本发明涉及microrna分子作为分子标记物预后非小细胞肺癌中的用途，具体地，本发明涉及microrna分子作为分子标记物用于预测非小细胞肺癌脑转移风险的用途，其中所述microrna分子选自microrna-193a-5p、microrna-210、microrna-214、microrna-423-3p、microrna-423-5p和microrna-4270中的一个或多个。
背景技术：
：：利用分子生物学技术，能够有效地通过分子水平的检测来判断恶性肿瘤患者脑转移的危险性，进而为个体化治疗这些疾病提供便利。世界范围内，肺癌是癌症死亡的首要因素。非小细胞肺癌约占全部肺癌的80％，约25％的非小细胞肺癌患者会发生脑转移。局部晚期非小细胞肺癌约占非小细胞肺癌的40％，并且脑转移是局部晚期非小细胞肺癌综合治疗后最常见的失败之一。早期非小细胞肺癌患者脑转移的风险为10％。然而，局部晚期非小细胞肺癌脑转移的风险要高得多，约30-50％。脑转移严重危害患者的生存和生活质量。手术和放射技术的进步提高了局部晚期非小细胞肺癌的局部控制。系统化疗降低了颅外转移的风险。综合治疗显著延长了生存。近来的研究报道：局部晚期非小细胞肺癌综合治疗后的中位生存为20-43月，3年生存为34-63％。尽管如此，血脑屏障的存在致使化疗对脑转移的作用有限，从而使脑的治疗相对不足。脑转移风险随着生存的提高而上升。研究显示：局部晚期非小细胞肺癌患者的生存和脑转移率呈正相关，脑转移对生存的危害逐渐上升。随着局部和颅外远处控制的改善，降低脑转移风险变得越来越重要。预防性脑照射能够改善小细胞肺癌患者的生存。然而，随机分组研究显示：尽管预防性脑照射降低了非小细胞肺癌的脑转移率，但是不能改善其生存。局部和颅外进展导致的死亡可能掩盖了预防性脑照射带来的可见获益。在综合治疗的现代，rtog0214的结果又一次提示并非所有的局部晚期非小细胞肺癌患者应该接受预防性脑照射，这促使我们寻找脑转移的高危因素，以辨别最可能获益于预防性脑照射的脑转移高危亚组。microrna是长约19-22个核苷酸的小片段单链非编码rna。它通过有缺陷的碱基配对绑定其靶基因的3’非翻译区的互补序列来控制基因表达，从而使靶基因在转录或者翻译水平表达下调。近来microrna成为从生长发育到癌症等很多病理生理过程的重要和革命性的保守调节因素。在不同的恶性肿瘤中，同一microrna的作用可能不同。一个microrna可以有很多属于不同通路的靶基因，而一个基因可以被几个microrna调控。科学家发展技术来识别与肿瘤分期和患者预后相关的特异的基因表达标记，以改善预后和治疗。人们使用全面转录研究来识别以基因表达为基础的预后标识，但是，目前为止无一能应用于临床。与经典的mrna表达谱相比，microrna肿瘤表达谱似乎能够更准确地确定肿瘤亚型的分类。越来越多的证据支持实体肿瘤有特异的microrna标记。与此同时，人们发现越来越多的microrna的靶基因在肺癌发生中起重要作用，例如let-7、mir-34家族和mir-17-92簇。目前，科学家对microrna的靶基因的识别仍然有限。在分子框架中，成熟microrna带电后成为microrna诱导的沉默复合体(mirisc)。该复合体含有argonaute家族(一类庞大的蛋白质家族)，与通常位于靶基因3’端非翻译区的互补位点反应。目前的模型认为microrna和其靶基因的反应起源于位于microrna的5’端的一段被称为“种子序列”的6至8个核苷酸短片段。microrna诱导的沉默复合体能够将靶基因再配置成特别间隔，在其中处理翻译阻滞和mrna衰变。许多研究证实了microrna诱导的mrna失稳。联合计算预测，mrna表达谱的测量代表了识别功能microrna-靶关系的有效方法。在非小细胞肺癌中，许多不同的microrna调节异常，可能有致癌或抑癌作用，并预测预后。识别能够预测肺癌患者预后的microrna是一项重要发现，这表明microrna可能在肿瘤进展中起重要作用。现行的临床病理分期在预测患者脑转移上有其局限性。