布鲁氏菌104M疫苗株敲除VirB2基因的重组菌及应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种布鲁氏菌104m疫苗株敲除virb2基因的重组菌及应用。

背景技术：

布鲁氏菌病是由布鲁氏菌(brucella)感染引起的一种慢性传染性疾病，也是世界范围内危害公共卫生安全的重大人畜共患传染病。在家畜中，牛、羊、猪最常发生，且可传染给人和其他家畜，其特征是生殖器官和胎膜发炎，引起母畜流产、公畜不育和各种组织的局部病灶，患病的牛、羊、猪、犬等也是人类布鲁氏菌病的主要传染源。人感染布鲁氏菌病可以引起发热、关节痛、疲乏无力，部分患者转为难以治愈的慢性病人。布鲁氏菌病在全世界范围内广泛流行，自2000年以后，我国人畜布鲁氏菌病发病率逐年上升，对畜牧业发展带来巨大危害，同时给我国公共卫生安全带来了巨大威胁，防控形势十分严峻。布鲁氏菌病的疫苗免疫是控制布病的有效方法，但是目前我国使用的人布鲁氏菌疫苗104m的安全性还存在很多问题。

全球预防动物布鲁氏菌感染的疫苗主要有s19、rev1和rb51。人用布鲁氏菌疫苗为ba-19(br.abortus缩写)和104m(mockba的缩写)菌苗。1923年美国人buck从牛体中分出一株牛种19号弱毒菌种，制成兽用19活菌苗。1946年苏联研究人员从19号菌种的变异菌落中选出一种纯系光滑型菌体，称之为ba-19菌苗，1951年正式用于人群接种。104m菌苗是上世纪五十年代在苏联中部地区病牛的胎盘中分离出一株牛种菌，该菌种编号为104m(mockba的缩写)。小量豚鼠实验证明该菌种对动物的免疫原性优于ba-19，毒力较ba-19强，在之后的十余年中苏联学者利用实验动物和家畜对104m进行了大量的研究，并少量用于人体的研究，证明它在一定条件下使用，对人和动物有效。我国引用该菌种后，于1959年-1965年进行了系统的研究，证明对人群预防布鲁氏菌病感染有效，优于ba-19菌种。1965年我国正式批准生产人用皮上划痕104m布鲁氏菌活疫苗。但是，使用过程中发现104m菌苗和ba-19一样，能使被接种的机体产生过敏反应，表现局部皮试敏感性增高及出现某些临床症状，存在着一些严重的问题而逐渐不被使用。其主要问题为：一、接种采用皮肤划痕的方法，不仅疼痛而且让人难以接受；二、因其是弱毒疫苗株，接种后副反应也较大，可致接种人员感染；三、免疫后与自然感染无法区分，严重地影响着对布病的诊断与检疫工作。

布鲁氏菌的毒力因子与布鲁氏菌病的发病及免疫机制、治疗及预防等均关系密切。由于现代分子生物学领域的不断进步，对布鲁氏菌毒力因子的认识也逐渐深化。目前公认的布鲁氏菌毒力相关因子有：脂多糖合成基因、bvrr/bvrs双组分调控蛋白基因、 iv型分泌系统、h2o2酶基因、超氧歧化酶基因、外膜蛋白、热休克蛋白等。

布鲁菌在入侵巨噬细胞的早期，被吞噬溶酶体吞噬之后，形成一个布氏小体(bcv)，布鲁氏菌就在bcv内的酸性环境中生存，并在其后与内质网(er)建立广泛的接触，从而获得er的标识，逃逸宿主细胞的免疫识别。目前，研究认为lps通过与巨噬细胞表面的脂筏之间相互作用，从而介导布鲁菌入侵宿主细胞，并且建立一个适合布鲁菌增殖、复制的环境。布鲁菌的lps毒力较弱，进入宿主细胞后仅引起较弱的炎症反应，从而可以逃逸宿主的免疫防御反应。布鲁菌的iv性分泌系统(t4ss)有virb操纵子编码，与布鲁菌的胞内转运、及胞内增殖密切相关。在t4ss的参与下，能有效地阻止溶酶小体与bcv融合，致使布鲁菌能在吞噬细胞中生存，随后通过依赖于t4ss的途径，bcv可持续的与网状内皮系统(endoplasmicreticμlum，er)相互作用，导致er膜在bcv的积聚，使bcv获得er的特性，从而逃逸宿主的免疫机制。而t4ss缺陷的布鲁菌不能调控bcv与er发生相互作用，bcv处于中间、未成熟状态，最终与溶酶体融合，导致降解。据文献报道，t4ss主要在调控布鲁菌从bcv到er的胞内运输过程中发挥作用，一旦布鲁菌到达其复制部位，该分泌系统即被关闭。iv型分泌系统是一种能分泌细菌毒力因子的多蛋白复合物家族，目前已在百日咳杆菌、幽门螺旋菌及军团杆菌中证实了该分泌系统的存在，并已证实该系统分泌了毒力效应子。最近，在布鲁氏菌的基因组中发现了由virb操纵子编码的t4ss的存在，t4ss是由12个不同的蛋白构成的复合体，这些蛋白跨越细菌的细胞壁。virb2位于细菌表面，与细菌侵袭密切相关，发挥关键作用。

