用于成像的新型PD‑L1结合多肽的制作方法

对相关申请的交叉引用本申请要求2014年11月25日提交的题为“novelpd-l1bindingpolypeptidesforimaging(用于成像的新型pd-l1结合多肽)”的美国临时申请no.62/084,298的优先权，其内容通过提述并入本文。发明背景程序性死亡配体-1(pd-l1)是pd-1(即由活化的t和b细胞表达并且介导免疫抑制的关键免疫检查点受体)的表面糖蛋白配体，其在抗原呈递细胞和人癌症两者上找到并且通过结合pd-1下调t细胞活化和细胞因子分泌(freeman等,2000；latchman等,2001)。抑制pd-l1/pd-1相互作用允许在临床前模型中有力的抗肿瘤活性，并且破坏这种相互作用的抗体已进入用于治疗癌症的临床试验(美国专利号8,008,449和7,943,743；brahmer等,2010；topalian等,2012b；brahmer等,2012；flies等,2011；pardoll,2012；hamidandcarvajal,2013)。pet或正电子发射断层摄影术(positronemissiontomography)是一种非侵入性核医学技术，其产生身体内各种分子过程的三维图像或与疾病病理学相关的蛋白质的位置。该方法检测由在生物活性分子上引入身体内的正电子发射放射性核素(示踪剂)间接发射的伽马射线对。pet成像工具具有极其多种药物开发用途，并且具有独特的翻译医学优势，因为相同的工具可以既在临床前又在临床上使用。实例包括直接显现靶标的体内饱和；监测正常组织中的摄取以预期毒性或患者与患者的变化；量化病变组织；肿瘤转移；监测随时间的药物效力，或随时间的抗性等。本文中描述了适合用作诊断/成像剂，例如用于正电子发射断层摄影术的新型抗pd-l1adnectin。发明概述本发明至少部分基于可用作诊断剂/成像剂(例如用于正电子发射断层摄影术)的新型抗人pd-l1adnectin的发现。这些药剂可用于例如区分pd-l1表达性细胞与非pd-l1表达性细胞，例如肿瘤细胞，并且区别pd-l1表达性组织与非pd-l1表达性组织，例如癌症组织。在一个方面，本文中提供了包含纤连蛋白iii型第10域(10fn3)的多肽，其中(a)10fn3域包含ab、bc、cd、de、ef和fg环，(b)10fn3具有至少一个选自下组的环：相对于人10fn3域的相应环的序列(seqidno:1)具有改变的氨基酸序列的环bc、de和fg，并且(c)多肽特异性结合pd-l1。在某些实施方案中，多肽以500mm或更小，例如100mm或更小的kd结合pd-l1。在某些实施方案中，10fn3域包含具有以下氨基酸序列的bc、de和fg环：(1)分别为seqidno:6、7和8；(2)分别为seqidno:21、22和23；(3)分别为seqidno:36、37和38；(4)分别为seqidno:51、52和53；(5)分别为seqidno:66、67和68；(6)分别为seqidno:81、82和83；(7)分别为seqidno:97、98和99；(8)分别为seqidno:113、114和115；(9)分别为seqidno:124、125和126；(10)分别为seqidno:135、136和137；(11)分别为seqidno:146、147和148；(12)分别为seqidno:157、158和159；(13)分别为seqidno:168、169和170；(14)分别为seqidno:179、180和181；(15)分别为seqidno:190、191和192；(16)分别为seqidno:201、202和203；(17)分别为seqidno:212、213和214；(18)分别为seqidno:223、224和225；(19)分别为seqidno:234、235和236；(20)分别为seqidno:245、246和247；(21)分别为seqidno:256、257和258；(22)分别为seqidno:267、268和269；(23)分别为seqidno:278、279和280；(24)分别为seqidno:289、290和291；(25)分别为seqidno:300、301和302；(26)分别为seqidno:311、312和313；(27)分别为seqidno:322、323和324；(28)分别为seqidno:333、334和335；(29)分别为seqidno:344、345和346；(30)分别为seqidno:355、356和357；(31)分别为seqidno:366、367和368；(32)分别为seqidno:377、378和379；(33)分别为seqidno:388、389和390；(34)分别为seqidno:399、400和401；(35)分别为seqidno:410、411和412；(36)分别为seqidno:421、422和423；(37)分别为seqidno:432、433和434；(38)分别为seqidno:443、444和445；(39)分别为seqidno:454、455和456；(40)分别为seqidno:465、466和467；(41)分别为seqidno:476、477和478；(42)分别为seqidno:487、488和489；(43)分别为seqidno:498、499和500；(44)分别为seqidno:509、510和511；(45)分别为seqidno:520、521和522；(46)分别为seqidno:531、530和531；(47)分别为seqidno:542、543和544；(48)分别为seqidno:553、554和555；或(49)分别为seqidno:564、565和566。在某些实施方案中，多肽包含与表3中列出的序列，例如seqidno:5、20、35、50、65、80,96、112、123、134、145、156、167、178、189、200、211、222.233、244、255、266、277、288、299、310、321、332、343、354、365、376、387、398、409、420、431、442、453、464、475、486、497、508、519、530、541、552和563中任一项至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，多肽包含与seqidno:5、20、35、50、65、80、96、112、123、134、145、156、167、178、189、200、211、222.233、244、255、266、277、288、299、310、321、332、343、354、365、376、387、398、409、420、431、442、453、464、475、486、497、508、519、530、541、552或563的非bc、de和fg环区至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，多肽包含与选自下组的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列：seqidno:9-15、24-30、39-45、54-60、69-75、84-91、100-107、116-122、127-133、138-144、150-155、160-166、171-177、182-188、193-199、204-210、215-221、227-232、237-243、248-254、259-265、271-276、291-287、292-298、303-309、314-320、325-331、337-342、347-353、358-364、369-375、380-386、391-397、402-408、413-419、424-430、435-441、446-452、457-463、468-474、479-485、490-496、501-507、512-518、523-529、534-540、545-551和556-562。在某些实施方案中，多肽包含与选自下组的氨基酸序列的非bc、de和fg环区至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列：seqidno:9-15、24-30、39-45、54-60、69-75、84-91、100-107、116-122、127-133、138-144、150-155、160-166、171-177、182-188、193-199、204-210、215-221、227-232、237-243、248-254、259-265、271-276、291-287、292-298、303-309、314-320、325-331、337-342、347-353、358-364、369-375、380-386、391-397、402-408、413-419、424-430、435-441、446-452、457-463、468-474、479-485、490-496、501-507、512-518、523-529、534-540、545-551和556-562。在某些实施方案中，多肽包含选自seqidno:574-583的n端前导物，和/或选自seqidno:584-618或pmcn的c端尾部，其中p是脯氨酸，并且其中m是至少0(例如0、1或2)的整数并且n是至少1(例如1或2)的整数。在某些实施方案中，多肽包含一种或多种选自下组的药动学(pk)模块：聚乙二醇、唾液酸、fc、fc片段、转铁蛋白、血清清蛋白、血清清蛋白结合蛋白和血清免疫球蛋白结合蛋白。在某些实施方案中，pk模块和多肽经由至少一种二硫键、肽键、多肽、聚合糖或聚乙二醇模块连接。在某些实施方案中，pk模块和多肽经由具有选自下组的氨基酸序列的接头连接：seqidno:629-678。本文中提供了本文中描述的编码多肽的核酸，以及包含核酸的载体和细胞。在某些实施方案中，核酸包含选自下组的核苷酸序列：seqidno:16-19、31-34、46-49、61-64、76-79、92-95和108-111。本文中提供了包含本文中描述的多肽和载体的组合物。例如，本文中描述的组合物包含多肽和载体，所述多肽包含选自下组的氨基酸序列：seqidno:5、9-15、20、24-30、35、39-45、50、54-60、65、69-75、80、84-91、96、100-107、112、116-122、123、127-133、134、138-144、145、150-155、156、160-166、167、171-177、178、182-188、189、193-199、200、204-210、211、215-221、222、227-232、233、237-243、244、248-254、255、259-265、266、271-276、277、291-287、288、292-298、299、303-309、310、314-320、321、325-331、332、337-342、343、347-353、354、358-364、365、369-375、376、380-386、387、391-397、398、402-408、409、413-419、420、424-430、431、435-441、442、446-452、453、457-463、464、468-474、475、479-485、486、490-496、497、501-507、508、512-518、519、523-529、530、534-540、541、545-551、552和556-562。本文中提供了成像剂，其包含本文中公开的多肽。在某些实施方案中，成像剂包含多肽，所述多肽包含选自下组的氨基酸序列：seqidno:5、9-15、20、24-30、35、39-45、50、54-60、65、69-75、80、84-91、96、100-107、112、116-122、123、127-133、134、138-144、145、150-155、156、160-166、167、171-177、178、182-188、189、193-199、200、204-210、211、215-221、222、227-232、233、237-243、244、248-254、255、259-265、266、271-276、277、291-287、288、292-298、299、303-309、310、314-320、321、325-331、332、337-342、343、347-353、354、358-364、365、369-375、376、380-386、387、391-397、398、402-408、409、413-419、420、424-430、431、435-441、442、446-452、453、457-463、464、468-474、475、479-485、486、490-496、497、501-507、508、512-518、519、523-529、530、534-540、541、545-551、552和556-562。在某些实施方案中，成像剂包含可检测标记物。在某些实施方案中，成像剂包含本文中公开的多肽、螯合剂和可检测标记物。在某些实施方案中，成像剂包含本文中公开的多肽、双功能性螯合剂或缀合(bfc)模块和可检测标记物。在某些实施方案中，可检测标记物是含有放射性核素的辅基。在某些实施方案中，可检测标记物通过正电子发射断层摄影术可检测。在某些实施方案中，螯合剂和/或双功能性螯合剂或缀合(bfc)模块选自下组：dfo、dota、cb-do2a、3p-c-depa、tcmc、dbco、dibo、barac、dimac、oxo-do3a、te2a、cb-te2a、cb-te1a1p、cb-te2p、mm-te2a、dm-te2a、diamsar、nodasa、nodaga、nota、neta、tacn-tm、dtpa、1b4m-dtpa、chx-a”-dtpa、trap、nopo、aazta、data、h2dedpa、h4octapa、h2azapa、h5decapa、h6phospa、hbed、shbed、bpca、cp256、pcta、heha、pepa、edta、teta和trita。在某些实施方案中，可检测标记物是放射性核素，例如64cu、124i、76/77br、86y、89zr、68ga、18f、11c、125i、124i、131i、123i、131i、123i、32cl、33cl、34cl、68ga、74br、75br、76br、77br、78br、89zr、186re、188re、90y、177lu、99tc或153sm。在某些实施方案中，螯合剂是nodaga，并且放射性核素是64cu。在某些实施方案中，成像剂包含抗pd-l1多肽(例如本文中描述的抗pd-l1adnectin，例如包含seqidno:80或96中列出的氨基酸序列的抗pd-l1adnectin)、螯合剂nodaga和放射性核素64cu。在某些实施方案中，成像剂包含抗pd-l1多肽(例如本文中描述的抗pd-l1adnectin，例如包含seqidno:80或96中列出的氨基酸序列的抗pd-l1adnectin)、双功能性螯合剂或缀合(bfc)模块和包含放射性核素18f的辅基。在某些实施方案中，成像剂具有以下结构：或其药学可接受盐。在某些实施方案中，成像剂具有以下结构：在一些实施方案中，bfc是包含反应性基团的环辛炔，所述反应性基团与所述蛋白质上的胺、羧基、羰基或硫醇官能团形成共价键。在一些实施方案中，环辛炔选自下组：二苯环辛炔(dibo)、二芳基氮杂环辛炔酮(barac)、二甲氧基氮杂环辛炔(dimac)和二苯环辛炔(dbco)。在一些实施方案中，环辛炔是dbco。在一些实施方案中，bfc是dbco-peg4-nhs-酯、dbco-硫代-nhs-酯、dbco-peg4-酸、dbco-peg4-胺或dbco-peg4-马来酰亚胺。在一些实施方案中，bfc是dbco-peg4-马来酰亚胺。在某些实施方案中，成像剂具有结构：其中x是包含以下任一项的氨基酸序列的多肽：seqidno:13、28、43、58、73、88、104、120、131、142、153、164、175、186、197、208、219、230、241、252、263、274、285、296、307、318、329、340、351、362、373、384、395、406、417、428、439、450、461、472、483、494、505、516、527、538、549、560和571。在某些实施方案中，多肽包含seqidno:88中列出的氨基酸序列。在某些实施方案中，多肽包含seqidno:104中列出的氨基酸序列。本文中提供了试剂盒，其包含本文中描述的抗pd-l1adnectin组合物和/或成像剂，和使用说明书。本文中提供了检测样品中的pd-l1的方法，其包括使所述样品与抗pd-l1adnectin接触，并且检测pd-l1。本文中提供了检测受试者中的pd-l1阳性细胞的方法，其包括对所述受试者施用包含抗pd-l1adnectin的成像剂，并且检测所述成像剂，检测到的成像剂限定所述受试者中的所述pd-l1阳性细胞的位置。本文中提供了检测受试者中的pd-l1表达性肿瘤的方法，其包括对所述受试者施用包含抗pd-l1adnectin的成像剂，并且检测所述成像剂，检测到的成像剂限定所述受试者中的所述肿瘤的位置。在某些实施方案中，成像剂通过正电子发射断层摄影术可检测。本文中提供了获得包含抗pd-l1adnectin的成像剂的图像的方法，所述方法包括a)对受试者施用所述成像剂；并且b)通过正电子发射断层摄影术对所述成像剂的分布体内成像。本文中提供了获得表达pd-l1的组织或细胞的定量图像的方法，所述方法包括使所述细胞或组织与抗pd-l1adnectin的成像剂接触，并且使用正电子发射断层摄影术检测或量化所述表达pd-l1的组织。本文中提供了用于检测pd-l1表达性肿瘤的方法，其包括对具有pd-l1表达性肿瘤的受试者施用成像有效量的包含抗pd-l1adnectin的成像剂，并且使用正电子发射断层摄影术检测所述肿瘤中的所述成像剂的放射性发射，其中在所述肿瘤中检测到所述放射性发射。本文中提供了诊断受试者中的pd-l1表达性肿瘤的存在的方法，所述方法包括：(a)对有此需要的受试者施用包含抗pd-l1adnectin的成像剂；并且(b)获得所述受试者的至少一部分的放射性图像以检测所述成像剂的存在或缺乏；其中高于背景的所述成像剂的存在和位置指示所述疾病的存在和位置。本文中提供了监测受试者中针对pd-l1表达性肿瘤的抗肿瘤疗法的进展的方法，所述方法包括：(a)在第一时间点对有此需要的受试者施用包含抗pd-l1adnectin的成像剂，并且获得所述受试者的至少一部分的图像以确定所述肿瘤的大小；(b)对所述受试者施用抗肿瘤疗法；(c)在一个或多个后续时间点对所述受试者施用所述成像剂，并且在每个时间点获得所述受试者的至少一部分的图像；其中在每个时间点所述肿瘤的尺寸和位置指示所述疾病的进展。附图简述图1是本文中所述的例示性抗pd-l1adnectin的核心氨基酸序列的示意图。bc、de和fg环是加下划线的。野生型(wt)(seqidno:2)、ati-968(seqidno:5)、ati-964(seqidno:20)、ati-967(seqidno:65)、a02(seqidno:80)、e01(seqidno:96)、ati-965(seqidno:35)和ati-966(seqidno:50)。图2是用于[18f]-e01-4peg-dbco-fppega的化学合成的示意图。分子的e01部分具有seqidno:104中列出的序列。图3是证明了用64cu-e01抗pd-l1adnectin(具有nodaga螯合剂)区分hpd-l1阳性l2987细胞与hpd-l1阴性ht-29细胞的图。通过当与过量冷(未标记)e01adnectin共温育时细胞结合的64cu-e01的减少确认特异性。图4a是描绘了用nodaga-64cu标记的a02抗pd-l1adnectin区分双侧异种移植物小鼠中的hpd-l1(+)与hpd-l1(-)肿瘤的pet图像。显示的是总和的0到2小时图像，其显示探针驻留区域。明亮的区域是暴露期间最大占据的组织。图4b是描绘hpd-l1(+)[l2987]肿瘤中肿瘤标记的时间过程的图。hpd-l1(+)系统[l2987阻断]中的脉冲追踪实验和hpd-l1(-)[ht29]肿瘤显示了标记的特异性。图5是描绘携带双侧hpd-l1(+)l2987和hpd-l1(-)ht-29异种移植物的小鼠中18f标记的a02抗pd-l1adnectin放射性示踪剂的组织分布的图，如通过γ计数器离体测量的。图6是猕猴中18f标记的e01抗pd-l1adnectin分布的复合图像。图7是描绘用与指定浓度的冷a02adnectin共温育的0.25nm18f-dbco-a02抗pd-l1adnectin标记的异种移植物和人肺组织的体外放射自显影术的图。图8描绘了用抗pd-l1adnectin标记的异种移植物和人肺肿瘤标本的免疫组织化学图像以证明hpd-l1的肿瘤表达。图9显示了用于合成[18f]-a02-4peg-dbco-fppega的反应方案。使用相同反应方案以标记e01adnectin。图10是用于自动合成[18f]-fppega的getracerlabfx2n合成模块的示意图。图11是用于自动合成[18f]-fppega的synthera合成模块(iba)的示意图。图12描绘了抗pd-l1adnectin的例示性校正曲线。发明详述定义除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与熟练技术人员通常理解的相同的含义。虽然与本文所述的方法和组合物相似或等同的任何方法和组合物可用于本发明的实践或测试中，但是本文描述了优选的方法和组合物。“程序化死亡配体-1(pd-l1)”是pd-1的两种细胞表面糖蛋白配体之一(另一种是pd-l2)，其在结合pd-1时下调t细胞活化和细胞因子分泌。如本文中使用，术语“pd-l1”包括人pd-l1(hpd-l1)、hpd-l1的变体、同种型和物种同源物，以及与hpd-l1具有至少一个共同表位的类似物。完整的hpd-l1序列可在genbank登录号q9nzq7下找到。pd-l1也称为cd274、b7-h、b7h1、pdcd1l1和pdcd1lg1。如本文中使用，“多肽”是指两个或多个氨基酸的任何序列，不管长度、翻译后修饰或功能如何。“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用。多肽可包括天然氨基酸和非天然氨基酸，如那些在美国专利号6,559,126(通过提述并入本文)中描述的。也可以以多种标准化学方式中的任何一种修饰多肽(例如可以用保护基修饰氨基酸；可以将羧基末端氨基酸制备成末端酰胺基团；可以用基团修饰氨基末端残基，例如增强亲油性；或者可以以化学方式糖基化或以其它方式修饰多肽以增加稳定性或体内半衰期)。多肽修饰可以包括另一种结构，如环状化合物或其它分子与多肽的附接，并且还可以包括含有一个或多个改变构型(即r或s；或l或d)的氨基酸的多肽。本文中描述的肽是源自纤连蛋白的第10个iii型域的蛋白质，其已经修饰为特异性结合pd-l1并且在本文中称为“抗pd-l1adnectin”或“pd-l1adnectin”。如本文中使用的，“多肽链”是指多肽，其中与非共价相互作用或二硫键相反通过肽键将其每个域连接到其它域。“分离的”多肽是已经从其天然环境的组分中鉴定和分离和/或回收的多肽。其天然环境的污染成分是会干扰多肽的诊断或治疗用途的物质，并且可包括酶、激素和其它蛋白质性或非蛋白质性溶质。在优选的实施方案中，多肽将被纯化(1)至大于95重量％的多肽，如通过lowry方法测定，最优选大于99重量％，(2)至足以通过使用旋转杯顺序分析仪获得至少n端残基或内部氨基酸序列的程度，或(3)通过sds-page在还原或非还原条件下使用考马斯蓝或优选银染色至同质性。分离的多肽包含在重组细胞内原位的多肽，因为多肽天然环境的至少一种成分将不存在。然而，通常通过至少一个纯化步骤制备分离的多肽。如本文中使用的，10fn3域的“区”是指环(ab、bc、cd、de、ef和fg)、β-链(a、b、c、d、e、f和g)、人10fn3域的n端(对应于seqidno:1的氨基酸残基1-7)或c端(对应于seqidno:1的氨基酸残基93-94)。“支架区”是指人10fn3域的任何非环区。支架区包括a、b、c、d、e、f和gβ链以及n端区(对应于seqidno:1的残基1-7的氨基酸)和c端区(对应于seqidno:1的残基93-94的氨基酸，并且任选地包含构成在人纤连蛋白中的fn3域的第10和第11个重复之间的天然接头的7个氨基酸)。本文中“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为候选序列中在比对序列并引入缺口之后(如果必要的话)以实现最大百分比序列同一性并且不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分，与所选序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。为了测定百分比氨基酸序列同一性的比对可以以本领域技术范围内的各种方式实现，例如使用公开可获得的计算机软件如blast、blast-2、align、align-2或megalign(dnastartm)软件。本领域技术人员可以容易地确定测量比对的适当参数，包括在待比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。例如，给定的氨基酸序列a对、与、或针对给定的氨基酸序列b的％氨基酸序列同一性(或者，其可以描述为对、与或针对给定的氨基酸序列b具有或包含某种％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列a)如下计算：100乘以分数x/y，其中x是通过序列比对程序align-2在所述程序的a和b的比对中评分为相同匹配的氨基酸残基的数目，并且其中y是b中的氨基酸残基的总数。应当理解，在氨基酸序列a的长度不等于氨基酸序列b的长度的情况下，则a与b的％氨基酸序列同一性不等于b与a的％氨基酸序列同一性。如本文中使用，术语“adnectin结合位点”是指与特定adnectin相互作用或结合的蛋白质(例如pd-l1)的位点或部分。adnectin结合位点可以由连续的氨基酸或通过蛋白质的三级折叠并列的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的adnectin结合位点通常在暴露于变性溶剂时保留，而通过三级折叠形成的adnectin结合位点通常在变性溶剂处理时丧失。