一种对蓝木霉菌株及其应用的制作方法

本发明涉及一种对蓝木霉菌株及其应用，具体涉及一种对蓝木霉菌株(Trichoderma cyanodichotomus)TW21990-1以及该菌株在盐碱地及其病害防治中的应用，属于微生物应用领域。

背景技术：

盐碱地是盐类集积的一个种类，是指土壤里面所含的盐份影响到作物的正常生长，根据联合国教科文组织和粮农组织不完全统计，全世界盐碱地面积为9.5438亿hm²，我国盐碱地面积为0.9913亿hm²。我国碱土和碱化土壤的形成，大部分与土壤中碳酸盐的累计有关，因而碱化度普遍较高，严重的盐碱土壤地区植物几乎不能生存。我国盐碱土分布区是根据它的土壤类型和气候条件变化决定的，分为滨海盐渍区、黄淮海平原盐渍区、荒漠及荒漠草原盐渍区、草原盐渍区四个大类型。盐碱地防治和开发是灌区农业发展不容忽视的问题，对于促进农业可持续发展，保障粮食生产具有重要作用。

针对盐碱地的改良与利用，19世纪明沟排水盛行欧洲，20世纪中期各实验室针对水盐运移进行研究，基本可分为物理模型、确定性模型等，20世纪末国外开始试探生物改良方法。

国内的盐碱地改良研究起步较晚，总的来说，形成了以物理改良、水利改良、生物改良和化学改良为核心的4大治理体系。目前，排水洗盐技术是运用较为广泛的一种改良盐碱地措施，但存在工程投资大、占用土地多、水资源消耗多和运行维护费用高等缺点。

近二十年来在农作物及栽培植物上开始有所研究，生物排盐对盐碱地利用及盐渍化改良具有重要意义，如中科院上海植物生理所培育成功的既抗盐又抗寒的植申系列高产小麦品种，表现出优异的抗盐、抗寒性能。微生物菌肥成为近年盐碱土改良新手段，如陈建爱等将木霉制剂用于盐碱地花生的种植上，提高了成苗率。崔西苓等筛选出耐盐、防治烟草黑胫病的木霉菌株。但该领域基础性研究还较薄弱，大多停留在初始阶段。今后，耐盐碱植物和微生物种类的筛选、综合价值高的土壤改良剂的选择等将成为盐碱地改良的研究重点。

技术实现要素：

针对上述技术问题，本发明提供了一种对蓝木霉菌株及其应用，具体涉及对蓝木霉菌株(Trichoderma cyanodichotomus)TW21990-1以及该菌株在盐碱地及其中的应用。

本发明对蓝木霉菌株TW21990-1于2015年4月分离自湖南省洞庭湖大桥土样，采集地经度113°06′09"，纬度29°24′3.03"。对蓝木霉菌株TW21990-1的生物菌种保藏编号为：CGMCC No.12161，保藏日期为：2016年2月23日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本发明分类命名为Trichoderma cyanodichotomus。

本发明还包括含有对蓝木霉菌株TW21990-1、通过TW21990-1菌株制备的两种分生孢子或者TW21990-1菌株的发酵液中的至少任意一种制备的制剂。

对蓝木霉菌株TW21990-1发酵过程如下：

(1)斜面培养：采用0.4mol/L NaCl的PDA培养基，将菌株接种在试管培养基上，28℃培养4～5d；

(2)三角瓶培养：采用0.4mol/L NaCl的PDB培养基，将试管菌种接种在液体三角瓶中，置于摇床上28℃振荡培养2d；

(3)液体培养：采用液体发酵培养基，115℃灭菌30min，将菌种接种到发酵罐，接种量0.2％(v/v)，28℃培养，溶氧量40～50％，通气量1：0.6～0.8，搅拌速度为160r/min，培养2d；

