本发明属于药物制备技术领域，具体涉及一种3,4-二羟基苯乙醇非诺贝特酸酯及其制备方法和应用。
背景技术：
糖尿病已成为威胁人类健康的主要公共卫生问题，全球已有糖尿病患者4.15亿，我国糖尿病患者已达一亿多，且发病率呈逐年增高趋势，其中，90％～95％为2型糖尿病(非胰岛素依赖型糖尿病，T2DM)。糖尿病的主要危害是高血糖及胰岛素抵抗诱发的多系统、多脏器并发症的发生与快速发展，其中心脑血管病占80％以上。T2DM是以高血糖、高血脂和胰岛素抵抗为特征的代谢紊乱综合症，是动脉粥样硬化等心脑血管疾病的常见危险因素，糖尿病患者中高血压、高血脂、冠心病等发病率远高于非糖尿病人群。
糖尿病与心脑血管病均与糖、脂代谢异常密切相关。血脂异常是导致如冠心病、糖尿病、心肌梗死、心脏猝死和缺血性脑卒中等疾病的一个重要的致病因素。临床研究证实，降低总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)能预防和逆转动脉粥样硬化病变，使冠心病发病率及病死率明显降低。高血脂与糖尿病互为因果、相互关联。在糖尿病患者中多合并甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇升高的混合性脂代谢紊乱，高血脂发生率达60％。研究表明，T2DM患者的甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇水平是未来心血管事件的危险因子，甘油三酯水平的增高不仅与糖尿病密切相关而且其变化能够很好地预测糖尿病的发病风险。研究显示，基线高三酰甘油水平是糖尿病发病的独立影响因素，高脂血症合并糖尿病患者冠心病概率比无高脂血症的糖尿病患者高出3倍。
多数T2DM患者血中游离脂肪酸(FFA)水平增高。当血中FFA水平异常增高超过了脂肪组织的储存能力和机体对其氧化能力，并以甘油三酯(TG)的形式沉积在非脂肪组织中。FFA在肌肉和肝脏组织的异位沉积导致脂肪细胞葡萄糖转运能力显著减低，并造成胰岛素敏感性降低，在胰岛中过多沉积可触发并加速胰岛β细胞凋亡；FFA刺激过度堆积的脂肪组织产生和释放过量的肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)等炎症因子，这些炎症因子与脂肪组织和其他组织细胞的受体相结合，干扰机体正常的糖脂代谢；FFA在胰岛素作用的靶组织如肝脏、骨骼肌过度堆积导致胰岛素抵抗；异位沉积在胰岛β细胞造成胰岛β细胞受损及胰岛素分泌障碍，最终导致糖尿病的发生与加重。
另一方面，胰岛素除了通过代谢信号通路和生长信号通路来调控细胞增殖、分化外，还对糖、脂肪、蛋白质的代谢进行调控，糖尿病状态下，胰岛素生物调节信号通路发生障碍，出现脂质代谢的紊乱，继而出现脂质代谢异常，形成血脂异常；血糖控制不佳时，低密度脂蛋白酶的活性就会显著降低，降低甘油三酯的代谢速度，血清甘油三酯水平增高，最终导致糖尿病性甘油三酯血症。由此可见，体内胰岛素的水平与高脂血症关系密切。
大量临床研究提示，改善糖尿病患者的血脂水平，尤其是降低甘油三酯，可明显改善糖尿病患者的糖脂异常、预防和减缓心血管疾病及其它并发症的发生与进展。目前临床上广泛应用的降血脂一线药物是他汀类降脂药，如辛伐他汀、阿发他汀等，而他汀类降脂药物主要是通过抑制胆固醇合成的限速酶羟甲戊二酰辅酶A还原酶，降低内源性胆固醇的合成，对甘油三酯无明显影响，而且他汀类药物诱发糖尿病的风险越来越引起重视。由于高甘油三酯在糖尿病及其并发症的发生发展中的突出作用，以降低甘油三酯为特征的贝特类降脂药，如氯贝丁酯、非诺贝特等，在糖尿病及糖尿病合并高脂血症治疗中的优势日益受到重视。
研究表明，高糖及高脂均可激发氧化应激，产生过量的活性氧族(ROS)和活性氮族(RNS)，导致脂质过氧化及血管内皮损伤。氧化应激已被证实是糖尿病及其并发症发生发展的共同病理基础，抗氧化干预是治疗糖尿病及其并发症的重要策略。
