补。例如，所述互补的突出端可以与所述切割的dna的突出端95％、96％、97％、98％或99％互补。在另外的实施方案中，所述互补的突出端与所述切割的dna的突出端至少98％或至少99％同源。

所公开的修饰msc的基因组dna的方法的一个实施方案涉及向所述细胞内引入第一talen(所述第一talen具有特异性针对clybl安全港基因座的内含子(例如内含子2)内的dna序列的dna结合结构域，所述dna结合结构域结合目的基因组序列的上游)和第二talen(所述第二talen具有特异性针对clybl安全港基因座的内含子(例如内含子2)内的dna序列的dna结合结构域，所述dna结合结构域结合目的基因组序列的下游)，由此所述talen切割所述基因组dna并切除所述目的基因组序列，进而修饰所述msc的基因组dna。另一个实施方案是修饰msc的基因组dna的方法，所述方法包括向所述msc引入第一talen(所述第一talen具有特异性针对seqidno:19所示序列内的dna序列的dna结合结构域，所述dna结合结构域结合目的基因组序列的上游)和第二talen(所述第二talen具有特异性针对seqidno:19所示序列内的dna序列的dna结合结构域，所述dna结合结构域结合目的基因组序列的下游)，由此所述talen切割所述基因组dna并切除所述目的基因组序列，进而修饰所述msc的基因组dna。

另一个实施方案是修饰msc的基因组dna的方法，所述方法包括向所述msc引入第一talen(所述第一talen具有特异性针对具有seqidno:1所示序列的dna序列的dna结合结构域，所述dna结合结构域结合目的基因组序列的上游)和第二talen(所述第二talen具有特异性针对具有seqidno:3所示序列的dna序列的dna结合结构域，所述dna结合结构域结合目的基因组序列的下游)，由此所述talen切割所述基因组dna并切除所述目的基因组序列，进而修饰所述msc的基因组dna。

修饰基因组dna的方法的一个实施方案包括向所述msc引入第一talen(所述第一talen具有seqidno:7所示的序列，并且具有特异性针对目的基因组序列上游的dna序列的dna结合结构域)和第二talen(所述第二talen具有特异性针对目的基因组序列下游的dna序列的dna结合结构域)，由此所述talen切割所述基因组dna并切除所述目的基因组序列，进而修饰所述细胞的所述基因组dna。在另一个实施方案中，并入了seqidno：7所示多肽的talen还可以包括衍生自foki的核酸酶。在具体的实施方案中，并入了seqidno：7所示多肽的talen还可以包括核酸酶，所述核酸酶衍生自具有seqidno：13所示序列的foki。

修饰基因组dna的方法的另一个实施方案包括向所述msc引入第一talen(所述第一talen具有特异性针对目的基因组序列上游的dna序列的dna结合结构域)和第二talen(所述第二talen具有seqidno:10所示的序列，并且具有特异性针对目的基因组序列下游的dna序列的dna结合结构域)，由此所述talen切割所述基因组dna并切除所述目的基因组序列，进而修饰所述msc的基因组dna。在另一个实施方案中，并入了seqidno：10所示多肽的talen还可以包括衍生自foki的核酸酶。在具体的实施方案中，并入了seqidno：10所示多肽的talen还可以包括核酸酶，所述核酸酶衍生自具有seqidno：13所示序列的foki。

修饰基因组dna的方法的另一个实施方案包括向所述msc引入第一talen(所述第一talen具有seqidno:7所示的序列，并且具有特异性针对目的基因组序列上游的dna序列的dna结合结构域)和第二talen(所述第二talen具有seqidno:10所示的序列，并且具有特异性针对目的基因组序列下游的dna序列的dna结合结构域)，由此所述talen切割所述基因组dna并切除所述目的基因组序列，进而修饰所述细胞的所述基因组dna。在另一个实施方案中，并入了seqidno：7所示多肽的talen还可以包括衍生自foki的核酸酶并且并入了seqidno：10所示多肽的talen还可以包括衍生自foki的核酸酶。在具体的实施方案中，并入了seqidno：7所示多肽的talen还可以包括核酸酶，所述核酸酶衍生自具有seqidno：13所示序列的foki，并且并入了seqidno：10所示多肽的talen还可以包括核酸酶，所述核酸酶衍生自具有seqidno：13所示序列的foki。

修饰基因组dna的方法的另一个实施方案包括向所述msc引入第一talen(所述第一talen具有seqidno:8所示的序列，并且具有特异性针对目的基因组序列上游的dna序列的dna结合结构域)和第二talen(所述第二talen具有特异性针对目的基因组序列下游的dna序列的dna结合结构域)，由此所述talen切割所述基因组dna并切除所述目的基因组序列，进而修饰所述msc的基因组dna。

修饰基因组dna的方法的一个实施方案包括向所述msc引入第一talen(所述第一talen具有特异性针对目的基因组序列上游的dna序列的dna结合结构域)和第二talen(所述第二talen具有seqidno:11所示的序列，并且具有特异性针对目的基因组序列下游的dna序列的dna结合结构域)，由此所述talen切割所述基因组dna并切除所述目的基因组序列，进而修饰所述msc的基因组dna。

修饰基因组dna的方法的一个实施方案包括向所述msc引入第一talen(所述第一talen具有seqidno:8所示的序列，并且具有特异性针对目的基因组序列上游的dna序列的dna结合结构域)和第二talen(所述第二talen具有seqidno:11所示的序列，并且具有特异性针对目的基因组序列下游的dna序列的dna结合结构域)，由此所述talen切割所述基因组dna并切除所述目的基因组序列，进而修饰所述msc的基因组dna。

提供了用于修饰msc的基因组dna的方法，所述方法包括向所述细胞中引入第一talen(所述第一talen具有特异性针对人第13号染色体内的dna序列的dna结合结构域，所述dna结合结构域结合目的基因组序列上游的正义链dna)和第二talen(所述第二talen具有特异性针对人第13号染色体内的dna序列的dna结合结构域，所述dna结合结构域结合目的基因组序列下游的反义链dna)。所述talen切割所述基因组dna并切除所述目的基因组序列，进而修饰所述msc的基因组dna。

在一些实施方案中，提供了用于修饰msc的基因组dna的方法，所述方法包括向所述细胞中引入第一talen(所述第一talen具有特异性针对所述aavs1或cybl安全港基因座内的dna序列的dna结合结构域，所述dna结合结构域结合目的基因组序列的上游dna的正义链)和第二talen(所述第二talen具有特异性针对所述aavs1或cybl安全港基因座内的dna序列的dna结合结构域，所述dna结合结构域结合目的基因组序列的下游dna的反义链)。所述talen切割所述基因组dna并切除所述目的基因组序列，进而修饰所述msc的基因组dna。

在另外的实施方案中，提供了用于修饰msc的基因组dna的方法，所述方法包括向所述细胞中引入第一talen(所述第一talen具有dna结合结构域，所述dna结合结构域特异性针对所述aavs1或cybl安全港基因座的内含子内的dna序列并且结合目的基因组序列的上游dna的正义链)和第二talen(所述第二talen具有dna结合结构域，所述dna结合结构域特异性针对所述aavs1或cybl安全港基因座内的dna序列并且结合目的基因组序列的下游dna的反义链)。所述talen切割所述基因组dna并切除所述目的基因组序列，进而修饰所述msc的基因组dna。

在另外的实施方案中，提供了用于修饰msc的基因组dna的方法，所述方法包括向所述msc引入第一talen(所述第一talen具有特异性针对seqidno:19所示序列内的dna序列的dna结合结构域，所述dna结合结构域结合目的基因组序列的上游dna的正义链)和第二talen(所述第二talen具有特异性针对seqidno:19所示序列内的dna序列的dna结合结构域，所述dna结合结构域结合目的基因组序列的下游dna的反义链)。所述talen切割所述基因组dna并切除所述目的基因组序列，进而修饰所述msc的基因组dna。

在另外的实施方案中，提供了用于修饰msc的基因组dna的方法，所述方法包括向所述细胞中引入第一talen(所述第一talen具有特异性针对具有seqidno:1所示序列的dna序列的dna结合结构域，所述dna结合结构域结合目的基因组序列的上游dna的正义链)和第二talen(所述第二talen具有特异性针对具有seqidno:3所示序列的dna序列的dna结合结构域，所述dna结合结构域结合目的基因组序列的下游dna的反义链)。所述talen切割所述基因组dna并切除所述目的基因组序列，进而修饰所述msc的基因组dna。

在一些实施方案中，提供了用于修饰基因组dna的方法，所述方法包括向所述msc引入第一talen(所述第一talen具有seqidno:7所示的序列，并且具有特异性针对目的基因组序列上游的dna序列的dna结合结构域)和第二talen(所述第二talen具有特异性针对目的基因组序列下游的dna序列的dna结合结构域)。所述talen切割所述基因组dna并切除所述目的基因组序列，进而修饰所述细胞的所述基因组dna。在另外的实施方案中，并入了seqidno：7所示多肽的talen还可以包括衍生自foki的核酸酶。在具体的实施方案中，并入了seqidno：7所示多肽的talen还可以包括核酸酶，所述核酸酶衍生自具有seqidno：13所示序列的foki。

修饰基因组dna的方法的一个实施方案包括向所述msc引入第一talen(所述第一talen具有dna结合结构域，所述dna结合结构域特异性针对目的基因组序列上游的dna的正义链上的dna序列)和第二talen(所述第二talen具有seqidno:10所示的序列，并且具有dna结合结构域，所述dna结合结构域具有特异性针对目的基因组序列下游的dna的反义链上的dna序列)。所述talen切割所述基因组dna并切除所述目的基因组序列，进而修饰所述msc的基因组dna。在另外的实施方案中，并入了seqidno：10所示多肽的talen还可以包括衍生自foki的核酸酶。在具体的实施方案中，并入了seqidno：10所示多肽的talen还可以包括核酸酶，所述核酸酶衍生自具有seqidno：13所示序列的foki。

