本发明涉及用于生产l-甲硫氨酸的重组微生物和制备l-甲硫氨酸的方法。本发明中的微生物通过以下方式修饰以提高l-甲硫氨酸的生产：使用硫代羧化蛋白质(thiocarboxylatedprotein)作为硫供体，以及过量生产具有高丝氨酸o-乙酰转移酶活性而不被甲硫氨酸和/或s-腺苷甲硫氨酸反馈抑制的酶、和具有o-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性的酶。现有技术含硫化合物如半胱氨酸、高半胱氨酸、甲硫氨酸或s-腺苷甲硫氨酸对细胞代谢至关重要。特别是动物不能合成的必需氨基酸l-甲硫氨酸，在许多机体功能中起着重要的作用。大多数工业生产的甲硫氨酸被广泛用作动物饲料和食品添加剂。由于bse(牛海绵样脑病)和鸡流感导致动物源性蛋白质使用的减少，对纯甲硫氨酸的需求增加。通常，从丙烯醛、甲硫醇和氰化氢化学生成d,l-甲硫氨酸。然而，外消旋混合物的表现不如纯l-甲硫氨酸(saunderson，1985)。此外，尽管纯的l-甲硫氨酸可以由外消旋的甲硫氨酸生产，例如通过酰基转移酶处理n-乙酰-d,l-甲硫氨酸，但是这大大增加了生产成本。因此，对于纯l-甲硫氨酸需求的增加以及环境问题，使得微生物生产甲硫氨酸具有诱人的前景。其他重要的氨基酸，如赖氨酸、苏氨酸和色氨酸通过发酵生产用于动物饲料。因此，这些氨基酸可以使用葡萄糖和其他可再生资源作为起始材料来制备。通过发酵生产l-甲硫氨酸尚未成功，但该技术的发展正在进行中。先前已经描述了用于优化微生物中l-甲硫氨酸生产的不同方法(参见例如专利或专利申请us7,790,424、us7,611,873、wo02/10209、wo2005/059093、wo2006/008097、wo2007/0770441、wo2009/043803和wo2012/098042)；然而，由微生物工业生产l-甲硫氨酸需要进一步改进。在这些方法中，描述了使用半胱氨酸作为硫供体生产l-甲硫氨酸，因此半胱氨酸生物合成途径通过过量生产参与以下的不同蛋白质被优化：(i)将硫酸酯同化为硫化物，依次通过由操纵子cysdnc和cysjih编码的硫酸腺苷酰转移酶、腺苷酰硫酸激酶、亚硫酸还原酶和3’-磷酸-腺苷酰硫酸还原酶，(ii)半胱氨酸合成，通过由cyse和cysm基因编码的丝氨酸乙酰转移酶和半胱氨酸合酶，(iii)转硫作用，是指将来自半胱氨酸的硫掺入琥珀酰高丝氨酸，分别通过由metb和metc基因编码的o-琥珀酰高丝氨酸(硫醇)-裂解酶和胱硫醚-β-裂解酶以得到γ-胱硫醚和高半胱氨酸。然而，优化生产l-甲硫氨酸所必需的半胱氨酸生物合成途径是困难的。事实上，半胱氨酸的积累对微生物是有毒的，于是如果其不被使用(这意味着如果半胱氨酸在l-甲硫氨酸生产过程中的合适时刻没有准确地产生)，就会迅速被半胱氨酸酶降解。此外，存在于大肠杆菌中的已知半胱氨酸酶中，由于metc负责在甲硫氨酸生物合成途径中将γ-胱硫醚转化为高半胱氨酸(wo2005/111202)，metc的产生是不可避免的并且在甲硫氨酸生产菌株中必然增加。为了避开这些困难，arkema和cjcheiljedangcorporation要求保护3步生产l-甲硫氨酸：一方面是生产甲硫氨酸前体(o-乙酰-l-高丝氨酸或o-琥珀酰-高丝氨酸)，另一方面是生产负责甲硫氨酸前体转化的酶(分别为mety或metz，即o-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶或o-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶)的两个生物合成过程。在第三步中，他们描述了在作为硫供体的甲硫醇存在下，通过mety或metz酶将甲硫氨酸前体酶促生物转化成l-甲硫氨酸(wo2008/013432)。事实上，用这种技术不需要优化微生物中半胱氨酸的生产，因为甲硫醇是硫供体。cjcheiljedangcorporation和cargill在专利wo2008/127240中描述了另一种使用半胱氨酸的替代方案，其中他们要求保护从编码高半胱氨酸合酶的外源基因产生甲硫氨酸的微生物，并因此提供直接硫化氢解化途径，这意味着将来自硫化物的硫直接掺入到乙酰-高丝氨酸中，一步得到高半胱氨酸。在文献中描述了蛋白硫代羧化物(proteinthiocarboxylate)是日渐增长的生物合成硫化物供体家族的成员，并参与包括维生素b1(taylor等人，1998)和半胱氨酸(agren等人，2008)的多种生物合成途径。最近，在产琥珀酸沃林氏菌(wolinellasuccinogenes)中鉴定了一种蛋白硫代羧化物依赖性甲硫氨酸生物合成途径(krishnamoorthy等，2011)。在该途径中，(i)参与将硫酸酯同化为硫化物的酶与大肠杆菌的那些相似；cysdnc用于硫酸腺苷酰转移酶和腺苷酰硫酸激酶，cysh用于3’-磷酸-腺苷酰硫酸酯还原酶，以及与cysji等价的sir用于亚硫酸酯还原酶；(ii)然后在由金属蛋白酶hcyd催化的反应中去除新的硫转移蛋白hcys-ala的羧基末端丙氨酸，得到hcys；(iii)hcyf(atp利用酶)催化hcys的腺苷酰化；(iv)然后hcys酰基-腺苷酸酯(hcys-cooamp)通过sir产生的二硫化物进行亲核取代，得到hcys硫代羧化物(hcys-cosh)；(v)将其加入到o-乙酰高丝氨酸，通过mety(o-乙酰高丝氨酸-硫化氢解酶)催化的plp-依赖性反应，得到hcys-高半胱氨酸；(vi)hcyd介导的水解释放高半胱氨酸，(vii)由mete(高半胱氨酸转甲基酶)催化的最终甲基化完成甲硫氨酸生物合成(参见图1)。发明人惊奇地发现，在经遗传修饰的产生甲硫氨酸的微生物中表达编码产琥珀酸沃林氏菌的蛋白硫代羧化物依赖性甲硫氨酸生物合成途径的基因，提高了甲硫氨酸生产并克服了半胱氨酸生产途径优化的问题。发明概述本发明涉及一种通过发酵产生甲硫氨酸的重组微生物，其中所述微生物表达编码硫代羧化蛋白质、具有高丝氨酸o-乙酰转移酶活性而不被甲硫氨酸和/或s-腺苷甲硫氨酸反馈抑制的多肽、以及具有o-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性的多肽的功能基因。包括在合适的培养基中培养所述重组微生物，并从培养基中回收甲硫氨酸的发酵生产甲硫氨酸的方法也是本发明的一个目标。附图说明图1：比较在大肠杆菌和具有蛋白硫代羧化物hcys的产琥珀酸沃林氏菌中的甲硫氨酸生物合成途径。发明详述在详细描述本发明之前，应该理解本发明不限于特定示例的方法，并且当然可变化。还应该理解，本文使用的术语仅为描述本发明的具体实施方案的目的，而不是旨在限制，其将仅由所附权利要求来限制。本文引用的所有出版物、专利和专利申请，无论是上文还是下文，均通过引用整体并入本文。此外，除非另有说明，否则本发明的实施采用本领域技术范围内的常规微生物学和分子生物学技术。这样的技术对于本领域技术人员来说是已知的，并且在文献中有充分的解释。必须注意的是，除非上下文另外明确指出，否则如本文和所附权利要求中所使用的单数形式包括复数形式。因此，例如，提及“一种微生物”包括多种该微生物，并且提及“一种内源基因”是指一种或多种内源基因等。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文所述相似或等同的任何材料和方法可用于实施或测试本发明，但现在描述优选的材料和方法。在下面的权利要求和本发明的连续描述中，除了文中要求或由于语言表达或必要的指示之外，词语“包括”、“包含”、“涉及”、或“含有”都是包含的意思，即明确所述特征的存在，但不排除在本发明的各种实施方案中存在或添加其他特征。术语“甲硫氨酸”和“l-甲硫氨酸”指含硫的必需氨基酸，所述氨基酸具有化学式ho2cch(nh2)ch2ch2sch3和cas编号59-51-8，或具体的l-异构体具有cas编号63-68-3。如本文所用，术语“微生物”是指活的微观生物体，其可是单细胞或多细胞生物体，并且通常可以在自然界中找到。在本发明的上下文中，微生物优选是细菌、酵母或真菌。更优选地，本发明的微生物选自肠杆菌科(enterobacteriaceae)、芽孢杆菌科(bacillaceae)、链霉菌科(streptomycetaceae)、棒杆菌科(corynebacteriaceae)和酵母。甚至更优选地，本发明的微生物是埃希氏菌属(escherichia)、克雷伯氏菌属(klebsiella)、好热厌氧杆菌属(thermoanaerobacterium)、棒杆菌属(corynebacterium)或糖酵母属(saccharomyces)的物种。甚至更优选地，本发明的微生物选自大肠杆菌(escherichiacoli)、肺炎克雷伯氏菌(klebsiellapneumoniae)、热解糖好热厌氧杆菌(thermoanaerobacteriumthermosaccharolyticum)、谷氨酸棒杆菌(corynebacteriumglutamicum)和啤酒糖酵母(saccharomycescerevisiae)。