具有相似临床病理特点或者相同分期的肺癌患者的脑转移预后可能明显不同。分子标记物可以帮助医生鉴别高危患者，以便给予患者个体化治疗，从而改善生存。恶性肿瘤转移的自然进程包括：肿瘤细胞从原发灶脱落、对趋化因子的应答、侵入并降解胞外基质、血管再生、最终在靶器官内成功生长。尽管近年来随着分子生物学技术的进展，更加深入了解恶性肿瘤转移机制成为可能，但与其他器官转移相比，我们对介导肺癌脑转移的分子机制还不十分清楚，这主要因为脑组织具有一些不同于其他组织器官的特性，包括：存在血脑屏障、自我血流调节、缺乏淋巴引流及受损神经元无法再生等。转移至脑的肿瘤细胞必须先黏附至微血管内皮细胞，穿过血脑屏障，进入脑实质，生成血管。肺癌，特别是腺癌，是脑转移的主要来源，部分原因是肺癌细胞很容易通过由肺至脑的动脉循环到达脑。脑转移是肺腺癌治疗失败的重要原因。目前仅有3项研究涉及到非小细胞肺癌脑转移的microrna表达差异，然而，这些研究的样本量太少，并且缺乏完整的机制研究。目前为止，没有较成熟的分子标记物可以或预期可能应用于临床来预测非小细胞肺癌脑转移高危亚群。技术实现要素：我们的前期研究聚焦于217名完全切除术后病理ⅲa-n2期非小细胞肺癌患者，评价该组人群的脑转移的临床危险因素。在多因素分析中，非鳞状细胞癌(rr:4.13,95％ci:1.86—9.19和p＝0.001)和淋巴结比率≥30％(rr:3.33,95％ci:1.79—6.18和p＝0.000)与脑转移风险升高显著相关。腺鳞癌、腺癌、大细胞癌和鳞状细胞癌的脑转移率分别为41.7％(5/12)、35.7％(40/112)、16.7(1/16)和8.0％(7/87)。所以，我们选择了其中腺癌/腺鳞癌的患者的福尔马林固定石蜡包埋的手术肿瘤标本，采用高通量microrna表达谱芯片技术研究脑转移的microrna标记，为将来深入研究microrna在肺腺癌脑转移的调控机制和临床应用筛选可能获益于预防性脑照射的脑转移高危亚组打下良好的基础。本发明人运用microrna基因芯片及qrt-pcr技术对我国非小细胞肺癌进行了研究，出人意料的发现，microrna-193a-5p,microrna-210,microrna-214,microrna-423-3p,microrna-423-5p在脑转移组表达明显上调，而microrna-4270在脑转移组表达明显下调。这6个microrna的表达水平和脑转移风险显著相关，它们组成的microrna标记是脑转移的独立预测因素。本发明涉及一组标志基因microrna-193a-5p,microrna-210,microrna-214,microrna-423-3p,microrna-423-5p,microrna-4270在用于预测非小细胞肺癌脑转移的风险中的用途。具体的，基因microrna-193a-5p,microrna-210,microrna-214,microrna-423-3p,microrna-423-5p,microrna-4270表达情况可作为非小细胞肺癌脑转移判断的标志。通过该预后模型，可以将非小细胞肺癌脑转移分为低危险性、高危险性两种类型，不同类型采用不同治疗方案，低危险性病变可以采用局部手段如手术、局部放疗等，而对于高危险性病变，治疗则相对激进，在手术、放化疗同时，则需要辅以全脑放疗。从而对非小细胞肺癌治疗模式的改变具有划时代意义。本发明涉及的检测方法包括microrna提取、基因芯片制作、杂交及qrt-pcr验证。基因芯片检测主要用于筛选与脑转移相关的基因，筛选出的基因通过qrt-pcr进行结果验证。鉴于发明人已经找到和非小细胞肺癌脑转移相关的基因，在今后临床应用中，仅运用microrna提取及qrt-pcr两种技术即可。这两种方法对于本领域的技术人员为常规操作。因此，该模型在临床中容易被推广。