一种铁皮石斛菌根真菌节菱孢菌株ZJ11C12及其应用的制作方法与工艺

本发明属于农业微生物技术领域，涉及一种铁皮石斛菌根真菌节菱孢菌株(Arthriniumsp.)ZJ11C12及其应用。

背景技术：
作为中国著名传统药材，铁皮石斛(Dendrobiumofficinale)早在《本草纲目》铁皮石斛就被列为药用，在《神农本草经》中被列为上品，在《道藏》中被列为“中华九大仙草”之首。铁皮石斛不但具有滋阴养胃、润肺止咳、清热明目的功效，还有增强人体免疫力，消除肿瘤，抑制癌症等作用。由于铁皮石斛非常名贵，近年来，铁皮石斛人工栽培产业在全国范围内发展比较迅速。但是，石斛生长发育中特有的复杂性使石斛产业发展的难度加大。其中一个主要原因是石斛是菌根植物，自然生长状态下，都必须部分或完全依赖与真菌建立共生关系形成菌根才能实现正常生命活动。而人工条件下进行石斛大规模扩繁时，往往因缺少适宜的共生真菌的参与，种子萌发率极低，菌根无法形成，造成石斛生长发育缓慢，影响国内外石斛产业的发展。同时，作为一种新的微生物资源，包括植物菌根菌在内的内生真菌引起了广泛关注。植物的内生真菌是指在植物生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的真菌。目前，已从内生真菌中分离出多种生物活性物质，包括抗菌、抗肿瘤、抗氧化等天然化合物，其中不少是新物质，具有特殊生物活性，在医药、保健品、植物菌肥菌剂等各个领域都展现出良好的应用前景，而且植物内生真菌是一类可持续利用的资源，对自然资源破坏极少，能够解决自然资源不足的问题。节菱孢类菌根菌作为一种植物内生真菌，其代谢产物具有抗氧化活性，对植物的健康成长、病害防治具有重要意义。本发明提供一种新型的节菱孢类菌根菌，该菌株能与铁皮石斛无菌苗共生形成典型的菌根结构，促进幼苗生长，提高其移栽存活率。