(4)固体培养：采用固体发酵培养基，121℃灭菌30min，在拌料罐中将液体菌种与固体培养基混合均匀，接种量为5～10％(v/v)，接种完毕转移到固体培养室，培养基厚度为5cm，料温控制在28±2℃，室温控制在25～30℃，培养室空气的相对含水量为95～100％，培养时间为4～5d；

(5)孢子收集：培养后用生理盐水洗脱分生孢子，5000r/min离心10min，收集沉淀，得到两种浓缩分生孢子；

步骤(3)中，液体发酵培养基为，玉米粉2％，葡萄糖0.5％，豆饼粉4％，K2HPO40.2％，KH2PO4 0.3％，NaCl 2.3％，余量为水，pH 6.0～6.5。

步骤(4)中，固体发酵培养基为，葡萄糖0.5％，NaCl 2.3％，麸皮42.2％，稻壳5.0％，余量为水。

含有本发明制备的两种分生孢子的制剂，按质量份数计由以下组分组成：

两种浓缩分生孢子 10～15份

麦饭石(300目) 950份

明胶 10份

NaCl 23份

SDS 1份。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

本发明高效耐盐，在0.4mol/L NaCl的PDA平板上长势较好，耐盐率为90.2％，对瓜果腐霉、尖孢镰孢的抑制率分别为100.0％、95.8％。本发明可产生两种大小不同的分生孢子，通过活菌计数，固体发酵后小分生孢子含量约为22.5亿/g，大分生孢子含量约为46.7亿/g。小区试验表明，含有本发明两种分生孢子的制剂对番茄猝倒病(Pythium aphanidermatum)和黄瓜枯萎病(Fusarium oxysporum)的防治效果分别为87.2％和85.7％，在盐碱地上对番茄和黄瓜的增产效果分别为67.5％和67.3％。

附图说明

图1为对蓝木霉菌株TW21990-1的形态特征图；

注：A-C为对蓝木霉菌株TW21990-1分别在培养基SNA、PDA、CMD上20℃培养7d的正面菌落形态图；D-F为对蓝木霉菌株TW21990-1分别在培养基SNA、PDA、CMD上20℃培养7d的反面菌落形态；G，2种分生孢子和脱落的厚垣孢子(箭头1为小分生孢子，箭头2为大分生孢子，箭头3为脱落的厚垣孢子)；H，未脱落的厚垣孢子；I，分生孢子梗；标尺G-I＝10μm。

图2为对蓝木霉菌株TW21990-1的耐盐性

注：A，对蓝木霉菌株TW21990-1在PDA平板上25℃培养4d的菌落大小；B，对蓝木霉菌株TW21990-1在0.4mol/L NaCl的PDA平板上25℃培养4d的菌落大小。

图3为对蓝木霉菌株TW21990-1对瓜果腐霉的平板抑制作用图；

注：A，对照瓜果腐霉在PDA平板上25℃培养4d的菌落大小；B，瓜果腐霉与对蓝木霉菌株TW21990-1在PDA平板上25℃对峙培养4d的菌落大小。

图4为对蓝木霉菌株TW21990-1对尖孢镰孢的平板抑制作用图；

注：A，对照尖孢镰孢在PDA平板上25℃培养4d的菌落大小；B，尖孢镰孢与对蓝木霉菌株TW21990-1在PDA平板上25℃对峙培养4d的菌落大小。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1对蓝木霉菌株TW21990-1

对蓝木霉TW21990-1菌株于2015年4月分离自湖南省洞庭湖大桥土样，采集地经度113°06′09"，纬度29°24′3.03"。对蓝木霉菌株TW21990-1的生物菌种保藏编号为：CGMCC No.12161，保藏日期为：2016年2月23日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

实施例2菌株TW21990-1的分子序列分析

对菌株TW21990-1中的ITS、tef1及rpb2序列结果进行比对分析。

ITS序列的扩增引物：

ITS1-F：5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’

ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’