一方面，本发明提供了一种或多种特异地检测microrna分子表达谱的引物和/或探针在制备用于预测非小细胞肺癌脑转移风险的试剂中的用途，其中所述microrna分子表达谱包含选自microrna-193a-5p、microrna-210、microrna-214、microrna-423-3p、microrna-423-5p和microrna-4270中的一个或多个。另一方面，本发明提供了一种或多种特异地检测microrna分子表达谱的引物和/或探针在制备用于预测非小细胞肺癌脑转移风险的试剂中的用途，其中所述microrna分子表达谱由microrna-193a-5p、microrna-210、microrna-214、microrna-423-3p、microrna-423-5p和microrna-4270组成。进一步地，根据本发明以上所述的用途，其中所述的非小细胞肺癌选自腺鳞癌、腺癌、大细胞癌和鳞状细胞癌。另一方面，本发明提供了一种或多种特异地检测microrna分子表达谱的引物和/或探针在制备用于预后非小细胞肺癌的试剂中的用途，其中所述microrna分子表达谱包含选自microrna-193a-5p、microrna-210、microrna-214、microrna-423-3p、microrna-423-5p和microrna-4270中的一个或多个。本发明还提供了一种或多种特异地检测microrna分子表达谱的引物和/或探针在制备用于预后非小细胞肺癌的试剂中的用途，其中所述microrna分子表达谱由microrna-193a-5p、microrna-210、microrna-214、microrna-423-3p、microrna-423-5p和microrna-4270组成。进一步地，根据本发明所述的用途，其中，根据预后结果确定是否采用选自放疗或化疗的辅助性治疗。本发明还提供了一种用于测定microrna分子表达谱的试剂盒，其中所述表达谱包含或由以下组成：microrna-193a-5p、microrna-210、microrna-214、microrna-423-3p、microrna-423-5p和microrna-4270。进一步地，根据本发明所述的试剂盒，其包含a)特异性扩增表达谱的引物和/或探针，或者b)特异性检测表达谱的核酸微阵列。附图说明图1a至图1f表示为根据脑转移模型表达情况，分析芯片组中非小细胞肺癌患者脑转移情况。图1a－1f分别表明microrna-193a-5p,microrna-210、microrna-214、microrna-423-3p、microrna-423-5p、microrna-4270的表达和脑转移的关系。图2-1-a至图2-6-b显示为定量pcr验证的microrna-193a-5p,microrna-210,microrna-214,microrna-423-3p,microrna-423-5p,microrna-4270的表达和脑转移的关系。bm，脑转移组；nbm，非脑转移组。具体实施方式在本发明的一个具体实施方案中，寻找检测待测样品中脑转移相关基因表达情况的大致方法如下：患者和标本我们回顾了2003年1月至2005年12月，在我院完全切除术后病理ⅲa-n2期肺腺癌或腺鳞癌并且术前未接受放化疗或其他针对肿瘤的治疗的患者。分期标准为第六版美国癌症分期联合委员会(greene,2002)。同时患有其它原发肿瘤或之前有肺癌病史的患者排除在本研究之外。入组患者具有疗前的脑磁共振或ct检查。我们回顾了患者的病历和随访资料，以记录患者和治疗特点及复发模式。全部患者均知情同意。病例筛选标准如下：医学病案记录完备；患者术后生存大于4个月；随访完整；福尔马林固定石蜡包埋的手术肿瘤标本完好，并且标本肿瘤含量大于75％。最后我们共筛选出87例标本，包括脑转移组32例和非脑转移组55例。与非脑转移组比较，脑转移组有更多的患者接受过术后放疗，并有更多的患者的转移淋巴结个数和切除淋巴结个数的比率(淋巴结比率)≥1/3。除此之外，两组间性别、年龄、病理类型及分化、吸烟史、t分期和是否接受过辅助化疗等特点都是相匹配的。