修饰基因组dna的方法的一个实施方案包括向所述msc引入第一talen(所述第一talen具有seqidno:7所示的序列，并且具有dna结合结构域，所述dna结合结构域特异性针对目的基因组序列上游的dna的正义链上的dna序列)和第二talen(所述第二talen具有seqidno:10所示的序列，并且具有dna结合结构域，所述dna结合结构域具有特异性针对目的基因组序列下游的dna的反义链上的dna序列)。所述talen切割所述基因组dna并切除所述目的基因组序列，进而修饰所述msc的基因组dna。在另外的实施方案中，并入了seqidno：7所示多肽的talen还可以包括衍生自foki的核酸酶，以及并入了seqidno：10所示多肽的talen还可以包括衍生自foki的核酸酶。在具体的实施方案中，并入了seqidno：7所示多肽的talen还可以包括核酸酶，所述核酸酶衍生自具有seqidno：13所示序列的foki，以及并入了seqidno：10所示多肽的talen还可以包括衍生自具有seqidno：13所示序列的foki的核酸酶。

在修饰基因组dna的方法的一个实施方案中，所述方法包括向所述msc引入第一talen(所述第一talen具有seqidno:8所示的序列，并且具有dna结合结构域，所述dna结合结构域特异性针对目的基因组序列上游的dna的正义链上的dna序列)和第二talen(所述第二talen具有dna结合结构域，所述dna结合结构域特异性针对目的基因组序列下游的dna的反义链上的dna序列)。所述talen切割所述基因组dna并切除所述目的基因组序列，进而修饰所述细胞的所述基因组dna。

在修饰基因组dna的方法的另一个实施方案中，所述方法包括向所述msc引入第一talen(所述第一talen具有dna结合结构域，所述dna结合结构域特异性针对目的基因组序列上游的dna的正义链上的dna序列)和第二talen(所述第二talen具有seqidno:11所示的序列，并且具有dna结合结构域，所述dna结合结构域特异性针对目的基因组序列下游的dna的反义链上的dna序列)。所述talen切割所述基因组dna并切除所述目的基因组序列，进而修饰所述细胞的所述基因组dna。

在修饰基因组dna的方法的另一个实施方案中，所述方法包括向所述msc引入第一talen(所述第一talen具有seqidno:8所示的序列，并且具有dna结合结构域，所述dna结合结构域特异性针对目的基因组序列上游的dna的正义链上的dna序列)和第二talen(所述第二talen具有seqidno:11所示的序列，并且具有dna结合结构域，所述dna结合结构域特异性针对目的基因组序列下游的dna的反义链上的dna序列)。所述talen切割所述基因组dna并切除所述目的基因组序列，进而修饰所述细胞的所述基因组dna。

根据本节中描述的修饰基因组dna的方法，应当理解，可以根据需要或期望开展这些方法在其他方面的广泛应用。在一个实施方案中，可以开展所述方法来导致在所述同一染色体的两个拷贝中的多核苷酸切除。

本文提供了使用所述多核苷酸结合多肽、重组的dna结合多肽、锌指或tale结构域、核酸酶蛋白或多肽、由多核苷酸结合多肽和核酸酶蛋白或多肽的融合产生的融合蛋白、以及talen，来将多核苷酸插入msc的基因组的方法。在一些实施方案中，通过将具有dna结合结构域的第一多肽(所述dna结合结构域特异性针对目的基因组序列上游的dna序列)，具有dna结合结构域的第二多肽(所述dna结合结构域特异性针对目的基因组序列下游的dna序列)，和具有正义链多核苷酸突出端和/或反义链多核苷酸突出端的单链或双链供体多核苷酸(当在基因组插入位点处切割时，所述突出端与相应的被切割的基因组dna的多核苷酸突出端互补)引入msc来开展所述方法。

在所公开的方法的一个实施方案中，通过将具有dna结合结构域的第一多肽(所述dna结合结构域包括seqidno:7所示的序列，并且特异性针对目的基因组序列上游的dna序列)，具有dna结合结构域的第二多肽(所述dna结合结构域包括seqidno:10所示的序列，并且特异性针对目的基因组序列下游的dna序列)，和具有正义链多核苷酸突出端和/或反义链多核苷酸突出端的单链或双链供体多核苷酸(当在基因组插入位点处被所述引入的多肽切割时，所述突出端与相应的被切割的基因组dna的多核苷酸突出端互补)引入msc来开展所述方法。所述互补的突出端促进所述供体多核苷酸插入到所述切割的基因组dna中，从而使得将所述供体多核苷酸引入所述msc的基因组中。

在一些实施方案中，所述方法包括将具有dna结合结构域的第一多肽(所述dna结合结构域特异性针对目的基因组序列上游的seqidno:19所示的序列内的dna序列)，具有dna结合结构域的第二多肽(所述dna结合结构域特异性针对所述目的基因组序列下游的seqidno:19所示的序列内的dna序列)，和具有正义链多核苷酸突出端和/或反义链多核苷酸突出端的单链或双链供体多核苷酸(当在基因组插入位点处被所述引入的多肽切割时，所述突出端与相应的被切割的基因组dna的多核苷酸突出端互补)引入msc。所述互补的突出端促进所述供体多核苷酸插入到所述切割的基因组dna中，从而使得将所述供体多核苷酸引入所述msc的基因组中。

在一些实施方案中，所述方法包括向msc引入第一talen(所述第一talen具有dna结合结构域，所述dna结合结构域特异性针对目的基因组序列上游的dna序列)，第二talen(所述第二talen具有dna结合结构域，所述dna结合结构域特异性针对目的基因组序列下游的dna序列)，和具有正义链多核苷酸突出端和/或反义链多核苷酸突出端的单链或双链供体多核苷酸(当在基因组插入位点处被所述引入的多肽切割时，所述突出端与相应的被切割的基因组dna的多核苷酸突出端互补)。所述互补的突出端促进所述供体多核苷酸与所述切割的基因组dna的同源重组，从而使得将所述供体多核苷酸引入到所述msc的基因组中。

还提供了使用所述多核苷酸结合多肽、所述重组的dna结合多肽、锌指或tale结构域、核酸酶蛋白或多肽、由多核苷酸结合多肽和核酸酶蛋白或多肽的融合产生的融合蛋白、以及talen的方法。一个应用是通过将具有dna结合结构域的第一多肽(所述dna结合结构域特异性针对目的基因组序列上游的dna序列)，具有dna结合结构域的第二多肽(所述dna结合结构域特异性针对目的基因组序列下游的dna序列)，和具有正义链多核苷酸突出端和/或反义链多核苷酸突出端的单链或双链供体多核苷酸(当在基因组插入位点处切割时，所述突出端与相应的被切割的基因组dna的多核苷酸突出端互补)引入msc来将多核苷酸插入到所述msc的基因组中的方法。所述互补的突出端促进所述供体多核苷酸与所述切割的基因组dna的同源重组，从而使得将所述供体多核苷酸引入到所述msc的基因组中。

还提供了通过向msc中引入第一talen(所述第一talen具有特异性针对人第13号染色体内的dna序列的dna结合结构域，所述dna结合结构域结合目的基因组序列的上游)和第二talen(所述第二talen具有特异性针对人第13号染色体内的dna序列的dna结合结构域，所述dna结合结构域结合目的基因组序列的下游)，以及具有正义链多核苷酸突出端和/或反义链多核苷酸突出端的单链或双链供体多核苷酸(所述突出端与相应的被所述引入的talen在基因组插入位点处切割的基因组dna的多核苷酸突出端互补)，来将多核苷酸插入到所述msc的基因组中的方法。所述互补的突出端促进所述供体多核苷酸与所述切割的基因组dna的同源重组，从而使得将所述供体多核苷酸引入到所述msc的基因组中。

在一些实施方案中，提供了通过向msc中引入第一talen(所述第一talen具有特异性针对所述aavs1安全港基因座内的dna序列的dna结合结构域，所述dna结合结构域结合目的基因组序列的上游)和第二talen(所述第二talen具有特异性针对所述aavs1安全港基因座内的dna序列的dna结合结构域，所述dna结合结构域结合目的基因组序列的下游)，以及具有正义链多核苷酸突出端和/或反义链多核苷酸突出端的单链或双链供体多核苷酸(所述突出端与相应的被所述引入的talen在基因组插入位点处切割的基因组dna的多核苷酸突出端互补)，来将多核苷酸插入到所述msc的基因组中的方法。所述互补的突出端促进所述供体多核苷酸与所述切割的基因组dna的同源重组，从而使得将所述供体多核苷酸引入到所述msc的基因组中。

所述将多核苷酸插入msc的基因组中的方法的一个实施方案涉及向所述msc引入第一talen(所述第一talen具有dna结合结构域，所述dna结合结构域特异性针对所述aavs1或cybl安全港基因座的内含子(例如内含子2)内的dna序列并且结合目的基因组序列的上游)和第二talen(所述第二talen具有dna结合结构域，所述dna结合结构域特异性针对所述aavs1或cybl安全港基因座内的dna序列并且结合目的基因组序列的下游)，以及具有正义链多核苷酸突出端和/或反义链多核苷酸突出端的单链或双链供体多核苷酸(所述突出端与相应的被所述引入的talen在基因组插入位点处切割的基因组dna的多核苷酸突出端互补)。所述互补的突出端促进所述供体多核苷酸与所述切割的基因组dna的同源重组，从而使得将所述供体多核苷酸引入到所述msc的基因组中。