最优选地，本发明的微生物是大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌。如本文所用，术语“重组微生物”、“经遗传修饰的微生物”或“遗传工程微生物”是指如上定义的自然界中不存在的微生物，因此在遗传上与其天然对应物不同。换句话说，它是指通过引入和/或通过缺失和/或修饰其遗传元件而被修饰的微生物。这种修饰可以通过遗传工程、通过在特异选择压力下培养微生物来迫使发展和进化出新的代谢途径、或通过组合两种方法来进行(参见例如wo2005/073364或wo2008/116852)。因此，根据本发明的经遗传修饰用于产生甲硫氨酸的微生物是指所述微生物是如上定义的能够产生甲硫氨酸的重组微生物。换句话说，所述微生物已被遗传修饰使得比非修饰的微生物有更高的甲硫氨酸产量。根据本发明，与对应的未修饰的微生物相比，本发明的重组微生物产生的甲硫氨酸的量，特别是甲硫氨酸产率(每碳源产生的甲硫氨酸的比率，克/克或摩尔/摩尔)，在修饰的微生物中更高。在本发明的上下文中，“非修饰的微生物”和“未修饰的微生物”，是指不包含参与甲硫氨酸生产的基因的任何基因修饰的微生物。本发明中经修饰的微生物针对甲硫氨酸生产进行了优化，并进一步被遗传修饰以表达编码硫代羧化蛋白质、具有高丝氨酸o-乙酰转移酶活性而不被甲硫氨酸和/或s-腺苷甲硫氨酸反馈抑制的多肽、以及具有o-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性的多肽的功能基因。术语“经遗传修饰的产生甲硫氨酸的微生物”、或“产甲硫氨酸微生物”、或“用于生产甲硫氨酸的经遗传修饰的微生物”、或“用于生产甲硫氨酸的优化的微生物”、或“重组产l-甲硫氨酸菌株”以及其衍生的表达均如上文所定义，表示比非修饰的微生物产生更高水平的甲硫氨酸的微生物。用于甲硫氨酸生产而优化的微生物是本领域已知的，并且已经具体地公开于专利申请wo2005/111202、wo2007/077041、wo2009/043803、wo2010/020681、wo2011/073738、wo2011/080542、wo2011/080301、wo2012/055798、wo2013/001055、wo2013/190343、wo2015/028675和wo2015/028674。为了清楚起见，产生甲硫氨酸并表达硫代羧化蛋白、高丝氨酸o-乙酰转移酶和o-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶的经遗传修饰的微生物在本公开被命名为“本发明的重组微生物”或“本发明的微生物”以及其衍生的表达。如下文进一步解释的，经遗传修饰的产生甲硫氨酸的微生物以及本发明的微生物可通过调节一种或多种内源基因的表达水平和/或通过在所述微生物中表达一种或多种异源基因而被遗传修饰。“调节”在本文中是指所述基因的表达水平与其天然表达水平相比上调、下调或甚至完全消除。因此这种调节可导致基因产物的活性增强，或者导致内源基因产物活性降低或无活性。“基因”在本文中是指编码特定蛋白质(即多肽)的核酸分子或多核苷酸，或在某些情况下，编码功能性或结构性rna分子的核酸分子或多核苷酸。在本发明的上下文中，本文提及的基因编码蛋白质，如酶。术语“功能基因”是指该基因的表达是功能性的，即该核苷酸序列含有使基因转录和基因翻译以及潜在地分泌由所述基因编码的蛋白质的所有元件。术语“编码”是指多核苷酸(即基因)通过转录和翻译机制产生氨基酸序列的过程。根据本发明的基因可以是内源基因或外源基因。术语“内源基因”在本文中是指天然存在于微生物中的基因。除了内源调控元件之外，通过引入有助于上调的异源序列，或通过用这些异源序列取代那些内源调控元件，或通过将内源基因的一个或多个补充拷贝引入微生物内的染色体或质粒来过表达内源基因。也可通过在其编码序列中引入突变以修饰基因产物来修饰内源基因活性和/或表达水平。还可以进行使内源基因缺失以完全抑制其在微生物内的表达。调节内源基因表达的另一种方法是用更强或更弱的启动子更换其启动子(即野生型启动子)以上调或下调该基因的表达水平。适用于这种目的的启动子可以是同源的或异源的，并且是本领域已知的。选择合适的启动子来调节内源基因的表达是在本领域技术人员的范围之内。另外，或者可选地，微生物可以被遗传修饰以表达一种或多种外源基因，只要将所述基因引入具有其在宿主微生物内表达所需的全部调控元件的微生物中。用外源dna来修饰或“转化”微生物是本领域技术人员的常规任务。“外源基因”或“异源基因”在本文中是指所述基因在微生物中不是天然存在的。为了在微生物中表达外源基因，可以将这种基因直接整合到微生物染色体中，或者通过质粒或载体在微生物染色体外进行表达。在复制起点和细胞中的拷贝数方面不同的各种质粒在本领域中是已知的，并且可以由熟练技术人员出于此目的容易地选择。根据本发明的外源基因有利地是同源基因。在本发明的上下文中，术语“同源基因”或“同源物”不仅指理论上共同遗传祖先的两个物种(即微生物物种)遗传的基因，而且包括可能与遗传无关的基因，尽管如此，它们进化为编码执行相似功能和/或具有相似结构的蛋白质(即功能同源物)。因此，术语“功能同源物”在本文中是指编码功能上同源蛋白质的基因。使用如uniprot(用于蛋白质)、genbank(用于基因)、或ncbi(用于蛋白质或基因)的数据库中可用的信息，本领域技术人员可以容易地确定微生物的具体蛋白质和/或基因的序列，并基于该序列鉴定另一种微生物中的等同基因或同源物之一。该常规工作可以通过微生物的具体基因序列与其他微生物的基因序列或基因组的序列比对来进行，这可以在上述数据库中找到。这种序列比对可以有利地使用altschul等人(1990)开发的blast算法进行。一旦在这些序列之间建立了序列同源性，可以衍生出共有序列并用于设计简并探针以便克隆相关微生物的相应同源基因。分子生物学的这些常规方法是本领域技术人员所熟知的。应当进一步理解的是，在本发明的上下文中，如果编码感兴趣蛋白质的外源基因在具体的微生物中表达，则该基因的合成版本优选通过将非优选的密码子或较不优选的密码子替换成所述微生物编码相同氨基酸的优选密码子来构建。事实上本领域众所周知，密码子使用在微生物物种之间有变化，这可影响感兴趣蛋白质的表达水平。为了克服这个问题，已经开发了密码子优化方法，并且由graf等人(2000)、deml等人(2001)和davis&olsen(2011)详细描述。为密码子优化确定开发了几种软件，例如软件(lifetechnologies)或者genscript的optimumgenetm软件。换言之，编码感兴趣蛋白质的外源基因优选经密码子优化用于在具体微生物中表达。根据本发明的微生物也可以被遗传修饰以增加或减少一种或多种基因的表达。根据本发明，术语“降低表达”或“减弱表达”是指相应基因的表达被部分或完全抑制，然后被称为“降低”或“减弱”。这种表达的抑制可以是抑制基因的表达、使基因表达所需的全部或部分启动子区缺失、使基因的全部或部分编码区缺失、或者用较弱的天然或合成启动子或用诱导型启动子来更换野生型启动子。本领域技术人员知道表现出不同强度的各种启动子，以及哪个启动子用于弱基因表达或可诱导基因表达。优选地，基因的减弱本质上是该基因的完全缺失，该基因可以被选择标记基因置换，该选择标记基因有利于根据本发明的菌株的鉴定、分离和纯化。优选地，基因通过同源重组技术失活(datsenko&wanner，2000)。术语“增加表达”、“增强表达”、或“过表达”及其语法上的等同，在文中可互换使用并具有相似的含义。这些术语意指与非修饰的微生物相比，内源或外源基因的表达或酶或蛋白质的产生增加，导致与非修饰的微生物相比，核糖核酸、蛋白质或酶的细胞内浓度增加。本领域技术人员知道测量细胞中核糖核酸浓度或蛋白质浓度的不同手段和方法，包括例如使用逆转录聚合酶链式反应(rt-pcr)来测定核糖核酸浓度和使用特异性抗体来测定具体蛋白质的浓度。增加蛋白质或酶的生产可以通过本领域技术人员熟知的几种技术，通过增加编码所述蛋白质或酶的基因的表达获得。在本发明的上下文中，术语“过表达”可用于指示微生物中基因转录的增加。增加基因(无论是内源的还是外源的)的转录可通过增加微生物内其拷贝的数量和/或通过使用与野生型启动子相比导致基因表达水平更高的启动子实现。如上所述，为了增加微生物中基因的拷贝数，可以将所述基因在染色体或染色体外编码。当在染色体上编码感兴趣的基因时，可以通过本领域熟知的遗传重组方法(例如基因置换)将一些基因的拷贝引入染色体中。当在微生物的染色体外编码基因时，它可以由不同类型的质粒(其复制起点根据其中其可复制的微生物而不同)携带，以及通过它们在细胞中的拷贝数携带。根据质粒的性质，由所述质粒转化的微生物可含有1至5个质粒拷贝、或约20个质粒拷贝、或甚至多达500个质粒拷贝。可在大肠杆菌中复制的低拷贝数质粒的实例包括但不限于psc101质粒(紧密复制)、rk2质粒(紧密复制)、以及pacyc和prsf1010质粒，而可在大肠杆菌中复制的高拷贝数质粒的例子是pskbluescriptii。可以增加基因表达水平的启动子也是本领域技术人员所熟知的，并且可以是同源的(来源于相同物种)或异源的(来自不同的物种或人工启动子)。