本发明涉及药物化学领域，具体而言，本发明涉及一种吡咯并[3,2-d]嘧啶类化合物的制备方法及其中间体。
背景技术：
：toll样受体表达于多种免疫细胞。toll样受体识别高度保守结构基序：由微生物病原体表达的病原体相关的微生物模式(pamp)或由坏死细胞释放的损伤相关分子模式(damp)。通过相应的病原体相关的微生物模式(pamp)或损伤相关分子模式(damp)刺激toll样受体引发信号级联导致转录因子如ap-1，nf-κb和干扰素调节因子(脉冲响应函数)的激活。这导致多种细胞反应，包括生产干扰素，促炎性细胞因子和效应细胞因子，从而产生免疫应答。迄今为止，哺乳动物中有13种toll样受体已被发现。toll样受体1，2，4，5和6主要表达在细胞表面上，toll样受体3，7，8和9表达在内体中。不同的toll样受体识别不同病原体衍生的配体。对于toll样受体7(tlr7)，它主要是由浆细胞样树突细胞(pdc)表达和配体识别而诱导干扰素α(ifn-α)的分泌。toll样受体7(tlr7)和toll样受体8(tlr8)高度同源。因此，tlr7配体在大多数情况下也是tlr8配体。tlr8刺激主要诱导产生细胞因子如肿瘤坏死因子α(tnf-α)和趋化因子。干扰素α是治疗慢性乙型肝炎或丙型肝炎的主要药物之一，而tnf-α是一种促炎细胞因子，过多分泌可能导致严重的副作用。所以，对tlr7和tlr8的选择性对于开发tlr7激动剂用于治疗病毒感染性疾病至关重要。几个tlr7激动剂已有报道，如咪喹莫特、瑞喹莫德、gs-9620。但具备更好的选择性、活性和安全性的新的tlr7激动剂仍然有很大需求。我们发现了一系列的新颖的吡咯并嘧啶衍生物是tlr7的激动剂。背景研发资料参照如下的期刊文章：hoffmann,j.a.,nature,2003,426,p33-38；akira,s.,takeda,k.,andkaisho,t.,annual.rev.immunology,2003,21,335-376；ulevitch,r.j.,naturereviews:immunology,2004,4,512-520；coffman,r.l.,nat.med.2007,13,552-559；paula.roethle,j.med.chem.2013,56(18),7324-7333。中国专利申请201410405136.0报道了多个作为tlr7激动剂的吡咯并嘧啶化合物，在此作为参考全部引入本文中。技术实现要素：本发明的一个方面在于提供式ⅰ化合物的制备方法，所述方法包括式ⅵ化合物通过脱羟基得式ⅰ化合物的步骤，其中，r1和r2独立地选自c1～c4的烷基，或者，r1、r2与所连n原子一起形成4～8元杂环烷基，所述杂环烷基任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基独立地选自羟基、卤素、c1～c4的烷基或c1～c4的烷氧基。具体实施方式作为优选的实施方式，式ⅰ化合物的制备方法是以式ⅱ化合物为原料，包括如下步骤：(a)式ⅱ化合物和式ⅲ化合物在碱的存在下反应得式ⅳ化合物，(b)式ⅳ化合物和式ⅴ化合物在还原剂存在下反应得式ⅵ化合物，(c)式ⅵ化合物通过脱羟基得式ⅰ化合物，其中，r1和r2独立地选自c1～c4的烷基，或者，r1、r2与所连n原子一起形成4～8元杂环烷基，所述杂环烷基任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基独立地选自羟基、卤素、c1～c4的烷基或c1～c4的烷氧基。作为另一优选的实施方式，式ⅰ化合物的制备方法是以式ⅱ化合物为原料，包括如下步骤：(a’)式ⅱ化合物和式ⅲ’化合物在碱的存在下反应得式ⅵ化合物，(b’)式ⅵ化合物通过脱羟基得式ⅰ化合物，其中，r1和r2独立地选自c1～c4的烷基，或者，r1、r2与所连n原子一起形成4～8元杂环烷基，所述杂环烷基任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基独立地选自羟基、卤素、c1～c4的烷基或c1～c4的烷氧基。