菌株TW21990-1的ITS序列全长为665bp，序列如SEQ ID No.1所示，将ITS序列提交至www.isth.info中的TrichOKEY进行比对，结果分别在110、132、309、467、560处发现了木霉的5个DNA寡核苷酸条形编码，表明菌株TW21990-1为木霉属，但在该数据库中找不到与该序列同源性较高的序列信息，初步表明该菌株可能为新种。将ITS序列提交www.ncbi.nlm.nih.gov进行比对，TW21990-1菌株与Trichoderma sp.4TMS-2011vocher MSbale50-9[HQ630962.1]同源性最高，为94％。

tef1序列扩增引物：

EF1-728F：5’-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3’

TEF1LLErev：5’-AACTTGCAGGCAATGTGG-3’

菌株TW21990-1的tef1序列全长为1346bp，序列如SEQ ID No.2所示，将tef1序列提交NCBI进行比对，TW21990-1菌株与Trichoderma estonicum strain CBS111147[FJ860638.1]同源性最高，为91％。

rpb2序列扩增引物：

fRPB2-5F：5’-GA(T/C)GA(T/C)(A/C)G(A/T)GATCA(T/C)TT(T/C)GG-3’

fRPB2-7cR：5’-CCCAT(A/G)GCTTG(T/C)TT(A/G)CCCAT-3’

菌株TW21990-1的rpb2序列全长为1234bp，序列如SEQ ID No.3所示，将rpb2序列提交NCBI进行比对，TW21990-1菌株与Hypocrea strictipilosa strain C.P.K.1601[FJ860594.1]同源性最高，为94％。

通过上述分析，可以看出菌株TW21990-1为木霉属，其ITS、tef1及rpb2三种序列同NCBI中其它种类的木霉同源性都不大于94％，故断定菌株TW21990-1为木霉属新种。

实施例3菌株TW21990-1形态特征描述

菌株TW21990-1在SNA培养基上20℃、25℃、30℃、35℃培养72h，菌落半径分别为36～43mm、62～64mm、67～71mm、13～14mm，40℃以上不生长，最适生长温度为25～30℃。在SNA培养基上25℃培养7d，气生菌丝成放射状生长，近接种点稀疏，远接种点稍稠密，孢子簇产生于接种点边缘的轮纹带上，绿色，成扇形分布，无明显气味，无明显色素，如图1A和1D所示。

菌株TW21990-1在PDA培养基上20℃、25℃、30℃、35℃培养72h，菌落半径分别为33～39mm、59～61mm、66～67mm、10～11mm，40℃以上不生长，最适生长温度为25～30℃。在PDA培养基上25℃培养7d，菌落均匀，气生菌丝稠密、丝绒状，分生孢子灰绿色，布满整个平板，无明显无气味，背面产生明显的蓝色色素，如图1B和1E所示。

菌株TW21990-1在CMD培养基上25℃培养7d，产生大量绿色孢子簇，颗粒状，不规则分布，无明显无气味，背面产生淡蓝色色素，如图1C和1F所示。

如图1I所示，菌株TW21990-1菌丝透明，粗壮，细胞壁光滑，直径3.9～4.4μm，菌丝间有隔，间隔长度为31.1～41.4μm，分生孢子梗有明显的长中轴，侧枝一般单生，少数对生，粗壮，分枝较长，初级分枝大小为(19.2～19.6)×(3.9～4.1)μm，次级分枝大小为(8.6～10.2)×(3.7～3.9)μm，分枝之间都有明晰可见的隔膜，分枝呈锐角，孢子梗分枝处的隔膜呈“V”字形，瓶梗对生，长烧瓶形，中部稍膨大，顶部较细，大小为(5.8～6.2)×(3.4～3.6)μm。

如图1G所示，分生孢子有2种，小型分生孢子(箭头1方向)一般为圆形，大小为(1.0～)1.2～2.0(～2.3)×(1.0～)1.1～1.9(～2.2)μm，长/宽比平均为1.0～1.1，绿色，壁光滑。大型分生孢子(箭头2方向)卵形或梨形，个别为椭圆形，大小为(3.7～)4.3～5.0(～5.5)×(3.4～)3.8～4.4(～4.6)μm，长/宽比(1.0～)1.1～1.2(～1.3)，绿色或黄绿色，壁光滑。