在糖尿病、高血脂等代谢性疾病的发展过程中，高血糖、高血脂和氧化应激等代谢紊乱相互交织，导致代谢性疾病的病因及发病机制极为复杂，需要通过多靶标、多途径的干预，较单一的降糖或降脂更为有效。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种3,4-二羟基苯乙醇非诺贝特酸酯及其制备方法和应用，该3,4-二羟基苯乙醇非诺贝特酸酯具有明显的降血糖活性，同时还具有降低胆固醇以及抗氧化的多重活性。
本发明是通过以下技术方案来实现：
本发明公开了一种3,4-二羟基苯乙醇非诺贝特酸酯，其结构式如下：
本发明还公开了上述3,4-二羟基苯乙醇非诺贝特酸酯的制备方法，将3,4-二羟基苯乙醇的3,4-二羟基用苄基保护后，再与非诺贝特酸缩合成酯，然后在氢气钯碳作用下脱去苄基，制得3,4-二羟基苯乙醇非诺贝特酸酯。
所述3,4-二羟基苯乙醇非诺贝特酸酯的制备方法，包括以下步骤：
1)将3,4-二羟基苯乙醇、碳酸钾及溴苄在50～60℃下，加热回流反应，反应完毕后抽滤、浓缩，将浓缩物进行柱层析分离；
2)取步骤1)分离的产物、非诺贝特酸及4-二甲氨基吡啶，以N,N-二甲基甲酰胺为溶剂，搅拌溶解后，向反应体系中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，室温下搅拌反应，将反应物洗涤、干燥、浓缩；
3)将步骤2)制得的产物溶于无水乙醇中，以钯碳作催化剂进行氢解反应，反应完毕后抽滤、浓缩，将浓缩物进行柱层析分离，制得3,4-二羟基苯乙醇非诺贝特酸酯。
步骤1)中，3,4-二羟基苯乙醇、碳酸钾及溴苄的反应摩尔比为1：(4～6)：(2～3)；步骤2)中，步骤1)分离的产物、非诺贝特酸及4-二甲氨基吡啶的反应摩尔比为1:(1～2):(0.2～0.4)；步骤3)中，步骤2)制得的产物与钯碳的反应摩尔比为1:0.2～0.4。
步骤1)柱层析分离所采用的展开剂为石油醚和乙酸乙酯按4：1体积比配制而成；步骤3)柱层析分离所采用的展开剂为石油醚和乙酸乙酯按3：1体积比配制而成。
步骤1)加热回流反应时间为24h；步骤2)室温下搅拌反应时间为12h；步骤3)氢解反应时间为24h。
本发明还公开了上述3,4-二羟基苯乙醇非诺贝特酸酯在制备抗糖尿病药物中的应用。
本发明还公开了上述3,4-二羟基苯乙醇非诺贝特酸酯在制备抗糖尿病合并高脂血症的药物中的应用。
本发明还公开了上述3,4-二羟基苯乙醇非诺贝特酸酯在制备治疗糖尿病并发症的药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明公开的3,4-二羟基苯乙醇非诺贝特酸酯，是一种新型多功效活性化合物，其能够用于治疗糖尿病和高脂血症，能够降低血糖和血脂(甘油三酯和胆固醇)，并且能够对抗脂质过氧化反应，改善糖尿病和高脂血症状态下的氧化应激作用。
本发明公开的3,4-二羟基苯乙醇非诺贝特酸酯对Triton WR-1339所致的高脂血症小鼠具有显著的降血脂作用，可明显降低高脂血症小鼠的甘油三酯水平和总胆固醇水平；对链脲佐菌素(STZ)所致的糖尿病小鼠具有显著的降血糖活性；并表现出明显的抗氧化作用。有望成为一种新型的多功能治疗糖尿病和高脂血症药物。
本发明还公开了上述3,4-二羟基苯乙醇非诺贝特酸酯的制备方法，将3,4-二羟基苯乙醇的3,4-二羟基用苄基保护后，再与非诺贝特酸缩合成酯，然后在氢气钯碳作用下脱去苄基，制得3,4-二羟基苯乙醇非诺贝特酸酯。该制备方法操作简单、对设备要求低，环境友好。
附图说明
图1为各组小鼠血糖浓度(mmol/L)结果图，n＝8；
图2为各组小鼠血浆丙二醛含量(nmmol/L)结果图，n＝8；
图3为各组小鼠血浆总胆固醇含量(nmmol/L)结果图，n＝8；