这样的启动子的实例包括但不限于启动子ptrc、ptac、plac和λ噬菌体的pr和pl。这些启动子也可以被特定的化合物或具体的外部条件如温度或光诱导(“诱导型启动子”)。术语“过量生产”也可用于指示微生物中mrna翻译的增加。通过修饰核糖体结合位点(rbs)可以实现mrna翻译的增加。rbs是启动蛋白质翻译时核糖体结合的mrna上的序列。它可以是真核生物中mrna的5’帽子、原核生物起始密码子aug上游6-7个核苷酸的区域(称为shine-dalgarno序列)、或病毒中的内部核糖体进入位点(ires)。通过修饰该序列，可改变蛋白质翻译起始速率、按比例改变其生产速率、并且控制其在细胞内的水平活性。也可通过使用软件rbscalculator来优化rbs序列的强度以达到靶翻译起始速率(salis，2011)。基于mrna的性质来选择rbs序列是在本领域技术人员的能力范围之内的。术语酶的“活性”与术语“功能”可互换使用，并且在本发明的上下文中指由酶催化的反应。本领域技术人员知道如何测量所述酶的酶活性。术语“增加的活性”或“增强的活性”表示酶活性优于非修饰的微生物的酶活性。除了上述用于增加编码蛋白质或酶的基因的转录或增加mrna翻译的技术之外，通过提高蛋白质催化效率、通过降低蛋白质周转(turnover)、通过降低信使rna(mrna)周转，均可实现增加这种活性。提高蛋白质催化效率意味着增加给定底物和/或给定辅因子的kcat和/或降低给定底物和/或给定辅因子的km、和/或增加给定抑制剂的ki。kcat、km和ki是本领域技术人员能够测定的michaelis-menten常数(segel，1993)。减少蛋白质周转意味着稳定蛋白质。提高蛋白质催化效率和/或降低蛋白质周转的方法是本领域技术人员熟知的。那些包括合理的对序列工程化和/或结构分析和定向诱变，以及随机诱变和筛选。可以通过常规方法例如聚合酶链式反应(pcr)的定点诱变，通过例如诱变剂(紫外线或化学试剂如亚硝基胍(ntg)或甲基磺酸乙酯(ems))或dna改组或错误倾向pcr的随机诱变技术来引入突变。稳定蛋白质也可以通过在蛋白质的n-末端或c-末端添加“标签”肽序列来实现。这种标签在本领域中是众所周知的，其中包括谷胱甘肽-s-转移酶(gst)。通过修饰5’-非翻译区(5’-utr)和/或编码区、和/或3’-utr的基因序列可以减少mrna周转(carrier和keasling，1999)。术语酶的“减弱的活性”或“减少的活性”是指通过突变氨基酸序列获得的蛋白质的特异性催化活性降低和/或通过如上所述的核苷酸序列突变或使基因编码区缺失获得的细胞中蛋白质浓度的降低。降低蛋白质的活性可意味着通过多聚核苷酸中的单个或多个残基的突变、抑制、插入或修饰来降低其特异性催化活性和/或降低细胞中相应基因的表达，导致在基因的蛋白质编码区出现改变以及蛋白质编码序列以外的区域(例如但不限于调节序列或启动子序列)的改变。改变可是任何类型的突变，例如：点突变、移码突变、无义突变、如上所述的部分或全部基因的插入或缺失。术语“反馈敏感性”或“反馈抑制”是指细胞机制控制，其中一种或几种催化细胞中特定物质的产生的酶在当该物质积累到一定水平时被抑制或活性变低。因此，术语“降低的反馈灵敏度”或“降低的反馈抑制”或“没有反馈抑制”意味着与非修饰的微生物相比，这种机制的活性降低或受到抑制。本领域技术人员知道如何修饰酶以获得该结果。已经在专利申请wo2005/111202或专利us7,611,873中描述了这样的修饰。本发明涉及通过发酵产生甲硫氨酸的经遗传修饰的微生物，其中所述微生物经进一步遗传修饰以表达编码以下的功能基因：-硫代羧化蛋白质，-具有高丝氨酸o-乙酰转移酶活性而不被甲硫氨酸和/或s-腺苷甲硫氨酸反馈抑制的多肽，以及-具有o-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性的多肽。在本发明的第一方面，本发明的重组微生物表达在甲硫氨酸生物合成途径中编码作为硫供体的硫代羧化蛋白质的功能基因。硫代羧化蛋白质或蛋白硫代羧化物是其中c-末端位置的羧酸官能团具有一个或两个氧被硫置换的蛋白质(r-cosh、r-csoh、r-cssh)。这些蛋白质是多种生化硫化物转移反应中的重要中间体。这些蛋白质是日渐增长的生物合成硫化物供体家族的成员并参与多种生物合成途径。在甲硫氨酸生物合成途径中，硫代羧化蛋白质通过o-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶的作用与乙酰高丝氨酸反应形成硫代羧化蛋白-高半胱氨酸复合物。然后将复合物水解以释放高半胱氨酸，最终被甲基化形成甲硫氨酸，如图1所示。在一个实施方案中，编码本发明的微生物中表达的硫代羧化蛋白质的功能基因是内源的或异源的。优选地，编码本发明的微生物中表达的硫代羧化蛋白质的功能基因是异源的。最优选地，本发明的重组微生物过表达来自产琥珀酸沃林氏菌的基因hcys、hcyd、hcyf和sir并编码硫代羧化蛋白质hcys。如seqidno：1所示的hcys基因编码如seqidno：2所示的蛋白质hcys-ala。如seqidno：3所示的hcyd基因编码如seqidno：4所示的金属蛋白酶，所述金属蛋白酶参与hcys-ala的c-末端加工，从hcys-ala去除c-末端丙氨酸以得到hcys蛋白以及催化从hcys-高半胱氨酸释放高半胱氨酸的酶。如seqidno：5所示的hcyf基因编码如seqidno：6所示的催化hcys蛋白腺苷酰化的酶。然后hcys酰基-腺苷酸酯通过由sir基因(如seqidno：8所示)编码的蛋白sir(如seqidno：7所示)产生的二硫化物进行亲核取代。在本发明的第二方面，本发明的重组微生物表达功能基因，所述功能基因编码具有高丝氨酸o-乙酰转移酶活性而不被甲硫氨酸和/或s-腺苷甲硫氨酸反馈抑制的多肽。该酶活性使细胞积累能够与上述硫代羧化蛋白质反应的o-乙酰高丝氨酸。具有高丝氨酸o-乙酰转移酶活性的多肽是具有催化以下化学反应的酶活性的多肽：因此，该酶的两个底物是乙酰-coa和l-高丝氨酸，而其两种产物是coa和o-乙酰-l-高丝氨酸。该酶属于转移酶家族(ec2酶)，特别是那些转移除氨酰基基团之外基团的酰基转移酶(ec2.3酶)。该酶类的系统名称是乙酰-coa:l-高丝氨酸o-乙酰转移酶。其它常用的名称包括高丝氨酸乙酰转移酶、高丝氨酸转乙酰酶、高丝氨酸-o-转乙酰酶、和l-高丝氨酸o-乙酰转移酶或更多目前的metx蛋白。这种酶参与甲硫氨酸代谢和硫代谢。高丝氨酸o-乙酰转移酶活性可以通过甲硫氨酸和/或s-腺苷甲硫氨酸的反馈抑制机制或无此机制(也就是说甲硫氨酸和/或s-腺苷甲硫氨酸的反馈抑制降低或被抑制)来控制。存在于本发明的重组微生物中的具有高丝氨酸o-乙酰转移酶活性的酶不具有甲硫氨酸和/或s-腺苷甲硫氨酸的反馈抑制，所述酶的活性不被甲硫氨酸和/或s-腺苷甲硫氨酸抑制：o-乙酰高丝氨酸形成库(formationpool)不被甲硫氨酸和/或s-腺苷甲硫氨酸浓度水平抑制或降低。在本发明的另一个实施方案中，编码具有高丝氨酸o-乙酰转移酶活性的酶的基因metx是内源的或异源的。优选地，编码具有高丝氨酸o-乙酰转移酶活性的酶的基因是异源的，并且可来源于多种微生物。可以获得编码具有高丝氨酸o-乙酰转移酶活性的酶的基因metx的微生物包括棒杆菌属物种(corynebacteriumspecies)、钩端螺旋体属物种(leptospiraspecies)、异常球菌属物种(deinococcusspecies)、假单胞菌属物种(pseudomonasspecies)或分枝杆菌属物种(mycobacteriumspecies)，但不限于此。优选地，具有高丝氨酸o-乙酰转移酶活性的酶可由源自选自以下的菌株的基因metx编码：谷氨酸棒杆菌(corynebacteriumglutamicum)、迈氏钩端螺旋体(leptospirameyerei)、耐放射异常球菌(deinococcusradiodurans)、铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)和耻垢分枝杆菌(mycobacteriumsmegmatis)。如seqidno：9所示的来源于迈氏钩端螺旋体(leptospirameyeri)的metx基因编码如seqidno：10所示的具有高丝氨酸o-乙酰转移酶活性而不被甲硫氨酸和/或s-腺苷甲硫氨酸反馈抑制的酶(bourhy等人，1997)。显示出对反馈抑制有抗性的其他高丝氨酸o-乙酰转移酶可以通过本领域技术人员熟知的技术获得并且尤其描述于wo2005111202、us8551742、ep2290051和wo2008013432专利申请中。最优选地，本发明的重组微生物表达来自迈氏钩端螺旋体的基因metx，其编码具有高丝氨酸o-乙酰转移酶活性而不被甲硫氨酸和/或s-腺苷甲硫氨酸反馈抑制的酶，甚至最优选所述基因是过表达的。在本发明的第三方面，本发明的重组微生物表达编码具有o-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性的多肽的功能基因。