抑制长链非编码RNASNHG6表达和肝癌细胞增殖的siRNA-203及应用的制作方法

本发明涉及一种siRNA，特别涉及一种抑制长链非编码RNASNHG6表达和肝癌细胞增殖的siRNA-203及应用。
背景技术：
：肝细胞性肝癌(hepatocellularcarcinoma，HCC，下称肝癌)是临床上常见的恶性肿瘤之一，其全球发病率逐年增长，已超过70万/年，位居最常见恶性肿瘤发病率的第5位；死亡接近60万/年，位居恶性肿瘤相关死亡的第3位。肝癌在我国高发，目前我国发病人数约占全球的50％，在恶性肿瘤相关死亡中位居第2位。由此可见，肝癌严重威胁我国人民的生命健康和国民经济的发展。由于肝癌起病隐袭，早期诊断困难，大多数患者在确诊时已达晚期或发生远处转移。目前，手术治疗与肝移植仍然是肝癌主要的治疗手段，介入栓塞化疗、全身化疗及射频消融等治疗手段也被广泛应用，但肝癌的预后仍然较差。迈入21世纪，肿瘤治疗已经入分子靶向治疗(moleculartargetedtherapy)时代，分子靶向治疗是指针对肿瘤发生、发展过程中的关键大分子，包括参与肿瘤发生发展过程中的细胞信号传导和其它生物学途径靶点，通过特异性阻断肿瘤细胞的信号传导，来控制其基因表达和改变生物学行为，或是通过阻力阻止肿瘤血管生成，从而抑制肿瘤细胞的生长和繁殖，发挥抗肿瘤作用。SNHG6基因位于8号染色体上，是小核仁RNAU87(SNORD87)的宿主基因。目前尚未有有关SNHG6功能的报道。我们的研究发现SNHG6在肝癌组织中高表达，且与肝癌肿瘤大小密切相关。近年来，利用RNA干扰技术，将化学合成的小干扰RNA(smallinterferingRNA，siRNA)转导至特定的细胞，沉默相关基因的表达，是研究基因功能最有效的手段之一，也是靶向基因治疗最有吸引力的方法之一。选择特异性的靶基因合成有效的siRNA，并且选择合适转染方式，使其在宿主细胞中高效作用，是实施这一靶向治疗措施的重点。有效的靶向治疗是目前国内外不断在寻找的辅助治疗方法，靶向针对SNHG6基因的siRNA序列对于开发新的抗肝癌基因药物和提高肝癌的治疗效果有重要的意义，具有很大的应用前景和经济价值。技术实现要素：本发明的首要目的在于提供一种能高效地抑制长链非编码RNASNHG6表达和肝癌细胞增殖的siRNA-203。本发明的另一目的在于提供上述siRNA-203的应用。本发明的目的通过下述技术方案实现：一种抑制长链非编码RNASNHG6表达和肝癌细胞增殖的siRNA-203，序列如下所示：正义链：5’-CGGCAUGUAUUGAGCAUAUTT-3’；反义链：5’-AUAUGCUCAAUACAUGCCGTT-3’。所述抑制长链非编码RNASNHG6表达和肝癌细胞增殖的siRNA-203应用于抑制SNHG6基因的表达，进一步研究SNHG6基因的功能。所述抑制长链非编码RNASNHG6表达和肝癌细胞增殖的siRNA-203应用于制备治疗肝癌的药物。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：1、本发明所提供的siRNA-203能高效抑制SNHG6基因的表达，下调程度达到10倍，如图3所示。2、本发明所提供的siRNA-203能有效抑制肝癌细胞的增殖，如图4所示。3、本发明所提供siRNA-203序列对于开发新的抗肝癌基因药物和提高肝癌的治疗效果有重要的意义，其具有很大的应用前景和经济价值。附图说明图1是实施例1中通过荧光显微镜光观察MHCC-LM3细胞转染效率图；其中：A为转染FAM-siRNA白光图(200×)；B为转染FAM-siRNA荧光图(200×)；C为对照组白光图(200×)；D为对照组荧光图(200×)。图2是实施例1中通过流式细胞仪检测MHCC-LM3细胞转染效率图；其中：A为对照组的流式图；B为转染FAM-siRNA流式图。图3是实施例2的siRNA筛选的实时定量PCR结果图；其中，***P<0.001。图4是实施例3的实验组和对照组的CCK-8结果图；其中，***P<0.001。图5是通过AnnexinV-FATC/PI双染流式细胞图仪得到的实验组和对照组的凋亡图；其中，P＝0.035。具体实施方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例1(1)设计和得到siRNA在GenBank(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)里查找SNHG6基因序列(ACCESSIONNR_002599.1)，然后设计针对SNHG6的siRNA。同时设计与目的基因序列无同源性的non-silencingscrambledcontrol(SC)对照19ntsiRNA。选择3条设计得到的siRNA以及设计得到的SC序列进行合成，如下：①siRNA-126：正义链序列为：5’-GAAGGUGUAUGAAAGUCAUTT-3’；反义链序列为：5’-AUGACUUUCAUACACCUUCTT-3’；②siRNA-203：正义链序列为：5’-CGGCAUGUAUUGAGCAUAUTT-3’；反义链序列为：5’-AUAUGCUCAAUACAUGCCGTT-3’；③siRNA-269：正义链序列为：5’-CUGCUUCGUUACCUCAAGUTT-3’；反义链序列为：5’-ACUUGAGGUAACGAAGCAGTT-3’；④SCRNA：正义链序列为：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’；反义链序列为：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3’。