作为本发明的一种实施方式，所述碱选自碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、磷酸钾、碳酸氢钾、碳酸铯、氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化镁、氢氧化钡、甲醇钠、乙醇钠、叔丁醇钠、叔丁醇钾、三乙胺、二异丙基乙基胺、吡啶、n,n-二甲氨基吡啶、哌啶、n-甲基哌啶、吗琳或n-甲基吗琳，优选碳酸钠、碳酸钾、氢氧化钠或氢氧化钾，更优选碳酸钾。作为本发明的一种实施方式，式ⅱ化合物与式ⅲ化合物或与式ⅲ’化合物的摩尔比为1.0：1.0～3.0，优选1.0：1.0～1.5，更优选1.0：1.2～1.5。作为本发明的一种实施方式，式ⅱ化合物与碱的摩尔比为1.0：1.0～3.0，优选1.0：1.0～1.5，更优选1.0：1.2。作为本发明的一种实施方式，所述还原剂选自bh3、nabh4、nabh3cn或nabh(aco)3，优选nabh(aco)3。作为本发明的一种实施方式，式ⅳ化合物与所述还原剂的摩尔比选自1.0：1.0～3.0，优选1.0：1.2～2.0，更优选1.0：1.5。作为本发明的一种实施方式，步骤(b)在酸的存在下进行，所述酸选自盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸、甲酸、醋酸、丙酸、柠檬酸、富马酸、苹果酸、琥珀酸、水杨酸、马来酸或三氟乙酸，优选醋酸。作为本发明的一种实施方式，步骤(b)中，式ⅳ化合物与酸的摩尔比选自1.0：1.0～3.0，优选1.0：1.2～2.0，更优选1.0：1.5。作为本发明优选的实施方式，所述的脱羟基是通过式ⅵ化合物在三乙基硅烷和三氟乙酸的作用下完成的。作为本发明的一种实施方式，式ⅵ化合物与三乙基硅烷的摩尔比选自1：1～10，优选1：2～8，更优选1：5。作为本发明的一种实施方式，式ⅵ化合物与三氟乙酸的摩尔比选自1：2～20，优选1：5～15，更优选1：10～12。作为本发明的一种实施方式，式ⅴ化合物选自：优选作为本发明的一种实施方式，式ⅰ化合物选自如下编号所示的化合物：本发明另一方面提供作为中间体的式ⅱ和式ⅵ化合物：其中，r1、r2定义同上所述。在本发明的部分实施方式中，所述式ⅵ化合物选自：本发明所述的式ⅱ化合物可以采用如下路线制备：式ⅶ化合物与sem-cl反应得式ⅷ化合物；式ⅷ化合物与氨水反应得式ⅸ化合物；式ⅸ化合物溶于正丁醇，在金属钠的作用下，正丁醇与钠形成正丁醇钠后发生取代反应生成式ⅹ化合物；式ⅹ化合物在tfa作用下脱除sem得式ⅱ化合物。本发明采用下述缩略词：sem代表2-(三甲硅烷基)乙氧基甲基；dipea代表二异丙基乙基胺；tfa代表三氟乙酸；dmf代表n,n-二甲基甲酰胺；n-buoh代表正丁醇。本发明所述的制备方法，反应条件温和，避免使用价格昂贵和危险性高的试剂，特别适合工业化生产。实施例为了更好的理解本发明的内容，下面结合具体实施例来做进一步的说明，但具体的实施方式并不是对本发明的内容所做的限制。制备实施例1式ⅰ化合物的制备实施例2-丁氧基-7-(4-(吡咯烷-1-基甲基)苄基)-5h-吡咯并[3,2-d]嘧啶-4-胺(编号为1的式ⅰ化合物)的制备1-1.4-((4-氨基-2-丁氧基-5h-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-羟基甲基)苯甲醛(式ⅳ化合物)的制备将对苯二甲醛(790.64mg，5.82mmol)和异丙醇(10ml)投入至三口瓶中，搅拌下加入2-丁氧基-5h-吡咯并[3,2-d]嘧啶-4-胺(1.00g，4.85mmol)，降温至0℃，之后继续搅拌10min，加入纯化水(10ml)和碳酸钾(804.17mg，5.82mmol)，25℃反应16hr，lcms监控至原料反应完全，反应完全后，有固体析出。