本文中所述的抗pd-l1adnectin的adnectin结合位点可以通过应用通常用于抗体表位定位的标准技术来确定，包括但不限于蛋白酶定位和突变分析。或者，可以通过使用结合相同多肽(例如pd-l1)的参考adnectin或抗体的竞争测定来测定adnectin结合位点(如下文在“交叉竞争adnectin和/或结合相同adnectin结合位点的adnectin”部分中进一步描述)。如果测试adnectin和参考分子(例如另一种adnectin或抗体)竞争，则它们结合相同的adnectin结合位点或足够接近的adnectin结合位点，使得一个分子的结合干扰另一个。如在本文中可互换使用，术语“特异性结合”和“选择性结合”，在结合pd-l1的adnectin的上下文中是指对pd-l1显示亲和力，但是如通过本领域中可用的技术(如但不限于scatchard分析和/或竞争性结合测定法(例如竞争elisa，biacore测定法))测量，不显著结合(例如，小于约10％的结合)不同多肽的adnectin。在例如本文所述的adnectin的结合域对pd-l1特异性的情况下，该术语也是适用的。如本文中使用，术语“优先结合”在adnectin与pd-l1结合的上下文下是指下述情况，其中本文所述的adnectin结合pd-l1比其结合不同多肽大至少约20％，如通过本领域可用的技术所测量的，如但不限于scatchard分析和/或竞争性结合测定(例如，竞争elisa，biacore测定法)。如本文在adnectin的上下文中使用，术语“交叉反应性”是指结合多于一个具有相同或非常相似的adnectin结合位点的独特蛋白质的adnectin。如本文在adnectin与pd-l1结合的上下文中使用，术语“kd”意图指特定的adnectin蛋白(例如，pd-l1)相互作用的解离平衡常数或adnectin对蛋白质(例如，pd-l1)的亲和力，如使用表面等离振子共振测定法或细胞结合测定法测量。如本文中使用，“期望的kd”是指对涵盖的目的足够的adnectin的kd。例如，期望的kd可以指在体外测定法(例如基于细胞的萤光素酶测定法)中引发功能效应所需的adnectin的kd。如本文中在adnectin与蛋白质结合的上下文中使用，术语“ka”意图指adnectin缔和成adnectin/蛋白质复合物的缔合速率常数。如本文中在adnectin与蛋白质结合的上下文中使用，术语“kd”是指用于从adnectin/蛋白质复合物解离adnectin的解离速率常数。如本文中在adnectin的上下文中使用，术语“ic50”是指在体外或体内测定法中以下述水平抑制应答的adnectin的浓度，所述水平是最大抑制应答的50％，即最大抑制应答和未处理应答之间的中间值。术语“pk”是“药动学”的首字母缩写，并且包括化合物的性质，包括例如受试者的吸收、分布、代谢和消除。如本文中使用，“pk调节蛋白”或“pk模块”是指当与生物活性分子融合或一起施用时影响生物活性分子的药动学性质的任何蛋白质、肽或模块。pk调节蛋白或pk模块的实例包括peg、人血清清蛋白(hsa)结合剂(如美国公开号2005/0287153和2007/0003549，pct公开号wo2009/083804和wo2009/133208中公开的)、人血清清蛋白及其变体、转铁蛋白及其变体、fc或fc片段及其变体和糖(例如唾液酸)。蛋白质或化合物的“血清半衰期”是多肽的血清浓度在体内降低50％所花费的时间，例如由于序列或化合物的降解和/或通过天然机制清除或螯合序列或化合物。半衰期可以以本身已知的任何方式测定，例如通过药动学分析。合适的技术对于本领域技术人员将是清楚的，并且可以例如通常牵涉下述步骤：适当地向受试者施用合适剂量的本文所述的氨基酸序列或化合物；定期从受试者收集血液样品或其它样品；测定所述血液样品中本文所述的氨基酸序列或化合物的水平或浓度；并且从如此获得的数据的(图)计算，直到本文所述的氨基酸序列或化合物的水平或浓度与给药时的初始水平相比降低了50％的时间。例如，参考标准手册，如kenneth,a.等,chemicalstabilityofpharmaceuticals:ahandbookforpharmacists和peters等,pharmacokineteanalysis:apracticalapproach(1996)。还参考gibaldi,m.等,pharmacokinetics,第二修订版,marceldekker(1982)。可使用参数如t1/2-α、t1/2-β、hl_lambda_z和曲线下面积(auc)来表达半衰期。在本说明书中，“半衰期的增加”是指这些参数中的任何一个，这些参数中的任何两个、这些参数中的任何三个或这些参数中的所有四个的增加。“半衰期的增加”特别是指在具有或没有t1/2-α和/或auc或两者的增加的情况下，t1/2-β和/或hl_lambda_z的增加。术语“可检测”是指检测高于背景信号的信号的能力。术语“可检测信号”是来自非侵入性成像技术的信号，如但不限于正电子发射断层摄影术(pet)。可检测信号是可检测的并且可与可以从受试者产生的其它背景信号区分的。换言之，存在可测量和统计学上的显著差异(例如，统计学上显著的差异足以区分可检测信号和背景的差异，如可检测信号和背景之间的约0.1％、1％、3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％或40％以上的差异)。标准品和/或校准曲线可用于测定可检测信号和/或背景的相对强度。将包含本文所述的成像剂的组合物的“可检测有效量”定义为足以使用可用于临床使用的设备产生可接受图像的量。可以以超过一次的注射施用本文提供的可检测有效量的成像剂。可检测的有效量可以根据因素如个体易感性的程度、个体的年龄，性别和重量、个体的特质应答等而变化。可检测有效量的成像组合物也可以根据所使用的仪器和方法而变化。这些因素的优化在本领域的技术水平之内。在某些实施方案中，pd-l1成像剂(例如本文所述的那些pd-l1成像剂)提供2或更多，例如3、4、5或更多的(即，特定信号与背景信号)的区分因子。术语“生物正交化学”是指可以发生在生物系统内部而不干扰天然生化过程的任何化学反应。该术语包括化学反应，所述化学反应是在生理ph在水中或在水存在下在体外发生的化学反应。为了视为生物正交，反应是选择性的并且避免与起始化合物中发现的其它官能团的副反应。此外，反应配偶体之间的所得到的共价键对于生物反应应该是强烈且化学惰性的，并且不应影响期望分子的生物活性。术语“点击化学”是指用于快速合成新化合物和组合文库的一组可靠且选择性的生物正交反应。点击反应的性质包括模块性、范围宽泛性、高产生(highyielding)、立体专一性和简单的产品分离(通过非层析法与惰性副产物分离)，以产生在生理条件下稳定的化合物。在放射化学和放射性药物中，点击化学是一组标记反应的通用术语，所述标记反应利用选择性和模块性构造单元，并使化学选择性连接在不存在催化剂的情况下能够放射性标记生物相关化合物。“点击反应”可以用铜，或者它可以是无铜点击反应。术语“辅基”或“双功能性标记剂”是指含有能够与肽或蛋白质连接的放射性核素(例如18f)的小有机分子。如本文中关于放射性药物化学使用，术语“螯合剂配体”是指在本文中可互换使用的双功能螯合剂或缀合(bfc)模块，其将放射性标记的辅基共价连接到生物活性靶向分子(例如，肽或蛋白质)。bfc利用官能团，如羧酸或活化酯进行酰胺偶联、异硫氰酸盐进行硫脲偶联以及马来酰亚胺用于硫醇偶联。在本文中可互换使用的术语“个体”、“受试者”和“患者”是指动物，优选哺乳动物(包括非灵长类和灵长类)，例如人。在某些实施方案中，受试者具有将受益于pd-l1的降低的水平或降低的生物活性的疾病或病症或状况。在某些实施方案中，受试者有风险发生会受益于pd-l1水平降低或pd-l1生物活性降低的疾病或病症或状况。“癌症”是指一大组的各种疾病，其特征在于体内异常细胞的不受控制的生长。不规则的细胞分裂和生长分裂和生长导致恶性肿瘤的形成，所述恶性肿瘤侵入相邻组织并且还可以通过淋巴系统或血流转移到身体的远处部分。“免疫应答”是指免疫系统的细胞(例如，t淋巴细胞、b淋巴细胞、天然杀伤(nk)细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、树突状细胞和嗜中性粒细胞)和由这些细胞中的任一种或肝脏产生的可溶性大分子的作用(包括ab(抗体)、细胞因子和补体)，其导致从脊椎动物身体中选择性靶向、结合、损害、破坏和/或消除侵入性病原体、感染有病原体的细胞或组织、癌性或其它异常细胞，或者(在自身免疫或病理学炎症的情况下)正常人细胞或组织。“免疫调节剂”是指调节免疫应答的物质、药剂、信号传导途径或其组分。“调节”、“缓解”或“调控”免疫应答是指免疫系统的细胞或此类细胞的活性的任何改变。此类调节包括免疫系统的刺激或抑制，其可以通过各种细胞类型的数目的增加或减少、这些细胞的活性的增加或减少或可以在免疫系统内发生的任何其它变化表现。已经鉴定出抑制和刺激性免疫调节剂两者，其中一些可以在癌症微环境中具有增强的功能。术语“免疫疗法”是指通过包括诱导、增强、抑制或以其它方式缓解免疫应答的方法治疗患有疾病或有风险染上或遭受疾病复发的受试者。受试者的“治疗”或“疗法”是指对受试者进行的任何类型的干预或过程或对受试者施用活性剂，目的在于逆转、减轻、改善、抑制、减缓或预防与疾病相关的症状、并发症、状况或生物化学指征的发作、进展、发展、严重性或复发。如本文中在抗pd-l1adnectin的上下文中使用，“施用”是指对受试者中引入本文中描述的pd-l1adnectin或基于pd-l1adnectin的探针或标记的探针(也称为“成像剂”)。任何施用途径是合适的，如可以使用静脉内、口服、表面、皮下、腹膜、动脉内、吸入、阴道、直肠、鼻、导入脑脊液中或输入身体区室中。术语“治疗有效量”是指对受试者赋予治疗益处所必需的药剂的至少最小剂量但小于有毒剂量。如本文中使用，“有效量”是指以必要的剂量和时间段，至少有效实现期望的结果的量。如本文中使用，“足够量”是指足以实现期望结果的量。如本文中使用，“正电子发射断层摄影术”或“pet”是指产生身体中示踪剂位置的三维图像的非侵入式核医学技术。该方法检测由正电子发射放射性核素(示踪剂)间接发射的γ射线对，其在生物活性分子上引入身体内。pet成像工具都有一大批用途并且在临床前和临床上都有助于药物开发。例示性应用包括靶标体内饱和度的直接显现；监测正常组织中的摄取以预期毒性或患者与患者的变化；量化病变组织；肿瘤转移；并监测随时间的药物效力，或随时间的抗性。概述本文提供了结合人pd-l1并且可偶联到异源分子(如放射性标记物)的多肽。例如，此类多肽可用于检测用于诊断测定法的样品或组织(例如，组织，如选择性表达pd-l1的癌组织)中的pd-l1。本发明基于允许患者的pd-l1表达的全身显现的非侵入性临床成像剂的开发。在某些实施方案中，进行患者全身的单日“虚拟活组织检查”以监测和定位pd-l1表达水平。本文所述的pd-l1成像剂可用于在单日内提供高对比度全身虚拟活组织检查。i.基于纤连蛋白的支架fn3是指来自纤连蛋白的iii型域。fn3域是小的、单体的、可溶的、且稳定的。它缺乏二硫键，并且因此在还原条件下是稳定的。fn3的整体结构类似于免疫球蛋白折叠。fn3域从n末端到c末端的次序包含β或β样链，a；环，ab；β或β样链，b；环，bc；β或β样链，c；环，cd；β或β样链，d；环，de；β或β样链，e；环，ef；β或β样链，f；环，fg；和β或β样链，g。七个反向平行的β链排列成在创建由连接β或β样链的环组成的两个“面”的情况下形成稳定核心的两个β片层。环ab、cd和ef位于一个面(“南极”)，并且环bc、de和fg位于相对面(“北极”)上。人纤连蛋白中至少有15个不同的fn3模块，而模块间的序列同源性较低，它们在三级结构中具有较高的相似性。本文描述了包含fn3域的抗-pd-l1adnectin，其中已经随机化或突变一种或多种溶剂可接近环。在某些实施方案中，fn3域是源自人纤连蛋白iii型域的野生型第十个模块(10fn3)的fn3域：vsdvprdlevvaatptslliswdapavtvryyritygetggnspvqeftvpgskstatisglkpgvdytitvyavtgrgdspasskpisinyrt(seqidno:1)(94个氨基酸；ab，cd和ef环是加下划线的；核心10fn3域以氨基酸9(“e”)开始，并且以氨基酸94(“t”)结束，并且对应于86个氨基酸的多肽)。在seqidno:2中显示了核心野生型人10fn3域。在某些实施方案中，可改变10fn3，即“10fn3支架”的非配体结合序列，条件是10fn3保留配体结合功能和/或结构稳定性。已经报道了多种突变体10fn3支架。在一个方面，asp7、glu9和asp23中的一个或多个被另一种氨基酸，例如未带负电荷的氨基酸残基(例如asn，lys等)替换。已经公开了10fn3支架中有益或中性的多种附加改变。参见例如batori等,proteineng.,15(12):1015-1020(2002年12月)；koide等,biochemistry,40(34):10326-10333(2001年8月28日)。变体和野生型10fn3蛋白的特征在于相同的结构，即称为a至g的七个β链域序列和连接七个β链域序列的六个环区(ab环、bc环、cd环、de环、ef环和fg环)。位于最接近n和c端的β链可在溶液中采用β样构象。在seqidno:1中，ab环对应于残基14-17，bc环对应于残基23-31，cd环对应于残基37-47，de环对应于残基51-56，ef环对应于残基63-67，并且fg环对应于残基76-87。因此，在某些实施方案中，本文所述的抗-pd-l1adnectin是10fn3多肽，其为与seqidno:1中所示的人10fn3域或如seqidno:2所示的其核心序列是至少40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％相同的。大量变异性通常发生在一个或多个环或一个或多个的β链或n-或c端区中。10fn3多肽的每个β或β样链可基本上由与如seqidno:1或2的相应的β或β样链的序列至少80％、85％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列组成，只要此类变化不破坏多肽在生理条件下的稳定性。在某些实施方案中，本发明提供了包含第十个纤连蛋白iii型(10fn3)域的抗人pd-l1adnectin，其中10fn3域包含环ab；环，bc；环，cd；环，de；环ef；和环fg；并且具有至少一个选自下组的环：相对于人10fn3域的相应环的序列，具有改变的氨基酸序列的环bc、de和fg。在一些实施方案中，本文所述的抗pd-l1adnectin包含10fn3域，其包含与seqidno:1或2的非环区至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，其中选自bc、de和fg的至少一个环是改变的。在某些实施方案中，bc和fg环是改变的，在某些实施方案中，bc和de环是改变的，在某些实施方案中，de和fg环是改变的，并且在某些实施方案中，bc、de和fg环是改变的，即10fn3域包含非天然存在的环。在某些实施方案中，ab、cd和/或ef环是改变的。“改变”是指相对于模板序列(相应的人纤连蛋白域)的一个或多个氨基酸序列改变，并且包括氨基酸添加、缺失、取代或其组合。改变氨基酸序列可以通过有意的、盲目的或自发的序列变化(通常是核酸编码序列)来实现，并且可通过任何技术发生，例如pcr、易错pcr或化学dna合成。在某些实施方案中，可相对于相应的人纤连蛋白环长度延长或缩短选自bc、de和fg的一个或多个环。在一些实施方案中，环的长度可以延长2-25个氨基酸。在一些实施方案中，环的长度可以减少1-11个氨基酸。因此，为了优化抗原结合，10fn3的环的长度可以在长度上和序列上改变，以在抗原结合中获得最大可能的灵活性和亲和力。在某些实施方案中，多肽包含fn3域，其包含非环区的氨基酸序列，其与seqidno:1或2的非环区至少80、85、90、95、98、99或100％相同，其中选自bc、de和fg的至少一个环是改变的。在一些实施方案中，改变的bc环具有多至1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代、多至1、2、3或4个氨基酸缺失、多至1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸插入，或其组合。在一些实施方案中，可以取代整联蛋白结合基序“精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸”(rgd)(seqidno:1的氨基酸78-80)的一个或多个残基以破坏整联蛋白结合。在一些实施方案中，本文提供的多肽的fg环不含rgd整联蛋白结合位点。在一个实施方案中，通过极性氨基酸-中性氨基酸-酸性氨基酸序列(以n端至c末端方向)替换rgd序列。在一些实施方案中，用sge替换rgd序列。在一个实施方案中，用rge替换rgd序列。在某些实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白包含通常以下述序列定义的10fn3域：evvaa(z)allisw(z)xyrity(z)bftv(z)yatisgl(z)cytitvya(z)zisinyrt(seqidno:3)其中ab环由(z)a表示，cd环由(z)b表示，ef环由(z)c表示，bc环由(z)x表示，de环由(z)y表示，并且fg环由(z)z表示。z表示任何氨基酸，并且z后面的下标表示氨基酸数目的整数。特别地，a可为1-15、2-15、1-10、2-10、1-8、2-8、1-5、2-5、1-4、2-4、1-3，2-3或1-2个氨基酸的任何位置；并且b、c、x、y和z可各自独立地为2-20、2-15、2-10、2-8、5-20、5-15、5-10、5-8、6-20、6-15、6-10、6-8、2-7、5-7、或6-7个氨基酸的任何位置。相对于seqidno:1或2所示的相应氨基酸，β链的序列在所有7个支架区间可具有0至10、0至8、0至6、0至5、0至4、0至3、0至2或0至1个取代、缺失或添加的任何位置。在某些实施方案中，相对于seqidno:1或2所示的相应氨基酸，β链的序列在所有7个支架区间可具有0至10、0至8、0至6、0个至5、0至4、0至3、0至2、0至1个保守取代的任何位置。在某些实施方案中，核心氨基酸残基是固定的，并且在除核心氨基酸残基之外的残基处发生任何取代、保守取代、缺失或添加。在某些实施方案中，本文所述的抗pd-l1adnectin基于10fn3支架，并且通常由下述序列定义：evvaatptsllisw(z)xyritygetggnspvqeftv(z)yatisglkpgvdytitvya(z)zisinyrt(seqidno:4).其中bc环由(z)x表示，de环由(z)y表示，并且fg环由(z)z表示。z表示任何氨基酸，并且z后面的下标表示氨基酸数目的整数。特别地，x、y和z可各自独立地为2-20、2-15、2-10、2-8、5-20、5-15、5-10、5-8、6-20、6-15、6-10、6-8、2-7、5-7、或6-7个氨基酸的任何位置。在优选的实施方案中，x为11个氨基酸，y为6个氨基酸，并且z为12个氨基酸。相对于seqidno:1或2所示的相应氨基酸，β链的序列在所有7个支架区间可以具有0至10、0至8、0至6、0至5、0至4、0至3、0至2或0至1个取代、缺失或添加的任何位置。在某些实施方案中，相对于seqidno:1或2所示的相应氨基酸，β链的序列在所有7个支架区间可以具有0至10、0至8、0至6、0至5、0至4、0至3、0至2或0至1个保守取代的任何位置。在某些实施方案中，核心氨基酸残基(例如在一个或多个环外)是固定的，并且在除核心氨基酸残基之外的残基处发生任何取代、保守取代、缺失或添加。在某些实施方案中，抗pd-l1adnectin可包含如seqidno:3或4中列出的序列，其中如分别以(z)x、(z)y和(z)z表示的bc、de和fg环中的至少一个是改变的。如上文所述，与seqidno:1的残基23-31、51-56和76-87对应的氨基酸残基分别限定bc、de和fg环。然而，应当理解，不需要修饰环区内的每个残基以实现对期望的靶物(例如pd-l1)具有强亲和力的10fn3结合剂。在某些实施方案中，抗pd-l1adnectin包含seqidno:3或4中列出的序列，其中如分别以(z)x、(z)y和(z)z表示的bc、de和fg环具有与分别在seqidno:21、22和23中列出的bc、de或fg环序列至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％,或99％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗pd-l1adnectin包含seqidno:3或4中列出的序列，其中如分别以(z)x、(z)y和(z)z表示的bc、de和fg环包含分别具有seqidno:21、22和23的氨基酸序列的bc、de和fg环。在某些实施方案中，抗pd-l1adnectin包含seqidno:3或4中列出的序列，其中如分别以(z)x、(z)y和(z)z表示的bc、de和fg环具有与分别在seqidno:36、37和38中列出的bc、de或fg环序列至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％,或99％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗pd-l1adnectin包含seqidno:3或4中列出的序列，其中如分别以(z)x、(z)y和(z)z表示的bc、de和fg环包含分别具有seqidno:36、37和38的氨基酸序列的bc、de和fg环。在某些实施方案中，抗pd-l1adnectin包含seqidno:3或4中列出的序列，其中如分别以(z)x、(z)y和(z)z表示的bc、de和fg环具有与分别在seqidno:51、52和53中列出的bc、de或fg环序列至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％,或99％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗pd-l1adnectin包含seqidno:3或4中列出的序列，其中如分别以(z)x、(z)y和(z)z表示的bc、de和fg环包含分别具有seqidno:51、52和53的氨基酸序列的bc、de和fg环。在某些实施方案中，抗pd-l1adnectin包含seqidno:3或4中列出的序列，其中如分别以(z)x、(z)y和(z)z表示的bc、de和fg环具有与分别在seqidno:66、67和68中列出的bc、de或fg环序列至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％,或99％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗pd-l1adnectin包含seqidno:3或4中列出的序列，其中如分别以(z)x、(z)y和(z)z表示的bc、de和fg环包含分别具有seqidno:66、67和68的氨基酸序列的bc、de和fg环。在某些实施方案中，抗pd-l1adnectin包含seqidno:3或4中列出的序列，其中如分别以(z)x、(z)y和(z)z表示的bc、de和fg环具有与分别在seqidno:6、7和8中列出的bc、de或fg环序列至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％,或99％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗pd-l1adnectin包含seqidno:3或4中列出的序列，其中如分别以(z)x、(z)y和(z)z表示的bc、de和fg环包含分别具有seqidno:6、7和8的氨基酸序列的bc、de和fg环。在某些实施方案中，抗pd-l1adnectin包含seqidno:3或4中列出的序列，其中如分别以(z)x、(z)y和(z)z表示的bc、de和fg环具有与分别在seqidno:81、82和83中列出的bc、de或fg环序列至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％,或99％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗pd-l1adnectin包含seqidno:3或4中列出的序列，其中如分别以(z)x、(z)y和(z)z表示的bc、de和fg环包含分别具有seqidno:81、82和83的氨基酸序列的bc、de和fg环。在某些实施方案中，抗pd-l1adnectin包含seqidno:3或4中列出的序列，其中如分别以(z)x、(z)y和(z)z表示的bc、de和fg环具有与分别在seqidno:97、98和99中列出的bc、de或fg环序列至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％,或99％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗pd-l1adnectin包含seqidno:3或4中列出的序列，其中如分别以(z)x、(z)y和(z)z表示的bc、de和fg环包含分别具有seqidno:97、98和99的氨基酸序列的bc、de和fg环。