一种分离凯氏带的方法与流程

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种分离凯氏带的方法。

背景技术：

植物根的初生结构由外至内分为表皮、皮层和维管柱三部分。皮层最内一层细胞为内皮层，细胞排列整齐而紧密。在内皮层细胞径向壁和横向壁上，常有木栓化和木质化的带状增厚部分，称为凯氏带。凯氏带的主要功能是阻止水分向组织渗透，控制皮层和维管柱之间的物质运输。在植物根部水与无机养分的运输过程中，凯氏带主要影响外质体运输途径，即水与无机养分经由表皮、外皮层及皮层细胞壁间质传递运输。然而由于凯氏带具有不透水性，当水与无机盐养分进入到内皮层细胞时，转由内皮细胞的细胞膜间质进行传递，即由质外体运输途径转为共质体运输途径，最终进入中柱内的木质部细胞。

经典的分离凯氏带的方法主要有以下两种：(1)用浓硫酸等强酸处理植物根部，自然降解分离得到凯氏带；(2)利用纤维素酶和果胶酶温和酶解植物根部，从内皮层细胞中分离得到凯氏带。但是，两种方法均存在操作过程危险(强腐蚀性和强致癌性)、分离时间过长(半个月以上)、分离效率偏低(约几毫克)以及成分破坏较为严重等缺点。因此，迫切需要设计一种安全、节省、快速、高效的分离凯氏带的方法。

技术实现要素：

本发明所要解决的问题是如何分离凯氏带。

为解决上述问题，本发明首先提供了一种分离凯氏带的方法。

本发明所提供的分离凯氏带的方法，包括步骤a2)：将植物初生根或植物初生根的根段进行微波处理。

所述植物初生根的根段的长度可为0.5～2cm(例如0.5～1cm或1～1.5cm或1.5～2cm或0.5cm或1cm或1.5cm或2cm)。

所述步骤a2)的所述微波处理中，所述微波的频率可为2000～2800MHz(例如2000～2450MHz或2450～2800MHz或2000MHz或2450MHz或2800MHz)。

所述微波的频率为2450MHz具体可通过输出功率为600W的微波炉实现。

所述微波炉具体可为格兰仕集团的产品，产品型号为P70F23P-G5(SO)。

所述步骤a2)中，所述微波处理的时间可为1～3min(例如1～2min或2～3min或1min或2min或3min)。

上述方法中，所述方法还可包括如下步骤：在进行所述步骤a2)前，进行步骤a1)；所述步骤a1)为：使用离析液浸泡处理植物初生根或植物初生根的根段；所述离析液 由过氧化氢水溶液和乙酸组成。

所述植物初生根的根段的长度可为0.5～2cm(例如0.5～1cm或1～1.5cm或1.5～2cm或0.5cm或1cm或1.5cm或2cm)。

所述离析液具体可由1体积份30％(质量体积比)过氧化氢水溶液和1体积份乙酸组成。

所述步骤a1)中，所述浸泡处理的条件参数可为：24～34℃(例如24～28℃或28～32℃或32～34℃或24℃或28℃或32℃或34℃)、1～2h(例如1h～1.5h或1.5h～2h或1h或1.5h或2h)。

所述步骤a1)中，所述浸泡处理的条件参数具体可为：32～34℃、1h。

所述步骤a1)中，所述浸泡处理的条件参数具体可为：32℃、1h。

所述步骤a1)中，所述浸泡处理的条件参数具体可为：34℃、1h。

上述方法中，所述方法还可包括如下步骤a3)：完成所述步骤a2)后，收集固态物质，使用酶解液浸泡处理。

所述酶解液的溶质及其在体系中的中浓度可为b1)或b2)：

b1)0.010～0.020g/mL(例如0.010～0.015g/mL或0.015～0.020g/mL或0.010g/mL或0.015g/mL或0.020g/mL)果胶酶，0.020～0.030g/mL(例如0.020～0.025g/mL或0.025～0.030g/mL或0.020g/mL或0.025g/mL或0.030g/mL)纤维素酶；

b2)10～20U/mL(例如10～15U/mL或15～20U/mL或10U/mL或15U/mL或20U/mL)果胶酶，20～30U/mL(例如20～25U/mL或25～30U/mL或20U/mL或25U/mL或30U/mL)纤维素酶。