如图1G和1H所示，厚垣孢子非常丰富，梨形或亚球形，端生、串生或间生，易脱落(1G箭头3方向)，大小为(7.3～)8.4～11.5(～12.6)×(5.3～)6.8～7.7(～9.7)μm，长/宽比(1.0～)1.1～1.2(～1.6)。

通过平板形态和分生孢子梗分枝特点，菌株TW21990-1应归属于木霉属中的肉座组(Hypocreanum)，该组中多数为肉座菌(Hypocrea)的无性世代，已鉴定的该组中的木霉种类较少，菌株TW21990-1与该组中其它木霉种类的特点差异较大，进一步断定该菌株为木霉属新种。本发明将菌株TW21990-1命名为对蓝木霉(Trichoderma cyanodichotomus)。

实施例4：菌株TW21990-1的耐盐性及平板对峙培养实验

在PDA培养基中添加0.4mol/L NaCl的NaCl，接种木霉菌株TW21990-1，以PDA为对照，25℃培养，如图2所示，记录木霉的生长半径，计算耐盐率。

耐盐率＝100％×处理木霉半径/对照木霉半经

在PDA平板直径两端距中心35mm处分别接种直径5mm的木霉菌株和病原真菌，以只接种病原真菌的为对照，25℃培养，记录病原真菌对峙半径，计算抑制率。

抑制率＝100％×(对照病原真菌半径-处理病原真菌半径)/对照病原真菌半经

通过上述实验，该木霉菌株TW21990-1在0.4mol/L NaCl的PDA平板上的耐盐率为90.2％。

对蓝木霉TW21990-1对瓜果腐霉的平板抑制作用如图3所示，其中，A为对照瓜果腐霉在PDA平板上25℃培养4d的菌落大小；B为瓜果腐霉与对蓝木霉TW21990-1菌株在PDA平板上25℃对峙培养4d的菌落大小。对蓝木霉TW21990-1菌株对尖孢镰孢的平板抑制作用如图4所示，其中，A为对照尖孢镰孢在PDA平板上25℃培养4d的菌落大小；B为尖孢镰孢与对蓝木霉TW21990-1菌株在PDA平板上25℃对峙培养4d的菌落大小。经测量计算本发明对蓝木霉TW21990-1菌株对瓜果腐霉、尖孢镰孢的平板抑制率分别为100.0％、95.8％。

实施例5：本发明含有两种分生孢子制剂的工业化生产

(1)斜面培养：采用0.4mol/L NaCl的PDA培养基，将菌株接种在试管培养基上，28℃培养4～5d；

(2)三角瓶培养：采用0.4mol/L NaCl的PDB培养基，将试管菌种接种在液体三角瓶中，置于摇床上28℃振荡培养2d；

(3)液体培养：采用液体发酵培养基，115℃灭菌30min，将菌种接种到发酵罐，接种量0.2％(v/v)，28℃培养，溶氧量40～50％，通气量1：0.6～0.8，搅拌速度为160r/min，培养2d；

(4)固体培养：采用固体发酵培养基，121℃灭菌30min，在拌料罐中将液体菌种与固体培养基混合均匀，接种量为5～10％(v/v)，接种完毕转移到固体培养室，培养基厚度为5cm，料温控制在28±2℃，室温控制在25～30℃，培养室空气的相对含水量为95～100％，培养时间为4～5d；

(5)孢子收集：培养后用生理盐水洗脱分生孢子，5000r/min离心10min，收集沉淀，得到两种浓缩分生孢子；

步骤(3)中，液体发酵培养基(质量百分比)为，玉米粉2％，葡萄糖0.5％，豆饼粉4％，K2HPO4 0.2％，KH2PO4 0.3％，NaCl 2.3％，余量为水，pH6.0～6.5。