在某些实施方案中，抗pd-l1adnectin包含seqidno:3或4中列出的序列，其中如分别以(z)x、(z)y和(z)z表示的bc、de和fg环包含分别具有seqidno:113、114和115；seqidno:124、125和126；seqidno:135、136和137；seqidno:146、147和148；seqidno:157、158和159；seqidno:168、169和170；seqidno:179、180和181；seqidno:190、191和192；seqidno:201、202和203；seqidno:212、213和214；seqidno:223、224和225；seqidno:234、235和236；seqidno:245、246和247；seqidno:256、257和258；seqidno:267、268和269；seqidno:278、279和280；seqidno:289、290和291；seqidno:300、301和302；seqidno:311、312和313；seqidno:322、323和324；seqidno:333、334和335；seqidno:344、345和346；seqidno:355、356和357；seqidno:366、367和368；seqidno:377、378和379；seqidno:388、389和390；seqidno:399、400和401；seqidno:410、411和412；seqidno:421、422和423；seqidno:432、433和434；seqidno:443、444和445；seqidno:454、455和456；seqidno:465、466和467；seqidno:476、477和478；seqidno:487、488和489；seqidno:498、499和500；seqidno:509、510和511；seqidno:520、521和522；seqidno:531、530和531；seqidno:542、543和544；seqidno:553、554和555；或seqidno:564、565和566的氨基酸序列的bc、de和fg环。相对于seqidno:4的支架氨基酸残基，此类抗pd-l1adnectin的支架区可包含0至20、0至15、0至10、0至8、0至6、0至5、0至4、0至3、0至2、或0至1个取代、保守取代、缺失或添加的任何位置。可做出此类支架修饰，只要抗pd-l1adnectin能够以期望的kd结合pd-l1。在某些实施方案中，抗pd-l1adnectin的bc环包含选自下组的氨基酸序列：6、21、36、51、66、81和97。在某些实施方案中，抗pd-l1adnectin的de环包含选自下组的氨基酸序列：7、22、37、52、67、82和98。在某些实施方案中，抗pd-l1adnectin的fg环包含选自下组的氨基酸序列：8、23、38、53、68、83和99。在某些实施方案中，抗pd-l1adnectin包含分别与seqidno:6、21、36、51、66、81和97；7、22、37、52、67、82和98；和8、23、38、53、68、83和99中任一项至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的bc、de和fg环氨基酸序列。在某些实施方案中，抗pd-l1adnectin包含与seqidno:5、20、35、50、65、80、96、112、123、134、145、156、167、178、189、200、211、222、233、244、255、266、277、288、299、310、321、332、343、354、365、376、387、398、409、420、431、442、453、464、475、486、497、508、519、530、541、552和563中任一项至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，本文中所述的抗pd-l1adnectin包含与seqidno:5、20、35、50、65、80、或96的非bc、de和fg环区至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗pd-l1adnectin包含与9-15、24-30、39-45、54-60、6975、84-91、100-107、116-122、127-133、138-144、150-155、160-166、171-177、182-188、193-199、204-210、215-221、227-232、237-243、248-254、259-265、271-276、291-287、292-298、303-309、314-320、325-331、337-342、347-353、358-364、369-375、380-386、391-397、402-408、413-419、424-430、435-441、446-452、457-463、468-474、479-485、490-496、501-507、512-518、523-529、534-540、545-551和556-562中任一项至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，本文中所述的抗pd-l1adnectin包含seqidno:9-15、24-30、39-45、54-60、69-75、84-91和100-107中任一项至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗pd-l1adnectin包含如seqidno:6、7和8中列出的bc、de和fg环。在某些实施方案中，抗pd-l1adnectin包含如seqidno:21、22和23中列出的bc、de和fg环。在某些实施方案中，抗pd-l1adnectin包含如seqidno:36、37和38中列出的bc、de和fg环。在某些实施方案中，抗pd-l1adnectin包含如seqidno:51、52和53中列出的bc、de和fg环。在某些实施方案中，抗pd-l1adnectin包含如seqidno:66、67和68中列出的bc、de和fg环。在某些实施方案中，抗pd-l1adnectin包含如seqidno:81、82和83中列出的bc、de和fg环。在某些实施方案中，抗pd-l1adnectin包含如seqidno:97、98和99中列出的bc、de和fg环。在某些实施方案中，将本文所述的bc、de和/或fg环氨基酸序列(例如，分别为seqidno:6、21、36、51、66、81和97；7、22、37、52、67、82和98；和8、23、38、53、68、83和99)植入非10fn3域蛋白质支架中。例如，将一个或多个环氨基酸序列交换或插入抗体重链或轻链或其片段的一个或多个cdr环中。在一些实施方案中，交换或插入一个或多个氨基酸环序列的蛋白质域包括但不限于共有fn3域(centocor，us)、锚蛋白重复蛋白(molecularpartnersag，zurichswitzerland)、域抗体(domantis，ltd，cambridge，ma)、单域骆驼科纳米抗体(ablynx,belgium)、脂笼蛋白(例如anticalins；pierisproteolabag，freising，germany)，avimers(amgen，ca)，亲和体(affibodyag，sweden)、泛素(例如affilins；scilproteinsgmbh，halle，germany)、蛋白质表位模拟物(polyphorltd，allschwil，switzerland)、螺旋束支架(例如，alphabodies，complix，belgium)、fynsh3域(covagenag，switzerland)或者atrimers(anaphor，inc.，ca)。在某些实施方案中，可通过相对于野生型人10fn3域(seqidno:1或2)的相应区域的氨基酸序列的缺失、取代或插入修饰本文提供的多肽的n端和/或c端域的氨基酸序列。10fn3域通常以seqidno:1的氨基酸号1开始。然而，本发明也涵盖具有氨基酸缺失的域。也可将另外的序列添加到具有seqidno:1或2的氨基酸序列的10fn3域的n端或c端。例如，在一些实施方案中，n端延伸由选自下组的氨基酸序列组成：m、mg和g。在某些实施方案中，mg序列可置于由seqidno:1定义的10fn3的n端。m通常将被切除，留下在n端的g。此外，m、g或mg也可置于表3中所示的任何n端延伸的n端。在例示性实施方案中，可将具有1-20、1-15、1-10、1-8、1-5、1-4、1-3、1-2或1个氨基酸长度的备选n端区添加到seqidno:1或2或表3中列出的任何adnectin的n端区。例示性的备选n端区包含(由单字母氨基酸代码表示)m、mg、g、mgvsdvprdl(seqidno:574)和gvsdvprdl(seqidno:575)。可连接到例如adnectin核心序列的n端的其它合适的备选n端区包括例如xnsdvprdl(seqidno:576)、xndvprdl(seqidno:577)、xnvprdl(seqidno:578)、xnprdl(seqidno:579)xnrdl(seqidno:580)、xndl(seqidno:581)或xnl，其中n＝0、1或2个氨基酸，其中n＝1，x为met或gly，并且当n＝2时，x为met-gly。当将met-gly序列添加到10fn3域的n端时，m通常被切除，留下在n端的g。在一些实施方案中，备选的n端域包含氨基酸序列mastsg(seqidno:582)。在例示性实施方案中，可将具有1-20、1-15、1-10、1-8、1-5、1-4、1-3、1-2、或1个氨基酸长度的备选c端区添加到seqidno:1或2或表3中所示的任何adnectin的c端区。备选c端区序列的具体实例包括例如包含、基本上组成为或者组成为eiek(seqidno:584)、egsgc(seqidno:585)、eiekpcq(seqidno:586)、eiekpsq(seqidno:587)、eiekp(seqidno:588)、eiekps(seqidno:589)或eiekpc(seqidno:590)的多肽。在一些实施方案中，备选c端区包含eidk(seqidno:591)，并且在具体实施方案中，备选c端区是eidkpcq(seqidno:592)或eidkpsq(seqidno:593)。seqidno:594-618中列出了另外的合适的备选c端区。在某些实施方案中，将adnectin连接到包含e和d残基的c端延伸序列，并且可为8-50、10-30、10-20、5-10和2-4个氨基酸的长度。在一些实施方案中，尾部序列包括基于ed的接头，其中序列包含ed的串联重复。在例示性实施方案中，尾部序列包含2-10、2-7、2-5、3-10、3-7、3-5、3、4或5个ed重复。在某些实施方案中，基于ed的尾部序列还可包括额外的氨基酸残基，如例如：ei、eid、es、ec、egs和egc。此类序列部分地基于已知的adnectin尾部序列，如eidkpsq(seqidno:593)，其中已经除去残基d和k。在例示性实施方案中，基于ed的尾部包含在ed重复之前的e、i或e1残基。在某些实施方案中，用已知接头序列(例如表3中的seqidno:629-678)将n或c端延伸序列连接到抗pd-l1adnectin序列。在一些实施方案中，可将序列置于10fn3域的c端以促进药动学模块的附接。例如，可将含有半胱氨酸的接头如gsgc(seqidno:638)添加到c端，以促进半胱氨酸残基上的位点定向聚乙二醇化。在某些实施方案中，可连接到c端氨基酸rt(即氨基酸94)的备选c端模块包含氨基酸pmxn，其中p是脯氨酸，x是任何氨基酸，m是至少1的整数且n为0或至少1的整数。在某些实施方案中，备选c端模块包含氨基酸pc。在某些实施方案中，备选c端模块包含氨基酸pi、pc、pid、pie、pidk(seqidno:605)、piek(seqidno:606)、pidkp(seqidno:607)、piekp(seqidno:608)、pidkps(seqidno:609)、piekps(seqidno:610)、pidkpc(seqidno:611)、piekpc(seqidno:612)、pidkpsq(seqidno:613)、piekpsq(seqidno:614)、pidkpcq(seqidno:615)、piekpcq(seqidno:616)、phhhhhh(seqidno:617)和pchhhhhh(seqidno:618)。在实施例和表3中提供了在其c端具有pc的例示性抗pd-l1adnectin。在某些实施方案中，本文所述的adnectin具有6xhis尾部(seqidno:619)。在某些实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白包含10fn3域，其具有备选的n端区序列和备选的c端区序列两者，和任选地6xhis尾。ii.抗pd-l1adnectin的生物学特性本文中提供了adnectin，其以10nm、1nm、0.5nm、0.1nm或更小的kd结合人pd-l1，如通过例如spr(biacore)测定，并且表现出下列特性中的一项或多项：1.将人pd-l1和人pd-1之间的相互作用抑制至少50％、70％、80％、90％或更多，如例如通过流式细胞术测定，例如使用人pd-1fc蛋白和人pd-l1阳性细胞，如l2987细胞；2.将人cd80(b7-1)对人pd-l1的结合抑制至少50％、70％、80％、90％或更多，如例如在elisa测定法中或者通过spr(biacore)测定；3.将抗pd-l1抗体12a4(记载于例如美国专利号7,943,743)对人pd-l1的结合抑制至少50％、70％、80％、90％或更多，如例如在elisa测定法中或者通过spr(biacore)测定；和4.在混合淋巴细胞反应(mlr)中抑制细胞增殖。在某些实施方案中，抗pd-l1adnectin以1nm或更小的kd结合人pd-l1，并且表现出特性1-4中的每一个。在某些实施方案中，抗pd-l1adnectin以0.1nm或更小的kd结合人pd-l1，并且表现出特性1-4中的每一个。本文中提供了adnectin，其包含与本文中所述的抗pd-l1adnectin或其部分(例如，bc、de和fg环)至少70％、80％、90％、95％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，以10nm、1nm、0.5nm、0.1nm或更小的kd结合人pd-l1，如例如通过spr(biacore)测定，并且表现出下列特征中的一项或多项：1.将人pd-l1和人pd-1之间的相互作用抑制至少50％、70％、80％、90％或更多，如例如通过流式细胞术测定，例如使用人pd-1fc蛋白和人pd-l1阳性细胞，如l2987细胞；2.将人cd80(b7-1)对人pd-l1的结合抑制至少50％、70％、80％、90％或更多，如例如在elisa测定法中或者通过spr(biacore)测定；3.将抗pd-l1抗体12a4对人pd-l1的结合抑制至少50％、70％、80％、90％或更多，如例如在elisa测定法中或者通过spr(biacore)测定；和4.在混合淋巴细胞反应(mlr)中抑制细胞增殖。在某些实施方案中，抗pd-l1adnectin包含与本文中所述的抗pd-l1adnectin或其部分(例如，bc、de和fg环)至少70％、80％、90％、95％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，以1nm或更小的kd结合人pd-l1，并表现出特性1-4中的每一种。在某些实施方案中，抗pd-l1adnectin包含与本文中所述的抗pd-l1adnectin或其部分(例如，bc、de和fg环)至少70％、80％、90％、95％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，以0.1nm或更小的kd结合人pd-l1，并表现出特性1-4中的每一种。在某些实施方案中，抗pd-l1adnectin与本文所述的特定抗pd-l1adnectin竞争(例如，交叉竞争)对pd-l1的结合。此类竞争性adnectin可基于其在标准pd-l1结合测定法中竞争性抑制本文所述的adnectin对pd-l1的结合的能力来鉴定。例如，可使用标准elisa测定法，其中将重组pd-l1蛋白质固定在平板上，adnectin之一是荧光标记的，并且评估非标记的adnectin竞争掉标记的adnectin的结合的能力。在某些实施方案中，可进行竞争性elisa形式以测定两种抗pd-l1adnectin是否结合pd-l1上重叠的adnectin结合位点。在一种形式中，将adnectin#1在板上涂覆，然后将其封闭并清洗。对该板添加单独的pd-l1或与饱和浓度的adnectin#2预温育的pd-l1。在合适的温育期后，清洗平板，并且用多克隆抗pd-l1抗体，如生物素化的抗pd-l1多克隆抗体探查，随后用链霉亲合素-hrp缀合物和标准四甲基联苯胺显影程序检测。如果od信号在具有或不具有与adnectin#2预温育的情况下是相同的，则两个adnectin彼此独立地结合，并且它们的adnectin结合位点不重叠。然而，如果接受pd-l1/adnectin#2混合物的孔的od信号低于接受单独的pd-l1的孔的od信号，则确认adnectin#2的结合阻断adnectin#1对pd-l1的结合。或者，通过表面等离振子共振(spr，例如biacore)进行类似的实验。将adnectin#1固定在spr芯片表面上，随后注射单独的pd-l1或与饱和浓度的adnectin#2预温育的pd-l1。如果pd-l1/adnectin#2混合物的结合信号与单独的pd-l1的结合信号相同或更高，则两个adnectin可彼此独立地结合，并且它们的adnectin结合位点不重叠。然而，如果pd-l1/adnectin#2混合物的结合信号低于单独的pd-l1的结合信号，则确认adnectin#2的结合阻断adnectin#1与pd-l1的结合。这些实验的特征是使用饱和浓度的adnectin#2。如果pd-l1未用adnectin#2饱和，则上述结论不成立。可以使用类似的实验来确定任何两种pd-l1结合蛋白是否结合重叠的adnectin结合位点。上文例示的这两种测定法也可以以相反的顺序进行，其中adnectin#2是固定的并且将pd-l1-adnectin#1添加到平板。或者，可用单克隆抗体和/或可溶性受体-fc融合蛋白替换adnectin#1和/或#2。在某些实施方案中，可使用htrf夹心测定法测定竞争。在某些实施方案中，竞争性adnectin是与本文所述的特定的抗pd-l1adnectin结合到pd-l1上的相同adnectin结合位点的adnectin。可使用标准定位技术如蛋白酶定位、突变分析、hdx-ms，x射线晶体学和2维核磁共振测定adnectin是否与参考adnectin结合相同的adnectin结合位点或表位(参见例如epitopemappingprotocolsinmethodsinmolecularbiology,vol.66,g.e.morris,ed.(1996))。表位由用于定位它的方法定义。例如，在某些实施方案中，pd-l1adnectin或抗体与本文所述的pd-l1adnectin之一结合相同的表位，如通过hdx-ms测定或通过x射线晶体学测定。候选竞争性抗pd-l1adnectin可将本文所述的抗pd-l1adnectin对pd-l1的结合抑制至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，在至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少97％，至少98％，或至少99％和/或它们的结合被抗pd-l1adnectin抑制至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少97％，至少98％，或至少99％。可使用上文所述的方法测定％竞争。本文提供了以10nm、1nm、0.5nm、0.1nm或更小的kd结合人pd-l1的adnectin，如通过例如通过spr(biacore)测定，并表现出以下特性中的一项或多项：1.将人pd-l1和人pd-1之间的相互作用抑制至少50％、70％、80％、90％或更多，如例如通过流式细胞术测定，例如使用人pd-1fc蛋白和人pd-l1阳性细胞，如l2987细胞；2.将人cd80(b7-1)对人pd-l1的结合抑制至少50％、70％、80％、90％或更多，如例如在elisa测定法中或者通过spr(biacore)测定；3.将抗pd-l1抗体12a4对人pd-l1的结合抑制至少50％、70％、80％、90％或更多，如例如在elisa测定法中或者通过spr(biacore)测定；4.在混合淋巴细胞反应(mlr)中抑制细胞增殖；和5.与本文中所述的抗pd-l1抗体竞争对人pd-l1的结合。在某些实施方案中，抗pd-l1adnectin以1nm或更小的kd结合人pd-l1，并表现出特性1-5中的每一项。在某些实施方案中，抗pd-l1adnectin以0.1nm或更小的kd结合人pd-l1，并表现出特性1-5中的每一项。本文提供了adnectin，其包含与本文所述的抗-pd-l1adnectin或其部分(例如，bc、de和fg环)至少70％，80％，90％，95％，97％，98％或99％相同的氨基酸序列，以10nm，1nm，0.5nm，0.1nm或更小的kd结合人pd-l1，如通过例如通过spr(biacore)测定，并表现出以下特性中的一项或多项：1.将人pd-l1和人pd-1之间的相互作用抑制至少50％、70％、80％、90％或更多，如例如通过流式细胞术测定，例如使用人pd-1fc蛋白和人pd-l1阳性细胞，如l2987细胞；2.将人cd80(b7-1)对人pd-l1的结合抑制至少50％、70％、80％、90％或更多，如例如在elisa测定法中或者通过spr(biacore)测定；3.将抗pd-l1抗体12a4对人pd-l1的结合抑制至少50％、70％、80％、90％或更多，如例如在elisa测定法中或者通过spr(biacore)测定；4.在混合淋巴细胞反应(mlr)中抑制细胞增殖；和5.与本文中所述的抗pd-l1抗体竞争对人pd-l1的结合。在某些实施方案中，抗pd-l1adnectin包含与本文所述的抗-pd-l1adnectin或其部分(例如，bc、de和fg环)至少70％，80％，90％，95％，97％，98％或99％相同的氨基酸序列，以1nm或更小的kd结合人pd-l1，并表现出特性1-5中的每一项。在某些实施方案中，抗pd-l1adnectin包含与本文所述的抗-pd-l1adnectin或其部分(例如，bc、de和fg环)至少70％，80％，90％，95％，97％，98％或99％相同的氨基酸序列，以0.1nm或更小的kd结合人pd-l1，并表现出特性1-5中的每一项。iii.融合物，其包含药动学模块在某些实施方案中，期望抗pd-l1adnectin具有短的半衰期，例如当用于诊断成像时。或者，例如，出于治疗目的，本文所述的抗-pd-l1adnectin还包含药动学(pk)模块。可根据感觉到的治疗需要评估改善的药动学。通常，期望提高生物利用度和/或增加剂量之间的时间，其可能通过增加蛋白质在给药后血清中保持可用的时间进行。在一些情况下，期望随着时间改善蛋白质血清浓度的连续性(例如，在施用后不久和在下次施用之前不久降低蛋白质的血清浓度差异)。可将抗pd-l1adnectin附接于模块，其相对于未修饰的抗pd-l1adnectin将哺乳动物(例如，小鼠、大鼠或人)中的多肽的清除率降低为小于1/2、小于1/3、小于1/4倍或小于1/5。改善药动学的其它措施可包括血清半衰期，其通常分为α期和β期。通过添加适当的模块可显著改善任一相或两相。例如，相对于单独的fn3域，pk模块可使多肽的血清半衰期增加5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150、200、400、600、800、1000％或更多。在本文中称为“pk模块”的减缓从血清中清除蛋白质的模块包括聚氧化烯模块(例如，聚乙二醇)、糖(例如唾液酸)和耐受良好的蛋白质模块(例如，fc及其片段和变体、转铁蛋白或血清清蛋白)。如美国公开号2007/0048282中所述，还可将抗pd-l1adnectin与清蛋白或清蛋白的片段(部分)或变体融合，或者可与一种或多种血清清蛋白结合性adnectin融合，如本文所述。可用于本发明的其它pk模块包括kontermann等,(currentopinioninbiotechnology2011；22:868-76)(其通过提述并入本文)中描述的那些。此类pk模块包括但不限于人血清清蛋白融合物、人血清清蛋白缀合物、人血清清蛋白结合剂(例如，adnectinpke、albudab、abd)、xten融合物、pas融合体(即，基于三个氨基酸脯氨酸、丙氨酸和丝氨酸的重组peg模拟物)、碳水化合物缀合物(例如羟乙基淀粉(hes))、糖基化、聚唾液酸缀合物和脂肪酸缀合物。因此，在一些实施方案中，本发明提供了与作为聚合糖的pk模块融合的抗pd-l1adnectin。在一些实施方案中，pk模块是聚乙二醇模块或fc区。在一些实施方案中，pk模块是血清清蛋白结合蛋白，例如美国公开号2007/0178082和2007/0269422中所述的血清清蛋白结合蛋白。在一些实施方案中，pk模块是人血清清蛋白。在一些实施方案中，pk模块是转铁蛋白。在一些实施方案中，通过多肽接头将pk模块与抗pd-l1adnectin连接。例示性多肽接头包括具有1-20、1-15、1-10、1-8、1-5、1-4、1-3或1-2个氨基酸的多肽。用于连接fn3域的合适的接头是允许单独的域彼此独立地折叠，形成允许对靶分子的高亲和力结合的三维结构的接头。合适的接头的具体实例包括基于甘氨酸-丝氨酸的接头、基于甘氨酸-脯氨酸的接头、脯氨酸-丙氨酸接头以及本文所述的任何其它接头。在一些实施方案中，接头是基于甘氨酸-脯氨酸的接头。这些接头包含甘氨酸和脯氨酸残基，并且长度可为3-30、10-30和3-20个氨基酸。此类接头的实例包括gpg、gpgpgpg(seqidno:672)和gpgpgpgpgpg(seqidno:673)。在一些实施方案中，接头是基于脯氨酸-丙氨酸的接头。这些接头包含脯氨酸和丙氨酸残基，并且长度可为3-30、10-30、3-20和6-18个氨基酸。此类接头的实例包括papapa(seqidno:674)、papapapapapa(seqidno:675)和papapapapapapapapa(seqidno:676)。在一些实施方案中，接头是基于甘氨酸-丝氨酸的接头。这些接头包含甘氨酸和丝氨酸残基，并且长度可为8-50、10-30和10-20个氨基酸。