所述酶解液的溶剂可为pH4.6～5.0(例如pH4.6～4.8或pH4.8～5.0或pH4.6或pH4.8或pH5.0)、0.01～0.05mol/L(例如0.01～0.02mol/L或0.02～0.03mol/L或0.03～0.04mol/L或0.04～0.05mol/L或0.01mol/L或0.02mol/L或0.03mol/L或0.04mol/L或0.05mol/L)柠檬酸-磷酸盐缓冲液。

所述酶解液的溶质及其在体系中的中浓度具体可为：0.015g/mL果胶酶，0.025g/mL纤维素酶。

所述酶解液的溶剂具体可为pH4.8、0.01mol/L柠檬酸-磷酸盐缓冲液。

所述纤维素酶可为纤维素酶R-10，具体可为北京科创汇达生物科技有限公司产品，产品编号为6008。纤维素酶R-10的比活力可为1000U/g。纤维素酶R-10酶活力定义可为：纤维素酶R-10在25℃条件下，每分钟催化1μmol纤维素转化为多糖所需要的酶量为1U。

所述果胶酶可为果胶酶Y-23，具体可为北京科创汇达生物科技有限公司产品，产品编号为6038。果胶酶Y-23的比活力可为1000U/g。果胶酶Y-23酶活力定义可 为：果胶酶Y-23在25℃条件下，每分钟催化1μmol果胶转化为多糖所需要的酶量为1U。

所述步骤a3)中，所述浸泡处理的条件参数可为：42～46℃(例如42～44℃或44～46℃或42℃或44℃或46℃)、5～7h(例如5h～6h或6h～7h或5h或6h或7h)。

所述步骤a3)中，所述浸泡处理的条件参数具体可为：42℃、5h。

上述方法中，所述方法还可包括如下步骤a4)：完成步骤a3)后，收集固态物质并将其置于水中进行振荡处理，然后收集固体物质，得到凯氏带。

所述水可为去离子水。

所述步骤a4)中，所述振荡处理的条件参数可为：140～160rpm(例如140～150rpm或150～160rpm或140rpm或150rpm或160rpm)、2～3h(例如2h～2.5h或2.5h～3h或2h或2.5h或3h)。

所述步骤a4)中，所述振荡处理的条件参数具体可为：150rpm、2.5～3h。

所述步骤a4)中，所述振荡处理的条件参数具体可为：150rpm、2.5h。

所述步骤a4)中，所述振荡处理的条件参数具体可为：150rpm、3h。

所述步骤a4)中，所述振荡处理中，旋转半径可为40～60mm(例如40～50mm或50～60mm或40mm或50mm或60mm)。

所述步骤a4)中，所述振荡处理中，温度可为25～30℃(例如25～28℃或28～30℃或25℃或28℃或30℃)。

所述植物可为种子植物。

所述种子植物可为裸子植物或被子植物。

所述裸子植物可为柏科植物。

所述柏科植物可为杉木。

所述杉木具体可为广西融水杉木

所述被子植物可为单子叶植物或双子叶植物。

所述单子叶植物可为禾本科植物。

所述禾本科植物可为玉米。

所述玉米具体可为玉米品种郑单958。

实验证明，利用本发明提供的方法可分离玉米根内皮层凯氏带和杉木根内皮层凯氏带。本发明提供的分离凯氏带方法具有以下优点：一是操作快速，将原有技术分离时间为3～5d缩短到8～12h，避免了分离时间过久对结构成分造成的损伤；二是经过微波处理植物初生根，提升了酶解反应效率；三是优化了酶解细胞壁的反应条件，不需要更换酶解液，从而降低了成本；四是分离效果好；五是操作安全：用过氧化氢乙酸离析液替代传统的铬酸硝酸离析液，避免了接触可致癌物铬酸；六是操作便捷，微 波处理只需使用常规微波炉。可见，本发明提供的分离凯氏带的方法安全、节省、快速和高效，为深入研究凯氏带奠定了技术基础，也为工业化分离凯氏带成分提供了理论支撑。