步骤(4)中，固体发酵培养基(质量百分比)为，葡萄糖0.5％，NaCl 2.3％，麸皮42.2％，稻壳5.0％，余量为水。

所述的制剂，由以下成分组成：

制剂中有效活性成分为两种分生孢子，总含量为5亿/g，其中小型分生孢子比例为32.5％，大型分生孢子比例为67.5％。由于该木霉特有的产生两种分生孢子的能力，使该木霉具有高效耐盐性和病害防治效果。

实施例6：本发明含有两种分生孢子制剂对盐碱地番茄猝倒病的防治效果及增产效果

试验设在山东省东营市垦利县，试验地盐度0.6％，经检测，试验地主要病菌为瓜果腐霉，番茄品种为天宝一号，济南大江种子有限公司。试验设3个处理：处理1为制剂，处理2为药剂(甲霜灵)，处理3为对照，每处理设4个小区重复，小区面积16m²，随机分布。

将种子常规催芽后，挑取形态一致的种子平均分成3份，处理1用本发明制剂拌匀，约500粒种子使用1g制剂处理，使种子上吸附的分生孢子数为10⁶cfu/粒，处理2用100μg/mL的甲霜灵浸泡30min，处理3用清水冲洗干净。按常规方法播种、管理。出苗后2周调查成苗率，计算防治效果。收获后统计产量，计算增产效果。

防治效果％＝100％×(处理组成苗率-对照组成苗率)/(1-对照组成苗率)

增产效果％＝100％×(处理组产量-对照组产量)/对照组产量

结果见表1，本发明制剂可有效提高盐碱地中番茄的成苗率，并可有效防治番茄猝倒病的发生，防治效果达到了87.2％，增产效果达到了67.5％，效果显著(p＜0.01)。

表1本发明制剂对盐碱地番茄猝倒病的防治效果及增产效果

(注：数据采用SPSS 10.0统计软件中的Duncan方法进行分析，结果为4次重复的平均值±标准差，以不同大写字母表示各处理间在0.01水平上存在显著性差异。)

实施例7：本发明含有两种分生孢子制剂对盐碱地黄瓜枯萎病的防治效果及增产效果

试验设在山东省东营市垦利县，试验地盐度0.8％，经检测，试验地主要病菌为尖孢镰孢，黄瓜品种为新优一号，济南大江种子有限公司。试验设3个处理：处理1为制剂，处理2为药剂(噻菌灵)，处理3为对照，每处理设4个小区重复，小区面积16m²，随机分布。

将种子常规催芽后，挑取形态一致的种子平均分成3份，处理1用本发明制剂拌匀，约500粒种子使用1g制剂处理，使种子上吸附的分生孢子数为10⁶cfu/粒，处理2用100μg/mL的噻菌灵浸泡30min，处理3用清水冲洗干净。按常规方法播种、管理。出苗后4周调查病情指数，计算防治效果。收获后统计产量，计算增产效果。

黄瓜枯萎病发病程度：

0级为无病症；

1级为胚轴或子叶出现轻微病症，但生长正常；

2级为胚轴或子叶出现明显的坏死斑，或1片子叶黄化，影响生长；

3级为2片子叶黄化，或1片子叶枯死；

4级为2片子叶生长僵化，植株部分萎蔫或停止生长；

5级为整株萎蔫、倒伏或枯死。

病情指数％＝100％×(∑(病情级别×该级病株数)/(5×调查总株数)

防病效果％＝100％×(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数)

增产效果％＝100％×(处理组产量-对照组产量)/对照组产量

结果见表2，本发明制剂可有效降低碱地黄瓜的病情指数，并可有效防治黄瓜枯萎病的发生，防治效果达到了85.7％，增产效果达到了67.3％，效果显著(p＜0.01)。

表2本发明制剂对盐碱地黄瓜枯萎病的防治效果及增产效果

(注：数据采用SPSS 10.0统计软件中的Duncan方法进行分析，结果为4次重复的平均值±标准差，以不同大写字母表示各处理间在0.01水平上存在显著性差异。)