此类接头的实例包括gsgsgsgsgs((gs)5；seqidno:662)、gsgsgsgsgsgs((gs)6；seqidno:663)、gsgsgsgsgsgsgsgsgsgs((gs)10；seqidno:677)、ggggsggggsggggsggggs((g4s)4；seqidno:678)、ggggsggggsggggsggggsggggs((g4s)5；seqidno:670)和ggggsggggsgggsg(seqidno:671)。在例示性实施方案中，接头不含任何asp-lys(dk)对。表3中列出了一批合适的接头。鉴于本文提供的教导，可以通过常规实验来确定最佳接头长度和氨基酸组成。在一些实施方案中，例如通过具有蛋白酶位点的多肽接头将抗pd-l1adnectin连接到抗hsaadnectin，所述蛋白酶位点可被血液或靶组织中的蛋白酶切割。此类实施方案可用于释放抗pd-l1adnectin以获得更好的递送或治疗性质或更有效的生产。可在fn3域和多肽接头之间在fn3域的n端或c端引入另外的接头或间隔物。聚乙二醇在一些实施方案中，抗-pd-l1adnectin包含聚乙二醇(peg)。peg是商品化的或可以通过依照本领域公知的方法(sandlerandkaro,polymersynthesis,academicpress,newyork,vol.3,第138-161页)的乙二醇的开环聚合制备的公知的水溶性聚合物。术语“peg”广泛地用于涵盖任何聚乙二醇分子，而不考虑peg的末端的大小或修饰，并且可由下式表示：x—o(ch2ch2o)n-1ch2ch2oh，其中n为20至2300，并且x为h或末端修饰，例如c1-4烷基。peg可包含对于结合反应必需的其它化学基团，其源自分子的化学合成；或者其起间隔物作用以实现分子的各部分的最佳距离。此外，此类peg可由连接在一起的一个或多个peg侧链组成。具有超过一个peg链的peg称为多臂的或分支的peg。分支peg记载于例如欧洲公布申请号473084a和美国专利号5,932,462。可将一个或多个peg分子附接于蛋白质上的不同位置，并且此类附接可通过与胺、硫醇或其它合适的反应性基团起反应来实现。胺模块可为例如在多肽的n端找到的伯胺或存在于氨基酸，如赖氨酸或精氨酸中的胺基基团。在一些实施方案中，将peg模块附接于选自下组的多肽上的位置：a)n端；b)在n端和最n端的β链或β样链之间；c)位于与靶结合位点相对的多肽的表面上的环；d)c端和最c端的β链或β样链之间；和e)在c端。聚乙二醇化可通过定点聚乙二醇化实现，其中将合适的反应性基团引入蛋白质以创建聚乙二醇化优先发生的位点。在一些实施方案中，修饰蛋白质以在期望的位置处引入半胱氨酸残基，允许在半胱氨酸上的定点聚乙二醇化。可将突变引入蛋白质编码序列以产生半胱氨酸残基。这可通过例如将一个或多个氨基酸残基突变成半胱氨酸来实现。用于突变为半胱氨酸残基的优选氨基酸包括丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸和其它亲水性残基。优选地，要突变为半胱氨酸的残基是表面暴露的残基。用于基于一级序列或蛋白质预测残基的表面可接近性的算法在本领域中是公知的。或者，可通过比较结合多肽的氨基酸序列来预测表面残基，鉴于已经解析框架的晶体结构(基于此设计并且演化结合多肽)(参见himanen等,nature2001；414:933-8)，因此鉴定出表面暴露的残基。可使用例如peg-马来酰亚胺、peg-乙烯基砜、peg-碘乙酰胺或peg-邻吡啶基二硫化物实施半胱氨酸残基的聚乙二醇化。在某些实施方案中，如本文进一步描述的，将peg连接至c端半胱氨酸，例如已经添加到抗pd-l1adnectin的半胱氨酸，如以“pc”延伸的形式。peg通常用适合于与多肽上的期望位点偶联的合适的活化基团来活化。聚乙二醇化方法是本领域中公知的，并且进一步记载于zalipsky,s.,等,"useoffunctionalizedpoly(ethyleneglycols)formodificationofpolypeptides"于polyethyleneglycolchemistry:biotechnicalandbiomedicalapplications,j.m.harris,plenuspress,newyork(1992)，以及于zalipsky(1995)advanceddrugreviews16:157-182。peg可以分子量上广泛变化，并且可为支链或直链的。通常，peg的重均分子量为约100道尔顿至约150,000道尔顿。peg的例示性重均分子量包括约5,000道尔顿、约10,000道尔顿、约20,000道尔顿、约40,000道尔顿、约60,000道尔顿和约80,000道尔顿。在某些实施方案中，peg的分子量为40,000道尔顿。也可使用具有上述任一项的总分子量的peg的支化形式。在一些实施方案中，peg具有两个分支。在一些实施方案中，peg具有四个分支。在一些实施方案中，peg是双-peg(nofcorporation,de-200ma)，其中两个adnectin是缀合的(参见例如实施例1和表5的ati-1341)。本领域已知的常规分离和纯化技术可用于纯化聚乙二醇化的抗-pd-l1adnectin，如大小排阻(例如凝胶过滤)和离子交换层析。产物也可使用sds-page分离。可分离的产物包括单、二、三、聚和非聚乙二醇化的adnectin，以及游离的peg。通过合并在洗脱峰周围的较宽的级分可控制单peg缀合物的百分比，以增加组合物中单peg的百分比。约90％的单peg缀合物代表产率和活性的良好平衡。在一些实施方案中，聚乙二醇化的抗pd-l1adnectin将优选保留至少约25％，50％，60％，70％，80％，85％，90％，95％或100％的与未修饰的抗pd-l1adnectin相关的生物活性。在一些实施方案中，生物活性是指其结合pd-l1的能力，如通过kd、kon、或koff评估。在一些实施方案中，聚乙二醇化的抗pd-l1adnectin相对于未聚乙二醇化的抗pd-l1adnectin显示与pd-l1的结合增加。免疫球蛋白fc域(及片段)在某些实施方案中，将抗-pd-l1adnectin融合到免疫球蛋白fc域或其片段或变体。如本文中使用，“功能性fc区”是保留结合fcrn的能力的fc域或其片段。在一些实施方案中，功能性fc区结合fcrn，但是不拥有效应器功能。可通过本领域已知的标准结合测定法来测定fc区或其片段与fcrn结合的能力。在一些实施方案中，fc区或其片段结合fcrn并拥有天然fc区的至少一种“效应器功能”。例示性的“效应器功能”包括c1q结合；补体依赖性细胞毒性(cdc)；fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)；吞噬；细胞表面受体(例如，b细胞受体；bcr)的下调等。此类效应器功能通常需要将fc区与结合域(例如抗pd-l1adnectin)结合，并且可使用用于评估此类抗体效应器功能的本领域已知的各种测定法评估。“天然序列fc区”包含与自然界中找到的fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。“变体fc区”包含凭借至少一个氨基酸修饰与天然序列fc区不同的氨基酸序列。优选地，变体fc区与天然序列fc区或亲本多肽的fc区相比具有至少一个氨基酸取代，例如在天然序列fc区或亲本多肽的fc区中的约1至约10个氨基酸取代，优选约1至约5个氨基酸取代。本文的变体fc区优选与天然序列fc区和/或与亲本多肽的fc区拥有至少约80％的序列同一性，最优选与其至少约90％序列同一性，更优选与其至少约95％的序列同一性。在一个例示性实施方案中，fc区源自igg1亚类，然而也可使用其它亚类(例如，igg2，igg3和igg4)。下文显示了人igg1免疫球蛋白fc域的序列：dkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seqidno:620)。核心铰链序列是加下划线的，并且ch2和ch3区域为普通文本。应当理解，c端赖氨酸是任选的。也可使用该序列的同种异型和突变体。如本领域已知的，突变体可设计成调节fc的多种性质，例如adcc、cdc或半衰期。在某些实施方案中，抗pd-l1adnectin融合体中使用的fc区包含ch1区。在某些实施方案中，抗pd-l1adnectin融合体中使用的fc区包含ch2和ch3区。在某些实施方案中，抗pd-l1adnectin融合体中使用的fc区包含ch2、ch3和铰链区(例如，如seqidno:620所示)。在某些实施方案中，“铰链”区包含横跨igg1fc区的seqidno:620的位置1-16(dkthtcppcpapellg；seqidno:621)的核心铰链残基。在某些实施方案中，抗-pd-l1adnectin-fc融合物部分由于铰链区内seqidno:620的6和9位的半胱氨酸残基而采用多聚体结构(例如二聚体)。在seqidno:622-626中列出其它合适的例示性铰链区。adnectin在某些实施方案中，pk模块是对血清蛋白质(例如，人血清清蛋白)特异性的另一种adnectin，如记载于us2012/0094909，其通过提及完整并入本文。可与本文所述的adnectin一起使用的其它pk模块记载于kontermann等(currentopinioninbiotechnology2011；22:868-76)，如上文讨论的。在一些实施方案中，例如，可将抗pd-l1adnectin直接或通过聚合物接头间接连接到抗hsaadnectin。可使用聚合物接头最佳地改变融合物的每个组分之间的距离以创建具有一个或多个以下特征的蛋白质融合物：1)当结合感兴趣的蛋白质时，一个或多个蛋白质域的结合的减少或增加的空间位阻，2)增加的蛋白质稳定性或溶解度，3)降低的蛋白质聚集，和4)蛋白质的增加的总体亲合力或亲和力。在一些实施方案中，例如，通过生物相容性聚合物如聚合糖将抗pd-l1adnectin连接到抗hsaadnectin。聚合糖可包含酶促切割位点，其可被血液或靶组织中的酶切割。此类实施方案可用于释放抗pd-l1adnectin以获得更好的递送或治疗性质或更有效的生产。iv.核酸-蛋白质融合技术在一方面，本发明提供了包含结合pd-l1的纤连蛋白iii型域的adnectin。快速制备和测试具有特异性结合特性的fn3域的一种方式是adnexus，bristol-myerssquibbr&d公司的核酸-蛋白质融合技术。本公开利用体外表达和标签化技术，称为“profusion”，其利用核酸-蛋白质融合(rna-和dna-蛋白质融合)来鉴定对于结合蛋白质重要的新多肽和氨基酸基序。核酸-蛋白质融合技术是将蛋白质与其编码遗传信息共价偶联的技术。关于rna-蛋白融合技术和基于纤连蛋白的支架蛋白文库筛选方法的详细描述，参见szostak等,美国专利号6,258,558,6,261,804,6,214,553,6,281,344,6,207,446,6,518,018和6,818,418；roberts等,proc.natl.acad.sci.,1997；94:12297-12302；和kurz等,molecules,2000；5:1259-64，所有这些都通过提述并入本文。v.载体和多核苷酸本公开中还包括编码本文所述的任何蛋白质的核酸序列。如本领域技术人员所理解的，由于第三碱基简并性，几乎每个氨基酸可由编码核苷酸序列中的超过一个三联体密码子表示。此外，次要的碱基对变化可导致编码的氨基酸序列中的保守取代，但预期基本上不改变基因产物的生物学活性。因此，编码本文所述的蛋白质的核酸序列可在顺序上略微修饰，但仍编码其各自的基因产物。编码本文所述的抗pd-l1adnectin及其融合物的某些例示性核酸包括具有seqidno:16-19、31-34、46-49、61-64、76-79、92-95和108-111中列出的序列的核酸。还涵盖核酸序列，其与seqidno:16-19、31-34、46-49、61-64、76-79、92-95和108-111至少50％，如至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％，或至少99％相同，并且编码结合pd-l1的蛋白质。在一些实施方案中，引入核苷酸取代以不改变所得的翻译的氨基酸序列。可化学合成编码本文所述的各种蛋白质或多肽的任何一种的核酸。可选择密码子选择以改善细胞中的表达。此类密码子选择将取决于所选择的细胞类型。已经为大肠杆菌和其它细菌以及哺乳动物细胞、植物细胞、酵母细胞和昆虫细胞开发了专门的密码子选择模式。参见例如：mayfield等,proc.natl.acad.sci.usa,100(2):438-442(jan.21,2003)；sinclair等,proteinexpr.purif.,26(i):96-105(october2002)；connell,n.d.,curr.opin.biotechnol.,12(5):446-449(october2001)；makrides等,microbiol.rev.,60(3):512-538(september1996)；和sharp等,yeast,7(7):657-678(october1991)。用于核酸操作的一般技术记载于例如sambrook等,molecularcloning:alaboratorymanual,第2版,第1-3卷,coldspringharborlaboratorypress(1989)，或ausubel,f.等,currentprotocolsinmolecularbiology,greenpublishingandwiley-interscience,newyork(1987)和定期更新，其通过提述并入本文。通常，将编码多肽的dna可操作地连接到源自哺乳动物、病毒或昆虫基因的合适的转录或翻译调控元件。此类调控元件包括转录启动子、用于控制转录的任选的操纵子序列、编码合适的mrna核糖体结合位点的序列、以及控制转录和翻译终止的序列。另外掺入通常由复制起点赋予的在宿主中复制的能力以及促进转化体识别的选择基因。本文描述的蛋白质可不仅直接重组产生，而且可作为与异源多肽的融合多肽产生，所述异源多肽优选是在成熟蛋白或多肽的n端处具有特异性切割位点的信号序列或其它多肽。所选择的异源信号序列优选是被宿主细胞识别和加工(即由信号肽酶切割)的。用于在哺乳动物系统中产生多肽的例示性n端前导序列是：metdtlllwvllwvpgstg(seqidno:583)，其在表达后由宿主细胞除去。对于不识别和处理天然信号序列的原核宿主细胞，通过选自例如碱性磷酸酶、青霉素酶、1pp或热稳定性肠毒素ii前导物的原核信号序列替换信号序列。对于酵母分泌，可通过例如酵母转化酶前导物、因子前导物(包括酵母属和克鲁维酵母α因子前导物)或酸性磷酸酶前导物、白色念珠菌葡糖淀粉酶前导物或美国专利号5,631,144中描述的信号序列替换天然信号序列。在哺乳动物细胞表达中，可使用哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导物，例如单纯疱疹病毒gd信号。可以符合读码框的方式将此类前导物区的dna连接到编码蛋白质的dna上。表达和克隆载体都含有能够使载体在一个或多个选择的宿主细胞中复制的核酸序列。通常，在克隆载体中，该序列是能够使载体独立于宿主染色体dna复制的序列，并且包括复制起点或自主复制序列。此类序列对于多种细菌、酵母和病毒是公知的。来自质粒pbr322的复制起点适用于大多数革兰氏阴性细菌，2微米质粒起点适用于酵母，并且各种病毒起点(sv40、多瘤、腺病毒、vsv或bpv)可用于哺乳动物细胞中的克隆载体。通常，哺乳动物表达载体不需要复制起点组分(sv40起点通常可仅由于其含有早期启动子而使用)。表达和克隆载体可含有选择基因，也称为选择标志物。典型的选择基因编码蛋白质，其(a)赋予对抗生素或其它毒素，例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨喋呤或四环素的抗性，(b)互补营养缺陷型缺陷，或(c)提供从复合培养基中不可用的关键营养物，例如用于芽孢杆菌的编码d-丙氨酸消旋酶的基因。表达和克隆载体通常含有由宿主生物体识别并与编码本文所述蛋白质例如基于纤连蛋白的支架蛋白质的核酸可操作连接的启动子。适用于原核宿主的启动子包括phoa启动子、β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统，以及杂合启动子如tan启动子。然而，其它已知的细菌启动子是合适的。用于细菌系统的启动子还将含有与编码本文所述蛋白质的dna可操作地连接的shine-dalgarno(s.d.)序列。启动子序列对于真核生物是已知的。几乎所有的真核生物基因都有位于起始转录的位点上游约25到30个碱基的富含at的区域。从许多基因转录开始上游70至80个碱基找到的另一个序列是cncaat区域，其中n可为任何核苷酸。大多数真核基因的3'末端是aataaa序列，其可为将polya尾添加到编码序列的3'末端的信号。将所有这些序列适当地插入到真核表达载体中。用于酵母宿主的合适的启动序列的实例包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶，如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡糖激酶的启动子。自哺乳动物宿主细胞中载体的转录可例如通过从病毒(如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙肝病毒，最优选猿猴病毒40(sv40))基因组获得的启动子，自异源哺乳动物启动子(例如，肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子)，自热休克启动子控制，只要此类启动子与宿主细胞系统相容。经常通过对载体插入增强子序列来增加高等真核生物转录编码本文所述的蛋白质的dna。现在已知来自哺乳动物基因(珠蛋白、弹性蛋白酶、清蛋白、α-甲胎蛋白和胰岛素)的许多增强子序列。然而，通常会使用来自真核细胞病毒的增强子。实例包括复制起点晚期侧的sv40增强子(bp100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点晚期侧的多瘤增强子和腺病毒增强子。关于活化真核启动子的增强元件，还参见yaniv,nature,297:17-18(1982)。可在肽编码序列的5'或3'的位置处将增强子剪接到载体中，但优选位于来自启动子的5'位。用于真核宿主细胞(例如酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或其它多细胞生物体的有核细胞)中的表达载体也将含有终止转录和稳定mrna所必需的序列。此类序列通常可从真核或病毒dna或cdna的5'和偶尔3'非翻译区获得。这些区域含有在编码本文所述的蛋白质的mrna的非翻译部分中转录为多聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。一种有用的转录终止组分是牛生长激素多聚腺苷酸化区。参见wo94/11026及其中公开的表达载体。重组dna还可包含可用于纯化蛋白质的任何类型的蛋白质标签序列。蛋白质标签的实例包括但不限于组氨酸标签、flag标签、myc标签、ha标签或gst标签。用于细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主的合适的克隆和表达载体可参见cloningvectors:alaboratorymanual,(elsevier,newyork(1985))，其相关公开内容通过提述并入本文。使用适合于宿主细胞的方法将表达构建体导入宿主细胞中，这对本领域技术人员将是显而易见的。将核酸导入宿主细胞中的多种方法是本领域中已知的，包括但不限于电穿孔；使用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、deae-葡聚糖或其它物质的转染；微粒轰击；脂转染；和感染(其中载体是传染源)。合适的宿主细胞包括原核生物、酵母、哺乳动物细胞或细菌细胞。合适的细菌包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如大肠杆菌或芽孢杆菌。酵母，优选来自酿酒酵母属物种，如酿酒酵母，也可用于产生多肽。各种哺乳动物或昆虫细胞培养系统也可用于表达重组蛋白。用于在昆虫细胞中产生异源蛋白的杆状病毒系统由luckow等(bio/technology,6:47(1988))综述。合适的哺乳动物宿主细胞系的实例包括内皮细胞、cos-7猴肾细胞、cv-1、l细胞、c127、3t3、中国仓鼠卵巢(cho)、人胚胎肾细胞、hela、293、293t和bhk细胞系。通过培养合适的宿主/载体系统来表达重组蛋白质来制备纯化的多肽。对于许多应用，本文所述的许多多肽的小尺寸使在大肠杆菌中的表达成为优选的表达方法。然后，从培养基或细胞提取物纯化蛋白质。vi.蛋白质产生本文还描述了表达抗pd-l1adnectin或其融合多肽的细胞系。可以使用本领域已知的标准技术(例如本文所述的那些)来实现产生抗pd-l1adnectin的细胞系的产生和分离。用本文描述的用于蛋白质产生的表达或克隆载体转化宿主细胞，并在适合于诱导启动子、选择转化体或扩增编码期望序列的基因的情况下修饰的常规营养培养基中培养。本发明的adnectin还可通过在例如原核细胞(例如大肠杆菌)中产生adnectin而以无糖基化形式获得。值得注意的是，当在体外测试时，本文所述的adectinins的无糖基化形式表现出与糖基化adnectin相同的亲和力、效力和作用机制。可在多种培养基中培养用于产生本发明的蛋白质的宿主细胞。商品化的培养基如汉克氏(ham's)f10(sigma)，极限必需培养基((mem),(sigma)，rpmi-1640(sigma)，和dulbecco改良的eagle培养基((dmem),sigma))适用于培养宿主细胞。此外，ham等,meth.enzymol.,58:44(1979),barites等,anal.biochem.,102:255(1980),美国专利号4,767,704,4,657,866,4,927,762,4,560,655,5,122,469,6,048,728,5,672,502或美国专利号re30,985中描述的许多培养基可用作宿主细胞的培养基。任何这些培养基可根据需要补充有激素和/或其它生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(如hepes)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如庆大霉素药物)、微量元素(定义为通常以微摩尔范围内的终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或等同能源。也可以以本领域技术人员已知的适当浓度包括任何其它必需的补充剂。培养条件如温度、ph等是先前与选择用于表达的宿主细胞一起使用的，并且对于本领域普通技术人员是显而易见的。也可使用无细胞翻译系统来产生本文所述的蛋白质。为了此类目的，编码多肽的核酸必须修饰为允许体外转录产生mrna并允许mrna在利用的特定的无细胞系统(真核的，如哺乳动物或酵母无细胞翻译系统，或原核的，如细菌无细胞翻译系统)中的无细胞翻译。还可通过化学合成产生本文所述的蛋白质(例如，通过solidphasepeptidesynthesis,第2版,thepiercechemicalco.,rockford,ill.(1984)中描述的方法)来生产。也可通过化学合成产生对蛋白质的修饰。可通过蛋白质化学领域中通常已知的蛋白质的分离/纯化方法纯化本发明的蛋白质。非限制性实例包括提取、重结晶、盐析(例如用硫酸铵或硫酸钠)、离心、透析、超滤、吸附层析、离子交换层析、疏水层析、正相层析、反相层析、过滤、凝胶渗透层析、亲和层析、电泳、逆流分布或这些的任何组合。纯化后，可以通过本领域已知的多种方法中的任一种(包括但不限于过滤和透析)将多肽交换成不同的缓冲液和/或浓缩。纯化的多肽优选是至少85％纯的，或优选至少95％纯的，最优选至少98％纯的。不管纯度的确切数值如何，多肽足够纯以用作药物产品。高通量蛋白质生产(htpp)将选择的结合剂在his6标签上游克隆到pet9d载体中，并转化到大肠杆菌bl21de3plyss细胞中，并以24孔形式接种于含有50μg/ml卡那霉素的5mllb培养基中并在37℃生长过夜。制备新鲜的5mllb培养基(50μg/ml卡那霉素)培养物用于可诱导表达，通过从过夜培养物中抽取200μl并将其分配到合适的孔中进行。将培养物在37℃培养到a6000.6-0.9。用1mm异丙基-β-硫代半乳糖苷(iptg)诱导后，在30℃表达培养物6小时，并通过在4℃以2750g离心10分钟收获。通过在450μl裂解缓冲液(50mmnah2po4、0.5mnacl、1xcompletetm蛋白酶抑制剂混合物-无edta(roche)、1mmpmsf、10mmchaps、40mm咪唑、1mg/ml溶菌酶、30μg/mldna酶、2μg/mlaprotonin,ph8.0)裂解细胞沉淀(以24孔形式)，并在室温摇动1-3小时。将裂解物澄清，并且通过转移到配备有96孔1.2ml捕获盘的96孔whatmangf/dunifilter中再分配到96孔形式中，并通过正压过滤。将澄清的裂解物转移到已经用平衡缓冲液(50mmnah2po4、0.5mnacl、40mm咪唑，ph8.0)平衡的96孔镍或钴螯合板，并温育5分钟。通过正压除去未结合的材料。用清洗缓冲液#1(50mmnah2po4,0.5mnacl,5mmchaps,40mm咪唑，ph8.0)以0.3ml/孔将树脂清洗两次。通过正压除去每次清洗。洗脱前，用50μl洗脱缓冲液(pbs+20mmedta)清洗每孔，温育5分钟，并通过正压弃去清洗液。通过向每个孔再添加100μl的洗脱缓冲液来洗脱蛋白质。在室温温育30分钟后，将板以200g离心5分钟，并且将在含有5μl0.5mmgcl2的96孔捕获板中收集的洗脱蛋白质添加到洗脱捕获板的底部，之后洗脱。使用用野生型10fn3域作为蛋白质标准品的总蛋白质测定法量化洗脱的蛋白质。基于纤连蛋白的不溶性支架蛋白质结合剂的中等规模表达和纯化为了表达不溶性克隆，将后面有his6标签的克隆克隆到pet9d(emdbioscience，sandiego，ca)载体中，并在大肠杆菌hms174细胞中表达。使用20ml接种物培养物(由单个铺板菌落产生)接种1升含有50μg/ml羧苄西林和34μg/ml氯霉素的lb培养基。在37℃培养培养物直至a6000.6-1.0。