另一个应用是通过向msc中引入第一talen(所述第一talen具有特异性针对seqidno:19所示序列内的dna序列的dna结合结构域，所述dna结合结构域结合目的基因组序列的上游)和第二talen(所述第二talen具有特异性针对seqidno:19所示序列内的dna序列的dna结合结构域，所述dna结合结构域结合目的基因组序列的下游)，以及具有正义链多核苷酸突出端和/或反义链多核苷酸突出端的单链或双链供体多核苷酸(所述突出端与相应的被所述引入的talen在基因组插入位点处切割的基因组dna的多核苷酸突出端互补)，来将多核苷酸插入所述msc的基因组中的方法。所述互补的突出端促进所述供体多核苷酸与所述切割的基因组dna的同源重组，从而使得将所述供体多核苷酸引入到所述msc的基因组中。

在一些实施方案中，提供了通过向msc中引入第一talen(所述第一talen具有特异性针对具有seqidno:1所示序列的dna序列的dna结合结构域，所述dna结合结构域结合目的基因组序列的上游)和第二talen(所述第二talen具有特异性针对具有seqidno:3所示序列的dna序列的dna结合结构域，所述dna结合结构域结合目的基因组序列的下游)，以及具有正义链多核苷酸突出端和/或反义链多核苷酸突出端的单链或双链供体多核苷酸(所述突出端与相应的被所述引入的talen在基因组插入位点处切割的基因组dna的多核苷酸突出端互补)，来将多核苷酸插入所述msc的基因组中的方法。所述互补的突出端促进所述供体多核苷酸与所述切割的基因组dna的同源重组，从而使得将所述供体多核苷酸引入到所述msc的基因组中。

将多核苷酸插入msc的基因组中的方法的一个实施方案包括向所述msc引入第一talen(所述第一talen具有seqidno:7所示的序列并且具有特异性针对目的基因组序列上游的dna序列的dna结合结构域)和第二talen(所述第二talen具有特异性针对目的基因组序列下游的dna序列的dna结合结构域)，以及具有正义链多核苷酸突出端和/或反义链多核苷酸突出端的单链或双链供体多核苷酸(所述突出端与相应的被所述引入的talen在基因组插入位点处切割的基因组dna的多核苷酸突出端互补)。所述互补的突出端促进所述供体多核苷酸与所述切割的基因组dna的同源重组，从而使得将所述供体多核苷酸引入到所述msc的基因组中。在另外的实施方案中，并入了seqidno：7所示多肽的talen还可以包括衍生自foki的核酸酶。在具体的实施方案中，并入了seqidno：7所示多肽的talen还可以包括核酸酶，所述核酸酶衍生自具有seqidno：13所示序列的foki。

将多核苷酸插入msc的基因组中的方法的一个实施方案包括向所述msc引入第一talen(所述第一talen具有特异性针对目的基因组序列上游的dna序列的dna结合结构域)和第二talen(所述第二talen具有seqidno:10所示的序列并且具有特异性针对目的基因组序列下游的dna序列的dna结合结构域)，以及具有正义链多核苷酸突出端和/或反义链多核苷酸突出端的单链或双链供体多核苷酸(所述突出端与相应的被所述引入的talen在基因组插入位点处切割的基因组dna的多核苷酸突出端互补)。所述互补的突出端促进所述供体多核苷酸与所述切割的基因组dna的同源重组，从而使得将所述供体多核苷酸引入到所述msc的基因组中。在另外的实施方案中，并入了seqidno：10所示多肽的talen还可以包括衍生自foki的核酸酶。在具体的实施方案中，并入了seqidno：10所示多肽的talen还可以包括核酸酶，所述核酸酶衍生自具有seqidno：13所示序列的foki。

将多核苷酸插入msc的基因组中的方法的一个实施方案包括向所述msc引入第一talen(所述第一talen具有具有seqidno:7所示的序列并且具有特异性针对目的基因组序列上游的dna序列的dna结合结构域)和第二talen(所述第二talen具有seqidno:10所示的序列并且具有特异性针对目的基因组序列下游的dna序列的dna结合结构域)，以及具有正义链多核苷酸突出端和/或反义链多核苷酸突出端的单链或双链供体多核苷酸(所述突出端与相应的被所述引入的talen在基因组插入位点处切割的基因组dna的多核苷酸突出端互补)。所述互补的突出端促进所述供体多核苷酸与所述切割的基因组dna的同源重组，从而使得将所述供体多核苷酸引入到所述msc的基因组中。在另外的实施方案中，并入了seqidno：7所示多肽的talen还可以包括衍生自foki的核酸酶并且并入了seqidno：10所示多肽的talen还可以包括衍生自foki的核酸酶。在具体的实施方案中，并入了seqidno：7所示多肽的talen还可以包括核酸酶，所述核酸酶衍生自具有seqidno：13所示序列的foki，并且并入了seqidno：10所示多肽的talen还可以包括核酸酶，所述核酸酶衍生自具有seqidno：13所示序列的foki。

将多核苷酸插入msc的基因组中的方法的一个实施方案包括向所述msc引入第一talen(所述第一talen具有seqidno:8所示的序列并且具有特异性针对目的基因组序列上游的dna序列的dna结合结构域)和第二talen(所述第二talen具有特异性针对目的基因组序列下游的dna序列的dna结合结构域)，以及具有正义链多核苷酸突出端和/或反义链多核苷酸突出端的单链或双链供体多核苷酸(所述突出端与相应的被所述引入的talen在基因组插入位点处切割的基因组dna的多核苷酸突出端互补)。所述互补的突出端促进所述供体多核苷酸与所述切割的基因组dna的同源重组，从而使得将所述供体多核苷酸引入到所述msc的基因组中。

将多核苷酸插入msc的基因组中的方法的一个实施方案包括向所述msc引入第一talen(所述第一talen具有特异性针对目的基因组序列上游的dna序列的dna结合结构域)和第二talen(所述第二talen具有seqidno:11所示的序列并且具有特异性针对目的基因组序列下游的dna序列的dna结合结构域)，以及具有正义链多核苷酸突出端和/或反义链多核苷酸突出端的单链或双链供体多核苷酸(所述突出端与相应的被所述引入的talen在基因组插入位点处切割的基因组dna的多核苷酸突出端互补)。所述互补的突出端促进所述供体多核苷酸与所述切割的基因组dna的同源重组，从而使得将所述供体多核苷酸引入到所述msc的基因组中。

将多核苷酸插入msc的基因组中的方法的一个实施方案包括向所述msc引入第一talen(所述第一talen具有seqidno:8所示的序列并且具有特异性针对目的基因组序列上游的dna序列的dna结合结构域)和第二talen(所述第二talen具有seqidno:11所示的序列并且具有特异性针对目的基因组序列下游的dna序列的dna结合结构域)，以及具有正义链多核苷酸突出端和/或反义链多核苷酸突出端的单链或双链供体多核苷酸(所述突出端与相应的被所述引入的talen在基因组插入位点处切割的基因组dna的多核苷酸突出端互补)。所述互补的突出端促进所述供体多核苷酸与所述切割的基因组dna的同源重组，从而使得将所述供体多核苷酸引入到所述msc的基因组中。

在一些实施方案中，将多核苷酸插入msc的基因组中的方法包括向所述msc引入第一talen(所述第一talen具有特异性针对人第13号染色体内的dna序列的dna结合结构域，所述dna结合结构域结合目的基因组序列的上游dna的正义链)和第二talen(所述第二talen具有特异性针对人第13号染色体内的dna序列的dna结合结构域，所述dna结合结构域结合目的基因组序列的下游dna的反义链)，以及具有正义链多核苷酸突出端和/或反义链多核苷酸突出端的单链或双链供体多核苷酸(所述突出端与相应的被所述引入的talen在基因组插入位点处切割的基因组dna的多核苷酸突出端互补)。所述互补的突出端促进所述供体多核苷酸与所述切割的基因组dna的同源重组，从而使得将所述供体多核苷酸引入到所述msc的基因组中。

在其他实施方案中，提供了用于将多核苷酸插入msc的基因组中的方法，所述方法包括向所述msc引入第一talen(所述第一talen具有特异性针对所述aavs1或cybl安全港基因座内的dna序列的dna结合结构域，所述dna结合结构域结合目的基因组序列的上游dna的正义链)和第二talen(所述第二talen具有特异性针对所述aavs1或cybl安全港基因座内的dna序列的dna结合结构域，所述dna结合结构域结合目的基因组序列的下游dna的反义链)，以及具有正义链多核苷酸突出端和/或反义链多核苷酸突出端的单链或双链供体多核苷酸(所述突出端与相应的被所述引入的talen在基因组插入位点处切割的基因组dna的多核苷酸突出端互补)。所述互补的突出端促进所述供体多核苷酸与所述切割的基因组dna的同源重组，从而使得将所述供体多核苷酸引入到所述msc的基因组中。

所述将多核苷酸插入msc的基因组中的方法的一个实施方案涉及向所述msc引入第一talen(所述第一talen具有dna结合结构域，所述dna结合结构域特异性针对所述aavs1或cybl安全港基因座内的dna序列，并且所述dna结合结构域结合目的基因组序列的上游dna的正义链)和第二talen(所述第二talen具有dna结合结构域，所述dna结合结构域特异性针对所述aavs1安全港基因座的内含子1或所述cybl安全港基因座的内含子2内的dna序列，并且所述dna结合结构域结合所述目的基因组序列的下游dna的反义链)，以及具有正义链多核苷酸突出端和/或反义链多核苷酸突出端的单链或双链供体多核苷酸(所述突出端与相应的被所述引入的talen在基因组插入位点处切割的基因组dna的多核苷酸突出端互补)。所述互补的突出端促进所述供体多核苷酸与所述切割的基因组dna的同源重组，从而使得将所述供体多核苷酸引入到所述msc的基因组中。