附图说明

图1为荧光显微镜观察玉米根内皮层凯氏带。

图2为荧光显微镜观察玉米根内皮层凯氏带。

图3为荧光显微镜观察杉木根内皮层凯氏带。

图4为荧光显微镜观察杉木根内皮层凯氏带。

图5为杉木根内皮层凯氏带的红外光谱分析。

图6为微波和非微波处理下玉米根内皮层凯氏带的红外光谱分析。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

离析液由1体积份30％(质量体积比)过氧化氢水溶液和1体积份乙酸组成。

酶解液：含0.015g/mL果胶酶和0.025g/mL纤维素酶的pH4.8、0.01mol/L柠檬酸-磷酸盐缓冲液；其中纤维素酶为纤维素酶R-10，果胶酶为果胶酶Y-23，均产自日本YAKULT公司，购自北京科创汇达生物科技有限公司，产品编号分别为6008和6038。

纤维素酶R-10的比活力为1000U/g。

纤维素酶R-10酶活力定义：纤维素酶R-10在25℃条件下，每分钟催化1μmol纤维素转化为多糖所需要的酶量为1U。

果胶酶Y-23的比活力为1000U/g。

果胶酶Y-23酶活力定义为：果胶酶Y-23在25℃条件下，每分钟催化1μmol果胶转化为多糖所需要的酶量为1U。

封片液由1体积份50％(体积百分比)甘油水溶液和1体积份0.5％(质量体积比)FeCl₃水溶液组成。

玉米具体为玉米品种郑单958，其为北京德农种业有限公司的产品。

杉木具体为广西融水杉木，记载在如下文献中：谢汝根等.杉木不同优良品种苗期对比研究.福建林业科技，2009，36(3)，124-127.

微波炉为格兰仕集团产品，产品型号为P70F23P-G5(SO)。

实施例1、玉米根内皮层凯氏带的分离及检测

一、采用本发明提供的方法从玉米根内皮层中分离凯氏带

采用本发明提供的方法从玉米根中提取凯氏带的步骤如下：

1、取萌发4天的玉米幼苗的初生根，切成1cm的根段，用去离子水冲洗2～3次。

2、完成步骤1后，取20段步骤1得到的根段，置于2mL离析液中，抽气(目的是使根段下沉，以实现充分浸泡)，32℃浸泡处理1h(根尖透明呈米黄色)，收集固态物质，用去离子水冲洗2～3次。

3、取步骤2得到的固态物质，采用频率为2450MHz的微波处理2min。

具体实现方法为：将步骤2得到的固态物质置于微波炉中，设置微波炉的输出功率为600W，微波处理时间为2min。

4、用酶解液浸泡处理步骤3的固态物质。

具体步骤：完成步骤3的固态物质置于酶解液中，42℃浸泡处理5h，收集固态物质，用去离子水冲洗2～3次。

5、振荡处理

具体步骤：将步骤4得到的固态物质置于去离子水中，28℃、振荡(摇速为150rpm，旋转半径为50mm)2.5h，收集固态物质。

6、取步骤5得到的固态物质，在解剖镜下用解剖针分离固态物质，然后用去离子水清洗2～3次，使用冷冻干燥机进行冷冻干燥后封装，得到玉米根内皮层凯氏带。

二、玉米根内皮层凯氏带的检测

1、将步骤一分离的玉米根内皮层凯氏带用小檗碱-甲苯胺蓝对染法(具体步骤记载于如下文献中：徐建华等.植物根内皮层凯氏带染色的小檗碱-苯胺蓝对染法。植物生理学通讯，2004，40(4)，479-482.)染色，然后用封片液封片，在荧光显微镜下观察。

实验结果表明，步骤一分离的玉米根内皮层凯氏带具有网状结构(图1)，其木栓质加厚(图2)。

2、将步骤一分离的玉米根内皮层凯氏带用溴化钾压片，然后在Spectrum 100D红外光谱仪下测量其红外吸收光谱。凯氏带的主要成分是木栓质和木质素，其中木栓质的特征吸收峰是甲基、亚甲基CH₂非对称伸缩振动，在玉米根的外部组织中出现在2925cm^-1和2850cm^-1；木质素的特征吸收峰是其组成成分松柏醇和芥子醇的苯环振动，在玉米根的外部组织出现在1631cm^-1。