用1mm异丙基-β-硫代半乳糖苷(iptg)诱导后，在30℃培养培养物4小时，并且在4℃以>10,000g离心30分钟收获。将细胞沉淀在-80℃冷冻。使用匀浆器(ika工作)在冰上将细胞沉淀重悬浮于25ml裂解缓冲液(20mmahah2p04,0.5mnacl,lx完全蛋白酶抑制剂混合物-无edta(roche),immpmsf,ph7.4)。通过使用m-1型10s(microfluidics)的高压匀浆(>18,000psi)实现细胞裂解。通过在4℃以23,300g离心30分钟分离不溶级分。从裂解物离心回收的不溶性沉淀用20mm磷酸钠/500mmnacl，ph7.4清洗。通过超声处理将沉淀在20mm磷酸钠/500mnaclph7.4中的6.0m盐酸胍中再溶解，然后在37度温育1-2小时。将再溶解的沉淀过滤至0.45μm，并加载到用20mm磷酸钠/500mnacl/6.0m胍ph7.4缓冲液平衡的histrap柱上。加载后，用相同的缓冲液将柱再清洗25个cv。用在20mm磷酸钠/500mmnacl/6.0m胍-hclph7.4中的50mm咪唑洗脱结合的蛋白质。通过对50mm乙酸钠/150mmnaclph4.5的透析重折叠纯化的蛋白质。基于纤连蛋白的可溶性支架蛋白质结合剂的中等规模表达和纯化为了表达可溶性克隆，将后面有his6标签的克隆克隆到pet9d(emdbioscience,sandiego,ca)载体中，并在大肠杆菌hms174细胞中表达。使用20ml接种物培养物(由单个铺板菌落产生)接种1升含有50μg/ml羧苄西林和34μg/ml氯霉素的lb培养基。在37℃培养培养物直至a6000.6-1.0。用1mm异丙基-β-硫代半乳糖苷(iptg)诱导后，在30℃培养培养物4小时，并且在4℃以>10,000g离心30分钟收获。将细胞沉淀在-80℃冷冻。使用匀浆器(ika工作)在冰上将细胞沉淀重悬浮于25ml裂解缓冲液(20mmnah2po4,0.5mnacl,lx完全蛋白酶抑制剂混合物-无edta(roche),immpmsf,ph7.4)。通过使用m-1型10s(microfluidics)的高压匀浆(>18,000psi)实现细胞裂解。通过在4℃以23,300g离心30分钟分离可溶级分。通过0.45μm过滤器澄清上清液。将澄清的裂解物加载到用20mm磷酸钠/500mnaclph7.4预平衡的histrap柱(ge)上。然后将柱用25个柱体积的相同缓冲液洗涤，接着用20个柱体积的20mm磷酸钠/500mnacl/25mm咪唑,ph7.4洗涤，然后用35柱体积的20mm磷酸钠/500mnacl/40mm咪唑,ph7.4洗涤。用15个柱体积的20mm磷酸钠/500mnacl/500mm咪唑,ph7.4洗脱蛋白质，基于a2so处的吸光度合并级分，并对1xpbs，50mmtris，150mmnacl；ph8.5或50mmnaoac；150mmnacl；ph4.5透析。通过在0.22μm过滤除去任何沉淀物。vii.组合物本发明还提供了组合物，如药物组合物和放射性药物组合物，其包含本文所述的抗pd-l1adnectin或其融合蛋白，其中组合物基本上不含内毒素，或至少含有仅仅可接受水平的内毒素，如由适当的管理机构(如fda)确定。本发明的组合物可为用于口服施用的丸剂、片剂、胶囊、液体或持续释放片剂的形式；用于静脉内、皮下或肠胃外施用的液体；或用于局部施用的凝胶、洗剂、软膏、霜剂或聚合物或其它持续释放媒介物。用于制备组合物的本领域公知的方法参见例如"remington:thescienceandpracticeofpharmacy"(第20版,a.r.gennaroar.编,2000,lippincottwilliams&wilkins,philadelphia,pa.)。用于胃肠外施用的组合物可例如含有赋形剂、无菌水、盐水、聚亚烷基二醇如聚乙二醇、植物来源的油或氢化萘。生物相容性、可生物降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物可用于控制化合物的释放。可使用纳米颗粒组合物(例如可生物降解的纳米颗粒、固体脂质纳米颗粒、脂质体)来控制化合物的生物分布。其它潜在有用的肠胃外递送系统包括乙烯-乙酸乙烯酯共聚物颗粒、渗透泵、可植入输注系统和脂质体。组合物中化合物的浓度随许多因素而变化，包括待施用的药物的剂量、施用途径和组合物的目的(例如预防、治疗、诊断)。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在使用的剂量和浓度时对接受无毒，并且包括缓冲液，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六氯化铵；苯扎氯铵，苄索氯铵；酚，丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清清蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合剂如edta；糖类如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；盐形成抗衡离子如钠；金属络合物(例如zn-蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂如tween、pluronictm(普兰尼克)或聚乙二醇(peg)。可任选地以药学上可接受的盐，例如通常用于制药业中的无毒的酸加成盐或金属络合物施用本发明的多肽。酸加成盐的实例包括有机酸如乙酸、乳酸、双羟萘酸、马来酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、琥珀酸、苯甲酸、棕榈酸、辛二酸、水杨酸、酒石酸、甲磺酸、甲苯磺酸或三氟乙酸等；聚合酸，如单宁酸、羧甲基纤维素等；和无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸等。金属络合物包括锌，铁等。在一个实例中，在乙酸钠的存在下配制多肽以增加热稳定性。也可在微胶囊中包埋活性成分，所述微胶囊例如通过凝聚技术或者通过界面聚合制备，例如分别在胶体药物递送系统(例如脂质体、清蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)中或在粗乳液中的羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。在remington'spharmaceuticalsciences16thedition,osol,a.编(1980)中公开了此类技术。可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适实例包括含有本文所述蛋白质的固体疏水性聚合物的半透性基质，所述基质为成形制品，例如薄膜或微胶囊形式。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利号3,773,919)、l-谷氨酸和y乙基-l-谷氨酸盐的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如luprondepottm(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球)和聚-d-(-)-3-羟基丁酸。虽然聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸能够释放分子超过100天，但某些水凝胶释放蛋白质达较短的时间段。虽然本文所述的包囊的蛋白质可长时间保持在体内，但由于在37℃下暴露于水分的结果，它们可能变性或聚集，导致生物活性的丧失和免疫原性的可能变化。根据所涉及的机制，可设计出用于稳定化的合理策略。例如，如果发现聚集机制是通过硫代二硫化物交换形成分子间s-s键，则可通过修饰巯基残基，自酸性溶液冻干，控制含水量，使用合适的添加剂和开发特定的聚合物基质来实现稳定化。用于口服使用的本发明的组合物包括含有与无毒的药学上可接受的赋形剂的混合物中的活性成分的片剂。这些赋形剂可为例如惰性稀释剂或填充剂(例如蔗糖和山梨醇)、润滑剂、助流剂和抗粘合剂(例如硬脂酸镁、硬脂酸锌、硬脂酸、二氧化硅、氢化植物油或滑石)。口服使用的组合物还可作为咀嚼片或作为硬明胶胶囊提供，其中活性成分与惰性固体稀释剂混合，或作为软明胶胶囊提供，其中活性成分与水或油介质混合。要用于体内施用的药物组合物通常必须是无菌的。这可通过无菌过滤膜过滤来实现。在冻干组合物的情况下，使用该方法的灭菌可在冷冻干燥和重建之前或之后进行。用于肠胃外施用的组合物可以冻干形式或溶液中贮存。此外，肠胃外组合物通常放置在具有无菌进入口的容器中，例如具有可被皮下注射针刺穿的塞的静脉内溶液袋或小瓶。一旦已配制药物组合物，其可作为溶液、悬浮液、凝胶、乳液、固体或脱水或冻干的粉末贮存在无菌小瓶中。此类配制剂可以即用形式或以施用前需要重建的形式(例如，冻干)贮存。本文的组合物还可含有如对于所治疗的具体适应症必需的超过一种活性化合物，优选具有不会相互影响的互补活性的活性化合物。此类分子合适地以对意图目的有效的量组合存在。viii.生物物理和生物化学表征可根据平衡常数(例如，解离，kd)和动力学常数(例如，结合速率常数kon和解离速率常数koff)评估本文描述的抗pd-l1adnectin与pd-l1的结合。adnectin通常以小于500nm、100nm、10nm、1nm、500pm、200pm或100pm的kd结合靶分子，尽管koff足够低或者kon足够高时可容许较高的kd值。用于结合亲和力的体外测定法可使用各种体外测定法鉴定结合并且拮抗pd-l1的抗pd-l1adnectin。在某些实施方案中，测定法是允许同时筛选多个候选adnectin的高通量测定法。用于测定抗pd-l1adnectin的结合亲和力的例示性测定法包括但不限于溶液相方法，如动力学排除测定法(kinexa)(blake等,jbc1996；271:27677-85；drake等,analbiochem2004；328:35-43)、用biacore系统(uppsala，sweden)的表面等离振子共振(spr)(welford等,opt.quant.elect1991；23:1；morton和myszka,methodsinenzymology1998；295:268)和均相时间分辨荧光(htrf)测定法(newton等,jbiomolscreen2008；13:674-82；patel等,assaydrugdevtechnol2008；6:55-68)。在某些实施方案中，可用biacore系统实时监测生物分子相互作用，所述biacore系统使用spr来检测由于表面折射率变化直至300nm而在玻璃支持物上的薄金膜表面处的光共振角的变化。biacore分析产生结合速率常数、解离速率常数、平衡解离常数和亲和常数。通过使用biacore表面等离振子共振系统(biacore，inc.)评估结合和解离速率常数获得结合亲和力。活化生物传感器芯片用于靶物的共价偶联。然后，将靶物稀释并在芯片上注射，以获得固定化材料的以响应单位计的信号。由于以共振单位(ru)计的信号与固定化材料的质量成正比，这表示基质上固定化的靶标密度范围。在全局分析中同时拟合结合和解离数据以解析1:1双分子相互作用的净速率表达，产生kon、koff和rmax(饱和时的最大响应)的最佳拟合值。用于结合的平衡解离常数kd由spr测量结果作为koff/kon计算。在一些实施方案中，本文所述的抗pd-l1adnectin在实施例2中描述的spr亲和力测定中表现出500nm或更小、400nm或更小、300nm或更小、200nm或更小、150nm或更小、100nm或更小、90nm或更小、80nm或更小、70nm或更小、60nm或更小、50nm或更小、40nm或更小、30nm或更小、20nm或更小、15nm10nm或更小、5nm或更小、或1nm或更小的kd。应当理解，上文所述的测定法是例示性的，并且本领域已知的用于确定蛋白质之间的结合亲和力的任何方法(例如，基于荧光的转移(fret)、酶联免疫吸附测定法和竞争性结合测定法(例如，放射免疫测定法))可用于评估本文所述的抗-pd-l1adnectin的结合亲和力。ix.用抗pd-l1adnectin的体内成像成像剂本文所述的抗pd-l1adnectin还可用于多种诊断和成像应用。在某些实施方案中，用在体内可检测的模块标记抗pd-l1adnectin，并且此类经标记的adnectin可用作体内成像剂，例如用于全身成像。例如，在一个实施方案中，用于检测受试者中的pd-l1阳性肿瘤的方法包括向受试者施用与可检测标记物连接的抗pd-l1adnectin，并且在适当的时间之后，检测受试者中的标记物。抗pd-l1adnectin成像剂可用于诊断与增加的pd-l1水平相关的病症或疾病，例如其中肿瘤选择性过表达pd-l1的癌症。以类似的方式，抗pd-l1adnectin可用于监测受试者(例如为了降低pd-l1水平和/或pd-l1阳性细胞(例如，肿瘤细胞)而治疗的受试者)中的pd-l1水平。可在有或没有修饰的情况下使用抗pd-l1adnectin，并且可通过可检测模块的共价或非共价附接来标记。可使用的可检测模块包括放射性药剂，例如：放射性重金属如铁螯合物，钆或锰的放射性螯合物，氧，氮，铁，碳或镓的正电子发射体，18f,60cu,61cu,62cu,64cu,124i,86y,89zr,66ga,67ga,68ga,44sc,47sc,11c,111in,114min,114in,125i,124i,131i,123i,131i,123i,32cl,33cl,34cl,74br,75br,76br,77br,78br,89zr,186re,188re,86y,90y,177lu,99tc,212bi,213bi,212pb,225ac或153sm。在某些实施方案中，放射性药剂在一个或多个氨基酸残基处与adnectin缀合。在某些实施方案中，标记的探针中可存在一个或多个，如两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个，或更多数目的放射性核素。在某些实施方案中，通过螯合剂将放射性核素直接附接于adnectin(例如参见美国专利8,808,665)。在某些实施方案中，放射性核素存在于通过双功能螯合剂或缀合(bfc)模块与adnectin缀合的辅基中。在某些实施方案中，放射性核素螯合剂和/或缀合模块是dfo、dota及其衍生物(cb-do2a、3p-c-depa、tcmc、oxo-do3a)、dbco、te2a、cb-te2a、cb-te1a1p、cb-te2p、mm-te2a、dm-te2a、diamsar和衍生物、nodasa、nodaga、nota、neta、tacn-tm、dtpa、1b4m-dtpa、chx-a”-dtpa、trap(prp9)、nopo、aazta和衍生物(data)、h2dedpa、h4octapa、h2azapa、h5decapa、h6phospa、hbed、shbed、bpca、cp256、pcta、heha、pepa、edta、teta和基于trita的螯合剂、及其紧密类似物和衍生物。在某些实施方案中，放射性核素螯合或缀合(bfc)模块是马来酰胺-nodaga或马来酰胺-dbco，其可通过多肽c末端附近的半胱氨酸残基与多肽共价附接。在某些实施方案中，通过添加半胱氨酸在其c末端修饰抗pd-l1adnectin。例如，可将pxcy连接到氨基酸残基nyrt的c端，其中p是脯氨酸，c是半胱氨酸，并且x和y是至少1的整数。在实施例中列出了在其c端具有氨基酸残基pc的例示性抗pd-l1adnectin。马来酰亚胺-nodaga或马来酰亚胺-dbco可与半胱氨酸起反应，以分别产生adnectin-nodaga或adnectin-dbco。在某些实施方案中，放射性核素螯合剂是dfo，其可例如在随机的表面赖氨酸处附接。在某些实施方案中，64cu的螯合剂是dota、nota、edta、df、dtpa或teta。在price等,chemsocrev2014；43:260-90中广泛综述了螯合剂和放射性核素的合适组合。在某些实施方案中，用pet示踪剂18f标记抗pd-l1adnectin。18f是一种具有1.8小时放射性半衰期的有吸引力的pet放射性核素，其提供了单日成像工具，其中pet放射性核素更好地与adnectin的生物半衰期相匹配，从而在对患者的放射暴露较小的情况下产生了卓越的图像。可用辅基标记pd-l1adnectin，如[18f]-3-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-氟吡啶([18f]-ffpega)，如实施例中进一步描述的。如实施例中进一步所示，18f标记的抗pd-l1adnectin特异性且有效地标记小鼠中的人pd-l1阳性肿瘤和猕猴中的pd-l1阳性肿瘤。在下文和实施例中提供关于标记方法的具体细节。在某些实施方案中，pd-l1成像剂是用64cu标记的抗pd-l1adnectin，例如如实施例中所述。可用螯合剂，例如nodaga将64cu连接到adnectin。如实施例中进一步所示，64cu标记的抗pd-l1adnectin特异性且有效地标记小鼠中的人pd-l1阳性肿瘤和猕猴中的pd-l1阳性肿瘤。还可使用用于用放射性核素(如64cu和18f)标记多肽来合成本文所述的基于抗pd-l1adnectin的成像剂的其它本领域公认的方法。参见例如us2014/0271467；gill等,natureprotocols2011；6:1718-25；berndt等nuclearmedicineandbiology2007；34:5-15,inkster等,bioorganic&medicinalchemistryletters2013；23:3920-6，其内容通过提及整体并入本文。在某些实施方案中，pd-l1成像剂包含peg分子(例如5kdapeg、6kdapeg、7kdapeg、8kdapeg、9kdapeg或10kdapeg)，以将成像剂的血液pk增加小的增量，从而增强成像对比度或增加基于抗pd-l1adnectin的成像剂的亲合力。施用和成像在某些实施方案中，标记的抗pd-l1adnectin可用于成像pd-l1阳性细胞或组织，例如表达pd-l1的肿瘤。例如，将标记的抗pd-l1adnectin以足以将标记的adnectin吸收到感兴趣的组织(例如，pd-l1表达性肿瘤)中的量施用于受试者。然后使用成像系统如pet对受试者进行成像，其时间适用于所使用的特定放射性核素。然后通过成像系统检测标记的抗pd-l1adnectin结合的pd-l1表达细胞或组织，例如pd-l1表达性肿瘤。可使用用pd-l1成像剂的pet成像来定性或定量检测pd-l1。可使用pd-l1成像剂作为生物标志物，并且受试者中pd-l1阳性信号的存在或不存在可指示，例如，受试者将响应给定的疗法(例如癌症治疗)，或者受试者响应疗法与否。在某些实施方案中，可将疾病(例如肿瘤)进展或消退成像作为时间或治疗的函数。例如，可在经历癌症疗法(例如，化疗，放疗)的受试者中监测肿瘤的大小，并可基于经标记的抗pd-l1adnectin的检测来实时监测肿瘤消退的程度。导致将成像剂(例如，18f-adnectin成像剂，64cu-adnectin成像剂)摄入到感兴趣的细胞或组织(例如肿瘤)中的有效量可取决于多种因素，包括例如，宿主的年龄、体重、一般健康、性别和饮食；施用时间；施用途径；采用的特定探针的排泄速率；治疗的持续时间；与采用的具体组合物组合或同时使用的其它药物的存在；和其它因素。在某些实施方案中，在施用经标记的抗pd-l1adnectin之前，期间和之后实现表达pd-l1的组织的成像。在某些实施方案中，受试者是哺乳动物，例如人、狗、猫、猿、猴、大鼠或小鼠。在某些实施方案中，本文所述的抗pd-l1adnectin可用于肺、心、肾、肝和皮肤和其它器官，或者与表达pd-l1的这些器官相关的肿瘤的pet成像。在某些实施方案中，抗pd-l1成像剂提供至少50％、75％、2、3、4、5或更多的对比度。实施例显示了使用的所有抗pd-l1adnectin均提供2或更多的pet对比度，并且adnectin的亲和力并不重要。当用于用短半衰期放射性核素(例如18f)成像(例如，pet)时，优选静脉内施用放射性标记的抗pd-l1adnectin。其它施用途径也是合适的，并且取决于使用的放射性核素的半衰期。在某些实施方案中，使用本文所述的抗pd-l1成像剂通过向受试者施用本文公开的抗pd-l1成像剂并检测成像来检测受试者中的pd-l1阳性细胞剂，检测的成像剂限定受试者中pd-l1阳性细胞的位置。在某些实施方案中，通过正电子发射断层摄影术检测成像剂。在某些实施方案中，使用本文所述的抗pd-l1成像剂通过向受试者施用本文公开的抗pd-l1成像剂并检测成像剂来检测受试者中表达pd-l1的肿瘤，检测的成像剂限定受试者中肿瘤的位置。在某些实施方案中，通过正电子发射断层摄影术检测成像剂。在某些实施方案中，通过将成像剂施用于受试者并通过正电子发射断层摄影术在体内成像成像剂的分布获得本文所述的抗pd-l1成像剂的图像。本文公开了获得表达pd-l1的组织或细胞的定量图像的方法，所述方法包括使细胞或组织与本文所述的抗pd-l1成像剂接触，并使用正电子发射断层摄影术检测或量化表达pd-l1的组织。本文还公开了检测pd-l1表达性肿瘤的方法，其包括向具有pd-l1表达性肿瘤的受试者施用成像有效量的本文所述的抗pd-l1成像剂，并使用正电子发射断层摄影术检测在肿瘤中所述成像剂的放射性发射，其中在肿瘤中检测到放射性发射。本文中还公开了诊断受试者中的pd-l1表达性肿瘤的存在的方法，所述方法包括：(a)对有此需要的受试者施用本文中所述的成像剂；并且(b)获得所述受试者的至少一部分的放射性图像以检测所述成像剂的存在或缺乏；其中高于背景的所述成像剂的存在和位置指示所述疾病的存在和位置。本文中还公开了监测受试者中针对pd-l1表达性肿瘤的抗肿瘤疗法的进展的方法，所述方法包括：(a)在第一时间点对有此需要的受试者施用本文中所述的成像剂，并且获得所述受试者的至少一部分的图像以确定所述肿瘤的大小；(b)对所述受试者施用抗肿瘤疗法；(c)在一个或多个后续时间点对所述受试者施用所述成像剂，并且在每个时间点获得所述受试者的至少一部分的图像；其中在每个时间点所述肿瘤的尺寸和位置指示所述疾病的进展。pet图像通常，对于pet成像目的，期望以单一静脉内输注给接受体提供在约1mg至200mg范围内的adnectin剂量，尽管在情况叙述时也可施用较低或较高剂量。通常，对于典型的成年人来说，期望给接受体提供在每平方米体面积约1mg至10mg蛋白质或肽的范围内的剂量，尽管在情况叙述时也可施用较低或较高剂量。可施用于人受试者用于成像目的的剂量蛋白质或肽的实例为约1至200mg、约1至70mg、约1至20mg和约1至10mg，尽管也可使用较高或较低剂量。在某些实施方案中，以每天约0.005μg/kg体重至约50μg/kg体重，通常0.02μg/kg体重至约3μg/kg体重的经标记的adnectin的量发生施用。与pet示踪剂相关联的质量为天然同位素(例如用于18fpet示踪剂的19f)的形式。本组合物的特定分析剂量包括约0.5μg至约100μg的经放射性标记的蛋白质。剂量通常为约1μg至约50μg的经放射性标记的蛋白质。调整剂量方案以提供用于获得摄取放射性标记的adnectin的组织或细胞的清晰图像的最佳可检测量。以剂量单位形式配制肠胃外组合物以便于施用和剂量一致性是特别有利的。如本文中使用，剂量单位形式是指适合作为接受放射性标记的adnectin施用的受试者的单位剂量的物理离散单位。本文描述的剂量单位形式的规格由以下各项规定并且直接依赖于以下各项：(a)放射性标记的adnectin的靶向部分的独特特征：(b)要靶向的组织或细胞；(c)使用的成像技术固有的限制。对于放射性标记的adnectin的施用，使用的剂量将取决于疾病类型、所使用的靶向化合物、受试者的年龄、身体状况和性别、疾病程度、待检查部位等。特别地，必须足够注意对受试者的暴露剂量。优选地，向患者施用饱和剂量的放射性标记物(例如18f或64cu)。例如，18f标记的adnectin的放射性量的范围通常为3.7兆贝可(megabecquerel)到3.7吉贝可(gigabecquerel)，优选是18兆贝可到740兆贝可。或者，剂量可通过例如毫居里测量。在一些实施方案中，为了成像研究施用的18f成像的量为5至10mci。在一些实施方案中，有效量将是足以产生约1-5mci范围内的发射的化合物的量。本文所述的药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以变化，以获得一定量的活性成分，其在对患者无毒性的情况下有效实现放射性标记的adnectin在特定患者的细胞或组织中的期望摄取、组合物和施用方式。然而，应当理解，本公开的放射性标记的adnectin的总每日使用将由主治内科医生或其它主治专业人员在合理的医学判断范围内决定。任何特定受试者的具体有效剂量水平将取决于多种因素，包括例如采用的特定组合物的活性；采用的具体组合物；宿主的年龄、体重、一般健康、性别和饮食；施用时间；施用路径；采用的特定化合物的排泄速率；治疗的持续时间；与所使用的特定组合物组合使用的其它药物、化合物和/或材料、所治疗的患者的年龄、性别、重量、状况、一般健康和先前医学史以及医学领域中公知的类似的因素。在某些实施方案中，对于成像需要的对人受试者施用的放射性标记的adnectin的量将由处方内科医生确定，剂量通常随放射性核素的发射量变化。可使用本领域已知的多种方法中的一种或多种通过一种或多种施用途径施用本文所述的组合物。本领域技术人员将理解，施用途径和/或模式将随期望的结果而变化。本文所述的放射性标记的adnectin的优选施用途径包括静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内、皮下、脊髓或其它肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。如本文中使用，术语“肠胃外施用”是指通常通过注射的与肠和表面施用不同的施用模式，并且包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心脏内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。