在另外的实施方案中，提供了用于将多核苷酸插入msc的基因组中的方法，所述方法包括向所述msc引入第一talen(所述第一talen具有特异性针对seqidno:19所示序列内的dna序列的dna结合结构域，所述dna结合结构域结合目的基因组序列的上游dna的正义链)和第二talen(所述第二talen具有特异性针对seqidno:19所示序列内的dna序列的dna结合结构域，所述dna结合结构域结合目的基因组序列的下游dna的反义链)，以及具有正义链多核苷酸突出端和/或反义链多核苷酸突出端的单链或双链供体多核苷酸(所述突出端与相应的被所述引入的talen在基因组插入位点处切割的基因组dna的多核苷酸突出端互补)。所述互补的突出端促进所述供体多核苷酸与所述切割的基因组dna的同源重组，从而使得将所述供体多核苷酸引入到所述msc的基因组中。

在另外的实施方案中，提供了用于将多核苷酸插入msc的基因组中的方法，所述方法包括向所述msc引入第一talen(所述第一talen具有特异性针对具有seqidno:1所示序列的dna序列的dna结合结构域，所述dna结合结构域结合目的基因组序列的上游dna的正义链)和第二talen(所述第二talen具有特异性针对具有seqidno:3所示序列的dna序列的dna结合结构域，所述dna结合结构域结合目的基因组序列的下游dna的反义链)，以及具有正义链多核苷酸突出端和/或反义链多核苷酸突出端的单链或双链供体多核苷酸(所述突出端与相应的被所述引入的talen在基因组插入位点处切割的基因组dna的多核苷酸突出端互补)。所述互补的突出端促进所述供体多核苷酸与所述切割的基因组dna的同源重组，从而使得将所述供体多核苷酸引入到所述msc的基因组中。

所述将多核苷酸插入msc的基因组中的方法的一个实施方案包括向所述msc引入第一talen(所述第一talen具有seqidno:7所示的序列，并且具有特异性针对目的基因组序列的上游dna的dna结合结构域)和第二talen(所述第二talen具有dna结合结构域，所述dna结合结构域特异性针对目的基因组序列的下游dna的反义链上的dna序列)，以及具有正义链多核苷酸突出端和/或反义链多核苷酸突出端的单链或双链供体多核苷酸(所述突出端与相应的被所述引入的talen在基因组插入位点处切割的基因组dna的多核苷酸突出端互补)。所述互补的突出端促进所述供体多核苷酸与所述切割的基因组dna的同源重组，从而使得将所述供体多核苷酸引入到所述msc的基因组中。在另外的实施方案中，并入了seqidno：7所示多肽的talen还可以包括衍生自foki的核酸酶。在具体的实施方案中，并入了seqidno：7所示多肽的talen还可以包括核酸酶，所述核酸酶衍生自具有seqidno：13所示序列的foki。

所述将多核苷酸插入msc的基因组中的方法的一个实施方案包括向所述msc引入具有dna结合结构域的第一talen(所述dna结合结构域特异性针对目的基因组序列的上游dna的正义链上的dna序列)和第二talen(所述第二talen具有seqidno:10所示的序列，并且具有dna结合结构域，所述dna结合结构域特异性针对目的基因组序列的下游dna的反义链上的dna序列)，以及具有正义链多核苷酸突出端和/或反义链多核苷酸突出端的单链或双链供体多核苷酸(所述突出端与相应的被所述引入的talen在基因组插入位点处切割的基因组dna的多核苷酸突出端互补)。所述互补的突出端促进所述供体多核苷酸与所述切割的基因组dna的同源重组，从而使得将所述供体多核苷酸引入到所述msc的基因组中。在另外的实施方案中，并入了seqidno：10所示多肽的talen还可以包括衍生自foki的核酸酶。在具体的实施方案中，并入了seqidno：10所示多肽的talen还可以包括核酸酶，所述核酸酶衍生自具有seqidno：13所示序列的foki。

所述将多核苷酸插入msc的基因组中的方法的一个实施方案包括向所述msc引入第一talen(所述第一talen具有seqidno:7所示的序列，并且具有dna结合结构域，所述dna结合结构域特异性针对目的基因组序列的上游dna的正义链上的dna序列)和第二talen(所述第二talen具有seqidno:10所示的序列，并且具有dna结合结构域，所述dna结合结构域特异性针对目的基因组序列的下游dna的反义链上的dna序列)，以及具有正义链多核苷酸突出端和/或反义链多核苷酸突出端的单链或双链供体多核苷酸(所述突出端与相应的被所述引入的talen在基因组插入位点处切割的基因组dna的多核苷酸突出端互补)。所述互补的突出端促进所述供体多核苷酸与所述切割的基因组dna的同源重组，从而使得将所述供体多核苷酸引入到所述msc的基因组中。在另外的实施方案中，并入了seqidno：7所示多肽的talen还可以包括衍生自foki的核酸酶并且并入了seqidno：10所示多肽的talen还可以包括衍生自foki的核酸酶。在具体的实施方案中，并入了seqidno：7所示多肽的talen还可以包括核酸酶，所述核酸酶衍生自具有seqidno：13所示序列的foki，以及并入了seqidno：10所示多肽的talen还可以包括核酸酶，所述核酸酶衍生自具有seqidno：13所示序列的foki。

所述将多核苷酸插入msc的基因组中的方法的一个实施方案包括向所述msc引入第一talen(所述第一talen具有seqidno:8所示的序列，并且具有dna结合结构域，所述dna结合结构域特异性针对目的基因组序列的上游dna的正义链上的dna序列)和第二talen(所述第二talen具有dna结合结构域，所述dna结合结构域特异性针对目的基因组序列的下游dna的反义链上的dna序列)，以及具有正义链多核苷酸突出端和/或反义链多核苷酸突出端的单链或双链供体多核苷酸(所述突出端与相应的被所述引入的talen在基因组插入位点处切割的基因组dna的多核苷酸突出端互补)。所述互补的突出端促进所述供体多核苷酸与所述切割的基因组dna的同源重组，从而使得将所述供体多核苷酸引入到所述msc的基因组中。

所述将多核苷酸插入msc的基因组中的方法的一个实施方案包括向所述msc引入第一talen(所述第一talen具有dna结合结构域，所述dna结合结构域特异性针对目的基因组序列的上游dna的正义链上的dna序列)和第二talen(所述第二talen具有seqidno:11所示的序列，并且具有dna结合结构域，所述dna结合结构域特异性针对目的基因组序列的下游dna的反义链上的dna序列)，以及具有正义链多核苷酸突出端和/或反义链多核苷酸突出端的单链或双链供体多核苷酸(所述突出端与相应的被所述引入的talen在基因组插入位点处切割的基因组dna的多核苷酸突出端互补)。所述互补的突出端促进所述供体多核苷酸与所述切割的基因组dna的同源重组，从而使得将所述供体多核苷酸引入到所述msc的基因组中。

所述将多核苷酸插入msc的基因组中的方法的一个实施方案包括向所述msc引入第一talen(所述第一talen具有seqidno:8所示的序列，并且具有dna结合结构域，所述dna结合结构域特异性针对目的基因组序列的上游dna的正义链上的dna序列)和第二talen(所述第二talen具有seqidno:11所示的序列，并且具有dna结合结构域，所述dna结合结构域特异性针对目的基因组序列的下游dna的反义链上的dna序列)，以及具有正义链多核苷酸突出端和/或反义链多核苷酸突出端的单链或双链供体多核苷酸(所述突出端与相应的被所述引入的talen在基因组插入位点处切割的基因组dna的多核苷酸突出端互补)。所述互补的突出端促进所述供体多核苷酸与所述切割的基因组dna的同源重组，从而使得将所述供体多核苷酸引入到所述msc的基因组中。

根据在本节中描述的将多核苷酸插入到msc基因组中的方法，应当理解，可以根据需要或期望实施这些方法所广泛应用的其它方面。在一个实施方案中，可以实施所述方法，使得在所述同一条染色体的两个拷贝中引起多核苷酸切除。

在一些实施方案中，将第一多肽或talen引入msc的步骤涉及用编码所述多肽或talen的多核苷酸转染所述msc。在一些实施方案中，将第二多肽或talen引入msc的步骤涉及用编码所述多肽或talen的多核苷酸转染所述msc。在一些实施方案中，可以使用单个载体，用编码上游talen的多核苷酸和编码所述下游talen的核酸来转染msc。

msc的分化

提供了用于诱导msc分化成选定的成熟细胞和/或组织的方法，包括但不限于脂肪细胞，软骨、骨、肌腱、肌肉和皮肤，以及肌细胞、神经元和胶质细胞。

在一些实施方案中，所述方法包括表达试剂，所述试剂用于诱导所述msc增殖和/或分化成选定的成熟细胞和/或组织。所述试剂可以是营养剂或生长因子。所述试剂或生长因子可以由目的多核苷酸编码。

在具体的非限制性实例中，所述试剂是神经生长因子，神经生长因子，胰岛素，成纤维细胞生长因子，胶质细胞衍生的神经营养因子，notch配体，delta，脑源性神经营养因子，胶质细胞衍生的神经营养因子，骨形态发生蛋白-2或4(bmp-2/4)，睫状神经营养因子(cntf)，heregulin1-1β，血小板衍生生长因子(pdgf)-1或pdgf-b。在其他实施方案中，所述供体多核苷酸还编码可选择的标志物和/或可检测标记。合适的可检测标记包括，但不限于，酶(例如辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶)和荧光蛋白(例如绿色荧光蛋白)。