通过基因芯片检测肿瘤组织标本，筛选出以下脑转移相关的基因：microrna-193a-5p,microrna-210,microrna-214,microrna-423-3p,microrna-423-5p,microrna-4270。芯片数据处理采用sam(significanceanalysisofmicroarrays)软件进行差异表达基因的筛选：上调基因的筛选标准为：(1)q-值≤5％；(2)差异倍数≥2；下调基因的筛选标准为：(1)q-值≤5％；(2)差异倍数≤0.5。聚类分析软件为cluster3.0，采用hierarchical，mediancenter(gene)，averagelinkage算法。将脑转移组和非脑转移组表达显著差异的microrna表达值按照其中位值分为低表达和高表达，随后进行单因素cox回归分析脑转移风险。保护性microrna的风险比<1，危险性microrna的风险比>1。之后，将每个脑转移相关的microrna表达值乘以其单因素cox回归系数，b，而后线性相加作为每名患者的脑转移危险分数。公式如下：危险分数＝b1gl+b2g2+b3g3+…+bngn(b：回归系数，g：mirna表达值，n：mirna个数)。然后基于危险分数中位值将患者分为高危组和低危组，利用log-rank方法比较两组脑转移风险。多因素cox回归分析影响脑转移的独立变量。所有统计检验为双向，p<0.05为有统计学差异。统计分析应用spss18.0。预后模型验证利用根据microrna-193a-5p,microrna-210,microrna-214,microrna-423-3p,microrna-423-5p,microrna-4270基因序列设计的引物行pcr扩增。取2～4微升pcr产物进行1.5％非变性(不加甲醛)琼脂糖凝胶电泳检测。pcr数据收集及处理采用u6rna作为内标，进行归一化处理。利用芯片所得模型评价预后。本发明将在下面的实施例中进一步描述，但本发明并不局限于这些实施例。实施例、rna提取、质量检测、芯片杂交及数据处理一、柠檬油精脱蜡处理石蜡包埋组织石蜡包埋组织样品的预处理：石蜡包埋组织如果已经切片，可选需厚度不大于50μm的切片十片左右，尽量除去周围石蜡，置于1.5ml离心管中。石蜡包埋组织如果是一整块，可用锋利刀片将组织轻轻刮下来并置于1.5ml离心管，尽量避免刮下石蜡。刮下的组织量控制在100mg以内。柠檬油精脱蜡处理：离心管中加入1ml柠檬油精(limonen)，55℃震荡混匀5min。13,200rpm室温离心2min，弃上清。此步骤总共进行3次。加入1ml无水乙醇至离心管中，55℃震荡混匀2min，13,200rpm室温离心2min，弃上清。重复此步骤一次。弃上清，室温短暂离心，用移液器将剩余的无水乙醇吸出。将离心管置于真空干燥仪中，抽干至组织呈干燥的粉末状。肺组织标本的rna、microrna的提取组织rna的提取全部过程严格按照trizol试剂盒说明书进行，在无rna酶环境下操作，所用试管吸头及溶液均常规用1％depc水处理(tris除外)，室温过夜。(1)分别取冻存的肺癌组织、癌旁正常组织各50～loomg，置入预先加入0.5mltrizol裂解液的1.5mleppendorf中，用匀浆器不断研磨成浆液状，并添加trizol裂解液至1ml。(2)15～30℃下孵育5分钟使核蛋白复合物完全溶解，每1mltrizol反应液加氯仿0.2ml，强烈震荡15秒，15～30℃孵育2～3分钟。(3)4℃12,000g离心15分钟，移上清至另一eppendorf管中，体积约为加入trizol反应液体积的60％。(4)沉淀rna：每1mltrizol加0.5ml异丙醇，15～30℃下孵育lo分钟。(5)2～8℃≤12，000g离心10分钟。(6)弃上清，70％乙醇(用depc处理的三蒸水配制)≥lml漂洗2次。(7)2～8℃≤7，500g离心5分钟。(8)真空抽干rna，溶解于50μldepc水中。-70℃保存备用。(9)rna定量及电泳鉴定a.取lμlrna溶液加100μl水，混匀后用紫外可见分光光度计测定a260、a280及a260/a280比值，并读出rna浓度。