或者，本文所述的放射性标记的adnectin可通过非肠胃外途径施用，例如表面、表皮或粘膜施用途径，例如鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或表面。在某些实施方案中，可配制本文所述的放射性标记的adnectin以确保体内适当分布。例如，血脑屏障(bbb)排除许多高亲水性化合物。药剂可通过例如在脂质体中配制它们穿过bbb。关于制备脂质体的方法，参见例如美国专利4,522,811；5,374,548；和5,399,331。脂质体可包含一个或多个模块，其被选择性转运到特定细胞或器官中，从而增强靶向的药物递送(参见例如v.v.ranade(1989)j.clin.pharmacol.29:685)。例示性靶向模块包括叶酸或生物素(参见例如low等的美国专利5,416,016)；甘露糖苷(umezawa等,(1988)biochem.biophys.res.commun.153:1038)；抗体(p.g.bloeman等(1995)febslett.357:140；m.owais等(1995)antimicrob.agentschemother.39:180)；表面活性剂蛋白a受体(briscoe等(1995)am.j.physiol.1233:134)；p120(schreier等(1994)j.biol.chem.269:9090)；还参见k.keinanen；m.l.laukkanen(1994)febslett.346:123；j.j.killion；i.j.fidler(1994)。例示性pet程序当对临床中的患者进行pet成像研究时，可使用以下说明性程序。将20g两英寸静脉导管插入对侧尺静脉用于放射性示踪剂施用。pet示踪剂的施用的时机通常与血液中抗pd-l1adnectin浓度的最大值(tmax)或最小值(tmin)的时间一致。将患者定位在pet照相机中，并且通过静脉注射导管施用放射性标记的抗pd-l1adnectin的pet示踪剂，如[18f]-adx_5417_e01(<20mci)的示踪剂剂量。在整个pet扫描中以15个适当的时间间隔采集动脉或静脉血样品，以分析和定量血浆中[18f]-adx_5417_e01的未代谢的pet示踪剂的分数。获取图像长达120分钟。在注射放射性示踪剂的10分钟之内并且在成像期结束时，获得1ml血样品用于确定可已经在pet示踪剂之前施用的任何未标记的抗pd-l1adnectin的血浆浓度。通过图像重建获得体层摄影图像。为了确定放射性示踪剂的分布，在重建图像上绘制感兴趣区域(roi)，包括但不限于肺、肝、心、肾、皮肤或其它器官和组织(例如癌组织)。使用在这些区域中随时间的放射性示踪剂摄取产生在所检查的各种给药范例在不存在任何干预的情况下或者在存在未标记的抗pd-l1adnectin的情况下获得的时间活性曲线(tac)。数据表示为每单位体积每单位时间的放射性(μci/cc/mci注射剂量)。x.用抗pd-l1adnectin检测pd-l1除了在体内检测pd-l1之外，可使用抗pdl1adnectin，例如本文所述的那些抗pdl1adnectin来检测样品中的靶分子。方法可包括使样品与本文所述的抗-pd-l1adnectin接触，其中所述接触在允许抗pd-l1adnectin-靶复合物形成的条件下进行；并检测所述复合物，由此检测所述样品中的所述靶物。可使用任何本领域公认的技术进行检测，如例如放射线照相术、免疫测定法、荧光检测、质谱术或表面等离振子共振。样品可来自人或其它哺乳动物。为了诊断目的，合适的药剂是可检测标记物，其包括用于全身成像的放射性同位素和用于样品测试的放射性同位素、酶、荧光标记物和其它合适的抗体标签。可检测标记物可以是目前在体外诊断领域中使用的各种类型中的任何一种，包括颗粒标记物，包括金属溶胶如胶体金，同位素如例如与n2s2、n3s或n4型肽螯合物一起呈现的i125或tc99，生色团包括荧光标志物、生物素、发光标志物、磷光标志物等，以及将给定底物转化为可检测标志物的酶标记物，以及如通过聚合酶链反应扩增后揭示的多核苷酸标签。然后，可通过亲合素或链霉亲合素结合检测生物素化的抗体。合适的酶标记物包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等。例如，标记物可为酶碱性磷酸酶，其通过测量1,2-二氧杂环丁烷(1,2dioxetane)底物如金刚烷基甲氧基磷酰氧基苯基二氧杂环丁烷(amppd)，3-(4-(甲氧基螺[{1,2-二氧杂环丁烷-3,2'-(5'-氯)三环{3.3.1.13,7}癸烷}-4-基)苯基磷酸二钠(cspd)，以及cdp和或本领域技术人员公知的其它发光底物，例如合适的镧系元素如铽(iii)和铕(iii)的螯合物转化后化学发光的存在或形成来检测。其它标记物包括上文在成像部分中列出的那些标记物。检测手段由所选择的标记物确定。可使用肉眼(在标记物是微粒并以适当水平积累的情况下)，或使用仪器，如分光光度计、发光计、荧光计等(都依照标准实践)实现标记物或其反应产物的出现。在某些实施方案中，缀合方法导致基本(或几乎)非免疫原性的连接，例如肽-(即酰胺-)、硫化物-、(空间位阻)、二硫化物-、腙-和醚键。这些连接几乎是非免疫原性的并且在血清中显示出合理的稳定性(参见例如senter,p.d.,curr.opin.chem.biol.13(2009)235-244；wo2009/059278；wo95/17886)。根据模块和adnectin的生物化学性质，可采用不同的缀合策略。在模块是天然存在的或50至500个氨基酸之间的重组多肽的情况下，教科书中有描述蛋白质缀合物合成化学的标准程序，其可由本领域技术人员容易地遵循(参见例如hackenberger,c.p.r.和schwarzer,d.,angew.chem.int.ed.engl.47(2008)10030-10074)。在一个实施方案中，使用马来酰亚胺模块与adnectin或模块内的半胱氨酸残基的反应。或者，进行与adnectin的c端的偶联。可进行蛋白质的c端修饰，如例如sunbul,m.和yin,j.,org.biomol.chem.7(2009)3361-3371中所述)。当模块是肽或多肽时，可通过标准遗传融合(任选地用本文公开的接头)融合adnectin和模块。通常，位点特异性反应和共价偶联是基于将天然氨基酸转化成具有与存在的其它官能团的反应性正交的反应性的氨基酸。例如，可在醛中酶促转化罕见序列背景内的特定半胱氨酸(参见frese,m.a.和dierks,t.,chembiochem.10(2009)425-427)。也可能通过利用某些酶与在给定的序列背景中天然氨基酸的特异性酶反应性获得期望的氨基酸修饰(参见例如taki,m.等,prot.eng.des.sel.17(2004)119-126；gautier,a.等chem.biol.15(2008)128-136。c--n键的蛋白酶催化形成描述于bordusa,f.,highlightsinbioorganicchemistry(2004)389-403。位点特异性反应和共价偶联也可通过末端氨基酸与合适的修饰试剂的选择性反应来实现。n端半胱氨酸与苯甲腈的反应性(参见ren,h.等,angew.chem.int.ed.engl.48(2009)9658-9662)可用于实现位点特异性共价偶联。天然化学连接也可依赖于c端半胱氨酸残基(taylor,e.vogel；imperiali,b,nucleicacidsandmolecularbiology(2009),22(proteinengineering),65-96)。ep1074563描述了一种缀合方法，其基于在带负电荷的氨基酸的区段内的半胱氨酸比位于带正电荷的氨基酸的区段中的半胱氨酸的反应更快。模块也可为合成肽或肽模拟物。在化学合成多肽的情况下，可在此类合成期间引入具有正交化学反应性的氨基酸(参见例如degraaf,a.j.等,bioconjug.chem.20(2009)1281-1295)。由于极其多种正交官能团在危险中(atstake)并且可引入到合成肽中，此类肽与接头的缀合是标准化学。为了获得单标记的多肽，可通过层析将具有1:1化学计量的缀合物与其它缀合副产物分离。可通过使用染料标记的结合对成员和带电荷的接头促进此程序。通过使用这种标记的且高度带负电荷的结合对成员，单缀合多肽容易与非标记的多肽和携带超过一个接头的多肽分离，因为可使用电荷和分子量的差异进行分离。荧光染料可用于从未结合的组分(如标记的一价结合剂)纯化复合物。xi.合成18f标记的抗pd-l1adnectin可通过首先制备18fr放射性标记的辅基，将adnectin连接到双功能性螯合剂，然后组合这两种试剂而合成18f标记的抗pd-l1adnectin(参见例如图9)。18f放射性标记的辅基在一个方面，本文提供了18f放射性标记的化合物，其包含用于生物正交反应的辅基，其涉及在耐水条件下选择性进行的叠氮化物和环辛炔之间的1,3-偶极环加成。本文公开的18f放射性标记的辅基可溶于100％水溶液中，并且不需要有机相将辅基连接到本文公开的抗pd-l1adnectin。该特征是特别有利的，因为不需要有机相来将辅基连接到抗pd-l1adnectin，其由于降解和聚集问题而不能承受甚至少量有机溶剂。另外，与脂肪族辅基不同，可用uv监测18f氟化反应，并且本文所述的18f放射性标记的辅基不是挥发性的。此外，可使用无铜点击化学物质(例如，如实施例中所述)将18f放射性标记的辅基掺入抗pd-l1adnectin中，因此避免了当使用铜介导的点击化学时在一些生物制剂中观察到的稳定性问题。在一个方面，本文提供了共价结合到具有以下结构的叠氮化物的聚乙二醇化的18f-吡啶，其中x是1至8的整数。在某些实施方案中，x是2至6的整数。在一些实施方案中，x是3至5的整数。在某些实施方案中，x是4。在某些实施方案中，将18f附接于n原子邻位的吡啶。在某些实施方案中，相对于吡啶环上的氮，[o(ch2)2]x模块以1-3构型存在。在某些实施方案中，相对于吡啶环上的氮，[o(ch2)2]x模块以1-2构型存在。在某些实施方案中，相对于吡啶环上的氮，[o(ch2)2]x模块以1-4构型存在。在某些实施方案中，18f放射性标记的化合物具有以下结构：其中x是1至8的整数。在某些实施方案中，x是1至6的整数。在一些实施方案中，x是3至5的整数。在某些实施方案中，x是4。在某些实施方案中，18f放射性标记的化合物具有以下结构：其中x是1至8的整数。在某些实施方案中，x是1至6的整数。在某些实施方案中，x是3至5的整数。在某些实施方案中，x是4。在某些实施方案中，18f放射性标记的化合物是[18f]-3-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-氟吡啶(18f-fppega)并且具有以下结构：在某些实施方案中，18f放射性标记的辅基可含有吡啶环上的另外的基团，其不干扰氟化反应。在某些实施方案中，对吡啶环的添加包括c1-6烷基基团，例如甲基、乙基和丙基。在某些实施方案中，18f放射性标记的辅基是具有以下结构的稠合环系统：其中"opeg"是[o(ch2)2]x，并且x是1至8的整数。在某些实施方案中，x是1至6的整数。在某些实施方案中，x是3至5的整数。在某些实施方案中，x是4。可使用本文实施例中所述的化学反应产生本文中所述的18f放射性标记的辅基。本文中还提供了制备与具有以下结构的叠氮化物共价结合的聚乙二醇化18f-吡啶的方法，其中x是1至8的整数，所述方法包括以下步骤：(a)提供具有以下结构的化合物a的溶液：a其中x是1至8的整数，并且r是no2、br、f或并且与吡啶环的n原子是邻位的；(b)提供18o水中的18f、4,7,13,16,21,24-己氧基-1,10-二氮杂双环[8.8.8]二十六烷和弱碱的混合物；c)干燥来自步骤b)的混合物以形成固体；并且d)使来自步骤a)的溶液与来自步骤c)的固体起反应以形成18f标记的化合物。在某些实施方案中，方法产生具有以下结构b的18f-吡啶辅基：(其中18f是n原子邻位的)，并且包括以下步骤：a)提供以下结构的化合物的溶液(其中x是n原子邻位的)，其中x是no2、br或b)提供18o水中的18f、4,7,13,16,21,24-己氧基-1,10-二氮杂双环[8.8.8]二十六烷和弱碱，如k2co3的混合物；c)干燥来自步骤b)的混合物以形成固体；并且d)使来自步骤a)的溶液与来自步骤c)的固体起反应以形成18f标记的化合物。在某些实施方案中，方法进一步包括依照下文显示的方案1产生具有以下结构a的化合物的步骤：在某些实施方案中，方法包括依照以下反应条件从d产生18f-吡啶辅基是[18f]-3-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-氟吡啶(18f-fppega),e：18f放射性标记的pd-l1adnectin在一些方面中，本文中提供了18f放射性标记的具有以下结构的探针或药剂，其中蛋白质是pd-l1adnectin，并且x是1至8的整数。在某些实施方案中，x是1至6的整数。在某些实施方案中，x是3至5的整数。在一些实施方案中，x是4。bfc可在本文中公开的18f-放射性标记的组合物中使用的双功能性螯合或缀合(bfc)模块是商品化的(例如sigmaaldrich；clickchemistrytools)，或者可以依照公知的化学反应合成。在某些实施方案中，bfc选自基于环辛炔的螯合剂(例如dbco,dibo),dfo,dota及其衍生物(cb-do2a,3p-c-depa,tcmc,oxo-do3a),te2a,cb-te2a,cb-te1a1p,cb-te2p,mm-te2a,dm-te2a,diamsar及衍生物,nodasa,nodaga,nota,neta,tacn-tm,dtpa,1b4m-dtpa,chx-a”-dtpa,trap(prp9),nopo,aazta及衍生物(data),h2dedpa,h4octapa,h2azapa,h5decapa,h6phospa,hbed,shbed,bpca,cp256,pcta,heha,pepa,edta,teta和基于trita的螯合剂，以及其紧密类似物和衍生物。螯合剂和放射性核素的合适的组合广泛描述于price等,chemsocrev2014；43:260-90。在某些实施方案中，bfc是包含反应性基团的环辛炔，所述反应性基团与靶向蛋白质或肽上的胺、羧基、羰基或硫醇官能团形成共价键。在环辛炔上的反应性基团包括酯、酸、羟基、氨基氧基、马来酰亚胺、α-卤代酮和α-卤代乙酰胺。在某些实施方案中，bfc是环辛炔是二苯环辛炔(dibo)、二芳基氮杂环辛炔酮(barac)、二甲氧基氮杂环辛炔(dimac)和二苯环辛炔(dbco)。在某些实施方案中，环辛炔是dbco。在某些实施方案中，环辛炔包含亲水性聚乙二醇(peg)y间隔物臂，其中y为1至8的整数。在某些实施方案中，y为2至6的整数。实施方案中，y为4或5。在某些实施方案中，bfc是与伯胺(例如，赖氨酸残基或氨基硅烷涂覆的表面的侧链)特异性且有效起反应的dbco-peg4-nhs-酯或dbco-磺基-nhs-酯。在某些实施方案中，bfc是具有末端羧酸(-cooh)的dbco-peg4-酸，所述末端羧酸可在存在形成稳定酰胺键的活化剂(例如edc)的情况下与伯胺基或仲胺基团起反应。在某些实施方案中，bfc是在活化剂(例如edc或dcc)存在下与羧基或与形成稳定酰胺键的活化酯(例如nhs酯)起反应的dbco-peg4-胺。在某些实施方案中，bfc是dbcm-peg4-马来酰亚胺，其与半胱氨酸残基上的巯基起反应，例如在多肽的c端或附近。在某些实施方案中，通过添加半胱氨酸在其c端修饰多肽。例如，可将pmcn连接到多肽的c端氨基酸残基，其中p是脯氨酸，c是半胱氨酸，m是至少0的整数，并且n是至少1的整数。用于做出此类修改的方法是本领域公知的。在某些实施方案中，18f放射性标记的探针或药剂具有以下结构a，其中所述bfc在半胱氨酸残基处与所述蛋白质(例如，抗-pd-l1adnectin)缀合。根据本文所述的程序使用适合于在体内直接使用的培养基(例如盐水)中的生物正交、无金属化学产生本文描述的18f放射性标记的靶向剂。xii.治疗方法使用抗pd-lladnectin的癌症患者的免疫疗法pd-l1是在实体肿瘤内上调的主要pd-1配体，在所述实体瘤处它可分别抑制pd-1阳性、肿瘤浸润性cd4+和cd8+t细胞的细胞因子产生和细胞溶解活性(dong等,2002；hino等,2010；taube等,2012)。这些性质使得pd-l1成为癌症免疫疗法的有希望的靶物。例如，如wo2013/173223(通过提及整体并入本文)所述的用抗pd-l1免疫疗法的临床试验证明了免疫抑制性配体pd-l1的mab(单克隆抗体)阻断产生转移性nsclc、mel、rcc和ov患者(包括用广泛的在前疗法的患者)的持久的肿瘤消退和延长(>24周)疾病稳定。因此，靶向pd-l1，例如使用pd-l1adnectin，适用于引发抗肿瘤响应。基于wo2013/173223中公开的临床数据，本文描述了用于对患有癌症的受试者的免疫疗法的方法，该方法包括向受试者施用包含治疗有效量的本文所述的pd-l1adnectin的组合物。本公开还提供了抑制受试者中肿瘤细胞生长的方法，包括向受试者施用本文所述的pd-l1adnectin。在某些实施方案中，受试者是人。在wo2013/173223中描述了通过靶向pd-l1治疗具有癌症的受试者的详细方法。在某些实施方案中，适用于本文所述的方法的本文所述的pd-l1adnectin具有以下特征中的一项或多项：对人pd-l1的高亲和力，增加t细胞增殖，增加例如自t细胞的il-2分泌，增加例如自t细胞的干扰素-γ产生，抑制pd-l1与pd-1的结合，并且逆转t调节细胞对t细胞效应细胞和/或树突状细胞的抑制影响。adnectin药物缀合物(adnectin-dc)可以通过半胱氨酸，例如c端半胱氨酸将本文所述的adnectin与治疗剂缀合以形成免疫缀合物，如adnectin-药物偶联物(“adnectin-dc”)。在adnectin-dc中，将adnectin与药物缀合，其中adnectin-dc发挥靶向剂功能，用于将adnectin引导到表达其抗原的靶细胞，例如癌细胞。优选地，抗原是肿瘤相关抗原，即由癌细胞独特表达或过表达的抗原。一旦在那里，药物在靶细胞内或其附近释放，起到治疗剂的作用。关于如与抗体一起使用的药物缀合物的作用机制和使用的综述，例如在癌症疗法中，参见schrama等,naturerev.drugdisc.2006,5,147。用于药物缀合物的合适的治疗剂包括抗代谢物、烷化剂、dna小沟结合剂、dna嵌入剂、dna交联剂、组蛋白脱乙酰酶抑制剂、核出口抑制剂、蛋白酶体抑制剂、拓扑异构酶i或ii抑制剂、热休克蛋白抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、抗生素和抗有丝分裂剂。在adnectin-dc中，adnectin和治疗剂优选通过可切割的接头，如肽基、二硫化物或腙接头缀合。更优选地，接头是肽基接头，如val-cit,ala-val,val-ala-val,lys-lys,pro-val-gly-val-val(seqidno:169),ala-asn-val,val-leu-lys,ala-ala-asn,cit-cit,val-lys,lys,cit,ser或glu。可依照与美国专利号7,087,600；6,989,452；和7,129,261；pctpublicationswo02/096910；wo07/038658；wo07/051081；wo07/059404；wo08/083312；和wo08/103693；美国专利公开文本20060024317；20060004081；和20060247295中描述的方法类似的方法制备adnectin-dc；其公开内容通过提述并入本文。可将接头自身连接(例如共价连接，例如使用马来酰亚胺化学)到多肽的半胱氨酸，例如多肽的c端或其附近的半胱氨酸，例如，附接于多肽的c端氨基酸残基的pmcn模块的半胱氨酸，其中m为至少0的整数(例如，0、1或2)，并且n为至少1的整数(例如1或2)。例如，可将接头共价连接到半胱氨酸，如adnectin的c端区中的半胱氨酸，例如adnectin-dc-pmcn的pc中的c端半胱氨酸，其中m和n独立地为至少1的整数。例如，可将接头连接到adnectin-dc-pmcn，其中p是脯氨酸，c是半胱氨酸，并且m和n是至少1，例如1-3的整数。在某些实施方案中，m为0，即半胱氨酸之前无脯氨酸。可如本领域已知的那样使用马来酰亚胺化学进行与半胱氨酸的连接(例如，taylor,e.vogel；imperiali,b,nucleicacidsandmolecularbiology(2009),22(proteinengineering),65-96)。为了将接头附接于adnectin上的半胱氨酸，接头可例如包含马来酰亚胺模块，该模块然后与半胱氨酸起反应以形成共价键。在某些实施方案中，优化半胱氨酸周围的氨基酸以促进化学反应。例如，半胱氨酸可围绕有带负电荷的氨基酸，用于相对于围绕有带正电荷的氨基酸的区段的半胱氨酸的更快反应(ep1074563)。对于癌症治疗，药物优选是导致靶向癌细胞死亡的细胞毒性药物。可用于adnectin-dcs的细胞毒性药物包括以下类型的化合物及其类似物和衍生物：(a)烯二炔，如加利车霉素(参见例如lee等,j.am.chem.soc.1987,109,3464和3466)和uncialamycin(参见例如davies等,wo2007/038868a2(2007)和chowdari等,us8,709,431b2(2012))；(b)tubulysins(参见例如domling等,us7,778,814b2(2010)；cheng等,us8,394,922b2(2013)；和cong等,us2014/0227295a1；(c)cc-1065和多卡米星(参见例如boger,us6,5458,530b1(2003)；sufi等,us8,461,117b2(2013)；和zhang等,us2012/0301490a1(2012))；(d)埃博霉素(参见例如vite等,us2007/0275904a1(2007)和usre42930e(2011))；(e)auristatins(参见例如senter等,us6,844,869b2(2005)和doronina等,us7,498,298b2(2009))；(f)吡咯苯并二氮杂卓(pyrrolobezodiazepine，pbd)二聚体(参见例如howard等,us2013/0059800a1(2013)；us2013/0028919a1(2013)；和wo2013/041606a1(2013))；和(g)美登木素生物碱(maytansinoids)，如dm1和dm4(参见例如chari等,us5,208,020(1993)和amphlett等,us7,374,762b2(2008))。可通过pd-l1adnectin治疗的例示性癌症本文所述的pd-l1adnectin可适用于治疗通常不认为免疫响应的一大批癌症，包括治疗难治性转移性nsclc。可使用本文所述的pd-l1adnectin治疗的例示性癌症包括mel(例如转移性恶性黑素瘤)、rcc、鳞状nsclc、非鳞状nsclc、crc、卵巢癌(ov)、胃癌(gc)、乳腺癌(bc)、胰腺癌(pc)和食管癌。此外，本文所述的pd-l1adnectin适用于治疗难治性或复发性恶性肿瘤。基于wo2013/173223中公开的抗pd-l1免疫疗法的非常广泛的适用性的适应症，可使用pd-l1adnectin治疗的癌症的非限制性实例包括骨癌、皮肤癌、头或颈癌、乳腺癌、肺癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、肾癌、子宫癌、去势抗性前列腺癌、结肠癌、直肠癌、肛门区癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、卵巢癌、胃肠道和乳腺癌、霍奇金氏病、非霍奇金氏淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病，包括急性髓样白血病、慢性髓样白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、儿童实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(cns)新生物、原发性cns淋巴瘤、肿瘤血管发生、脊柱轴肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、t细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、环境诱导的癌症，包括由石棉诱导的那些、转移性癌症和所述癌症的任何组合。pd-l1adnectin也适用于治疗转移性癌症。用pd-l1adnectin的联合疗法在某些实施方案中，本文所述的pd-l1adnectin可与免疫原性药剂，例如癌性细胞的制备物、纯化的肿瘤抗原(包括重组蛋白、肽和碳水化合物分子)、抗原呈递细胞如携带肿瘤相关抗原的树突细胞，以及用编码免疫刺激细胞因子的基因转染的细胞(he等，2004)组合。可使用的肿瘤疫苗的非限制性实例包括黑素瘤抗原肽，如gp100的肽、mage抗原、trp-2、marti和/或酪氨酸酶，或转染以表达细胞因子gm-csf的肿瘤细胞。pd-l1阻断也可有效地与标准的癌症治疗组合，包括化疗方案、放射、手术、激素剥夺和血管生成抑制剂，以及另一种免疫治疗抗体(例如抗pd-1、抗ctla-4和抗lag-3抗体)。抗pd-l1adnectin的药物和用途本文所述的抗pd-l1adnectin可用于制备药物，用于抑制来自pd-1/pd-l1途径的信号传导，从而由此增强患有癌症的受试者中的内源免疫应答。本公开还提供了本文所述的任何抗pd-l1adnectin用于制备用于患有癌症的受试者的免疫疗法的药物的用途。本公开提供本文所述的任何抗pd-l1adnectin的医疗用途，其对应于采用本文所述的pd-l1adnectin的治疗方法的所有实施方案。本文还描述了用于治疗患有癌症的受试者的抗pd-l1adnectin，包括通过抑制来自pd-1/pd-l1途径的信号传导在患有癌症的受试者中增强内源免疫应答。本公开进一步提供抗pd-l1adnectin，其用于免疫治疗患有癌症的受试者，包括破坏pd-1和pd-l1之间的相互作用。这些抗pd-l1adnectin可用于增强针对本文中所述的完整癌症范围的内源免疫应答或者用于本文中所述的完整癌症范围的免疫疗法。