所述供体多核苷酸可以包括以可操作的方式连接异源性核酸(例如编码目的试剂和/或可选择标志物和/或可检测标记的核酸)的启动子。所述启动子可以是组成型或诱导型。所述启动子可以是谱系特异性启动子，例如适用于在脂肪细胞、软骨、骨、肌腱、肌肉和/或皮肤以及肌细胞、神经元和胶质细胞中表达的启动子。在具体的非限制性实例中，所述启动子是双皮质素(doublecourtin)或gfap启动子。

用于将dna引入msc的方法包括化学方法和物理方法。化学方法包括基于脂质体的基因转导或脂质转染，磷酸钙介导的基因转导，deae-葡聚糖转染技术和聚乙烯亚胺(pei)介导的递送。物理方法包括弹道基因转导，显微注射和核转染(amaxabiosystem，2004)。在一些实施方案中，使用核转染来将本文公开的多核苷酸引入msc中。在具体的非限制性实例中，所述核转染涉及使用核转染素d装置。在一些实施方案中，所述核转染提供至少约60％，至少约65％，至少约70％，至少约75％，至少约80％，至少约85％，至少约90％，或者至少约95％的转染效率。在具体的非限制性实例中，所述转染效率为至少约80％，例如至少约85％，至少约90％，或至少约95％，约96％，约97％，约98％，或约99％。

所述方法可以包括使所述间充质干细胞与约1:1:1比例的所述上游talen，所述下游talen和所述目的多核苷酸接触。在另外的实施方案中，使用约1:2:1或2:1:1或1:1:2的比例。在其他实施方案中，使用1:3:1或3:1:1或1:1.3的比例。在其它实施方案中，使用1:4:1或4:1:1或1:4:1的比例。在另外的实施方案中，使用1:5:1或5:1:1或1:1:5的比例。

在一些实施方案中，这些方法包括将以下引入到所述间充质干细胞中：(a)上游的转录激活子样效应因子核酸酶(talen)，其包括与dna切割结构域连接的上游dna结合结构域，其中所述上游dna结合结构域特异性结合所述间充质干细胞基因组中在基因组插入位点的上游位点处的安全港基因座，(b)下游的转录激活子样效应因子核酸酶(talen)，其包括与dna切割结构域连接的下游dna结合结构域，其中所述下游dna结合结构域特异性地结合所述间充质干细胞基因组中在基因组插入位点的下游位点处的安全港基因座，和(c)单链或双链供体多核苷酸，其包括正义链多核苷酸突出端和/或反义链多核苷酸突出端，当在所述基因组插入位点处切割时，其与相应的被切割的基因组dna的多核苷酸突出端互补。所述互补的突出端促进所述供体多核苷酸与所述切割的基因组dna的同源重组，从而使得将所述供体多核苷酸引入到所述msc的基因组中。在一些实施方案中，所述上游talen与位于所述插入位点侧翼的基因组dna基因座的正义链结合，并且所述下游talen与位于所述插入位点侧翼的基因组dna基因座的反义链结合。在另外的实施方案中，所述供体多核苷酸编码足以使所述msc分化成选定的成熟细胞和/或组织(包括，但不限于，脂肪细胞、软骨、骨、肌腱、肌肉和皮肤，以及肌细胞、神经元和胶质细胞)的一种或多种试剂。

所述互补的突出端促进所述供体多核苷酸与所述切割的基因组dna的同源重组，

从而使得将所述多核苷酸引入到所述msc的基因组中。这些方法使得将所述供体多核

苷酸引入到所述msc基因组中的安全港基因座的基因组插入位点上。在一些实施方案中，所述上游talen与位于所述插入位点侧翼的基因组dna基因座的正义链结合，并且所述下游talen与位于所述插入位点侧翼的基因组dna基因座的反义链结合。在一些实施方案中，所述供体多核苷酸编码足以使所述msc分化成选定的成熟细胞和/或组织(包括，但不限于，脂肪细胞、软骨、骨、肌腱、肌肉和皮肤，以及肌细胞、神经元和胶质细胞)的一种或多种试剂。

在一些实施方案中，所述上游talen包括seqidno：8。在另外的实施方案中，所述下游talen包括seqidno：11。在另外的实施方案中，所述dna切割结构域包括foki核酸酶结构域，例如，但不限于，seqidno：13。在一些实施方案中，与所述上游talen结合的基因组正义链基因座包括seqidno：1。在其他实施方案中，与所述下游talen结合的基因组反义链基因座包括seqidno：3。在另外的实施方案中，将所述供体多核苷酸插入所述同一染色体的两个拷贝中。在一些实施方案中，将所述多核苷酸插入到所述同一染色体的所述两个拷贝中。在一些实施方案中，所述供体多核苷酸编码足以使所述msc分化成选定的成熟细胞和/或组织(包括，但不限于，脂肪细胞、软骨、骨、肌腱、肌肉和皮肤，以及肌细胞、神经元和胶质细胞)的一种或多种因子。

使msc分化的方法的另一个实施方案包括向所述msc引入第一talen(所述第一talen具有seqidno:7所示的序列，并且具有特异性针对目的基因组序列上游的dna序列的dna结合结构域)和第二talen(所述第二talen具有seqidno:10所示的序列，并且具有特异性针对所述目的基因组序列下游的dna序列的dna结合结构域)，由此所述talen切割所述基因组dna并切除所述目的基因组序列，进而修饰所述msc的所述基因组dna。在另一个实施方案中，并入了seqidno：7所示多肽的talen还可以包括衍生自foki的核酸酶并且并入了seqidno：10所示多肽的talen还可以包括衍生自foki的核酸酶。在具体的实施方案中，并入了seqidno：7所示多肽的talen还可以包括核酸酶，所述核酸酶衍生自具有seqidno：13所示序列的foki，并且并入了seqidno：10所示多肽的talen还可以包括核酸酶，所述核酸酶衍生自具有seqidno：13所示序列的foki。在一些实施方案中，所述供体多核苷酸编码足以使所述msc分化成选定的成熟细胞和/或组织(包括，但不限于，脂肪细胞、软骨、骨、肌腱、肌肉和皮肤，以及肌细胞、神经元和胶质细胞)的一种或多种试剂。

在一些实施方案中，使msc分化的方法包括向所述msc引入第一talen(所述第一talen具有特异性针对具有seqidno:1所示序列的dna序列的dna结合结构域，所述dna结合结构域结合目的基因组序列的上游)和第二talen(所述第二talen具有特异性针对具有seqidno:3所示序列的dna序列的dna结合结构域，所述dna结合结构域结合所述目的基因组序列的下游)，以及具有正义链多核苷酸突出端和/或反义链多核苷酸突出端的单链或双链供体多核苷酸，所述突出端与相应的被所述引入的talen在基因组插入位点处切割的基因组dna的多核苷酸突出端互补。所述互补的突出端促进所述供体多核苷酸与所述切割的基因组dna的同源重组，从而使得将所述供体多核苷酸引入到所述msc的基因组中。所述供体多核苷酸编码一种或多种试剂，其中所述一种或多种试剂的表达足以使所述msc分化成选定的成熟细胞和/或组织，包括，但不限于，脂肪细胞、软骨、骨、肌腱、肌肉和皮肤，以及肌细胞、神经元和胶质细胞。

使msc分化的方法的一个实施方案包括向所述msc引入第一talen(所述第一talen具有seqidno:7所示的序列，并且具有特异性针对目的基因组序列上游的dna序列的dna结合结构域)和第二talen(所述第二talen具有特异性针对所述目的基因组序列下游的dna序列的dna结合结构域)，以及具有正义链多核苷酸突出端和/或反义链多核苷酸突出端的单链或双链供体多核苷酸，所述突出端与相应的被所述引入的talen在基因组插入位点处切割的基因组dna的多核苷酸突出端互补。所述互补的突出端促进所述供体多核苷酸与所述切割的基因组dna的同源重组，从而使得将所述供体多核苷酸引入到所述msc的基因组中。在另外的实施方案中，并入了seqidno：7所示多肽的talen还可以包括衍生自foki的核酸酶。在具体的实施方案中，并入了seqidno：7所示多肽的talen还可以包括核酸酶，所述核酸酶衍生自具有seqidno：13所示序列的foki。所述供体多核苷酸编码一种或多种试剂，其中所述一种或多种试剂的表达足以使所述msc分化成选定的成熟细胞和/或组织，包括，但不限于，脂肪细胞、软骨、骨、肌腱、肌肉和皮肤，以及肌细胞、神经元和胶质细胞。

使msc分化的方法的一个实施方案包括向所述msc引入第一talen(所述第一talen具有seqidno:10所示的序列，并且具有特异性针对目的基因组序列上游的dna序列的dna结合结构域)和第二talen(所述第二talen具有特异性针对所述目的基因组序列下游的dna序列的dna结合结构域)，以及具有正义链多核苷酸突出端和/或反义链多核苷酸突出端的单链或双链供体多核苷酸，所述突出端与相应的被所述引入的talen在基因组插入位点处切割的基因组dna的多核苷酸突出端互补。所述互补的突出端促进所述供体多核苷酸与所述切割的基因组dna的同源重组，从而使得将所述供体多核苷酸引入到所述msc的基因组中。在另外的实施方案中，并入了seqidno：10所示多肽的talen还可以包括衍生自foki的核酸酶。在具体的实施方案中，并入了seqidno：10所示多肽的talen还可以包括核酸酶，所述核酸酶衍生自具有seqidno：13所示序列的foki。所述供体多核苷酸编码一种或多种试剂，其中所述一种或多种试剂的表达足以使所述msc分化成选定的成熟细胞和/或组织，包括，但不限于，脂肪细胞、软骨、骨、肌腱、肌肉和皮肤，以及肌细胞、神经元和胶质细胞。