应为1.8～2.0。b.1.2％甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定rna质量：①电泳槽用0.3％的h202浸泡30分钟，用depc水冲洗晾干。②制胶(20ml)，含琼脂糖0.24g、无rnaase水17.4ml、10×mops2ml、37％甲醛0.6ml、eblml，将琼脂糖加水微波炉加热融化后，加10×mops，待凝胶冷却至60℃再加甲醛和eb。然后在胶槽中灌制凝胶，插好梳子，水平放置待凝固后使用。③将凝胶预电泳5min，电压降为5v/cm。④取适量的rna，加入电泳缓冲液(10×)2μl、甲醛3.5μl、甲酰胺l0μl混匀，置60℃保温10min，冰上速冷。加入3μl的上样缓冲液混匀，取适量加样于凝胶点样孔内。同时点rna标准品。⑤电泳结束后在紫外灯下拍照。电泳后应见28s及18s两条条带，且28s：18s比值大于2，说明rna未降解。细胞小rna的提取细胞系小分子rna(≤200nt)的提取用mirvanatmmirna提取试剂盒按照说明书提取。方法简述如下：细胞(<107)收集后用600μl裂解/结合缓冲液裂解(取适量组织(<250mg)，于液氮中研磨成粉末，转移至600μl裂解/结合缓冲液中裂解)，再加入60μlmirna匀浆液，在冰上放置lomin。加入600μl酸酚/氯仿，剧烈混匀30-60s后于室温以10000rpm离心5min(完全分层)。小心吸取上清转移至新的无rnase1.5ml离心管中。加入l/3体积的无水乙醇，完全混匀后加入到装在收集管中的离心柱中(每次最多700μl)，室温以10000rpm离心lmin，收集流出液。在收集的流出液中再加入其2/3体积的无水乙醇，完全混匀后再加入到装在收集管中的另一新的离心柱中，室温以l0000rpm离心lmin，弃掉流出液。离心柱中加入700μlmirna洗液1，离心5-10s漂洗。再按上述方法用500μl洗液2/3漂洗两次。再离心lmin以完全去掉乙醇。加100μl室温的洗脱液，l0000rpm离心lmin，回收rna。rna稀释25倍后，紫外分光光度计测其od260及od280的值，并计算od260/d280，比值大于1.8时，表明rna纯度较好。同时根据od260计算rna的浓度。affxmirna表达谱芯片实验(1)稀释atpmix以totalrna起始量为1μg为例，取一1.5mlep管，加入500μl1mmtriscl，再加入1μlatpmix(vial3),充分混匀，瞬时离心(～5sec)收集溶液于管底，放置于冰上。(2)poly(a)tailinga.取一支0.2mlep管，加入1ugtotalrna。如果样品体积超过8μl，使用真空浓缩仪浓缩至8μl以下，用rnase-freewater定容至8μl。b.加入2μlrnaspikecontrololigos(vial8)，置于冰上。c.制备poly(a)加尾mix。d.将5μlpoly(a)tailingmix转移至上述10μlrna/spikecontrol混合物中，终体积为15μl；轻弹管壁数次使其充分混匀，瞬时离心(～5sec)收集溶液于管底。e.37℃温育15min，之后置于冰上进行下一步。(3)生物素标记mirnaa.加4μl5xflashtagligationmixbiotin(vial5)至上述15μl反应体系中。b.加2μlt4dnaligase(vial6)，至终体积21μl轻弹管壁数次使其充分混匀。瞬时离心(～5sec)收集溶液于管底。c.25℃温浴30min。d.加2.5μlstopsolution(vial7)终止反应，轻弹管壁数次使其充分混匀。瞬时离心(～5sec)收集溶液于管底，置于冰上。(4)芯片杂交a.取出芯片平衡芯片至室温。b.配制杂交液。轻弹管壁数次使其充分混匀，瞬时离心(～5sec)收集溶液于管底。c.取81.7μl杂交液加入到标记好的mirna体系中，轻弹管壁数次使其充分混匀，瞬时离心(～5sec)收集溶液于管底。