在某些实施方案中，癌症包括mel(例如转移性恶性mel)、rcc、鳞状nsclc、非鳞状nsclc、crc、卵巢癌(ov)、胃癌(gc)、乳腺癌(bc)、胰腺癌(pc)和食管癌。传染性疾病本文还描述了用于治疗已经暴露于特定毒素或病原体的患者的方法。例如，在某些方面中，本公开提供了治疗受试者中的传染病的方法，包括向受试者施用本文所述的抗pd-l1adantiin，以对受试者治疗传染病。类似于其对如上文讨论的肿瘤的应用，adnectin介导的pd-l1阻断可单独使用或作为佐剂与疫苗组合使用以加强对病原体、毒素和/或自身抗原的免疫应答。此治疗方法可为特别有用的病原体的实例包括目前没有有效疫苗的病原体，或常规疫苗小于完全有效的病原体。这些包括但不限于hiv、肝炎(甲、乙和丙型)、流感、疱疹、贾第虫、疟疾、利什曼原虫、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌。pd-l1阻断针对由媒介物，如在感染过程里呈现改变的抗原的hiv建立的感染特别有用。这些抗原上的新表位在抗pd-l1adnectin施用时认为是外源的，因此激发不受经由pd-1/pd-l1途径的负信号抑制的强t细胞应答。在上述方法中，pd-l1阻断可与本领域已知的其它形式的免疫疗法，如细胞因子治疗(例如，施用干扰素、gm-csf、g-csf或il-2)组合。xiii.试剂盒和制品本文所述的抗-pd-l1adnectin可以以试剂盒，预定量的试剂的包装组合以及用于本文所述的治疗或诊断方法的说明书提供。例如，在某些实施方案中，提供了含有可用于治疗或预防本文所述的病症或状况，或用于本文所述的检测方法的物质的制品。制品包含容器和标签。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器和试管。容器可由多种材料，如玻璃或塑料形成。容器可以容纳用于体内成像的本文所述的组合物，并且可以具有无菌进入口(例如，容器可为具有可被皮下注射针刺穿的塞的静脉内溶液袋或小瓶)。组合物中的活性剂是本文所述的抗pd-l1adnectin。制品可进一步包含第二容器，其包含药学上可接受的缓冲液，如磷酸盐缓冲盐水、林格溶液和右旋糖溶液。它还可包括从商业和用户观点看期望的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、滤器、针、注射器和具有使用说明书的包装插页。在某些实施方案中，试剂盒包含形成18f标记的抗pd-l1adnectinin体内成像剂必需的一种或多种试剂，如pd-l1adnectin-peg4-dbco-18f，如本文进一步描述。例如，试剂盒可含有包含抗-pd-l1adnectin-peg-4-dbco的第一小瓶和包含[18f]fppega的第二小瓶。试剂盒可含有包含抗pd-l1adnectin-peg-4-dbco的第一小瓶、包含4-peg-甲苯磺酰叠氮化物的第二小瓶和包含o18水中的18f的第三小瓶。试剂盒还可包含制造pd-l1adnectin-peg4-dbco-18f必需的小瓶、溶液和任选地另外的试剂。类似地，试剂盒可包含用于形成64cu标记的抗pd-l1adnectin必需的试剂，如本文所述的试剂。通过提述并入通过提述个别并入本文所述的所有文件和参考文献，包括专利文件和网站，其程度就像在本文件中完全或部分书写一样。现在通过参考以下实施例来描述本发明，所述实施例仅是说明性的，并不意图限制本发明。虽然已经参照本发明的具体实施方案详细描述了本发明，但是对于本领域技术人员显而易见的是，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对其进行各种改变和修改。实施例实施例1：鉴定pd-l1结合性adnectin从用人pd-l1蛋白筛选的adnectin文库中分离抗pd-l1adnectin，或从文库中鉴定的克隆通过profusion亲和力成熟。在图1和表3中呈现这些adnectin的全长序列、核心序列、bc、de和fg环序列以及具有“pc”修饰的c端的变体。例如，通过亲和力成熟ati-964adnectin获得高亲和力抗pd-l1adnectinadx_5322_a02(“a02”)。通过在编码环bc、de或fg中的残基的每个核苷酸位置处引入少量的非野生型核苷酸，将编码ati-964的基因重新多样化。然后，通过profusion(mrna展示)将所得到的与ati-964相关的adnectin序列文库进行体外选择，以在高严格性条件下与人pd-l1结合。对完成选择后富集的克隆进行测序，以htpp形式表达，并筛选其结合pd-l1的能力及其单体性(monomericity)分数。将具有对pd-l1的亲和性和强力的生物物理性质的最佳组合的克隆进行突变以包含c端半胱氨酸，首先用c端序列nyrtpch6(鉴定为adx_5322_a02的形式)，后来用c端序列nyrtpc。遵循相同方法以亲和力成熟ati-967，产生adnectinadx_5417_e01。类似地，通过ati_1422_g05的亲和力成熟获得亲和力成熟的ati_1760_c02、ati_1760_e01(“e01”)和ati_1760_f01。分离另外的抗人pd-l1adnectin。表3中列出其序列。加his标签的抗pd-l1adnectin的表达和纯化所有dna构建体都含有n端his标签，随后是tvmv识别序列。将上文描述的抗pd-l1adnectin的表达质粒(pet-28nn载体)转化到bl21(de3)细胞(newenglandbiolabs)中。将细胞在overnightexpressautoinduction培养基(novagen)中在37℃在1l摇瓶中培养6小时，然后在220rpm在20℃培养16小时。通过离心收获细胞并悬浮于pbsph7.2中。将细胞机械裂解，然后通过离心澄清。通过重力进料到ni-nta琼脂糖树脂(qiagen)结合可溶性级分，在20mmtris+10mm咪唑ph8.0中清洗，然后用20mmtris+40mm咪唑ph8.0清洗，并用20mmtris+400mm咪唑ph8.0洗脱。镍洗脱液以1:23倍摩尔过量的adnectin掺有tvmv蛋白酶。将tvmv-adnectin洗脱液混合物在4℃对20mmtrisph8.0透析16小时。为了分离tvmv蛋白酶并切割his标签片段，将样品加载到10mlhistrapff柱(gehealthcare)上，并收集流过(flowthrough)级分。实施例2：pd-l1adnectin的生物物理学评估评估ati-1420d05、ati-1420d05、at1-1421e04和ati-1422g05、ati_1760_c02、ati_1760_e01和ati_1760_e01的结合特性。表1：抗pd-l1adnectin的结合特性序列名称seqidkd(nm)ati-1420b092.5ati-1420d059.5at1-1421e045.6表2中显示了纯化的ati-964、ati-967、ati-968、adx_5322_a02和adx_5417_e01adnectin与人或猕猴pd-l1的结合性质，如通过biacore测定的。通过测量与人pd-l1阳性细胞l2987的结合确定细胞结合。表2：抗pd-l1adnectin的生物物理性质结合数据指示亲和力成熟的抗人pd-l1adnectin以小于1nm或甚至小于0.1nm的亲和力结合人pd-l1。图12中显示了例示性的抑制曲线。抗pd-l1adnectin具有以下另外的特征：-抑制人pd-1对人pd-l1的结合，如通过流式细胞术测量对人pd-1fc对pd-l1阳性细胞l2987的结合的抑制确定的并且例如对adnectinsati-964、ati-965、ati-966、ati-967、ati-968、a02和e01显示；-如通过elisa测定的，抑制人cd80(b7-1)对人pd-l1的结合。例如，ati-964以41pm的ec50抑制结合；ati-965以210pm的ec50抑制结合；ati-966以28pm的ec50抑制结合；并且ati-968以56pm的ec50抑制结合；-如通过elisa测定的，抑制抗pd-l1抗体12a4对人pd-l1的结合。还在混合淋巴细胞反应(mlr)中测试抗pd-l1抗体：ati-964、ati-965和ati-968在mlr中有活性，而ati-966和ati-967在mlr中无活性。以下实施例涉及用18f和64cu标记抗pd-l1adnectin。实施例3：4-甲基苯磺酸2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙酯的制备4-甲基苯磺酸2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙酯在乙醇(50ml)中溶解((氧基二(乙烷-2,1-二基))二(氧基))二(乙烷-2,1-二基)二(4-甲基苯磺酸)(5g,9.95mmol)和叠氮化钠(0.647g,9.95mmol)的混合物，并且在90℃在17小时时段内回流反应。使用部分真空除去溶剂，然后加载到40克二氧化硅筒上，并且使用快速层析纯化(使用线性梯度法进行iscocombiflash-洗脱，所述线性梯度法在45分钟时段里从己烷中的10％乙酸乙酯开始到己烷中的90％乙酸乙酯)。通过tlc检查合并的级分，并且组合以给出4-甲基苯磺酸2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙酯，为无色油。由于4-甲基苯磺酸2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙酯产物的反应性性质，此材料在没有任何进一步表征的情况下“本身(asis)”使用。实施例4：3-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-氟吡啶的制备3-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-氟吡啶对dmf(10ml)中的氢化钠(0.129g,3.21mmol)的悬浮液在0℃逐滴添加dmf(5ml)中的2-氟吡啶-3-醇(0.363g,3.21mmol)的搅拌溶液，然后逐滴添加dmf(5ml)中的4-甲基苯磺酸2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙酯(1.00g,2.68mmol)溶液。将悬浮液于0℃保持10分钟，然后带到环境温度1小时，接着在60℃再加热4小时。在真空中除去溶剂。添加100ml乙酸乙酯，接着用浓缩的卤水溶液进行3次分开的清洗提取。通过硫酸钠干燥有机层，过滤，并浓缩。使用快速层析(用hex中的10-50％etoac进行iscocombiflash-洗脱)纯化粗制材料以给出无色油，作为澄清的油分离3-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-氟吡啶(702mg,2.233mmol,83％产率)。1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ7.75(dt,j＝4.9,1.6hz,1h),7.33(ddd,j＝10.0,8.1,1.5hz,1h),7.10(ddd,j＝7.9,4.9,0.7hz,1h),4.30-4.16(m,2h),3.95-3.83(m,2h),3.80-3.61(m,10h),3.38(t,j＝5.1hz,2h)13cnmr(101mhz,chloroform-d)d142.3,137.7,137.5,123.4,123.4,121.7,121.6,77.3,76.7,70.9,70.7,70.6,70.0,69.4,69.0,50.619fnmr(400mhz,chloroform-d)δ-83.55.hrms(esi)理论:c13h20fn4o4+m/z315.464；发现315.1463。实施例5：3-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-硝基吡啶的制备3-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-硝基吡啶在dmf(7.0ml)中溶解氢化钠(0.121g,3.01mmol)(油中的60％悬浮液)，并且将所得的悬浮液冷却到0℃。缓慢添加dmf(1.5ml)中的2-硝基吡啶-3-醇(0.384g,2.74mmol)溶液，接着逐滴添加dmf(1.5ml)中的4-甲基苯磺酸2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙酯(1.023g,2.74mmol)。将悬浮液于0℃保持10分钟，然后带到环境温度2小时，接着60℃加热72小时时段。用10mldi水淬灭反应，然后乙酸乙酯提取(3x10ml)。用浓缩的卤水溶液(10ml)清洗汇集的etoac提取物，通过硫酸钠干燥，过滤，并在减压下蒸发以给出浅黄色油。通过快速层析纯化粗制物。24g二氧化硅筒，25ml/min，从己烷中的10％乙酸乙酯开始，接着在25分钟时段内线性变化到己烷中的50％乙酸乙酯。在此时间后，将梯度保持于此溶剂组成达10分钟，然后在10分钟时段内改变为100％乙酸乙酯。在层析图的30-40分钟部分之间洗脱3-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-硝基吡啶，并在减压下蒸发汇集的级分，然后在真空下蒸发2小时以给出3-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-硝基吡啶(687mg,1.973mmol,72.0％产率)，为浅黄色油。1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ8.11(dt,j＝4.9,1.6hz,1h),7.60(ddd,j＝10.0,8.1,1.5hz,1h),7.52(ddd,j＝7.9,4.9,0.7hz,1h),4.30-4.16(m,2h),3.95-3.83(m,2h),3.80-3.61(m,10h),3.38(t,j＝5.1hz,2h)13cnmr(101mhz,chloroform-d)d147.3,139.5,128.4,124.4.71.1,70.7,70.6,70.0,69.9,69.3,50.7.hrms(esi)理论:c13h20n5o6+m/z342.1408；发现342.1409。实施例6：合成3-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-溴吡啶3-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-溴吡啶对二甲基甲酰胺(dmf,5ml)中的氢化钠(nah,25.7mg,0.643mmol)的悬浮液在0℃逐滴添加dmf(1ml)中的2-溴吡啶-3-醇(112mg,0.643mmol)的溶液，然后逐滴添加dmf(1ml)中的4-甲基苯磺酸2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙酯(200mg,0.536mmol)溶液。将悬浮液于0℃保持10分钟，然后带到环境温度1小时，接着在60℃加热4小时。在完成加热后，在真空中除去粗制反应混合物的溶剂。在50ml乙酸乙酯中重建粗制反应，用2x50ml水性卤水溶液清洗，并且通过硫酸镁干燥有机层，过滤，并在真空中浓缩。使用反相hplc纯化粗制反应以给出3-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-溴吡啶，tfa(112mg,0.229mmol,42.7％产率)，为浅黄色油。hrmsesim/z(m+h),理论c13h20brn4o4375.0664发现375.0662；1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ7.97(dd,j＝4.6,1.5hz,1h),7.54(dd,j＝8.2,1.6hz,1h),7.40(dd,j＝8.1,4.6hz,1h),4.24(dd,j＝5.3,3.9hz,2h),3.85-3.78(m,2h),3.68-3.62(m,2h),3.62-3.52(m,8h),3.42-3.34(m,2h)。实施例7：用于合成三甲基铵(trimethylanilium)化合物的方案实施例8：合成3-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-n,n-二甲基吡啶-2-胺3-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-n,n-二甲基吡啶-2-胺将二甲基亚砜(dmso,2.5ml)中的3-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-氟吡啶(160mg,0.509mmol)、碳酸钾(k2co3,84mg,0.611mmol)和二甲胺(水中的40％，0.097ml,0.764mmol)的混合物于110℃在密封耐压容器中加热14小时。在完成加热后，在真空中除去粗制反应混合物的溶剂。在50ml乙酸乙酯中重建粗制反应，用2x50ml水性卤水溶液清洗，并且通过硫酸镁干燥有机层，过滤，并在真空中浓缩。使用正相层析纯化粗制反应以给出3-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-n,n-二甲基吡啶-2-胺(140mg,0.413mmol,81％产率)，为无色油。1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ7.86(dd,j＝4.9,1.5hz,1h),7.02(dd,j＝7.8,1.5hz,1h),6.73(dd,j＝7.8,4.9hz,1h),4.20-4.07(m,2h),3.98-3.86(m,2h),3.81-3.61(m,9h),3.38(t,j＝5.1hz,2h),3.13-2.94(m,6h),1.69(s,2h).hrms(esi)理论:c15h26n5o4+m/z340.1980；发现340.1979。实施例9：合成3-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-n,n,n-三甲基吡啶-2-铵3-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-n,n,n-三甲基吡啶-2-铵在稳定氮气流下在密封容器中将三氟甲磺酸甲酯(0.065ml,0.589mmol)添加到甲苯(1.5ml)中的3-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-n,n-二甲基吡啶-2-胺(40mg,0.118mmol)溶液。在14小时时段内于室温搅拌反应混合物。除去溶剂，并且用2x10ml醚清洗所得的残留物，与2x1ml二氯甲烷共沸干燥，并在高压真空下干燥过夜从而以定量产率给出3-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-n,n,n-三甲基吡啶-2-铵，三氟甲磺酸盐，为稠的无色油。lcmsm/z354.33；1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.24-8.17(m,1h),7.98(d,j＝8.3hz,1h),7.75(ddd,j＝8.2,4.6,3.2hz,1h),4.44(br.s.,2h),3.88(d,j＝3.9hz,2h),3.69-3.45(m,21h)。实施例10：用3-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-n,n,n-三甲基吡啶-2-铵，三氟甲磺酸盐合成[18f]-3-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-氟吡啶[18f]-3-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-氟吡啶的合成水性[18f]-氟化物溶液(2.0ml,33.3gbq/900mci)购自westpointpa中的pharmaceuticals，并且直接转移到sep-paklightqma[在使用前用5ml0.5m碳酸氢钾、5ml去离子水和5mlmecn序贯预条件化sep-paklightqma筒]。在完成此转移后，通过序贯添加碳酸钾(15mg/ml；0.1ml)，接着是碳酸钾(30mg/ml,0.1ml)、4,7,13,16,21,24-六氧代-1,10-二氮杂二环[8.8.8]二十六烷(15mg,0.04mmol)和1.2mlmecn的混合物从qmasep-pak释放水性[18f]氟化物。在90℃和真空在温和的氮气流下蒸发溶剂。用1ml乙腈部分将共沸干燥重复两次以产生无水k.2.2.2/k[18f]f复合物。在500微升dmso中溶解3-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-n,n,n-三甲基吡啶-2-铵，三氟甲磺酸盐(2mg,5.6μmol)，并且添加到干燥的穴状配体(cryptand)。于120℃将此溶液加热10分钟。在此时间后，用3mldi水稀释粗制反应混合物。然后，转移粗制反应混合物的整个内容物，加载，并且在以下条件下在反相hplc纯化：hplc柱：lunac18250x10溶剂a：di水中的0.1％tfa；溶剂b：乙腈中的0.1％tfa，以4.6ml/分钟的流速，使用等度方法32％b，期间以280nm监测uv。在层析图的24min标记处分离[18f]-3-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-氟吡啶，并且在2分钟时段内收集。将此产物收集到含有10mldi水的100ml烧瓶中，并且将整个内容物递送到来自waters的sep-pakvactc186cc1g分离包。从此反应分离6.1gbq/164mci的[18f]-3-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-氟吡啶。这使用3ml乙醇从sep-pak释放，并且用98℃热源、温和氮气流和真空在15分钟时段内减少(reduce)此溶液，直至小瓶中仅保留膜。在100％1xpbs缓冲液中重建终产物，并且在此培养基中在37℃稳定超过1小时。可使用[18f]-3-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-氟吡啶产生18f标记的生物产物(例如18f标记的抗pd-l1adnectin，如下文描述)，通过用含有炔的合适的生物制剂利用“点击”叠氮化物-炔反应进行。实施例11：使用“点击化学”产生18f放射性标记的蛋白质a.4-peg-甲苯磺酰基-叠氮化物前体的氟化以形成[18f]-fppega将18o水(3ml)活性中的900mci18f(购自ibamolecular)直接转移到微小瓶(无qma)，其含有4,7,13,16,21,24-六氧代-1,10-二氮杂二环[8.8.8]二十六烷(2.8mg,7.44μmol)和碳酸钾(1.7mg,0.012mmol)。将额外的2.0ml乙腈转移到此粗制反应混合物中，并且共沸干燥整个混合物。这通过使用98℃油浴蒸发溶液，并且应用温和的n2流和部分真空完成。将溶液的体积减少到约2ml。再添加2ml乙腈，并且在40分钟时段内将方法重复3次。当将液体的体积减少到小于0.3ml时，添加0.7ml乙腈等分试样，并且通过进一步共沸蒸馏减少溶液，直至体积是～0.1ml。添加额外的0.9ml乙腈，并且完成此方法，直至形成白色固体。此过程花费～55分钟。在最终程序期间，从油浴取出小瓶，之后溶液已经进入干燥，并且在室温在完全真空(无n2流)下放置小瓶中的残留物达20分钟。用于转移和干燥[18f]-fppega穴状配体混合物的总时间是65分钟。对干燥的[18f]-fppega穴状配体混合物添加500微升dmso中溶解的3-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-硝基吡啶(2mg,5.86μmol)，并且于120℃加热此混合物10分钟。在此时间后，用3mldi水稀释粗制反应混合物，然后将整个内容物转移并且加载到以下hplc柱和条件上：hplc柱：lunac18250x10mm；溶剂a：di水中的0.1％tfa；溶剂b：乙腈中的0.1％tfa；流速4.6ml/min；压力1820psi；等度方法32％b；uv-280nm。在层析图的24分钟标记处分离[18f]-3-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-氟吡啶([18f]-fppega)产物，并且在2分钟时段内收集。将此产物收集到含有15mldi水的100ml烧瓶中，并且将整个内容物递送到seppakvactc186cc1g分离包中。pnwat036795。使用2.5ml乙醇从seppak释放[18f]-fppega，并且用98℃n2和真空在15分钟时段内减少此溶液直至干燥。将此化合物溶解于0.1ml1xpbs(磷酸盐缓冲盐水)中。使用varianhplchplc柱lunac18(2)4.6x150mm溶剂a：di水中的0.1％tfa；溶剂b：乙腈中的0.1％tfa；流速1.0ml/分钟；梯度法0分钟90％a10％b；15分钟30％a70％b；17分钟30％a70％b；18分钟90％a10％b；20分钟90％a10％b；uv-280nm分析此产物。分离220mci的[18f]-fppega。b.制备e01-4peg-dbco本实施例描述了将e01抗pd-l1adnectin连接到peg4-dbco。由于使用马来酰亚胺化学将adnectin连接到peg4-dbco，e01adnectin首先通过在其c端添加后面有半胱氨酸的脯氨酸修饰。seqidno:104中提供了此修饰的e01adnectin的氨基酸序列。使用半胱氨酸将adnectin连接至peg4-dbco。将4倍摩尔过量的马来酰亚胺-peg4-dbco(clickchemistrytools)溶解于dmso中，并且在存在1mmtcep的情况下添加到纯化的经修饰的e01adnectin。最终dmso浓度在缀合混合物中不超过5％。