过滤，所得固体用20ml纯化水打浆，然后用30ml(乙酸乙酯/正庚烷＝1/20)打浆，过滤，干燥，得到标题化合物黄色固体(1.50g，4.41mmol，收率：90.9％)。1hnmr(400mhz,甲醇-d4)δ9.94(s,1h),7.86(d,j＝8.16hz,2h),7.72(d,j＝8.16hz,2h),7.12-7.17(m,1h),6.19(s,1h),4.28(t,j＝6.53hz,2h),1.68-1.77(m,2h),1.44-1.54(m,2h),0.97(t,j＝7.34hz,3h)。1-2.1(4-氨基-2-丁氧基-5h–吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)(4-(吡咯烷-1-基甲基)苯基)甲醇(式ⅵ-1化合物)的制备将实施例1获得的式ⅳ化合物4-((4-氨基-2-丁氧基-5h-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-羟基甲基)苯甲醛(450.0g，1.32mol)和异丙醇(4.5l)投入至30l反应釜中，搅拌5min，之后加入冰醋酸(119.0g，1.98mol)，搅拌降温至0-10℃，滴加吡咯烷(112.4g，1.58mol)，在滴加中保持温度低于10℃，滴毕，分批次加入三乙酰氧基硼氢化钠(nabh(aco)3)(420.0g，1.98mol)，10-20℃反应3hr，液相监控至原料完全消失，反应完全后，加入纯化水5l，将溶液温度降至-10℃左右，加入15％氨水12l，加入过程中溶液温度低于0℃，搅拌有固体析出，过滤，所得滤饼2l水打浆，然后使用2l×2乙酸乙酯打浆，过滤，40℃减压烘干12hr，得到标题化合物黄色固体465.0g，1.18mol，收率89.4％，水分0.9％。1hnmr(400mhz,甲醇-d4)δ7.46(d,j＝7.91hz,1h),7.29(d,j＝8.03hz,1h),7.09(s,1h),6.12(s,1h),4.29(t,j＝6.53hz,2h),3.60(s,2h),2.52(br.s.,4h),1.66-1.83(m,6h),1.49(d,j＝7.53hz,2h),0.98(t,j＝7.40hz,3h)。或者，所述的式ⅵ-1化合物按照如下方法制备：1-2.2(4-氨基-2-丁氧基-5h–吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)(4-(吡咯烷-1-基甲基)苯基)甲醇(式ⅵ-1化合物)的制备向2-丁氧基-5h并吡咯并[3,2-d]嘧啶-4-胺(3.00g，14.55mmol)，4-(吡咯烷-1-基甲基)苯甲醛(4.13g，21.82mmol)，甲醇(30ml)和水(30ml)的混合物在25℃搅拌下加入碳酸钾(2.41g，17.46mmol)，然后在25℃继续搅拌12小时，薄层色谱监控至原料反应完全，反应完全后，有固体析出。加入30ml水，固体通过过滤，干燥，得到标题化合物白色固体(3.50g，8.85mmol，收率：60.82％)。1hnmr(400mhz,甲醇-d4)δ7.46(d,j＝7.91hz,1h),7.29(d,j＝8.03hz,1h),7.09(s,1h),6.12(s,1h),4.29(t,j＝6.53hz,2h),3.60(s,2h),2.52(br.s.,4h),1.66-1.83(m,6h),1.49(d,j＝7.53hz,2h),0.98(t,j＝7.40hz,3h)。