该酶催化硫代羧化蛋白质hcys与o-乙酰高丝氨酸反应以形成hcys-高半胱氨酸复合物，并将来自硫代羧化蛋白质hcys的硫基团掺入乙酰高丝氨酸。该酶属于转移酶家族(ec2酶)，将具体官能团(例如甲基或糖基基团)从一个分子(称为供体)转移到另一个(称为受体)。特别地，该酶转移除甲基基团之外的烷基或芳基基团(ec2.5.1)。该酶的具体名称是o-乙酰-l-高丝氨酸:甲硫醇3-氨基-3-羧丙基转移酶。其他常用的名称包括o-乙酰-l-高丝氨酸乙酸裂解酶(加入甲硫醇)、o-乙酰-l-高丝氨酸硫化水解酶(o-acetyl-l-homoserinesulfhydrolase)、o-乙酰高丝氨酸(硫醇)-裂解酶、o-乙酰高丝氨酸硫化水解酶(o-acetylhomoserinesulfhydrolase)和甲硫氨酸合酶、或更多目前的mety蛋白。这种酶参与甲硫氨酸代谢和硫代谢。在一个实施方案中，编码具有o-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性的酶的基因mety可以是内源的或异源的。优选地，编码具有o-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性的酶的基因是异源的。最优选地，本发明的微生物表达来自产琥珀酸沃林氏菌的如seqidno：11所示的基因mety，其编码如seqidno：12所示的具有o-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性的多肽，甚至最优选所述基因是过表达的。所述过表达还可通过表达来自产琥珀酸沃林氏菌的如seqidno：13所示的经修饰的mety基因(从而编码如seqidno：14所示的具有o-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性的多肽)来优化。优选地，在本发明的重组微生物中，编码具有高丝氨酸o-乙酰转移酶活性的多肽的基因和编码具有o-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性的多肽的基因是异源的。优选地，用于本发明的微生物能够产生l-甲硫氨酸氨基酸。更优选地，本发明经遗传修饰的产生甲硫氨酸的微生物针对l-甲硫氨酸的生产进行了优化。参与微生物中甲硫氨酸生产的基因在本领域中是众所周知的，并且包含参与甲硫氨酸特异性生物合成途径的基因以及参与前体供应途径的基因和参与甲硫氨酸消耗途径的基因。甲硫氨酸的有效生产需要优化甲硫氨酸特异性途径和几个前体供应途径。在专利申请wo2005/111202、wo2007/077041和wo2009/043803、wo2010/020681、wo2011/073738、wo2011/080542、wo2011/080301、wo2012/055798、wo2013/001055、wo2013/190343、wo2015/028675和wo2015/028674中描述了产l-甲硫氨酸菌株，其作为参考并入本申请中。为了改善l-甲硫氨酸的生产，经遗传修饰用于产生甲硫氨酸的微生物可以表现出：-选自以下的至少一种基因的表达增加：·编码周质硫酸酯结合蛋白的cysp，如wo2007/077041和wo2009/043803所述，·编码硫酸酯abc转运蛋白组分的cysu，如wo2007/077041和wo2009/043803所述，·编码膜结合硫酸酯转运蛋白的cysw，如wo2007/077041和wo2009/043803所述，·编码硫酸酯通透酶的cysa，如wo2007/077041和wo2009/043803所述，·编码o-乙酰丝氨酸硫化水解酶(o-acetylserinesulfhydralase)的cysm，如wo2007/077041和wo2009/043803所述，·分别编码亚硫酸酯还原酶α和β亚基的cysi和cysj，如wo2007/077041和wo2009/043803所述。优选地，cys1和cysj一起过表达。·编码腺苷酰硫酸还原酶的cysh，如wo2007/077041和wo2009/043803所述。增加c1代谢也是导致甲硫氨酸生产提高的一种修饰。它涉及增加参与c1代谢的至少一种选自gcvthp、lpd、metf或meth的酶的活性。在本发明的优选实施方案中，通过增强以下至少一种的表达和/或活性来提高一碳代谢：·编码甘氨酸裂解复合物的gcvt、gcvh、gcvp和lpd，如专利申请wo2007/077041所述。甘氨酸裂解复合物(gcv)是催化甘氨酸氧化的多酶复合物，产生二氧化碳、氨、亚甲基-thf和还原的吡啶核苷酸。gcv复合物由四种蛋白质组分(称作p蛋白(gcvp)的甘氨酸脱氢酶、称作h蛋白(gcvh)的硫辛酰-gcvh-蛋白、称作t蛋白(gcvt)的氨甲基转移酶和称作l蛋白(gcvl或lpd)的二氢硫辛酰胺脱氢酶)组成。p蛋白催化从甘氨酸中吡哆醛磷酸酯依赖性释放co2，留下甲胺部分。将甲胺部分转移至h蛋白的硫辛酸基团，其在甘氨酸脱羧之前与p蛋白结合。t蛋白催化从甲胺基基团释放nh3，并将剩余的c1单元转移到thf，形成亚甲基-thf。然后l蛋白氧化h蛋白的硫辛酸组分并将电子转移到nad+，形成nadh；·编码亚甲基四氢叶酸还原酶的metf，如专利申请wo2007/07704所述。在本发明的具体实施方案中，metf的活性通过过表达metf基因和/或通过优化翻译来增强。在本发明的另一个具体实施方案中，通过在属于ptrc家族启动子的强启动子的控制下或者在诱导型启动子如温度诱导型启动子pr的控制下表达该基因来实现metf基因的过表达，如申请wo2011/073738所述。根据本发明的另一个实施方案，蛋白质metf的翻译的优化通过使用rna稳定剂来实现。用于过表达基因的其它手段是本领域技术人员已知的，并且可以用于metf基因的过表达。过表达以下参与丝氨酸生物合成的基因中的至少一种，也能减少副产物异亮氨酸的产生：·编码磷酸甘油酸脱氢酶的sera，如wo2007/077041和wo2009/043803所述，·编码磷酸丝氨酸磷酸酶的serb，如wo2007/077041和wo2009/043803所述，·编码磷酸丝氨酸氨基转移酶的serc，如wo2007/077041和wo2009/043803所述。以下基因的过表达已经被证明可以提高甲硫氨酸的生产：·编码具有降低的苏氨酸反馈抑制的天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶的thra或thra等位基因(thra*)，如wo2009/043803和wo2005/111202所述，·编码具有双功能天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶的多肽的metl。·编码葡萄糖特异性磷酸烯醇丙酮酸(pep)磷酸转移酶系统(pts)通透酶的ptsg，如wo2013/001055所述，·编码钴胺素依赖性甲硫氨酸合酶的meth，如wo2015/028674所述，·编码钴胺素非依赖性甲硫氨酸合酶的mete，如wo2013/190343所述，·编码作为与fpr和meth蛋白相互作用的辅基的含有fmn的必需黄素氧还蛋白的flda，如wo2015/028674所述，·编码甲硫氨酸合酶meth活化所需的黄素氧还蛋白nadp+还原酶的fpr，如wo2015/028674所述。所述还原酶使用非共价结合的fad作为辅因子，·分别编码膜结合质子转位吡啶核苷酸转氢酶的α-亚基和具有9个预测的跨膜结构域的内膜蛋白的pntab操纵子，如wo2012/055798中所述，·编码负责l-缬氨酸和l-甲硫氨酸输出的支链氨基酸输出蛋白(liv-e)家族成员的ygazh操纵子，·编码丙酮酸羧化酶的pyc，如专利申请wo2012/055798所述。通过过表达相应基因或修饰该基因的核酸序列以表达具有提高的活性的酶，获得丙酮酸羧化酶的活性增加。在本发明的另一个实施方案中，pyc基因通过重组将一个或多个拷贝引入染色体，或者通过存在的质粒将至少一个拷贝携带入经修饰的微生物中。pyc基因来源于菜豆根瘤菌(rhizobiumetli)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)、荧光假单胞菌(pseudomonasfluorescens)、乳酸乳球菌(lactococcuslactis)或棒杆菌属物种(corynebacteriumspecies)。在一个优选的实施方案中，本发明的微生物过表达来自菜豆根瘤菌(rhizobiumetli)的pyc基因。-和/或降低至少一种以下基因的表达：·编码丙酮酸激酶的pyka，如wo2007/077041和wo2009/043803所述，·编码丙酮酸激酶的pykf，如wo2007/077041和wo2009/043803所述，·编码甲酰四氢叶酸脱甲酰基酶的puru，如wo2007/077041和wo2009/043803所述，·编码n-乙酰转移酶的ynca，如wo2010/020681所述，·编码甲硫氨酸生物合成途径的一种阻遏物的metj，如wo2005/111202所述。