将缀合混合物保持于室温达1小时，之后进行质谱分析。在ms确认缀合后，通过使用在pbsph7.2中平衡的hiload26/60superdex75柱(gehealthcare)的大小排阻层析纯化样品。c.将[18f]-fppega与adnectin偶联图2和9中显示了用于合成[18f]-e01-4peg-dbco-fppega的示意图。将0.2mle01-4peg-dbcoadnectin溶液的5.4mg/ml溶液(如b部分中所述的那样制备)与1xpbs缓冲液中的200mci的0.1ml[18f]-fppega(实施例4)一起温育。通过将粗制反应上下移液几次温和地混合溶液，并在45℃或室温一起温育45分钟。使用sec柱纯化此粗制反应混合物的内容物。在2分钟时段内在层析图的37分钟标记处分离superdex2000.5ml/分钟1xpbs缓冲液和[18f]-e01-4peg-dbco-fppega产物。使用plrps柱和凝胶电泳在共注射非放射性标准品rphplc的情况下经由sec分析[18f]-e01-4peg-dbco-fppega。用以下参数进行大小排阻层析(sec)：superdex200柱；溶剂100％1xpbs缓冲液；0.5ml/分钟280uv；反相hplc柱：plrps8微米1000a4.6x250mm溶剂a：di水中的0.1％甲酸溶剂b：乙腈流速：1ml/分钟压力：1351psi梯度：0分钟90％a10％b30分钟45％a55％b32分钟25％a75％b36分钟25％a75％b50分钟90％a10％b当在45℃进行反应时，通过sec和rphplc计算以>99％的放射化学纯度(rcp)和以0.6mci/nmol的比活性分离15mci[18f]-e01-4peg-dbco-fppega。当在室温进行反应时，获得5.72mci。当分别于45℃或室温进行反应时，[18f]-fppega的比活性在其合成结束后3小时时是0.512mci/nmol以及rcp为85.7％。通过nanodrop(见www.nanodrop.com)测量比活性。产物在sec和plrps两者上与非放射性标准物共洗脱。凝胶电泳确认了与11kda分子量标准一致的18f产物。18f放射性标记的e01-4peg-dbco可用于多种体外和/或体内成像应用，包括诊断成像、基础研究和放射治疗应用。可能的诊断成像和放射治疗应用的具体实例包括确定pd-l1阳性肿瘤的位置、相对活性和/或量化pd-l1阳性肿瘤、pd-l1阳性肿瘤的放射免疫测定法和放射自显影以确定哺乳动物或其器官或组织样品中pd-l1阳性肿瘤的分布。特别地，18f放射性标记的e01-4peg-dbco可用于人和实验动物的肺、心、肾、肝和皮肤和其它器官的pd-l1阳性肿瘤的正电子发射断层摄影(pet)成像。使用18f放射性标记的e01-4peg-dbco的pet成像可用于获得以下信息：候选pd-l1肿瘤治疗药物组织占据水平与患者中临床功效之间的关系；在开始长期临床研究之前，pd-l1肿瘤治疗药物临床试验的剂量选择；结构新型pd-l1肿瘤治疗药物的比较效力；研究pd-l1肿瘤治疗药物在用pd-l1肿瘤治疗药物治疗临床靶物期间对体内转运蛋白亲和力和密度的影响；在有效和无效治疗期间，pd-l1阳性肿瘤的密度和分布的变化。实施例12：将pd-l1adnectin与nodaga连接以产生nodaga-pd-l1adnectin本实施例描述了e01和a02抗pd-l1adnectin与nodaga的连接。由于马来酰亚胺化学用于将adnectin与nodaga连接，两个adnectin使用在其c末端的后面有半胱氨酸的脯氨酸(如上文对e01所述)。分别在seqidno:104和88中提供了经修饰的e01和a02adnectin的氨基酸序列。使用半胱氨酸连接adnectin与nodaga。对于adnectin的64cu标记，将50倍摩尔过量的马来酰亚胺-nodaga(chematech)溶于pbsph7.4中，并在1mmtcep存在下添加到纯化的adnectin。最终dmso浓度在缀合混合物中不超过5％。在质谱分析之前，将缀合混合物于室温保持1小时。在ms确认缀合后，使用在pbsph7.2中平衡的hiload26/60superdex75柱(gehealthcare)通过大小排阻层析法纯化样品。实施例13：合成基于64cu的抗pd-l1adnectin探针64cu-a02-nodaga的合成在环境温度将0.1n盐酸溶液中的[64cu]-氯化铜(64cucl2)用0.8ml0.1n乙酸钠(naoac)水溶液中和4分钟。将1ml的64cu/naoac溶液添加到a02-nodaga(30μl，1.6mg/ml)中，并且温和移液粗反应以允许混合，接着在环境温度静置30分钟。将粗反应混合物的内容物转移到pd-10脱盐柱，其在装载样品之前用20ml的1x磷酸盐缓冲盐水(pbs，ph7.4)缓冲液预活化。向柱添加额外的1.5ml1xpbs，接着是额外的0.8ml1xpbs溶液，并且弃去这些级分。然后在pd-10柱的1.2ml洗脱液后收集[64cu]-a02-nodaga，给出10.79mci作为期望的产物。使用agilentplrp-shplc柱使用反相hplc系统测量质量控制，大小：250x4.60mm,8μm,280nm，并且流动相为在蒸馏水和乙腈中的0.1％甲酸。使用梯度法，其中乙腈的百分比在30分钟的时间范围内从10％线性增加到45％。[64cu]-a02-nodaga在hplc层析图的22分钟标记处与参考标准物共洗脱。使用该方法测定放射化学纯度为96％。[64cu]-a02-nodaga也使用大小排阻层析法(sec)在20分钟标记处与参考物质共洗脱，柱：gesuperdex200gl大小：10x300mm，280nm。基于纯化样品的分离放射性和nanodrop蛋白浓度，计算的比活性为956.8mci/μmol。用于合成64cu-e01-nodaga的程序在0.1n盐酸溶液(0.25ml中的20mci)中的[64cu]-氯化铜([64cu]cucl2)用1.10ml0.1n乙酸铵缓冲液进行ph调节，然后混合并与在1xpbs水溶液中e01-nodagaadnectin(40μl1.2mg/ml，4.62nmol)在环境温度温育30分钟。温育30分钟后，将反应混合物(～1250μl)转移到pd-10脱盐柱(gehealthcarelifescience,sephadexg25medium,14.5x50mm–用40ml1xpbs平衡)，并且允许样品通过重力完全进入柱，然后用1.1ml的1xpbs。在液体完全通过柱后，通过用每个样品小瓶1xpbs以1ml的增量洗脱收集产物。在第二个1ml级分中分离64cu-e01-nodaga，并在1ml1xpbs中测量为9.26mci。使用装配有uv/vis检测器(λ＝280nm)、posi-ram检测器和superdex20010/300gl大小排阻柱(gehealthecarelifescience,孔径13μm)的agilenthplc系统使用分析大小排阻hplc法分析此样品。流速为0.5ml/min，并且水流动相与具有0.02％nan3的1xpbs等度60分钟。使用此系统，放射化学纯度为99％，并且产物与非放射性参考标准品共洗脱。基于3点校正曲线的方程(y＝656978x)计算比活性。将约100μl来自小瓶3的产物溶液注射到superdex-200大小排阻柱。收集产物峰，并且测定为0.74mci，产物峰的uv计数为156367单位，并且比活性为3.1mci/nmol。实施例14：用抗pd-l1adnectin成像剂体外区分pd-l1阳性细胞与pd-l1阴性细胞在本实验中，对64cu-e01抗pd-l1adnectin(使用nodaga作为螯合剂)测试了其在体外区分hpd-l1阳性细胞和hpd-l1阴性细胞的能力。细胞标记是特异的，如与hpd-l1阴性ht-29细胞相比64cu-e01与hpd-l1阳性l2987细胞的差异结合证明的(细胞相关放射性在hpd-l1阳性l2987细胞中为44.6倍高)。进一步确认了特异性，如通过当与过量的450nm冷(未标记的)e01adnectin共温育时细胞相关的64cu-e01显著降低(99.6％降低)证明的。当将细胞与450nm的冷(未标记的)非pd-l1结合性adnectin共温育时，细胞相关的18f-e01是最少降低的(9.9％降低，不显著)(图3)。将1x106个hpd-l1阳性l2987人肺癌细胞或hpd-l1阴性ht-29人结肠直肠腺癌细胞置于5ml培养管(每种条件n＝3个管)。在pbs+0.5％bsa中以300ntci/200μl的浓度制备64cu-e01adnectin溶液。将此溶液的部分用冷(未标记)e01adnectin或冷(未标记)非pd-l1结合性adnectin补充至终浓度450nm。将细胞样品以200xg离心5分钟，然后重悬于200μl适当的64cu-e01adnectin溶液中，并在冰上温育1小时。在温育期后，将细胞样品以200xg离心，并且弃去上清液。将细胞沉淀重悬于1mlpbs+0.5％bsa中，并重复清洗程序共3次清洗。最终清洗后，将细胞再次以200xg离心，并且弃去上清液。然后，通过γ计数器测量剩余的细胞沉淀的放射性。总之，这些结果证明64cu-e01adnectin体外区分pd-l1(+)与pd-l1(-)细胞的能力。通过与450nm未标记的抗pd-l1e01adnectin共温育的样品中细胞相关放射性示踪剂的显著减少(以及当与450nm的非pd-l1结合性adnectin共温育时，仅统计学不显著的降低)进一步证实了特异性。进行了使用不同adnectin变体以及18f作为放射性核素的类似实验，具有相似的结果。实施例15：用抗pd-l1adnectin成像剂区分pd-l1-阳性肿瘤与pd-l1-阴性肿瘤对于pet成像，通过最小化“背景”探针信号从非相关组织中消耗所需要的时间量，快速血清清除率提供了相对于更慢的清除蛋白质(如抗体)的优点。在临床上，基于长血液半衰期抗体的pet示踪剂在可收集图像前在注射后可需要几天等待。快速清除探针打开了通向可在探针注射的同一天收集的高对比度图像的门，并且非常重要的是，它们还可用来减少对所研究的动物或检查的患者的全面辐射暴露。在本实验中，对如上述实施例中所述的那样制备的64cu-a01抗pd-l1adnectin(使用nodaga作为螯合剂)测试其区分小鼠中的hpd-l1阳性肿瘤和hpd-l1阴性肿瘤的能力。通过在小鼠的相对侧皮下引入1x106个hpd-l1(+)l2987人肺癌细胞和1.5x106个hpd-l1(-)ht-29人结肠癌细胞产生携带双侧异种移植肿瘤的小鼠。一旦肿瘤达到约300mm3(细胞植入后约2-3周)，选择动物进行成像。对于成像，将动物置于用2％异氟烷的麻醉下，并安装尾静脉导管。然后，将小鼠放入具有4只动物容量的定制动物保持器中，在那里它们保持麻醉持续整个研究。将动物保持器转移到f120tm扫描仪(siemenspreclinicalsolutions，knoxville，tn)。此仪器视图的轴向视场为7.6cm。凭借此限制，将动物定位为使得扫描区域从眼的正前方到大致地尾部的基部。为了最终pet图像的衰减校正，首先使用57co点源获取10分钟的透射图像。在透射扫描之后，通过先前安装的尾静脉导管施用放射性示踪剂溶液，并获得2小时的发射图像。注射的放射性示踪剂溶液由约200μci64cu-a02(具有nodaga螯合剂)或补充有3mg/kg终浓度的冷的未标记的a02adnectin(基于个体动物体重)的200μci64cu-a02组成。在注射前将所有注射液在200μl盐水中配制。通过采取配制剂量的直接测量并减去注射器和尾静脉导管中剩余的放射性来计算精确的注射剂量。使用收集的透射图像在衰减校正的情况下使用最大值后验(map)算法重建图像，并且对放射性同位素衰变进行校正。在最终图像中，使用asipro软件(siemenspreclinicalsolutions)在肿瘤边界周围绘制感兴趣区域(roi)。计算每个roi的时间-活性曲线，以产生2小时发射图像过程中肿瘤体积内放射性示踪剂的定量视图。为了最终比较，基于每个特定动物的注射放射性示踪剂剂量对各个时间-活性曲线进行标准化。使用每个时间-活性曲线的最后10分钟(放射性示踪剂注射后1小时50分钟-2小时)，在肿瘤间比较放射性示踪剂吸收。使用此方法，hpd-l1(+)l2987异种移植物中的放射性示踪剂摄取是在仅接受64cu-a02放射性示踪剂的动物中看到的3.05倍。在用64cu-a02放射性示踪剂和3mg/kg未标记的a02adnectin共注射的动物中，hpd-l1(+)l2987异种移植物中的摄取仅是hpd-l1(-)ht-29异种移植物中看到的1.04倍(图4a和4b)。对于一些研究，在成像后立即通过颈脱位法处死动物。然后对动物进行尸体剖检，并将各组织(血液、心、肺、肝、脾、肾、肌肉、胃、骨、l2987肿瘤和ht-29肿瘤)收集到预先称重的管中。然后，再次称重所有组织以确定每个组织的重量。然后，使用perkin-elmerwizard3γ计数器离体直接测量每个组织中的放射性。对于所有组织，将每分钟计数(cpm)的测量值相对于各个动物的注射放射性剂量标准化并校正放射性衰变。然后绘制这些结果以显示放射性示踪剂的生物分布。图5中显示了对于18f-a02adnectin放射性示踪剂的此分析的实例。这些结果证明与hpd-l1(-)ht-29异种移植物相比，hpd-l1(+)l2987异种移植物中放射性示踪剂的明显差异摄取。此外，仅具有较高pd-l1摄取的组织是肾，其是预期的，因为预期18f-a02adnectin的清除通过基于分子的分子量的肾过滤实现。总之，这些结果提供体内区分hpd-l1(+)与hpd-l1(-)异种移植肿瘤的直接显现。通过共注射3mg/kg未标记的抗pd-l1a02adnectin进一步证明特异性，导致hpd-l1(+)肿瘤中放射性示踪剂摄取降低至hpd-l1(-)异种移植物的水平。这进一步验证了使用抗pd-l1adnectin以使用pet成像显现pd-l1组织表达。在小鼠中进行使用18f作为放射性核素的相似实验，并且获得类似的结果，使用18f-a02adnectin放射性示踪剂在hpd-l1(+)l2987异种移植物相对于hpd-l1(-)ht-29异种移植物中达到3.53:1的最大放射性示踪剂吸收比率。当在猕猴中进行时，基于抗pd-l1adnecin的成像剂也显示相似的结果。在这些研究中，对如上述实施例中所述的那样产生的18f-e01抗pd-l1adnectin测试其在猕猴中产生高对比度图像的能力。本文所述的抗pd-l1adnectin对猕猴pd-l1维持高亲和力(但对啮齿类pd-l1具有低亲和力)。此外，由于猕猴不含如在小鼠模型中的pd-l1(+)肿瘤，主要根据在内源pd-l1表达的背景中的图像中测量的背景水平评估成像性能(低背景实现pd-l1(+)组织的高灵敏性检测的潜力)。在这些研究中，所得pet图像的背景水平非常低，主要在肾、脾和膀胱中注意到显著的放射性示踪剂积累。将具有先前安装的血管存取口(vap)的雄性猕猴用0.02mg/kg阿托品、5mg/kgtelazol(舒泰)和0.01mg/kg丁丙诺啡(i.m.)肌肉注射(均被吸入单个注射器)麻醉。然后，将静脉注射导管置于头部血管中，以在成像程序期间进行流体施用以维持水合。用气管内管对动物插管-通常3.0mm，并且转移到f220tmpet仪(siemenspreclinicalsolutions，knoxville，tn)的成像床。用异氟烷和氧气维持麻醉，并且在成像程序期间以6ml/kg/hr的速率施用静脉注射流体(lrs)。由于f220tm仪视图的轴向视野仅为7.6cm，获取了超过5个独特的床位置上的图像，以大致通过骨盆刚好从心脏上方创建动物的复合图像。对于每个视场，为了最终pet图像的衰减校正的目的，首先采用57co点源获取10分钟透射图像。一旦获得了所有床位置的透射图像，通过安装的vap施用约1.5mci(约0.015mg/kg)的18f-e01adnectin放射性示踪剂。然后对于每个床位置序贯获取5分钟持续时间发射扫描，从大致位于心脏中心的位置1开始并且朝向动物的骨盆移动。一旦在每个位置(1至5)获取图像，将成像床移回床位置1，并重复该过程。使用此程序，在成像研究持续时间内，对于每个床位置获取总共5个独特的图像。使用收集的透射图像在衰减校正的情况下使用过滤反投影(fbp)算法重建个体图像，并且针对放射性同位素衰变进行校正。然后，通过比对来自所有5个床位置的图像产生最终复合图像，所述床位置从覆盖成像研究的持续时间的单次通过获得(即，从床位置1到5的每组序贯图像产生单一复合图像)。视觉检查最终图像以注意可见的放射性示踪剂摄取(即脾、肾，膀胱)和背景组织(肌肉)的区域(图6)。18f-e01adnectin的背景积累非常低，在背景组织如肌肉中很少有可见信号。此外，在脾脏中验证了摄取，基于mrna表达认为其是pd-l1(+)。因此，猕猴中的研究证明了在内源pd-l1背景下高灵敏性pd-l1成像的潜力。总体而言，啮齿类和猕猴中的pet研究显示64cu和18f标记的抗人pd-l1adnectin提供用于体内标记pd-l1阳性组织的强烈且特异性的探针，其具有高灵敏度检测具有低水平pd-l1表达的组织的能力。还用抗pd-l1抗体进行体内成像实验，并且此成像剂检测的区域是用pd-l1成像剂检测的相同区域，因此确认抗pd-l1adnectin成像剂在体内成功检测pd-l1阳性细胞。实施例16：用[18f]-e01抗pd-l1adnectin对人和异种移植物组织的体外放射自显影术将人肺肿瘤组织包埋于oct中，并在2-甲基丁烷中冷却2-5分钟直到冷冻。将样品在-80℃度冷冻器中贮存直到使用。人异种移植组织也包括在测定法中。通过将4x106个hpd-l1(+)l2987细胞和1.5x106个hpd-l1(-)ht-29t细胞皮下引入nu/nu小鼠的相对侧中产生携带双侧异种移植物的小鼠。一旦所得到的异种移植物肿瘤达到适当的大小(约200-300mm3)，将小鼠用2％异氟烷麻醉，并通过颈脱位法处死。将新鲜的肿瘤组织切下，浸入oct中，并且在2-甲基丁烷中冷却2-5分钟直到冷冻。然后，将组织包裹在箔袋中，并在-80℃贮存直至使用。对于所有组织(人肺肿瘤和异种移植物)，使用低温恒温器切割5μm厚度的切片(以2个切片/载玻片收集)，将其解冻安装在玻璃显微镜载玻片上，并允许风干约30分钟。使用以下条件进行用0.025nm、0.25nm、2.5nm和25nm的冷(未标记)a02adnectin和25nm非pd-l1结合adnectin的阻断研究。将各个载玻片(每个浓度1个载玻片)置于塑料载玻片盒中，并在dako无血清蛋白质封闭溶液中预温育30分钟。然后，将载玻片转移到玻璃载玻片温育室中用于进一步温育。分开地，通过用300mlpbs+0.5％bsa稀释10.6μl初始原液放射性配体溶液(实验时7064nm)产生0.25nm18f-a02adnectin的储备溶液。从此储备溶液中，将40ml添加到每个温育室。这些室之一仅含有放射性配体缓冲溶液，其称为总结合部分。其它温育室接受40ml此储备溶液以及相关浓度的封闭化合物(0.025nm、0.25nm、2.5nm或25nm的未标记的a02adnectin或25nm的未标记的非pd-l1结合adnectin)。将载玻片在各个缓冲溶液中在室温下温育1小时以达到最大结合。温育后，从温育溶液中取出来自每个处理组的载玻片，并且置于冰冷的清洗缓冲液(pbs+0.5％bsa)中3分钟，并漂洗分开的4次。然后，将载玻片在冷空气流下干燥约30分钟。将风干的载玻片通过将载玻片置于成像板(bas-sr3545s)上室温过夜暴露。使用生物成像分析仪(fujifilmfluorescentimageanalyzer，fla-9000)扫描成像板。放射自显影图像的像素大小为100μm。使用multi-gauge软件进行图像分析。在所有研究组中绘制感兴趣区域(roi)以围绕整个肿瘤组织。从这些roi中量化来自组织相关放射性的放射自显影术信号。在人肺肿瘤切片及人异种移植物切片两者中对4种不同浓度(0.025nm、0.25nm、2.5nm和25nm)的未标记的a02adnectin测定当与总结合切片相比时18f-a02adnectin放射性配体的表观置换。在添加未标记的a02adnectin的所有组织切片中看到18f-a02的剂量依赖的置换，而与总结合相比，25nm非pd-l1结合adnectin在所有组织中显示最小的阻断(图7)。对来自每个组织的系列5μm组织切片进行抗人pd-l1免疫组织化学程序以验证样品中pd-l1抗原表达的水平(图8)。总之，这些结果提供在人肺肿瘤样品以及人异种移植组织中pd-l1的直接显现。单个组织中放射性配体结合的水平对应于通过ihc得到的冷冻切片的pd-l1染色强度。此外，用未标记的抗pd-l1a02adnectin对受体的剂量依赖性阻断(和缺乏用未标记的非pd-l1结合adnectin的阻断)进一步验证了18f-a02用于使用pet成像显现pd-l1组织表达的用途。实施例17：依照使用商业getracerlabfx2n合成单元的放射性合成的通用程序自动制备[18f]-3-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-氟吡啶程序：使用非盒型getracerlabfx2n合成模块进行[18f]-3-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-氟吡啶的自动合成。在表4中汇总了合成单元的设置。将[18f]-氟化物水溶液(2.0ml，29.6gbq/800mci)递送到sep-paklightqma[在使用前用5ml0.5m碳酸氢钾、5ml去离子水和5ml乙腈序贯预条件化sep-paklightqma筒]。完成此转移后，通过将洗脱混合物(来自“v1”)添加入反应器中从qmasep-pak释放水性[18f]氟化物。在温和氮气流和真空下蒸发溶剂。将前体溶液(来自“v3”)添加到干燥的穴状配体残留物，并且将此反应混合物加热120℃达10分钟。然后，将4ml蒸馏水(来自“v4”)添加到反应器中的粗反应混合物，并且将混合物经由液体传感器转移到半制备hplc的5ml样品注射环中，所述液体传感器控制加载的结束。将混合物加载到半制备型hplc柱(lunac18(2).250x10mm,phenomenex)上。将0.1％三氟乙酸水溶液中的35％乙腈的混合物以每分钟4.6ml的速率冲洗通过柱。将该产物从此hplc柱收集到含有15ml蒸馏水的稀释烧瓶中，并将其整个内容物转移到tc181克，固相提取筒。用3ml乙醇从此筒(来自“v14”)释放352mci(13gbq)的[18f]-3-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-氟吡啶，并可用于通过利用与含有炔的合适的生物制剂的“点击”叠氮化物-炔反应产生18f标记的生物制品。表4实施例18：依照ibasynthera合成单元上的放射性合成的通用程序自动制备[18f]-3-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-氟吡啶程序：使用盒型ibasynthera合成模块和适当组装的积分仪流体处理器试剂盒进行[18f]-3-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-氟吡啶的自动合成。积分仪流体处理器(ifp)试剂盒加载有用于此合成的合适的前体，并且在表5中汇总。在varianhplc单元上进行纯化。通过hplc单元上的稳定氮气流控制hplc的注射环的填充。在表2中汇总了两种自动化的设置。将[18f]-氟化物水溶液(2.0ml，29.6gbq/800mci)递送到sep-paklightqma[在使用前用5ml0.5m碳酸氢钾、5ml去离子水和5ml乙腈序贯预条件化sep-paklightqma筒]。完成此转移后，通过将洗脱混合物(来自“v1”)添加入反应器中从qmasep-pak释放水性[18f]氟化物。在温和氮气流和真空下蒸发溶剂。将前体溶液(来自“v2”)添加到干燥的穴状配体残留物，并且将此反应混合物加热120℃达10分钟。然后，将3ml蒸馏水(来自“v4”)添加到反应器中的粗反应混合物，并且将混合物经由液体传感器转移到半制备hplc的5ml样品注射环中，所述液体传感器控制加载的结束。将混合物加载到半制备型hplc柱(lunac18(2).250x10mm,phenomenex)上。将0.1％三氟乙酸水溶液中的35％乙腈的混合物以每分钟4.6ml的速率冲洗通过柱。将该产物从此hplc柱收集到含有15ml蒸馏水的稀释烧瓶中，并将其整个内容物转移到tc181克，固相提取筒。用3ml乙醇从此筒释放325mci(12gbq)[18f]-3-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-氟吡啶并可用于通过利用与含有炔的合适的生物制剂的“点击”叠氮化物-炔反应产生18f标记的生物制品。表5实施例19：合成基于68ga的抗pd-l1adnectin探针合成68ga-e01-nodaga用32mg乙酸钠(naoac)在环境温度中和0.1n盐酸溶液中的[68ga]-氯化镓4分钟，搅拌所得溶液以确保适当混合整个体积。然后，将此溶液添加到e01-nodaga(15μl的1.3mg/ml)溶液，并且将粗反应温和移液以允许混合，接着在环境温度下静置15分钟。将粗反应混合物的内容物转移到pd-10脱盐柱，其在加载样品前用20ml的1x磷酸盐缓冲盐水(pbs，ph7.4)缓冲液预活化。对柱添加额外的1.5ml1xpbs，接着是额外的0.8ml1xpbs溶液，并且弃去这些级分。然后，在pd-10柱的1.4ml洗脱后收集[68ga]-e01-nodaga，以给出5.78mci(214mbq)作为期望的产物。使用agilentplrp-shplc柱使用反相hplc系统测量质量控制，大小：250x4.60mm，8μm，280nm，并且流动相为蒸馏水和乙腈中的0.1％甲酸。使用梯度法，其中乙腈的百分比在30分钟的时间范围内从10％线性增加到45％。[68ga]-e01-nodaga在hplc层析图的22分钟标记处与参考标准品共洗脱。使用该方法测量放射化学纯度为98％。[68ga]-e01-nodaga也使用大小排阻层析在20分钟标记处与参考材料共洗脱，(sec)柱：gesuperdex200gl大小：10x300mm,280nm。表3：序列表等同方案本领域技术人员会认可，或者仅使用常规实验便确定本文中所述的具体实施方案的许多等同方案。此类等同方案意图为所附权利要求书涵盖。当前第1页12