技术实现要素：
本发明的第一个目的是提供一株节菱孢ZJ11C12菌株，其于2013年12月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号CGMCCNo.8602；分类命名为节菱孢Arthriniumsp.；本发明节菱孢ZJ11C12是从野生药用植物铁皮石斛根系中分离出来的。其分离方法为：取新鲜的铁皮石斛营养根4～5cm，冲洗表面泥沙，清水缓慢流洗30min。将根放入无菌杯中，75％酒精处理30s，倒掉酒精，再加入0.1％升汞，灭菌5min左右。倒掉升汞，无菌水冲洗4～5次。随后用解剖刀将材料横切成3～5mm的薄片，置于PDA培养基中，切面朝向培养基。每个培养皿4～5块组织，25℃恒温避光培养。培养3～7天后菌丝体从组织块上长出，并形成一定大小的菌落，以组织块为中心向周围扩散生长。从其边缘挑取菌丝体移到另一PDA平板，重复至获得纯培养物，转入PDA斜面保存。将分离到的ZJ11C12菌株接种至PDA平板上进行培养观察，黑暗培养7d后菌落直径7.5cm。气生菌丝发达，质地绒毛状，近絮状，菌落呈白色，边缘不整齐。显微镜观察菌丝无色，具隔膜，分枝，直径2.5-5μm，分生孢子未见。采用常规手段提取ZJ11C12菌株的基因组DNA，并利用真菌的ITS区的通用引物扩增其ITS区间，其碱基序列如SEQIDNO.1所示。通过在GenBank中进行blast检索，发现其与节菱孢属(Arthriniumsp.)菌株ML-2004(GeneBank登录号AY425967)同源性最高，达99％，鉴定该菌株为节菱孢属(Arthriniumsp.)真菌。本发明的第二个目的是所述的节菱孢菌株ZJ11C12在与铁皮石斛无菌苗建立共生体系，形成典型的菌根结构中的应用，或上述的节菱孢真菌促进石斛生长和生物活性物质积累的应用，节菱孢真菌与石斛幼苗共生后，促进幼苗移栽存活率、提高幼苗长势。本发明的菌株能与铁皮石斛无菌苗共生形成典型的菌根结构，并通过温室盆栽试验证实，形成菌根结构后的幼苗移栽存活率明显高于普通无菌幼苗，且长势明显提高。节菱孢属(Arthriniumsp.)ZJ11C12，于2013年12月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号CGMCCNo.8602。附图说明图1为本发明的节菱孢ZJ11C12菌株在PDA培养基中的菌落特征图；图2为本发明的节菱孢ZJ11C12菌株的菌丝显微镜观察图片；图3为本发明的节菱孢ZJ11C12菌株与铁皮石斛无菌苗共生后形成的菌根横切面显微结构图；其中A、菌根共生7d，菌丝开始侵染根被(×100)；B、菌根共生14d，菌丝由通道细胞进入外皮层(×400)；C、菌根共生21d，菌丝进入皮层细胞(×200)；D、菌根共生28d，皮层细胞中有大量衰败的菌丝团(×200)；E、菌根共生35d，菌丝团进入内皮层细胞(×200)；F、对照根横切面(×100)。具体实施方式以下通过具体实施例来对本发明进一步说明，但并非限制本发明。实施例1：节菱孢ZJ11C12的分离培养：节菱孢ZJ11C12是从采自云南省昆明市的药用植物铁皮石斛分离得到，其分离方法为：取新鲜的铁皮石斛营养根4～5cm，冲洗表面泥沙，清水缓慢流洗30min。将根放入无菌杯中，75％酒精处理30s，倒掉酒精，再加入0.1％升汞，灭菌5min左右。倒掉升汞，无菌水冲洗4～5次。随后用解剖刀将材料横切成3～5mm的薄片，置于PDA培养基中，切面朝向培养基。每个培养皿4～5块组织，25℃恒温避光培养。培养3～7天后菌丝体从组织块上长出，并形成一定大小的菌落，以组织块为中心向周围扩散生长。从其边缘挑取菌丝体移到另一PDA平板，重复至获得纯培养物，转入PDA斜面保存。本发明的节菱孢ZJ11C12形态特征如下：如图1和图2所示，节菱孢ZJ11C12菌株在PDA培养基上的生长温度为25℃，气生菌丝发达，质地绒毛状，近絮状，菌落呈白色，边缘不整齐。显微镜观察菌丝无色，具隔膜，分枝，直径2.5-5μm，分生孢子未见。采用常规手段提取ZJ11C12菌株的基因组DNA，并利用真菌的ITS区的通用引物扩增其ITS区间，其碱基序列如SEQIDNO.1所示。通过在GenBank中进行blast检索，发现其与节菱孢属(Arthriniumsp.)菌株ML-2004(GeneBank登录号AY425967)同源性最高，达99％，鉴定该菌株为节菱孢属(Arthriniumsp.)真菌。节菱孢属(Arthriniumsp.)ZJ11C12，于2013年12月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号CGMCCNo.8602。实施例2：铁皮石斛-节菱孢菌株ZJ11C12共生体系的建立将6月龄生长较一致的铁皮石斛无菌组培苗接种于含有50ml共生培养基的培养瓶中，每瓶接种3株苗，共接种30瓶，置于25℃、光照强度2000Lx、每日光照12～14h的恒温光照培养箱预培养一周左右。同时，将ZJ11C12菌株接种PDA固体培养基，在25℃培养5d后，用打孔器取菌落边缘菌块，接种到盛有100mLPDB液体培养基的500mL三角瓶内，置25℃、转速200r/min的摇床上振荡培养3d，得到节菱孢ZJ11C12种子液。取种子液中的等量大小的菌体球(直径为0.3cm)，用接种针将菌球接种于与石斛苗相距2cm培养基上，培养观察共生体系形成情况。实施例3：节菱孢菌株ZJ11C12与铁皮石斛无菌苗共生形成典型的菌根结构通过对不同共生时期的铁皮石斛菌根石蜡切片的观察，发现ZJ11C12菌株与铁皮石斛幼苗能形成完整的菌根结构。铁皮石斛根的结构从外向内依次为根被、外皮层、皮层、内皮层和中柱。根被通常由3～4层细胞构成，排列较为规则，细胞壁较厚，多为死细胞；外皮层为单层细胞，除通道细胞外多为死细胞，细胞体积较大，排列规则；皮层由5～6层活细胞组成，壁薄，与外皮层、内皮层相邻的1～2层细胞体积较小，中间部分体积较大，呈不规则的多边形状；内皮层细胞单层，体积较小；皮层细胞在铁皮石斛根中所占比例最大，细胞壁薄，可消化侵入的菌丝，为兰科植物的生长提供营养物质[83]。显微结构观察发现，菌苗共生7天时，菌丝接触到铁皮石斛的根被组织并在根被外积聚(图3-A)；14天时，菌丝由通道细胞进入外皮层(图3-B)；21天时，菌丝继续侵入皮层的薄壁细胞，通常以一条或多条菌丝弯曲聚集，呈现出典型的菌丝结结构并且菌丝量增多,有些菌丝则溶解成深色的胶状物(图3-C)；28天时，皮层细胞出现大量衰败的菌丝团(图3-D)；35天时，内皮层附近有菌丝出现，外皮层出现新形成的菌丝团缠绕通道细胞的细胞核(图3-E)。在未接菌的对照组中，则能观察到正常的根结构，而未见到上述的染菌结构(图3-F)。实施例4：节菱孢菌株ZJ11C12促进铁皮石斛幼苗移栽存活率根据上述结果，将共生14天后的铁皮石斛幼苗移栽至穴盘中，观察幼苗存活情况。温室培养，常规日照，3个月后统计幼苗存活率。共处理石斛幼苗4000株(对照和处理组各2000株)，经统计移栽苗的存活率分别为93.99％和99.95％，即处理后存活率上升了5.96％，且处理组石斛幼苗长势明显高于对照组。SEQUENCELISTING<110>杭州师范大学<120>一种铁皮石斛菌根真菌节菱孢菌株ZJ11C12及其应用<130>1<160>1<170>PatentInversion3.3<210>1<211>580<212>DNA<213>人工合成<400>1tccgtaggtgaacctgcggagggatcattacagagttatacaactcccataccatctgtt60aacctacccagttatgcctcggcgtaagctcggttggaggcacctgcagctaccctgtag120ttgcggactgccaactccagccgcggcccgccggcggtacactaaactctgttttatttt180atattctgagcgtcttattttaataagttaaaactttcaacaacggatctcttggttctg240gcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaat300catcgaatctttgaacgcacattgcgcccatcagtattctggtgggcatgcctgttcgag360cgtcatttcaacccttaagcctagcttagtgttgggaatctgctgtactgcagttcctta420aagacagtggcggagcggcggtagtcctctgagcgtagtaatttattcctcgcttttgtc480aggctctgtcctcccgccataaaacccccaattttttagtggttgacctcggatcaggta540ggaatacccgctgaacttaagcatatcaataagcggagga580