使msc分化的方法的一个实施方案包括向所述msc引入第一talen(所述第一talen具有seqidno:7所示的序列，并且具有特异性针对目的基因组序列上游的dna序列的dna结合结构域)和第二talen(所述第二talen具有seqidno:10所示的序列，并且具有特异性针对所述目的基因组序列下游的dna序列的dna结合结构域)，以及具有正义链多核苷酸突出端和/或反义链多核苷酸突出端的单链或双链供体多核苷酸，所述突出端与相应的被所述引入的talen在基因组插入位点处切割的基因组dna的多核苷酸突出端互补。所述互补的突出端促进所述供体多核苷酸与所述切割的基因组dna的同源重组，从而使得将所述供体多核苷酸引入到所述msc的基因组中。在另外的实施方案中，并入了seqidno：7所示多肽的talen还可以包括衍生自foki的核酸酶并且并入了seqidno：10所示多肽的talen还可以包括衍生自foki的核酸酶。在具体的实施方案中，并入了seqidno：7所示多肽的talen还可以包括核酸酶，所述核酸酶衍生自具有seqidno：13所示序列的foki，并且并入了seqidno：10所示多肽的talen还可以包括核酸酶，所述核酸酶衍生自具有seqidno：13所示序列的foki。所述供体多核苷酸编码一种或多种试剂，其中所述一种或多种试剂的表达足以使所述msc分化成选定的成熟细胞和/或组织，包括，但不限于，脂肪细胞、软骨、骨、肌腱、肌肉和皮肤，以及肌细胞、神经元和胶质细胞。

使msc分化的方法的一个实施方案包括向所述msc引入第一talen(所述第一talen具有seqidno:8所示的序列，并且具有特异性针对目的基因组序列上游的dna序列的dna结合结构域)和第二talen(所述第二talen具有特异性针对所述目的基因组序列下游的dna序列的dna结合结构域)，以及具有正义链多核苷酸突出端和/或反义链多核苷酸突出端的单链或双链供体多核苷酸，所述突出端与相应的被所述引入的talen在基因组插入位点处切割的基因组dna的多核苷酸突出端互补。所述互补的突出端促进所述供体多核苷酸与所述切割的基因组dna的同源重组，从而使得将所述供体多核苷酸引入到所述msc的基因组中。所述供体多核苷酸编码一种或多种试剂，其中所述一种或多种试剂的表达足以使所述msc分化成选定的成熟细胞和/或组织，包括，但不限于，脂肪细胞、软骨、骨、肌腱、肌肉和皮肤，以及肌细胞、神经元和胶质细胞。

使msc分化的方法的一个实施方案包括向所述msc引入第一talen(所述第一talen具有特异性针对目的基因组序列上游的dna序列的dna结合结构域)和第二talen(所述第二talen具有seqidno:11所示的序列，并且具有特异性针对所述目的基因组序列下游的dna序列的dna结合结构域)，以及具有正义链多核苷酸突出端和/或反义链多核苷酸突出端的单链或双链供体多核苷酸，所述突出端与相应的被所述引入的talen在基因组插入位点处切割的基因组dna的多核苷酸突出端互补。所述互补的突出端促进所述供体多核苷酸与所述切割的基因组dna的同源重组，从而使得将所述供体多核苷酸引入到所述msc的基因组中。所述供体多核苷酸编码一种或多种试剂，其中所述一种或多种试剂的表达足以使所述msc分化成选定的成熟细胞和/或组织，包括，但不限于，脂肪细胞、软骨、骨、肌腱、肌肉和皮肤，以及肌细胞、神经元和胶质细胞。

使msc分化的方法的一个实施方案包括向所述msc引入第一talen(所述第一talen具有seqidno:8所示的序列，并且具有特异性针对目的基因组序列上游的dna序列的dna结合结构域)和第二talen(所述第二talen具有seqidno:11所示的序列，并且具有特异性针对所述目的基因组序列下游的dna序列的dna结合结构域)，以及具有正义链多核苷酸突出端和/或反义链多核苷酸突出端的单链或双链供体多核苷酸，所述突出端与相应的被所述引入的talen在基因组插入位点处切割的基因组dna的多核苷酸突出端互补。所述互补的突出端促进所述供体多核苷酸与所述切割的基因组dna的同源重组，从而使得将所述供体多核苷酸引入到所述msc的基因组中。所述供体多核苷酸编码一种或多种试剂，其中所述一种或多种试剂的表达足以使所述msc分化成选定的成熟细胞和/或组织，包括，但不限于，脂肪细胞、软骨、骨、肌腱、肌肉和皮肤，以及肌细胞、神经元和胶质细胞。

在一些实施方案中，提供了使msc分化的方法，所述方法包括向所述msc引入第一talen(所述第一talen具有特异性针对人第13号染色体内的dna序列的dna结合结构域，所述dna结合结构域结合目的基因组序列的上游dna的正义链)和第二talen(所述第二talen具有特异性针对人第13号染色体内的dna序列的dna结合结构域，所述dna结合结构域结合所述目的基因组序列的下游dna的反义链)，以及具有正义链多核苷酸突出端和/或反义链多核苷酸突出端的单链或双链供体多核苷酸，所述突出端与相应的被所述引入的talen在基因组插入位点处切割的基因组dna的多核苷酸突出端互补。所述互补的突出端促进所述供体多核苷酸与所述切割的基因组dna的同源重组，从而使得将所述供体多核苷酸引入到所述msc的基因组中。所述供体多核苷酸编码一种或多种试剂，其中所述一种或多种试剂的表达足以使所述msc分化成选定的成熟细胞和/或组织，包括，但不限于，脂肪细胞、软骨、骨、肌腱、肌肉和皮肤，以及肌细胞、神经元和胶质细胞。

在一些实施方案中，提供了使msc分化的方法，所述方法包括向所述msc引入第一talen(所述第一talen具有特异性针对所述aavs1或cybl安全港基因座内的dna序列的dna结合结构域，所述dna结合结构域结合目的基因组序列的上游dna的正义链)和第二talen(所述第二talen具有特异性针对所述aavs1或cybl安全港基因座内的dna序列的dna结合结构域，所述dna结合结构域结合所述目的基因组序列的下游dna的反义链)，以及具有正义链多核苷酸突出端和/或反义链多核苷酸突出端的单链或双链供体多核苷酸，所述突出端与相应的被所述引入的talen在基因组插入位点处切割的基因组dna的多核苷酸突出端互补)。所述互补的突出端促进所述供体多核苷酸与所述切割的基因组dna的同源重组，从而使得将所述供体多核苷酸引入到所述msc的基因组中。所述供体多核苷酸编码一种或多种试剂，其中所述一种或多种试剂的表达足以使所述msc分化成选定的成熟细胞和/或组织，包括，但不限于，脂肪细胞、软骨、骨、肌腱、肌肉和皮肤，以及肌细胞、神经元和胶质细胞。

使msc分化的方法的一个实施方案包括向所述msc引入第一talen(所述第一talen具有dna结合结构域，所述dna结合结构域特异性针对所述aavs1安全港基因座的内含子1或所述cybl安全港基因座的内含子2内的dna序列，并且所述dna结合结构域结合目的基因组序列的上游dna的正义链)和第二talen(所述第二talen具有dna结合结构域，所述dna结合结构域特异性针对所述aavs1安全港基因座的内含子1或所述cybl安全港基因座的内含子2内的dna序列，并且所述dna结合结构域结合所述目的基因组序列的下游dna的反义链)，以及具有正义链多核苷酸突出端和/或反义链多核苷酸突出端的单链或双链供体多核苷酸，所述突出端与相应的被所述引入的talen在基因组插入位点处切割的基因组dna的多核苷酸突出端互补。所述互补的突出端促进所述供体多核苷酸与所述切割的基因组dna的同源重组，从而使得将所述供体多核苷酸引入到所述msc的基因组中。所述供体多核苷酸编码一种或多种试剂，其中所述一种或多种试剂的表达足以使所述msc分化成选定的成熟细胞和/或组织，包括，但不限于，脂肪细胞、软骨、骨、肌腱、肌肉和皮肤，以及肌细胞、神经元和胶质细胞。

另一个应用是使msc分化的方法，所述方法包括向所述msc引入第一talen(所述第一talen具有特异性针对seqidno:19所示序列内的dna序列的dna结合结构域，所述dna结合结构域结合目的基因组序列的上游dna的正义链)和第二talen(所述第二talen具有特异性针对seqidno:19所示序列内的dna序列的dna结合结构域，所述dna结合结构域结合所述目的基因组序列的下游dna的反义链)，以及具有正义链多核苷酸突出端和/或反义链多核苷酸突出端的单链或双链供体多核苷酸，所述突出端与相应的被所述引入的talen在基因组插入位点处切割的基因组dna的多核苷酸突出端互补。所述互补的突出端促进所述供体多核苷酸与所述切割的基因组dna的同源重组，从而使得将所述供体多核苷酸引入到所述msc的基因组中。所述供体多核苷酸编码一种或多种试剂，其中所述一种或多种试剂的表达足以使所述msc分化成选定的成熟细胞和/或组织，包括，但不限于，脂肪细胞、软骨、骨、肌腱、肌肉和皮肤，以及肌细胞、神经元和胶质细胞。