1-32-丁氧基-7-(4-(吡咯烷-1-基甲基)苄基)-5h-吡咯并[3,2-d]嘧啶-4-胺(编号为1的式ⅰ化合物)的制备将式ⅵ-1化合物(4-氨基-2-丁氧基-5h–吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)(4-(吡咯烷-1-基甲基)苯基)甲醇(440.0g，1.11mol)和二氯甲烷(7.0l)投入20l反应釜中，搅拌降温至-15℃以下，滴加三乙基硅烷(880ml，5.55mol)后，继续滴加三氟乙酸(880ml)，在滴加中保持温度低于-10℃，滴加完毕后，0℃反应2hr，液相监控至原料点消失，反应完全后，将反应液浓缩至干，加入乙酸乙酯2.2l，搅拌降温至0℃以下，之后加入饱和碳酸钠溶液调节溶液ph＝9-10，此过程中温度小于10℃，过滤，所得滤饼用2.2l水打浆后过滤，减压烘干，得到2-丁氧基-7-(4-(吡咯烷-1-基甲基)苄基)-5h-吡咯并[3,2-d]嘧啶-4-胺白色固体550g(标题化合物的三氟乙酸盐)。所得白色固体用本领域公知技术手段，在碱性条件下脱盐得到标题化合物。1hnmr(400mhz,甲醇-d4)δ7.46(d,j＝7.91hz,1h),7.29(d,j＝8.03hz,1h),7.09(s,1h),6.12(s,1h),4.29(t,j＝6.53hz,2h),3.60(s,2h),2.52(br.s.,4h),1.66-1.83(m,6h),1.49(d,j＝7.53hz,2h),0.98(t,j＝7.40hz,3h)。制备实施例2式ⅱ化合物的制备实施例2-12,4-二氯-5-((2-(三甲基硅基)乙氧基)甲基)-5h-吡咯并[3,2-d]嘧啶2,4-二氯-5h-吡咯并[3,2-d]嘧啶(4.00kg，21.28mol)溶解于dmf(20.00l)；室温(25℃)下分批加入dipea(2.58kg，20.00mol)，随后搅拌30min，反应液用冰浴降温至0℃，然后在5小时内，以1～2滴/秒的滴速，缓慢滴加sem-cl(4.00kg，24.00mol)，滴完后，反应液在0℃下搅拌反应4小时，hplc监测反应完全，反应液用70l水淬灭稀释后，用乙酸乙酯(15l×3)萃取，合并的有机相依次用1m的盐酸水溶液(5l×2)和饱和食盐水(7l×2)洗涤，减压蒸馏除去溶剂后得标题化合物(6.40kg，20.11mol，产率94.50％)。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.24-8.35(m,1h)，6.70-6.85(m,1h)，5.77(s,2h)，3.45-3.57(m,2h)，0.74-0.86(m,2h)，0.00(s,9h)。2-22-氯-5-((2-(三甲基硅基)乙氧基)甲基)-5h-吡咯并[3,2-d]嘧啶-4-胺10l高压釜中，2,4-二氯-5-((2-(三甲基硅基)乙氧基)甲基)-5h-吡咯并[3,2-d]嘧啶(1.60kg,5.03mol)溶于异丙醇(1.60l)，室温(25℃)下一次性加入氨水(4l)，反应混合物在95摄氏度下搅拌7小时，hplc监测反应完毕，反应液自然冷却到室温，经布氏漏斗过滤后得到黑褐色固体，该固体依次用乙酸乙酯/正庚烷(1/1,5l×2)中打浆，乙酸乙酯(4l)打浆，得到标题化合物棕色固体(1.25kg,4.18mol，产率83.1％)。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ7.61-7.77(m,1h)，6.97-7.19(m,2h)，6.28-6.38(m,1h)，5.54-5.67(m,2h)，3.43-3.53(m,2h)，0.76-0.91(m,2h)，0.07(s,9h)。2-32-丁氧基-5-((2-(三甲基硅)基乙氧基)甲基)-5h-吡咯并[3,2-d]嘧啶-4-胺氮气保护下，金属钠(525.05g，22.84mol)缓慢分批加入到n-buoh(17.0l)中；加入完毕后，体系升温至60℃，并在该温度下持续搅拌，直至金属钠全部溶解，随后，体系冷却至25℃，将2-氯-5-((2-(三甲基硅基)乙氧基)甲基)-5h-吡咯并[3,2-d]嘧啶-4-胺(1.95kg，6.53mol)分批加入，搅拌混合均匀后，反应物在90℃下持续搅拌8小时，hplc监测反应完全，反应混合物自然降温至25℃后，缓慢倒入30l饱和氯化铵水溶液中，随后用乙酸乙酯(15l×3)萃取，合并的有机相用饱和食盐水(20l×2)洗涤，经无水na2so4干燥、过滤后，减压蒸馏除去溶剂后，残余物在正庚烷(4l)中打浆，过滤分离得到固体，再在乙酸乙酯(5l)中打浆，得到标题化合物黄白色固体(1.53kg，4.55mol，69.7％)。