d.将杂交液置于加热块上，99℃温育5min。e.将99℃已温育5min的杂交液转移到另一加热块上，45℃温育5min。f.从加热块上取出杂交液，微型离心机最大转速离心5min，以除去杂交混合液中的不溶性物质。g.注入100μl杂交液至芯片中。h.将芯片平衡放置于杂交炉中，48℃，60rpm旋转杂交16hr。(5)芯片清洗染色、扫描a.杂交结束前，打开gcos软件，建立实验信息，包括输入芯片的barcode。b.准备fluidicsstation，运行prime。c.从stainmodule,box1中分装以下试剂，体积足够为一张芯片使用：600μlstaincocktail1到1.5ml棕色ep管600μlstaincocktail2到1.5mlep管800μlarrayholdingbuffer到1.5mlep管。d.杂交结束后，吸走杂交液，注入100μlarrayholdingbuffer。e.在fluidics对话框中，选择experimentname即fs450_0003，根据芯片类型不同选择相应的protocol，各个protocol所对应的详细过程如表1所示，点击运行，开始芯片清洗染色，这个过程大约需要90min完成。f.芯片扫描，如果不马上进行扫描，芯片可以在4℃避光贮存直至扫描。结果定量pcr的验证结果表明，microrna-193a-5p,microrna-210,microrna-214,microrna-423-3p,microrna-423-5p水平在非小细胞肺癌脑转移组表达明显上调，而microrna-4270表达水平在非小细胞肺癌脑转移组表达明显下调。证明了这些microrna分子可用于预测非小细胞肺癌脑转移的发生。表1、microrna标记的低危组和高危组的脑转移风险比较。参考文献al-nedawi,k.,meehan,b.,micallef,j.,lhotak,v.,may,l.,guha,a.,andrak,j.(2008).intercellulartransferoftheoncogenicreceptoregfrviiibymicrovesiclesderivedfromtumourcells.naturecellbiology10,619-624.arora,s.,ranade,a.r.,tran,n.l.,nasser,s.,sridhar,s.,korn,r.l.,ross,j.t.d.,dhruv,h.,foss,k.m.,andsibenaller,z.(2011).microrna‐328isassociatedwith(non‐small)celllungcancer(nsclc)brainmetastasisandmediatesnsclcmigration.internationaljournalofcancer.baek,d.,villen,j.,shin,c.,camargo,f.d.,gygi,s.p.,andbartel,d.p.(2008).theimpactofmicrornasonproteinoutput.nature455,64-71.calin,g.a.,ferracin,m.,cimmino,a.,dileva,g.,shimizu,m.,wojcik,s.e.,iorio,m.v.,visone,r.,sever,n.i.,fabbri,m.,etal.(2005).amicrornasignatureassociatedwithprognosisandprogressioninchroniclymphocyticleukemia.nengljmed353,1793-1801.calin,g.a.,liu,c.g.,sevignani,c.,ferracin,m.,felli,n.,dumitru,c.d.,shimizu,m.,cimmino,a.,zupo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