图4各组小鼠血浆甘油三酯含量(nmmol/L)结果图，n＝8。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
本发明提供一种新的化合物3,4-二羟基苯乙醇非诺贝特酸酯(HT-Fen)及其制备方法，本发明还提供所述的化合物在制备用于治疗糖尿病和高脂血症的用途。
本发明公开一种新的化合物3,4-二羟基苯乙醇非诺贝特酸酯(I)，化学名为2-甲基-2-[4-(4-氯苯甲酰基)苯氧基]丙酸-2-(3,4-二羟基苯基)乙酯，简称为3,4-二羟基苯乙醇非诺贝特酸酯(hydroxytyrosol fenofibric ester,HT-Fen)。
本发明HT-Fen的降血糖作用通过HT-Fen对链脲佐菌素(STZ)所致糖尿病小鼠模型的降血糖作用来实现；HT-Fen的抗氧化作用通过降低链脲佐菌素(STZ)所致糖尿病小鼠模型的脂质过氧化产物MDA来实现；HT-Fen的降脂作用通过HT-Fen对Triton WR-1339所致高脂血症小鼠模型的降血脂作用来实现。
本发明的新化合物HT-Fen的制备方法是：(1)将羟基酪醇、溴苄、碳酸钾，丙酮为溶剂，55℃加热条件下反应，反应完毕，抽滤，浓缩。通过柱层析(展开剂：石油醚和乙酸乙酯)分离得苄基保护的羟基酪醇；(2)将苄基保护的羟基酪醇、非诺贝特酸和4-二甲氨基吡啶(DMAP)一起加入烧瓶，加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，搅拌5min后再加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)室温下搅拌，反应完毕，反应物用5％的NaHCO3溶液洗涤2次，饱和食盐水洗涤2次，无水Na2SO4干燥，浓缩；(3)将步骤(2)浓缩物溶于无水乙醇中，钯碳作催化剂，氢解反应，反应完毕，抽滤，浓缩。通过柱层析(展开剂：石油醚和乙酸乙酯)分离得产物。
具体步骤如下：
实验材料和仪器
材料：链脲佐菌素(Streptozocin，STZ，美国Sigma公司)，非诺贝特酸(武汉鸿睿康试剂有限公司)，西格列汀(武汉鸿睿康试剂有限公司)，HT-Fen，一水合柠檬酸、二水合柠檬酸三钠均为分析纯。
仪器：安稳血糖仪及配套血糖试纸(三诺生物传感股份有限公司)，紫
外-可见分光光度计等。
动物：昆明小鼠(20.0±2.0g)。
实施例1:HT-Fen的制备
将3,4-二羟基苯乙醇(1.00g，6.50mmol)、碳酸钾(3.60g，26.09mmol)溶于丙酮(25mL)中，加入溴苄(1.40ml，14.95mmol)，加热回流反应24h，反应完毕，抽滤，浓缩。柱层析分离(展开剂：石油醚和乙酸乙酯)得3,4-二苄氧基苯乙醇淡黄色固体1.46g，收率为67.12％。
3,4-二苄氧基苯乙醇(1.00g，3.26mmol)、非诺贝特酸(1.56g，4.89mmol)和DMAP(0.08g，0.65mmol)加入DMF(20mL)中，搅拌5min后加入EDC·HCl(0.94g，4.89mmol)，室温下搅拌，薄层板检测，反应完毕，反应物用5％的NaHCO3溶液和饱和食盐水依次洗涤2次，无水Na2SO4干燥，浓缩，得黄色油状物2.13g，直接投入下一步反应。
将上述所得黄色油状物用无水乙醇(25ml)溶解，钯碳(0.22g)催化下通氢气氢解，室温反应24h，反应完毕，抽滤，浓缩。柱层析分离(展开剂：石油醚和乙酸乙酯)，得淡黄色油状HT-Fen 1.08g，收率72.97％。
核磁共振谱图数据：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.27(m,1H),7.16(m,3H),7.00(m,2H),6.73～6.63(m,4H),6.54(m,1H),6.06(s,1H),5.99(s,1H),4.30(t,J＝7.0Hz,2H),2.76(t,J＝7.0Hz,2H),1.52(s,6H)。