另一个应用是使msc分化的方法，所述方法包括向所述msc引入第一talen(所述第一talen具有特异性针对具有seqidno:1所示序列的dna序列的dna结合结构域，所述dna结合结构域结合目的基因组序列的上游dna的正义链)和第二talen(所述第二talen具有特异性针对具有seqidno:3所示序列的dna序列的dna结合结构域，所述dna结合结构域结合所述目的基因组序列的下游dna的反义链)，以及具有正义链多核苷酸突出端和/或反义链多核苷酸突出端的单链或双链供体多核苷酸，所述突出端与相应的被所述引入的talen在基因组插入位点处切割的基因组dna的多核苷酸突出端互补。所述互补的突出端促进所述供体多核苷酸与所述切割的基因组dna的同源重组，从而使得将所述供体多核苷酸引入到所述msc的基因组中。所述供体多核苷酸编码一种或多种试剂，其中所述一种或多种试剂的表达足以使所述msc分化成选定的成熟细胞和/或组织，包括，但不限于，脂肪细胞、软骨、骨、肌腱、肌肉和皮肤，以及肌细胞、神经元和胶质细胞。

使msc分化的方法的一个实施方案包括向所述msc引入第一talen(所述第一talen具有seqidno:7所示的序列，并且具有dna结合结构域，所述dna结合结构域特异性针对目的基因组序列的上游dna的正义链上的dna序列)和第二talen(所述第二talen具有dna结合结构域，所述dna结合结构域特异性针对所述目的基因组序列的下游dna的反义链上的dna序列)，以及具有正义链多核苷酸突出端和/或反义链多核苷酸突出端的单链或双链供体多核苷酸，所述突出端与相应的被所述引入的talen在基因组插入位点处切割的基因组dna的多核苷酸突出端互补。所述互补的突出端促进所述供体多核苷酸与所述切割的基因组dna的同源重组，从而使得将所述供体多核苷酸引入到所述msc的基因组中。在另外的实施方案中，并入了seqidno：7所示多肽的talen还可以包括衍生自foki的核酸酶。在具体的实施方案中，并入了seqidno：7所示多肽的talen还可以包括核酸酶，所述核酸酶衍生自具有seqidno：13所示序列的foki。所述供体多核苷酸编码一种或多种试剂，其中所述一种或多种试剂的表达足以使所述msc分化成选定的成熟细胞和/或组织，包括，但不限于，脂肪细胞、软骨、骨、肌腱、肌肉和皮肤，以及肌细胞、神经元和胶质细胞。

使msc分化的方法的一个实施方案包括向所述msc引入第一talen(所述第一talen具有dna结合结构域，所述dna结合结构域特异性针对目的基因组序列的上游dna的正义链上的dna序列)和第二talen(所述第二talen具有seqidno:10所示的序列，并且具有dna结合结构域，所述dna结合结构域特异性针对所述目的基因组序列的下游dna的反义链上的dna序列)，以及具有正义链多核苷酸突出端和/或反义链多核苷酸突出端的单链或双链供体多核苷酸，所述突出端与相应的被所述引入的talen在基因组插入位点处切割的基因组dna的多核苷酸突出端互补。所述互补的突出端促进所述供体多核苷酸与所述切割的基因组dna的同源重组，从而使得将所述供体多核苷酸引入到所述msc的基因组中。在另外的实施方案中，并入了seqidno：10所示多肽的talen还可以包括衍生自foki的核酸酶。在具体的实施方案中，并入了seqidno：10所示多肽的talen还可以包括核酸酶，所述核酸酶衍生自具有seqidno：13所示序列的foki。所述供体多核苷酸编码一种或多种试剂，其中所述一种或多种试剂的表达足以使所述msc分化成选定的成熟细胞和/或组织，包括，但不限于，脂肪细胞、软骨、骨、肌腱、肌肉和皮肤，以及肌细胞、神经元和胶质细胞。

使msc分化的方法的一个实施方案包括向所述msc引入第一talen(所述第一talen具有seqidno:7所示的序列，并且具有dna结合结构域，所述dna结合结构域特异性针对目的基因组序列的上游dna的正义链上的dna序列)和第二talen(所述第二talen具有seqidno:10所示的序列，并且具有dna结合结构域，所述dna结合结构域特异性针对所述目的基因组序列的下游dna的反义链上的dna序列)，以及具有正义链多核苷酸突出端和/或反义链多核苷酸突出端的单链或双链供体多核苷酸，所述突出端与相应的被所述引入的talen在基因组插入位点处切割的基因组dna的多核苷酸突出端互补。所述互补的突出端促进所述供体多核苷酸与所述切割的基因组dna的同源重组，从而使得将所述供体多核苷酸引入到所述msc的基因组中。在另外的实施方案中，并入了seqidno：7所示多肽的talen还可以包括衍生自foki的核酸酶并且并入了seqidno：10所示多肽的talen还可以包括衍生自foki的核酸酶。在具体的实施方案中，并入了seqidno：7所示多肽的talen还可以包括核酸酶，所述核酸酶衍生自具有seqidno：13所示序列的foki并且并入了seqidno：10所示多肽的talen还可以包括核酸酶，所述核酸酶衍生自具有seqidno：13所示序列的foki。所述供体多核苷酸编码一种或多种试剂，其中所述一种或多种试剂的表达足以使所述msc分化成选定的成熟细胞和/或组织，包括，但不限于，脂肪细胞、软骨、骨、肌腱、肌肉和皮肤，以及肌细胞、神经元和胶质细胞。

使msc分化的方法的一个实施方案包括向所述msc引入第一talen(所述第一talen具有seqidno:8所示的序列，并且具有dna结合结构域，所述dna结合结构域特异性针对目的基因组序列的上游dna的正义链上的dna序列)和第二talen(所述第二talen具有dna结合结构域，所述dna结合结构域特异性针对所述目的基因组序列的下游dna的反义链上的dna序列)，以及具有正义链多核苷酸突出端和/或反义链多核苷酸突出端的单链或双链供体多核苷酸，所述突出端与相应的被所述引入的talen在基因组插入位点处切割的基因组dna的多核苷酸突出端互补。所述互补的突出端促进所述供体多核苷酸与所述切割的基因组dna的同源重组，从而使得将所述供体多核苷酸引入到所述msc的基因组中。所述供体多核苷酸编码一种或多种试剂，其中所述一种或多种试剂的表达足以使所述msc分化成选定的成熟细胞和/或组织，包括，但不限于，脂肪细胞、软骨、骨、肌腱、肌肉和皮肤，以及肌细胞、神经元和胶质细胞。

使msc分化的方法的一个实施方案包括向所述msc引入第一talen(所述第一talen具有dna结合结构域，所述dna结合结构域特异性针对目的基因组序列的上游dna的正义链上的dna序列)和第二talen(所述第二talen具有seqidno:11所示的序列，并且具有dna结合结构域，所述dna结合结构域特异性针对所述目的基因组序列的下游dna的反义链上的dna序列)，以及具有正义链多核苷酸突出端和/或反义链多核苷酸突出端的单链或双链供体多核苷酸，所述突出端与相应的被所述引入的talen在基因组插入位点处切割的基因组dna的多核苷酸突出端互补。所述互补的突出端促进所述供体多核苷酸与所述切割的基因组dna的同源重组，从而使得将所述供体多核苷酸引入到所述msc的基因组中。所述供体多核苷酸编码一种或多种试剂，其中所述一种或多种试剂的表达足以使所述msc分化成选定的成熟细胞和/或组织，包括，但不限于，脂肪细胞、软骨、骨、肌腱、肌肉和皮肤，以及肌细胞、神经元和胶质细胞。

使msc分化的方法的一个实施方案包括向所述msc引入第一talen(所述第一talen具有seqidno:8所示的序列，并且具有dna结合结构域，所述dna结合结构域特异性针对目的基因组序列的上游dna的正义链上的dna序列)和第二talen(所述第二talen具有seqidno:11所示的序列，并且具有dna结合结构域，所述dna结合结构域特异性针对所述目的基因组序列的下游dna的反义链上的dna序列)，以及具有正义链多核苷酸突出端和/或反义链多核苷酸突出端的单链或双链供体多核苷酸，所述突出端与相应的被所述引入的talen在基因组插入位点处切割的基因组dna的多核苷酸突出端互补。所述互补的突出端促进所述供体多核苷酸与所述切割的基因组dna的同源重组，从而使得将所述供体多核苷酸引入到所述msc的基因组中。所述供体多核苷酸编码一种或多种试剂，其中所述一种或多种试剂的表达足以使所述msc分化成选定的成熟细胞和/或组织，包括，但不限于，脂肪细胞、软骨、骨、肌腱、肌肉和皮肤，以及肌细胞、神经元和胶质细胞。

根据在本节中描述的将多核苷酸插入到msc的基因组中的方法，应当理解，可以根据需要或期望实施这些方法所广泛应用的其它方面。在一个实施方案中，可以实施所述方法，以在所述同一染色体的两个拷贝中引起多核苷酸切除。在一个实施方案中，可以使用核转染多核苷酸或载体实施所述方法，所述多核苷酸或载体编码与这些方法一起使用的所述多肽或talen。在一些实施方案中，将第一多肽或talen引入msc的步骤涉及用编码所述多肽或talen的多核苷酸转染所述msc。在一些实施方案中，将第二多肽或talen引入msc的步骤涉及用编码所述多肽或talen的多核苷酸转染所述msc。在一些实施方案中，可以使用单个载体，用编码上游talen的多核苷酸和编码所述下游talen的核酸来转染msc。

根据在本节中描述的将多核苷酸插入到msc的基因组中的方法，应当理解，可以根据需要或期望实施这些方法所广泛应用的其它方面。在一个实施方案中，可以实施所述方法，以在所述同一染色体的两个拷贝中引起多核苷酸切除。