上述RNA均由上海吉玛公司化学合成。(2)准备处于对数生长期的MHCC-LM3细胞将高转移人肝癌细胞(MHCC-LM3，购自中科院上海细胞所)接种于含体积百分比10％胎牛血清的DMEM培养基中，在含体积百分数5％CO2的培养箱37℃连续培养，2～3天传代一次，得到处于对数生长期的MHCC-LM3细胞。(3)用FAM-siRNA测试MHCC-LM3细胞的转染效率FAM-siRNA的正义链为：5’-UUCUCCGAACGUGUACGUTT-3’；FAM-siRNA的反义链为：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。A、转染前一天，向6孔板中接种3×105个处于对数生长期的肝癌细胞，每孔加入约2mlDMEM培养基，转染时的细胞密度能够达到50％左右；B、取5μl/孔LipofectamineRNAiMAX(使用前轻轻摇匀)，用250μlOpti-MEMIReducedSerumMedium稀释，轻轻混和后在室温孵育5min；C、取5μl浓度为20nM的FAM-siRNA，用250μlOpti-MEMI稀释，轻轻混和摇匀；D、稀释的LipofectamineRNAiMAX经过5min的孵育后，与稀释的FAM-siRNA轻轻混和，室温静置20min，以形成FAM-siRNA与转染试剂混和物；E、将混和液加入含有细胞及无血清培养液(约2.5ml)的孔中，轻轻摇晃孔板混和；F、在37℃、体积分数为5％CO2的细胞培养箱内培养6h后可将培养基换成含血清的完全培养基，转染完成，利用荧光显微镜和流式细胞仪检测荧光值，分析转染效率。通过荧光显微镜和流式细胞仪检测的结果分别如图1和图2所示，可见通过上述转染方法的转染效率稳定在90％左右。(4)使用步骤(1)设计得到的siRNA和SC分别转染MHCC-LM3细胞，检测SNHG6基因水平的表达，步骤如下：A、实验分组：实验组为siRNA-126组、siRNA-203组和siRNA-269组，对照组为SC组，实验方法同步骤(3)，各组的RNA量均为3μg。空白对照组是没有任何处理的细胞。B、荧光实时定量PCR检测：分别收集各组转染后48h的细胞，按常规方法提取RNA，在去RNase的PCR管中配制如表1所示的反应体系，42℃孵育2min，去除RNA中混有的DNA，得到产物I；然后配制如表2所示的反应体系，37℃孵育15min，85℃孵育5sec灭活逆转录酶，得到cDNA。qRT-PCR的反应体系如表3所示，所用的引物序列见表4；反应条件如下：将反应的八连管置于ABI7500SequenceDetectionSystem(ABI公司)中，反应条件为95℃30sec预变性、95℃5sec变性、60℃34sec退火并延伸，40个循环，荧光信号监测。融解曲线分析：温度60℃-95℃，每0.4℃读1次。定量的方法参考机器运作说明，用2-ΔΔCt(Ct代表循环阈值)法对结果进行相对定量，计算方法为：ΔΔCt＝(Ct(目的基因)-Ct(内参))待测样本-(Ct(目的基因)-Ct(内参))参照样本，实验重复3次。结果如图3所示，只有siRNA-203对SNHG6才具有干扰效果。表15×gDNAEraserBuffer2μlgDNAEraser1μl总RNA1μl无RNA酶的去离子水6μl总体积10μl表2表3表4实施例2实施例的结果证明了只有siRNA-203对SNHG6才具有干扰效果，此实施例表明了siRNA-203下调MHCC-LM3细胞SNHG6表达后所产生的生物学效应。包括细胞增殖和凋亡的变化等。(1)CCK-8法检测细胞增殖情况：按实施例1步骤(3)分别将siRNA-203和SC(RNA用量分别为3μg)转染到MHCC-LM3细胞中，转染结束立即取各组细胞约1×103个，每组平行取3孔，放入培养箱中1、2、3、4、5、6天后加入10μl的CCK-8溶液(同仁化学研究所，日本)，再37℃孵育2h，于450nm处检测各组OD值，计算抑制率。结果显示，与各对照组相比，siRNA-203组可以明显抑制细胞的增殖(表5，图4)。表5CCK-8法检测转染siRNA-203后对MHCC-LM3细胞增殖的影响(2)流式细胞仪检测细胞凋亡情况：转染48h后取各组细胞约1×105个，用4℃预冷的PBS(0.01M、pH7.4)洗涤细胞2次，1ml结合缓冲液(中国南京凯基生物，KGA107)洗细胞2次，1000rpm离心5min，去上清，加入200μl结合缓冲液，重悬细胞后，分别加入5μlAnnexinV和5μlPI(中国南京凯基生物，KGA107)溶液，轻轻混匀，避光反应30min，立即上机检测，Winmdi软件分析结果。结果显示，与各对照组相比，siRNA-203组细胞早期和中晚期凋亡均有增加(图5)。上述实验结果说明了本发明提供的抑制SNHG6表达和肝癌细胞增殖的siRNA-203具有明显的抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡的功能。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。当前第1页1 2 3