如专利申请jp2000/157267中所显示的，阻遏蛋白metj负责下调甲硫氨酸调节子，·编码可溶性吡啶核苷酸转氢酶的udha，所述可溶性吡啶核苷酸转氢酶基本上通过把nad+还原成nadh催化了将nadph氧化为nadp+，如专利申请wo2012/055798所述。·编码转录双重调节剂的dgsa，所述转录双重调节剂控制编码磷酸转移酶(pts)和磷酸烯醇丙酮酸(pep)系统的酶的许多基因的表达，如wo2013/001055所述，·编码转录后调节ptsg丰度的小rna的sgrs，如wo2013/001055所述，·编码调节剂的sgrt，所述调节剂在葡萄糖磷酸应激反应中起作用，调节ptsg的活性，如wo2013/001055所述·编码参与摄取甲硫氨酸的abc转运蛋白亚基的metniq操纵子。基因可在诱导型启动子的控制下表达。专利申请wo2011/073738描述了产l-甲硫氨酸菌株在诱导型启动子的控制下表达具有降低的苏氨酸反馈抑制的thra等位基因(thra*)。此申请通过引用并入本申请。在本发明的具体实施方案中，thra或thra等位基因、pyc、pntab、ygazh或ptsg基因处于温度诱导型启动子的控制下。在最优选的实施方案中，所使用的温度诱导型启动子属于pr或pl启动子家族。在本发明的具体实施方案中，过表达的基因处于其在染色体上的天然位置或整合在非天然位置上。对于最佳的l-甲硫氨酸生产，可能需要基因的几个拷贝，并且这些多拷贝被整合到特异的基因座，其修饰不会对甲硫氨酸的生产产生负面影响。在专利申请wo2011/073122、wo2011/073738和wo2012/055798中公开了可整合基因却不干扰细胞代谢的基因座的实例，所述专利申请通过引用并入本文。在本发明的一个优选实施方案中，经遗传修饰的产生甲硫氨酸的微生物过表达至少一种以下的基因：编码具有天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶活性且具有降低的苏氨酸反馈抑制的多肽的thra或thra等位基因(thra*)，编码具有双功能天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶的多肽的metl，编码具有钴胺素非依赖性甲硫氨酸合酶的多肽的mete或编码具有钴胺素依赖性甲硫氨酸合酶的多肽的meth。更优选地，经遗传修饰的产生甲硫氨酸的微生物过表达基因meth和metl。甚至更优选地，经遗传修饰的产生甲硫氨酸的微生物过表达基因thra*、meth和metl。在本发明的另一个优选实施方案中，缺失metj基因以避免甲硫氨酸调节子的阻遏。在这种情况下，内源基因metl、metb、mete和/或meth，以及在属于甲硫氨酸调节子的内源启动子控制下的外源基因，都不被metj蛋白阻遏。在另一个优选的实施方案中，表达metj基因，但是在这种情况下，要更换属于metj调节子的内源基因的启动子以及用于控制外源基因表达并属于metj调节子的启动子。适用于这种目的的启动子可以是同源的或异源的，并且是本领域已知的。在一个具体方面，本发明的重组微生物包含以下遗传修饰：·增强以下基因的表达：来自产琥珀酸沃林氏菌的hcys、hcyd、hcyf和sir基因，来自迈氏钩端螺旋体的metx基因，以及来自产琥珀酸沃林氏菌的mety基因。除了这些修饰之外，本发明的重组微生物优选进一步包含：o提高至少一种以下基因的表达：pyc、ptsg、pntab、cysp、cysu、cysw、cysa、cysm、cysj、cysi、cysh、gcvt、gcvh、gcvp、lpd、glya、sera、serb、serc、metf、flda、fpr、metn、meti、metq，和/或o减弱至少一种以下基因的表达：met、pyka、pykf、puru、ynca、mete、dgsa、sgrs、sgrt、ygazh或udha。更具体地，本发明的重组微生物包含以下遗传修饰：·增强以下基因的表达：来自产琥珀酸沃林氏菌的hcys、hcyd、hcyf和sir基因，来自迈氏钩端螺旋体的metx基因，以及来自产琥珀酸沃林氏菌的mety基因。·增强基因cyspuwam、cysjih、thra*和meth的表达。甚至更具体地，本发明的重组微生物包含以下遗传修饰：·增强以下基因的表达：来自产琥珀酸沃林氏菌的hcys、hcyd、hcyf和sir基因，来自迈氏钩端螺旋体的metx基因，以及来自产琥珀酸沃林氏菌的mety基因·增强基因cyspuwam、cysjih、gcvthp、thra*、metf和meth的表达，·减弱基因metj的表达。或者：·增强以下基因的表达：来自产琥珀酸沃林氏菌的hcys、hcyd、hcyf和sir基因，来自迈氏钩端螺旋体的metx基因，以及来自产琥珀酸沃林氏菌的mety基因·增强基因cyspuwam、cysjih、gcvthp、thra*、metf和meth的表达，·减弱基因metj、pyka、pykf和puru的表达。或者：·增强以下基因的表达：来自产琥珀酸沃林氏菌的hcys、hcyd、hcyf和sir基因，来自迈氏钩端螺旋体的metx基因，以及来自产琥珀酸沃林氏菌的mety基因·增强基因cyspuwam、cysjih、gcvthp、thra*、metf和meth的表达，·减弱基因pyka、pykf和puru的表达。本发明的微生物优选属于肠杆菌科(enterobacteriaceae)或棒杆菌科(corynebacteriaceae)，并且最优选是大肠杆菌(escherichiacoli)。最后，本发明涉及一种发酵生产甲硫氨酸的方法，包括培养如上所述的经遗传修饰的产生甲硫氨酸的微生物，并且表达编码硫代羧化蛋白质、具有高丝氨酸o-乙酰转移酶活性而不被甲硫氨酸和/或s-腺苷甲硫氨酸反馈抑制的多肽、和具有o-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性的多肽的功能基因，并从所述培养基中回收甲硫氨酸。根据本发明的一个具体方面，所述方法使用过表达来自产琥珀酸沃林氏菌的hcys、hcyd、hcyf和sir基因，来自迈氏钩端螺旋体的metx基因以及来自产琥珀酸沃林氏菌的mety基因的重组微生物进行。根据所述方法的另一具体方面，所述微生物进一步过表达以下基因中的至少一种：编码具有天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶活性且具有降低的苏氨酸反馈抑制的多肽的thra或thra等位基因(thra*)、编码具有双功能天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶的多肽的metl，编码具有钴胺素非依赖性甲硫氨酸合酶的多肽的mete或编码具有钴胺素依赖性甲硫氨酸合酶的多肽的meth。根据本发明，术语“发酵过程”、“培养”或“发酵”可互换使用，表示给定微生物在含有碳源、硫源和氮源的适当培养基上的生长。通常生长在具有适合于所用微生物的合适的生长培养基的发酵罐中进行。在本发明的发酵过程中，碳源同时用于：o生物量生产：通过特别是转化培养基的碳源使得微生物生长，o甲硫氨酸生产：通过生物量将相同的碳源转化为甲硫氨酸。因为该微生物包含允许这种转化的代谢途径，这两个步骤是伴随的，并且由微生物生长转化的碳源导致培养基中l-甲硫氨酸的生产。“合适的培养基”在本文中是指包含对于微生物的维持和/或生长必需或有益的营养物的培养基(例如无菌液体培养基)，例如碳源或碳底物；氮源，例如蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、麦芽提取物、尿素、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵和磷酸铵；磷源，例如磷酸一钾或磷酸二钾；微量元素(例如金属盐)，例如镁盐、钴盐和/或锰盐；以及生长因子如氨基酸和维生素。根据本发明的术语“碳源”表示可以由本领域技术人员用来支持微生物正常生长的任何碳源，其可以是己糖如葡萄糖、半乳糖或乳糖；戊糖；单糖；二糖如蔗糖(糖蜜)、纤维二糖或麦芽糖；低聚糖如淀粉或其衍生物；半纤维素；甘油及其组合。特别优选的碳源是葡萄糖。另一种优选的碳源是蔗糖。在本发明的具体实施方式中，碳源衍生自可再生原料。可再生原料定义为某些工业加工所需的原材料，其可以在短暂的延迟内再生，并有足够的数量使其转化成所需的产品。处理或未处理的植物生物量是一种感兴趣的可再生碳源。碳源是可发酵的，即它可以用于微生物的生长。根据本发明的术语“硫源”是指硫酸盐/酯、硫代硫酸盐/酯、硫化氢、连二硫酸盐/酯、连二亚硫酸盐/酯、亚硫酸盐/酯、甲硫醇、二甲基硫醚、二甲基二硫醚和其它含甲基帽的硫化物、或不同来源的组合。培养基中优选的硫源是硫酸盐/酯或硫代硫酸盐/酯或其混合物。另一种优选的硫源是二甲基二硫醚。术语“氮源”对应于铵盐或氨气。氮来自无机(例如(nh4)2so4)或有机(例如尿素或谷氨酸)来源。在本发明中培养的氮源是(nh4)2hpo4、(nh4)2s3o3和nh4oh。培养可以在微生物无机底物(特别是磷酸盐和/或钾)限制或缺乏的条件下进行。使生物受到无机底物的限制，从而限定了微生物的生长受控于所供应的无机化学品数量但仍然允许微弱生长的条件。