实施例2：HT-Fen的降血糖作用及抗氧化作用
0.1mmol/L pH4.5柠檬酸缓冲液的配制：
A液的配制(0.1mol/L柠檬酸水溶液)：柠檬酸2.10g加入蒸馏水至100ml。B液的配制(0.1mol/L柠檬酸三钠水溶液)：柠檬酸三钠2.94g加蒸馏水至100ml。0.1mol/L柠檬酸水溶液与0.1mol/L柠檬酸三钠水溶液的按体积比1:1.44进行混合，即可配制形成0.1mmol/L pH4.5柠檬酸缓冲液。
STZ溶液配制：以0.1mmol/LpH 4.5柠檬酸缓冲液溶解，配制成20mg/ml的溶液，冰浴，避光，半小时内注射完。
糖尿病小鼠模型的建立：小鼠适应性喂养3d，禁食12h，腹腔注射STZ(使用0.1mol/L，pH4.5柠檬酸缓冲液，200mg/kg)72h后禁食，自由饮水。禁食6h后测血糖，选择血糖大于16.0mmol/L，并出现多饮、多食、体重减轻的为糖尿病模型小鼠。
糖尿病小鼠的降血糖药效学研究
取糖尿病模型小鼠，分别称重并测量空腹血糖值，按照体重、血糖值相近的原则分为3组：模型组、西格列汀组、HT-Fen组，再取一组正常小鼠为空白组，每组8只：①空白组，灌胃给予蒸馏水；②模型组，灌胃给予蒸馏水；③西格列汀组，灌胃给予西格列汀13mg/kg；④HT-Fen组，灌胃给予HT-Fen16.4mg/kg。除正常组和模型组灌胃给予等剂量蒸馏水外其余分别灌胃给药，每天1次，连续8d，第7d给药后禁食不禁水6h后各组小鼠断尾用血糖测定仪测定血糖值，第8天给药6h后各组小鼠摘眼球取全血，全血放在冰浴上静置1h，5000r/min离心15min得血浆，按照试剂盒方法测定血浆丙二醛含量。
给药剂量按照转换公式确定剂量：
实验结果：各组小鼠血糖浓度见表1和图1；各组小鼠血浆MDA含量见表2和图2。
表1各组小鼠血糖浓度(mmol/L)(n＝8)
注：*表示与模型组相比较P＜0.05，##表示与空白组相比较P＜0.01，△表示与西格列汀组相比较P＞0.05。
从表1和图1的分析可以得出，化合物F-HT能显著降低糖尿病小鼠的血糖，具有降血糖活性。
表2各组小鼠血浆丙二醛含量(nmmol/L)(n＝8)
注：#表示与空白组相比较P＞0.05，##表示与空白组相比较P＜0.01，**表示与模型组相比较P＜0.01。
从表2和图2的分析可以得出，化合物F-HT可以降低糖尿病小鼠体内丙二醛的含量，同时在糖尿病模型组发挥抗氧化应激的作用。
实施例3：HT-Fen的降脂作用
小鼠适应性喂养3d，随机分为4组(空白组、模型组、HT-Fen组、非诺贝特酸组)每组8只：①正常对照组，灌胃给予蒸馏水；②模型组，灌胃给予蒸馏水；③F-HT组，灌胃给予F-HT 16.4mg/kg；④非诺贝特酸组，灌胃给予非诺贝特酸11.5mg/kg。除正常对照组和模型组灌胃给予等剂量蒸馏水外其余分别灌胃给药，每日1次，连续7d，在末次给药前18h，除正常对照组外，其余各组尾静脉注射Triton WR-1339 400mg/kg。
给药剂量按照转换公式确定剂量：
在末次给药后6h，各组小鼠均摘眼球取血，收集到的全血在冰浴上静置1h，然后5000r/min离心15min得血浆，然后按照试剂盒方法分别测定血浆总胆固醇、甘油三酯的含量和血浆丙二醛含量。
实验结果：各组小鼠血浆总胆固醇和甘油三酯含量见表3和图3、图4；各组小鼠血浆丙二醛含量见表2和图2。
表3各组小鼠血浆总胆固醇和甘油三酯含量(mmol/L)(n＝8)
注：*表示与模型组相比较P＜0.05，##表示与空白组相比较P＜0.01
从表3、图3和图4的分析可以得出，化合物HT-Fen可以降低高脂血症小鼠的总胆固醇和甘油三酯含量，具有降低总胆固醇和甘油三酯的活性。
综上可见，本发明提供的化合物3,4-二羟基苯乙醇非诺贝特酸酯(HT-Fen)，具有降血糖、降血脂和抗氧化应激的多重活性。