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ7.49-7.54(m,1h)，6.54-6.62(m,2h)，6.15-6.20(m,1h)，5.54(s,2h)，4.10-4.22(m,2h)，3.42-3.55(m,2h)，1.58-1.73(m,2h)，1.35-1.47(m,2h)，0.90-0.96(m,3h)，0.83-0.89(m,2h)，0.05(s,9h)。2-42-丁氧基-5h-吡咯并[3,2-d]嘧啶-4-胺2-丁氧基-5-((2-(三甲基硅)基乙氧基)甲基)-5h-吡咯并[3,2-d]嘧啶-4-胺(1.10kg,3.27mol)溶于tfa(5.50l)，反应液在25℃下持续搅拌16小时，hplc监测反应完全，减压蒸馏除去tfa，剩余物溶解在甲醇(1.2l)和冰水(1.2l)中，均匀搅拌下，用浓氨水调节体系ph至12，然后搅拌2小时，溶液中不断有沉淀析出，过滤后，滤饼为白色固体，依次用15％的氨水(1.2l×3)和乙酸乙酯(4l)打浆，得到标题化合物白色固体(550.00g，2.67mol，81.7％)。1hnmr(400mhz,甲醇-d4)δ7.37(d,j＝2.89hz,1h)，6.29(d,j＝3.01hz,1h)，4.27(t,j＝6.53hz,2h)，1.75(d,j＝7.91hz,2h)，1.44-1.61(m,2h)，1.00(t,j＝7.40hz,3h)。药物活性效果实施例toll样受体7和toll样受体8体外受体结合活性筛选试验试剂hek-bluehtlr7细胞和hek-bluehtlr8细胞(来源于invivogen公司)dmem培养基热灭活胎牛血清抗支原体试剂normocintm博来霉素杀稻瘟菌素方案1.96孔化合物板的准备：利用液体工作站pod将化合物从10毫摩尔/升浓度起始，用dmso做3倍梯度稀释，共稀释10个点(从第2列到第11列，每个点2个重复)。在第12列加入1微升5毫克/毫升的阳性化合物r848作为阳性对照，在第1列加入1微升dmso作为阴性对照。每孔中含有的dmso体积都是1微升。2.收取细胞培养瓶中的细胞，将细胞密度稀释成250,000个细胞/毫升。3.加入200微升(50,000个细胞/孔)细胞悬液至准备好的化合物板中。每孔中dmso终浓度为0.5％。4.将含有细胞和化合物的培养板放入co2培养箱中培养24小时，培养条件为37℃，5％co2浓度。5.培养24小时后，从细胞培养板中每孔取出20微升上清液转移到一块96孔透明检测板中。然后向检测板中每孔加入180微升quanti-blue试剂，并置于37℃，5％co2培养箱孵育1小时。6.1小时后，用酶标仪od650读板检测20微升上清液中碱性磷酸酶的含量。7.利用prism软件分析数据，得出各化合物的ec50。实验结果如表1所示：表1化合物tlr7ec50化合物tlr7ec50化合物1b化合物9b化合物2c化合物10b化合物3b化合物11b化合物4b化合物12b化合物5b化合物13b化合物6c化合物14b化合物7c化合物15b化合物8b化合物16b注：1nm≤a≤100nm；100nm＜b≤1000nm；1000nm＜c≤50μm。化合物1与对照品toll样受体7激动剂gs-9620头对头测试实验结果如表2所示：表2结论本发明的化合物1展现出比对照品toll样受体7激动剂gs-9620更高的与toll样受体7体外受体结合活性、比对照品toll样受体7激动剂gs-9620更低的与toll样受体8体外受体结合活性。当前第1页12