使微生物由于无机底物饥饿，从而限定了由于缺少无机底物而完全停止微生物生长的条件。本领域技术人员能够确定用于本发明微生物的培养条件和培养基的组成。具体而言，细菌在20℃至55℃的温度、优选在25℃至40℃发酵，更具体地，谷氨酸棒杆菌(c.glutamicum)约为30℃，大肠杆菌约为37℃。作为用于大肠杆菌的已知培养基的实例，培养基可以具有与以下培养基相同或相似的组成：m9培养基(anderson，1946，proc.natl.acad.sci.usa32：120-128)、m63培养基(miller，1992；ashortcourseinbacterialgenetics：alaboratorymanualandhandbookforescherichiacoliandrelatedbacteria，coldspringharborlaboratorypress，coldspringharbor，newyork)、或如schaefer等人定义的培养基(1999，anal.biochem.270：88-96)。作为用于谷氨酸棒杆菌的已知培养基的实例，培养基可以具有与以下培养基相同或相似的组成：bmcg培养基(liebl等，1989，appl.microbiol.biotechnol.32：205-210)、或者如riedel等人所述的培养基(2001，j.mol.microbiol.biotechnol.3：573-583)。本发明的方法可以是分批方法、补料分批方法或连续方法，以及在需氧、微氧或厌氧条件下进行。“需氧条件下”的发酵是指通过将气体溶解到培养物的液相中从而将氧气提供给培养物。这可以通过(1)将含氧气体(例如空气)喷射到液相中，或(2)摇动含有培养基的容器，以便将包含在顶部空间中的氧气转移到液相中来实现。在需氧条件下发酵的主要优点是由于作为电子受体的氧气的存在，在细胞过程中提高了菌株产生更多以atp形式的能量的能力，由此提高菌株的一般代谢。微氧条件可以在本文中使用，并且定义为其中低百分比的氧(例如使用含有0.1-10％的氧、用氮填充至100％的气体混合物)溶解到液相中的培养条件。相反，“厌氧条件”定义为不向培养基提供氧气的培养条件。严格的厌氧条件可以通过向培养基中喷射惰性气体如氮气以除去痕量的其他气体来获得。硝酸盐可以作为电子受体来提高菌株atp产生并提高其代谢。在本发明中，发酵是以补料分批模式进行的。这是指在发酵过程中添加补充生长培养基的发酵类型，但直到批次结束时才除去培养物(除了用于取样和hplc/gcms分析的小体积之外)。该过程包括两个主要步骤；第一步是在合适的分批矿物质培养基和分批补料矿物质培养基中进行一系列的预培养。随后，根据所需的生产，使用装有适当最少分批培养基的发酵罐并用不同的分批补料培养基进行培养。本发明的方法还包括从培养基中回收甲硫氨酸的步骤。“从培养基中回收甲硫氨酸”的行为表示从发酵培养基回收无论纯度如何的甲硫氨酸的行为。“回收”是指从含有感兴趣的产物(在这种情况下为甲硫氨酸)和其它发酵副产物的发酵过程(必须发酵(fermentationmust))中直接获得的第一产物，因此具有或多或少可接受的纯度。“纯化”步骤由特异性纯化感兴趣的产物(在这种情况下为甲硫氨酸)组成，以获得具有提高的纯度的甲硫氨酸。甲硫氨酸可通过本领域技术人员熟知的技术和方法如蒸馏、离子交换色谱法、沉淀、结晶或与盐络合(特别是与钙盐或铵盐络合)来回收和纯化。所产生的化合物的回收和纯化方法是本领域技术人员已知的(具体参见wo2005/007862、wo2005/059155)。优选地，回收甲硫氨酸的步骤包括在发酵液中浓缩甲硫氨酸和/或其衍生物的步骤。可以使用本领域已知的多种方法，例如高效液相色谱(hplc)或气相色谱(gc)来测定发酵培养基中产物的量。例如，使用l-甲硫氨酸(sigma，ref64319)作为标准，在opa/fmoc衍生化后，通过hplc测量培养基中所获得的甲硫氨酸的量。实施例以下实验表明，过表达编码参与硫代羧化蛋白质hcys生产的蛋白质的基因与过表达编码参与微生物(例如大肠杆菌)中乙酰-高丝氨酸和hcys-高半胱氨酸生产的酶的基因如何提高甲硫氨酸的生产。在下面给出的实施例中，用本领域熟知的方法来构建datsenko&wanner(2000)描述的针对大肠杆菌的包含复制载体和/或用同源重组进行的各种染色体插入、缺失和取代的大肠杆菌菌株。以相同方式，使用质粒或载体在重组微生物中表达或过表达一种或几种基因是本领域技术人员熟知的。合适的大肠杆菌表达载体的实例包括ptrc、pacyc184、pbr322、puc18、puc19、pkc30、prep4、phs1、phs2、pplc236等。实验方案以下实施例中描述了几种用于构建产甲硫氨酸菌株的实验方法。在本发明中使用的实验方案1(通过同源重组的染色体修饰、重组体的选择和抗生素盒切除)和实验方案2(噬菌体p1的转导)已经在专利申请wo2013/001055中充分描述。实验方案3：构建重组质粒重组dna技术已被充分描述并为本领域技术人员所知。简而言之，使用本领域技术人员能够设计的寡核苷酸对dna片段进行pcr扩增，并使用感兴趣菌株的基因组dna作为基质。用相容限制酶消化dna片段和所选的质粒、连接、然后转化到感受态细胞中。分析转化体，并通过dna测序验证感兴趣的重组质粒。实施例1：在重组产l-甲硫氨酸大肠杆菌菌株-菌株1以及构建的菌株2和3中产琥珀酸沃林氏菌的蛋白硫代羧化物依赖性甲硫氨酸生物合成途径的过量生产。用于本申请的产甲硫氨酸菌株：菌株1菌株1：用作过量生产产琥珀酸沃林氏菌的蛋白硫代羧化物依赖性甲硫氨酸生物合成途径的受者的产l-甲硫氨酸菌株是在之前专利申请wo2009/043803中描述的mg1655meta*11dmetjptrc36-arnmst17-metfptrc-methptrcf-cysjihptrcf-cyspuwamptrc09-gcvthpdpykadpykfdpuru，并且在本专利申请中命名为菌株1。该菌株是一种产l-甲硫氨酸的大肠杆菌菌株，其不具有完全优化的内源半胱氨酸生产途径。该菌株用作参考，与本发明重组菌株相比较，所述重组菌株具有产琥珀酸沃林氏菌的蛋白硫代羧化物依赖性甲硫氨酸生物合成途径，并且本申请中已描述。过量生产产琥珀酸沃林氏菌的蛋白硫代羧化物依赖性甲硫氨酸生物合成途径：过表达来自产琥珀酸沃林氏菌的hcys、hcyf、hcyd和sirseqidno：1所示的基因hcys编码如seqidno：2所示的硫转移蛋白质，seqidno：3所示的基因hcyd编码seqidno：4所示的金属蛋白酶，seqidno：5所示的基因hcyf编码seqidno：6所示的酶，该酶可以催化hcys的腺苷酸化，以及seqidno：8所示的基因sir编码如seqidno：7所示的亚硫酸还原酶，这些全部来自产琥珀酸沃廉氏菌(atcc29543d-5)，在菌株1的遗传背景中过表达。通过使用描述用于专利申请wo2007/0770441描述的pme101-thra*1-cyse质粒的cyse基因的相同启动子、每个hcysfd-sir基因的核糖体结合位点和中等质粒拷贝数pcl1920过表达操纵子hcysfd-sir(lerner&inouye，1990)。更准确地，与所选择的启动子可操作地连接的hcysfd-sir操纵子被克隆到专利申请wo2007/0770441中所述的pme101-thra*1重组质粒的thra*1基因的下游。该质粒命名为pme1308。用来自产琥珀酸沃林氏菌的替代甲硫氨酸生物合成途径修饰重组产l-甲硫氨酸大肠杆菌菌株：缺失meta*11等位基因和过表达分别来自迈氏钩端螺旋体和产琥珀酸沃林氏菌的metx和mety基因。为了用菌株1产生乙酰高丝氨酸而不是琥珀酰高丝氨酸，使大肠杆菌中编码高丝氨酸o-琥珀酰转移酶的meta*11基因缺失，并且被过表达来自迈氏钩端螺旋体(leptospirameyeriserovarsemaranga-dsm21536)的编码高丝氨酸o-乙酰转移酶(如seqidno：10所示)的metx基因(如seqidno：9所示)置换。然后，通过过表达编码o-乙酰高丝氨酸-硫化氢解酶的产琥珀酸沃林氏菌mety基因获得hcys-高半胱氨酸，所述hcys-高半胱氨酸是向hcys硫代羧化物(hcys-cosh)加入乙酰-高丝氨酸。缺失大肠杆菌菌株1的meta*11等位基因-构建菌株2为了缺失菌株1的meta*11等位基因，使用datsenko&wanner，2000(根据实验方案1)描述的同源重组策略。带有抗性标记的片段被pcr扩增，所述片段侧翼为与如seqidno：15和seqidno：16所示的meta*11基因座上下游序列同源的dna序列。然后通过电穿孔将获得的pcr产物引入菌株1中，其中预先把pkd46载体引入菌株1中。然后选择抗生素抗性转化体，用合适的寡核苷酸通过pcr分析验证与抗性盒相关的meta*11基因的缺失。保留的菌株命名为菌株2。