治疗的方法

本文所公开的方法能修饰msc的基因组和/或使所述msc分化。所述msc和从这些msc分化而来的细胞可用于治疗受试者。

在一些实施方案中，所公开的方法可用于产生msc和/或由这些msc产生的选定的分化的成熟细胞，以将所述细胞或者由这些细胞表达的分子递送给有需要的受试者。

在一个非限制性实施方案中，所述受试者可能患有疾病或病症，例如但不限于，炎性或免疫性疾病或病症、神经性疾病或病症、癌症或心血管疾病或病症。

在一个非限制性实施方案中，所述受试者可能患有与蛋白(如，例如溶酶体贮积病中的酶，例如可用于增强骨再生长和/或加速溃疡修复或肢体缺血的的生长因子，或者用于缓解与免疫性病症如类风湿性关节炎等相关的疼痛的细胞因子)缺乏相关的疾病或病症。

在另一个非限制性实施方案中，可以修饰所述msc的基因组以产生可用于治疗疾病或病症的抗体，其中所述疾病或病症有必要需要抗体治疗。

预期可用根据本发明而修饰的msc来治疗的疾病或病症的实例包括，但绝不限于，癌症、自身免疫性疾病(包括但不限于类风湿性关节炎)、多发性硬化症、克罗恩病、狼疮和牛皮癣、高胆固醇症、器官移植以防止排斥、心血管疾病、中风、阿尔茨海默病、骨疾病、败血症、传染病、病毒感染、血液病、骨质疏松症和哮喘。

在根据上述方法形成和/或分化了所述间充质干细胞后，将所述细胞悬浮在生理学相容的载体中。所述载体可以是与所述制剂的其它成分相容的任何载体，并且对其接受者无害。本领域技术人员熟悉生理学相容的载体。合适的载体的实例包括细胞培养基(例如，eagle's最低必需培养基)，磷酸盐缓冲盐水和hank's平衡盐溶液+/-葡萄糖(hbss)。在一个实施方案中，可以加入支持性细胞，例如胶质细胞或星形胶质细胞。这些细胞可以来自与所述间充质干细胞相同的物种，或者来自不同的物种。因此，在一个非限制性实施方案中，间充质干细胞分化成神经元细胞，并与人胶质瘤或星形胶质细胞一起施用给所述受试者。在一些实施方案中，所述共同施用的细胞可以是非人细胞。

向受试者施用的细胞悬液的体积将根据植入部位、治疗目标和溶液中的细胞量而变化。通常施用给受试者的细胞量会是治疗有效量。例如，在所述治疗是用于神经退行性疾病如帕金森病的情况下，治疗有效量的细胞的移植通常会导致降低该病症(例如僵直、运动障碍和步态障碍)相关症状的量和/或严重程度。

筛选方法

应当注意，通过本文所公开的方法产生的细胞也可以用于筛选药剂以用来选择影响特定的人细胞类型的试剂，例如影响间充质干细胞或其衍生物的试剂。

在一些实施方案中，提供了用于评估多肽对msc的生理学效应的方法。所述方法包括使用上述任意方法将多核苷酸引入到所述msc中，并且评估所述间充质干细胞的参数，由此确定所述多肽对所述msc的生理学效应。

在一些实施方案中，提供了用于评估多肽对msc的生理学效应的方法。所述方法包括使用上述公开的任意方法从所述msc切除多核苷酸，并且评估所述msc的参数，从而确定所述多肽对所述msc的生理学效应。

本文提供了一种用于选择影响人msc分化的试剂的方法。在一个实施方案中，所述试剂影响人msc向分化的细胞命运进行分化。

所述测试化合物可以是任意目的化合物，包括化学化合物、小分子、多肽或其他生物剂(例如抗体或细胞因子)。在几个实例中，筛选一组潜在试剂，例如筛选一组细胞因子或生长因子。

用于制备可测试所需活性的分子组合文库的方法是本领域熟知的并且包括，例如，制备肽噬菌体展示库的方法，所述肽可以是约束肽(参见，例如，美国专利号5,622,699；美国专利号5,206,347；scott和smith,science249:386-390,1992；markland等,gene109:13-19,1991)，肽库(美国专利号5,264,563)；拟肽库(blondelle等,trendsanalchem.14:83-92,1995)；核酸库((o'connell等,proc.natlacad.sci.,usa93:5883-5887,1996；tuerk和gold,science249:505-510,1990；gold等,ann.rev.biochem.64:763-797,1995)；寡糖文库(york等,carb.res.285:99-128,1996；liang等,science274:1520-1522,1996；ding等,adv.expt.med.biol.376:261-269,1995)；脂蛋白文库(dekruif等,febslett.399:232-236,1996)；糖蛋白或糖脂文库(karaoglu等,jcellbiol.130.567-577,1995)；或者包括例如，药物或其他药剂的化学文库(gordon等,jmed.chem.37.1385-1401,1994；ecker和crooke,biotechnology13:351-360,1995)。由于核酸分子对细胞靶点(包括细胞多肽)具有结合特异性，核酸分子可以天然存在，并且由于可以容易地制备和鉴定具有这种特异性的合成性分子，因此多核苷酸可以特别用作可以改变干细胞或祖细胞功能的试剂(参见，例如，美国专利号5,750,342)。

在一个实施方案中，对于高通量形式，可以将msc引入多孔板或玻璃载片或微芯片的孔中，并且可以与所述测试剂接触。通常，将所述细胞组织成阵列，特别是可定位的阵列，使得方便使用机器人来操纵所述细胞和溶液以及用来监测所述msc，特别是监测被检测的功能方面。使用高通量形式的优点是可以并行检查多个测试试剂，并且如果需要的话，也可以在与所述测试条件相同的条件下进行对照反应。因此，本文公开的方法提供了筛选一种、几种或大量的测试试剂的手段，以便鉴定可以改变msc的功能的试剂，例如诱导所述msc分化成所想要的细胞类型的试剂，或者例如通过保持调节分子的高水平表达来防止自发分化的试剂。

使细胞与足以使所述化合物与所述细胞相互作用的测试化合物接触。当所述化合物结合离散的受体时，让所述细胞接触足够长的时间使得所述试剂结合其受体。在一些实施方案中，将所述细胞与所述测试化合物一起孵育一段足以影响底物磷酸化的时间。在一些实施方案中，在37℃5％co2的加湿气氛中，用测试化合物在体外处理细胞。用测试化合物处理后，用不含ca²+和mg²+的pbs洗涤细胞，并且按照描述(haldar等,celldeathdiff.1:109-115,1994；haldar等,nature342:195-198,1989；haldar等,cancerres.54:2095-2097,1994)提取总蛋白。在另外的实施方案中，使用测试化合物的连续稀释液。

实施例

通过以下非限制性实施例来说明本公开物。

实施例1：aavs-copgfp供体载体的构建和aavstalenmrna的产生

在lox2272和lox511位点之间构建了含有嘌呤霉素抗性基因(其侧翼有两个loxp位点)以及由cag启动子驱动的copgfp表达盒的骨架载体。将两个绝缘子插入到所述aavs1-copgfp供体载体中，靶向chr.19上的aavs1位点(见图1)。通过pcr从xcl1(xcellinc，ca)的gdna上扩增出754bp的左侧同源臂和838bp的右侧同源臂，并将其克隆到所述骨架载体中。靶向第19号染色体中aavs安全港基因座的talen表达质粒由nih提供。按照修改过的制造商方案，将每个质粒dna通过xbai线性化，用于产生和纯化mrna。

实施例2：稳定表达aavs-copgfp的msc系的产生

人骨髓源间充质干细胞(msc)购自roosterbioinc.(frederick，md)，并且根据制造商的方案进行细胞复苏和维持。简单来说，让细胞在t-25烧瓶中的msc高性能培养基(roosterbioinc.，md)中生长，并且每3-4天更换培养基。在核转染当天，细胞应有约80-90％融合并且为单层。使用0.05％的胰蛋白酶-edta(lifetech.，nj)来产生单细胞悬液。在用pbs洗涤三次后，使用amaxa人干细胞核转染试剂盒(lonza，nj)，用4-6μg的每种aavstalenrna连同5μg供体载体(aavs-copgfp)对2×10⁶个msc进行核转染，并将其铺板在新的t-25烧瓶中，所述t-25烧瓶中有新鲜的msc高性能培养基。所述过程总结在图2a中。

如图2b所示，所述核转染效率为约60％并且在此阶段，所有绿色细胞均含有游离型载体。在核转染后，用2-3天的时间恢复msc以在用嘌呤霉素进行选择前达到80-90％的融合。在药物选择后两周获得了稳定的嘌呤霉素抗性细胞群。所述细胞群中超过98％有绿色荧光(图2c)。还进行了接头pcr以确认aavs-copgfp构建体成功整合进了msc系中(图2d)。在稳定的aavs-copgfpmsc系中观察到5'和3'臂的pcr条带均表明了正确的同源重组，但在wtmsc系中没有观察到此现象。在wt和aavs-copgfpmsc中均检测到了orf条带，表明在所述转染系中存在混合群体(杂合子和纯合子都存在)(图2d)。

将稳定系扩增并用冷冻液冷冻保存，所述冷冻液是含有10％dmso的msc高性能培养基。

鉴于本发明的原理可以应用于许多可能的实施方案，因此应当认识到，所示出的实施方案仅是本发明的示例，并且不应被认为是对本发明范围的限制。相反，本发明的范围由所附权利要求限定。因此，我们认为我们的发明的全部都在这些权利要求的范围和精神内。

序列表

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