实验结果表明，在步骤一分离的玉米根内皮层凯氏带中检测到木栓质和木质素成分(图6)，可见，分离得到的固态物质确实为玉米根内皮层凯氏带。

三、采用对照方法从玉米根内皮层中分离凯氏带

采用对照方法从玉米根中提取凯氏带的步骤如下：

1、同步骤一中1。

2、同步骤一中2。

3、用酶解液浸泡处理步骤2的固态物质。

具体步骤：完成步骤2的固态物质置于酶解液中，42℃浸泡处理3d，收集固态物质，用去离子水冲洗2～3次。

4、同步骤一中5。

5、取步骤4得到的固态物质，在解剖镜下用解剖针分离固态物质，然后用去离子水清洗2～3次，使用冷冻干燥机进行冷冻干燥后封装，得到玉米根内皮层凯氏带。

按照步骤二中2的方法，得到采用对照方法从玉米根内皮层中分离凯氏带的红外吸收光谱。

实验结果表明，步骤一采用本发明提供的方法从玉米根内皮层分离凯氏带和步骤三采用对照方法从玉米根内皮层分离凯氏带的状态基本一致(图6，微波为本发明提供的方法，无微波为对照方法)。可见，经过步骤一中3的微波处理，能够迅速获得玉米根内皮层凯氏带，且不会影响其成分。

实施例2、杉木根内皮层凯氏带的分离及检测

一、分离杉木根内皮层凯氏带

分离杉木根内皮层凯氏带的步骤如下：

1、取萌发15天的杉木幼苗的初生根，切成1cm的根段，用去离子水冲洗2～3次。

2、完成步骤1后，取20段步骤1得到的根段，置于2mL离析液中，抽气(目的是使根段下沉，以实现充分浸泡)，34℃浸泡处理1h(根尖透明呈米黄色)，收集固态物质，用去离子水冲洗2～3次。

3、取步骤2得到的固态物质，采用频率为2450MHz的微波处理2min。

具体实现方法为：将步骤2得到的固态物质置于微波炉中，设置微波炉的输出功率为600W，微波处理时间为2min。

4、用酶解液浸泡处理步骤3的固态物质。

具体步骤：完成步骤3的固态物质置于酶解液中，46℃浸泡处理5h，收集固态物质，用去离子水冲洗2～3次。

5、振荡处理

具体步骤：将步骤4得到的固态物质置于去离子水中，28℃、振荡(摇速为150rpm，旋转半径为50mm)3h，收集固态物质。

6、取步骤5得到的固态物质，在解剖镜下用解剖针分离固态物质，然后用去离 子水清洗2～3次，使用冷冻干燥机进行冷冻干燥后封装，得到杉木根内皮层凯氏带。

二、杉木根内皮层凯氏带的检测

1、将步骤一分离的杉木根内皮层凯氏带用小檗碱-甲苯胺蓝对染法(具体步骤记载于如下文献中：徐建华等.植物根内皮层凯氏带染色的小檗碱-苯胺蓝对染法。植物生理学通讯，2004，40(4)，479-482.)，然后封片液封片，在荧光显微镜下观察。

实验结果表明，步骤一分离的杉木根内皮层凯氏带具有网状结构(图3)，其木栓质加厚(图4)。

2、将步骤一分离的杉木根内皮层凯氏带用溴化钾压片，然后在Spectrum 100D红外光谱仪下测量其红外吸收光谱。凯氏带的主要成分是木栓质和木质素，其中木栓质的特征吸收峰是甲基、亚甲基CH₂非对称伸缩振动，在杉木根的外部组织中出现在2923cm^-1和2850cm^-1；木质素的特征吸收峰是其组成成分松柏醇和芥子醇的苯环振动，在杉木根的外部组织出现在1600cm^-1。

实验结果表明，在步骤一分离的杉木根内皮层凯氏带中检测到木栓质和木质素成分(图5)，可见，分离得到的固态物质确实为杉木根内皮层凯氏带。