过表达迈氏钩端螺旋体的metx基因通过使用与专利申请wo2011/073122(实施例1)中描述的用于pcl1920-ttadc-ci857-plambdar*(-35)-thra*1-cyse-pgapa-meta*11质粒的meta*11基因相同的启动子和核糖体结合位点以及中等质粒拷贝数pcl1920过表达迈氏钩端螺旋体的metx基因(lerner&inouye，1990)。更确切地，与所选择的启动子可操作地连接的metx基因被克隆到本专利申请所述的pme1308重组质粒sir基因的下游。该质粒命名为pme1325。过表达产琥珀酸沃林氏菌的mety如seqidno：11所示的mety基因编码如seqidno：12所示的产琥珀酸沃林氏菌(atcc29543d-5)的mety蛋白，通过使用大肠杆菌metb基因的启动子(kirby等人，1986)、mety基因的内源核糖体结合位点和细菌人工染色体(pcc1bac，epicentre)过表达。为优化过表达，mety的起始密码子gtg也改为如seqidno：13所示的atg，从而编码甲硫氨酸作为第一氨基酸代替如seqidno：14所示的缬氨酸。该质粒命名为pme1306。构建菌株3：在重组产l-甲硫氨酸大肠杆菌菌株中过量生产产琥珀酸沃林氏菌的蛋白硫代羧化物依赖性甲硫氨酸生物合成途径将质粒pme1325和pme1306转化到菌株2中，得到菌株3。实施例2：在缺失meta的重组产l-甲硫氨酸大肠杆菌菌株中过量生产metx和mety，且不需来自产琥珀酸沃林氏菌的替代性甲硫氨酸生物合成途径-构建菌株4。通过使用适当限制酶除去质粒pme1325携带的操纵子hcysfd-sir。得到的质粒命名为pme1338。将质粒pme1338和pme1306转化到菌株2中，产生菌株4。实施例3：生长和用来自产琥珀酸沃林氏菌的替代性甲硫氨酸生物合成途径生产l-甲硫氨酸在小锥形瓶中评估生产菌株。在混合培养基(含有2.5gl-1葡萄糖和90％基本培养基pc1的10％lb培养基(sigma25％))中，在37℃生长5.5ml的预培养物。在pc1培养基中，将预培养物接种到50ml培养物，使od600为0.2。加入浓度为50mg.l-1的壮观霉素和卡那霉素，并且在必要时，加入浓度为10mgl-1氨苄青霉素。培养物的温度是37℃。当培养物od600达到5-7时，在opa/fmoc衍生化之后通过hplc定量胞外氨基酸，并且其他相关的代谢产物用折光检测器(有机酸和葡萄糖)和甲硅烷基化后用gc-ms分析。甲硫氨酸滴度表示如下：表1：基本培养基组成(pc1)。表2：在锥形瓶中基本培养基中测试的每种菌株的生长和l-甲硫氨酸生产水平(mm)。(-)表示完全没有生长(0h-1)；(+)对应于0和0.2h-1之间的生长速率；(++)对应于0.2h-1以上的生长速率。菌株生长速率甲硫氨酸生产(mm)菌株1+1.7菌株2-0菌株4+1.1菌株3++1.8在重组产l-甲硫氨酸大肠杆菌菌株中，过表达来自产琥珀酸沃林氏菌的硫途径提高了生长速率和l-甲硫氨酸产量(菌株3与菌株4相比)。这个结果表明，替代的硫途径在大肠杆菌中起作用并且提高了l-甲硫氨酸的生产。在菌株2、3和4中，缺失meta*11基因证明蛋白硫代羧化物依赖性甲硫氨酸生物合成途径的功能性。然而，在相同条件下也构建和评估了在染色体上具有meta*11基因的功能性拷贝的等同菌株。结果显示代谢途径也在大肠杆菌meta*11菌株中起作用(数据未显示)。所有这些结果表明来自产琥珀酸沃林氏菌的替代硫途径在大肠杆菌中起作用并且提高了含硫氨基酸l-甲硫氨酸的生产。此外，这种途径的使用克服了通常在该生产中遇到的与半胱氨酸过量生产有关的问题。参考文献-agrend.,schnellr.,oehlmannw.,singhm.,schneiderg.,2008,journalofbiologicalchemistry,283(46):31567-31574.-altschuls,gishw,millerw,myerse,lipmandj,1990,j.mol.biol,215(3):403–410.-anderson,1946,proc.natl.acad.sci.usa.,32:120-128.-bourhyp,martela,margaritad,saint-gironsiandbelfaizaj.1997,journalofbacteriology,179(13):4396-4398.-carriert&keaslingj.1999,biotechnolprog.,15(1):58-64.-datsenkok.a.,wannerb.l.,2000,proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheusa,97:6640-6645-davisjj&olsengj.,2011,mol.biol.evol.,28(1):211-221.-demll,bojaka,stecks,grafm,wildj,schirmbeckr,wolfh,wagnerr.,2001,j.virol.,75(22):10991-11001.-grafm,bojaka,demll,bielerk,wolfh,wagnerr.,2000,j.virol.,74(22):10/22-10826.-kirbytw.,hindenachbr.,greenerc.,1986,journalofbacteriology,165(3):671-677-krishnamoorthyk.,begleytp.,2011,journaloftheamericanchemicalsociety,133(2):379-386-lernercg,inouyem.,1990,nucleicacidsres.1990aug11；18(15):4631.-lieblw,klamerr,schleiferkh1989,appl.microbiol.biotechnol.32:205-210.-miller,1992“ashortcourseinbacterialgenetics:alaboratorymanualandhandbookforescherichiacoliandrelatedbacteria”,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,newyork.-riedelc,rittmannd,dangelp,b,petersens,sahmh,eikmannsbj.,2001,j.mol.microbiol.biotechnol.3:573-583.-salish,2011,methodsenzymol.,498:19-42.-saundersonc.l.,1985,britishjournalofnutrition,54:621-633-schaeferu,boosw,takorsr,weuster-botzd,1999anal.biochem.270:88-96.-segelih,1993,enzymekinetics,johnwiley&sons,pp.44-54and100-112.-taylorsv.,kellehernl.,kinslandc.,chiuhj.,costelloca.,backstromad.,mclaffertyfw.,begleytp.,1998,journalofbiologicalchemistry,273(26):16555-16560.序列表<110>赢创德固赛有限公司<120>通过发酵的蛋白硫代羧化物依赖性l-甲硫氨酸生产<130>b368291d35196<160>16<170>patentinversion3.5<210>1<211>210<212>dna<213>wolinellasuccinogenes<400>1atgaatctcatcatcaacggagagaataagagttttgaaaaagagggcttaagcgtgaag60gagcttttggttttagaatcggttaaaatgcctgaaatggtctccattcagctcaatgac120gagtttttaagagagcctgagtatgcgaccacttcgcttaaagagggcgatacgattaac180tttttatatttcatgggagggggcgcatga210<210>2<211>69<212>prt<213>wolinellasuccinogenes<400>2metasnleuileileasnglygluasnlysserpheglulysglugly151015leuservallysgluleuleuvalleugluservallysmetproglu202530metvalserileglnleuasnaspglupheleuarggluproglutyr354045alathrthrserleulysgluglyaspthrileasnpheleutyrphe505560metglyglyglyala65<210>3<211>393<212>dna<213>wolinellasuccinogenes<400>3atgctcaaaatccctaaagcgctctttgattccattatcgagcacgcccaaagagagctt60cccttagaggcgtgcggctatgtagctggagtggagggcgaggtgaagcggctctttcct120atgaggaatgtcgatgcgagccctgagcatttcagctttgatcccgccgaacaatttagc180gcttttaaagaggcgcaaaaagagggattgcggctcattggctgctatcactctcaccca240agcactcctgcaagaccctccgatgaggatattcgcctagcctatgacagtagcctcagc300tacctcattgtctcgctggccaaggagcctgttttaaactcttttaaaatcaaagaggga360gtcgtcactcccgaaaatatcgaggtgatctaa393<210>4<211>130<212>prt<213>wolinellasuccinogenes<400>4metleulysileprolysalaleupheaspserileilegluhisala151015glnarggluleuproleuglualacysglytyrvalalaglyvalglu202530glygluvallysargleupheprometargasnvalaspalaserpro354045gluhispheserpheaspproalagluglnpheseralaphelysglu505560alaglnlysgluglyleuargleuileglycystyrhisserhispro65707580serthrproalaargproseraspgluaspileargleualatyrasp859095serserleusertyrleuilevalserleualalysgluprovalleu100105110asnserphelysilelysgluglyvalvalthrprogluasnileglu115120125valile130<210>5<211>819<212>dna<213>wolinellasuccinogenes<400>5atgagagagtttagcgaagaggagctagaacgctactcaaggcatatcatccttgaagag60gtgggaatcgaggggcaagagaagatcatgaactccaaagtccttatcatcggtgcaggc120ggacttggttcgcccattgccttctatttggccgcagcgggagtgggagagatcggaatc180atcgatggggatgtggtggatcggagcaatcttcagcgccagatcattcacaccacggat240gagattggaatccccaaagtcgaatcggcacgccgcaagctcaaggcgctcaatcccaat300attcgagttcaaacttggcagatcatgatcaatgccgaaaacatctcacgaatcatcgcc360ccctacgattttatcatcgatgggacggataattttgcggccaaattcctcatcaatgat420gcgtgtgtcatggcgggcaaaccctactcccacggtggaatcttgaaatttgcagggcag480agcatgaccataaaaccgggagagagcgcctgctatgcgtgtgtctttgatcagcctccc540cccgctggctctattcccacctgctctagcgcagggattttaggggcgattgcagggatg600cttggcaccattcaagccgccgaggcgctcaaagtgattacaggcgtaggcgaacccctc660tataatcgccttttaagctttgatgccaaaagcatgaatttccgcaccgtgaaattcacc720aaaaacccccattgtcgtgtttgcggaggcgagggagtgaagattttacgcgaatatgaa780caacccatatgcgaggtgaatcatgctcaaaatccctaa819<210>6<211>272<212>prt<213>wolinellasuccinogenes<400>6metarggluphesergluglugluleugluargtyrserarghisile151015ileleuglugluvalglyilegluglyglnglulysilemetasnser202530lysvalleuileileglyalaglyglyleuglyserproilealaphe354045tyrleualaalaalaglyvalglygluileglyileileaspglyasp505560valvalaspargserasnleuglnargglnileilehisthrthrasp65707580gluileglyileprolysvalgluseralaargarglysleulysala859095leuasnproasnileargvalglnthrtrpglnilemetileasnala100105110gluasnileserargileilealaprotyrasppheileileaspgly115120125thraspasnphealaalalyspheleuileasnaspalacysvalmet130135140alaglylysprotyrserhisglyglyileleulysphealaglygln145150155160sermetthrilelysproglygluseralacystyralacysvalphe165170175aspglnproproproalaglyserileprothrcysserseralagly180185190ileleuglyalailealaglymetleuglythrileglnalaalaglu195200205alaleulysvalilethrglyvalglygluproleutyrasnargleu210215220leuserpheaspalalyssermetasnpheargthrvallysphethr225230235240lysasnprohiscysargvalcysglyglygluglyvallysileleu245250255argglutyrgluglnproilecysgluvalasnhisalaglnasnpro260265270<210>7<211>764<212>prt<213>wolinellasuccinogenes<400>7metserhistyrthrleuproproservalalagluaspphealaser151015phelysgluserhisalaaspphemetalaglylysleuaspalaleu202530thrphelysthrileargvalpropheglyiletyrgluglnargglu354045seraspthrtyrmetvalargvallysleualaglyglyileleuthr505560proalaglnleuhisserleualaleuleualagluhistyralalys65707580prohisleuhisvalthrthrargglyglyvalglnleuhistyrala859095lysleuglnaspleuproglnileileglnalaleuhisglumetgly100105110leuthrglyargglyglyglyglyasnthrvalargasnilethrala115120125aspprotyralaglyilealaproaspglualapheaspvalthrpro130135140cysalaleuserleuthrthrlysmetleugluthrlysaspsertyr145150155160serleuproarglysphelysilealapheserglysersergluasp165170175argglyglyalathrtyrileaspvalglypheilealalysilehis180185190gluglyvalargglypheargleuphevalalaglyglymetglyala195200205lysserargleuglyseralapheileasppheleuproglngluglu210215220ilepheleupheserglnalailelysglnvalpheaspglnhisgly225230235240asnarglysasnlyshisalaalaargleuargpheleuilegluglu245250255leuglygluglyglnphearggluleuvalphelysgluvalglnala260265270leuargaspglnglyglytrpgluilelysleugluglualapheglu27528028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