基因缺失疫苗作为新型的基因工程疫苗之一，对预防和控制布病具有广阔的研究前景。目前布鲁氏菌弱毒疫苗株是实践应用中控制布鲁氏菌最有效的疫苗，但多数疫苗表现出一定的毒性，当在怀孕前使用会引起流产，并且免疫所产生的抗体难以与自然感染区别。因此，急需研制一种能够用于人的安全、有效免疫的布鲁氏菌疫苗。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供一种布鲁氏菌104m疫苗株敲除virb2基因的重组菌。

本发明提供的重组菌，为降低和/或抑制布鲁氏菌104m中virb2蛋白活性得到的菌。

上述重组菌中，所述降低和/或抑制布鲁氏菌104m中virb2蛋白活性为抑制或沉默布鲁氏菌104m中virb2蛋白编码基因的表达。

上述重组菌中，所述抑制或沉默布鲁氏菌104m中virb2蛋白编码基因的表达为敲除布鲁氏菌104m中virb2蛋白编码基因。

上述重组菌中，所述敲除布鲁氏菌104m中virb2蛋白编码基因为将布鲁氏菌104m中virb2蛋白编码基因替换为抗性基因。

上述重组菌中，所述布鲁氏菌104m中virb2蛋白编码基因替换为抗性基因均采用基因组定点编辑或同源重组的方式进行；

所述同源重组具体为λ-red同源重组或sacb基因介导筛选的同源重组或自杀质粒介导的同源重组。

上述重组菌中，所述布鲁氏菌104m中virb2蛋白编码基因替换为抗性基因为将含有抗性基因的同源重组片段导入布鲁氏菌104m中；

所述含有抗性基因的同源重组片段包括virb2蛋白编码基因上游同源臂、抗性基因和virb2蛋白编码基因下游同源臂。

上述重组菌中，所述含有抗性基因的同源重组片段通过重组载体导入布鲁氏菌104m中；

所述重组载体为将含有抗性基因的同源重组片段插入表达载体得到的载体。

上述重组菌中，所述抗性基因为kan；

所述含有所述抗性基因的同源重组片段的核苷酸序列为序列1。

上述的重组菌在制备如下1)-6)中任一种产品中的应用也是本发明保护的范围：

1)、布鲁氏菌减毒疫苗；

2)、布鲁氏菌疫苗；

3)、促进淋巴细胞增值产品；

4)、促进cd3+、cd4+和/或cd8+细胞增加产品；

5)、提高cd4+细胞与cd8+细胞的数量比产品；

6)、降低细胞因子il-4的含量和/或提高细胞因子il-2的含量和/或降低细胞因子inf-γ含量产品。

本发明另一个目的是提供一种如下1)-6)中任一种产品。

本发明提供的产品，其活性成分为上述的重组菌；

1)、布鲁氏菌减毒疫苗；

2)、布鲁氏菌疫苗；

3)、促进淋巴细胞增值产品；

4)、促进cd3+、cd4+、cd8+细胞增加产品；

5)、提高cd4+细胞与cd8+细胞的数量比产品；

6)、降低细胞因子il-4的含量和/或提高细胞因子il-2的含量和/或降低细胞因子inf-γ含量产品。

本发明的实验证明，本发明经过敲除布鲁氏菌104m毒力基因virb2得到重组菌，通过对其毒性和免疫原性的研究，筛选出毒力减弱且保持免疫原性的布鲁氏菌减毒疫苗候选株△virb2。

附图说明

图1为kan基因的pcr产物。

图2为virb2基因上、下游同源臂的pcr扩增。

图3为融合pcr扩增打靶片段virb2::kan电泳图。

图4为敲除载体菌液pcr的鉴定结果。

图5为突变株的筛选结果。

图6为△virb2缺失株连续稳定传代pcr鉴定结果。

图7为布鲁氏菌特异性引物的pcr鉴定。

图8为不同免疫剂量感染小鼠结果。

图9为菌株免疫后小鼠体温、体重变化。

图10为小鼠感染后脾重及脾指数变化情况。

图11为小鼠感染后平均克脾含菌数。

图12为菌株特异性毒性生存率分析结果。

图13为基因缺失对菌株诱导机体抗体水平消长水平的影响。

图14为小鼠淋巴细胞转化结果。

图15为淋巴细胞转化结果。

图16为抗原特异性脾淋巴细胞增殖实验。

图17为小鼠脾淋巴细胞上清细胞因子含量检测。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

布鲁氏菌疫苗株104m由兰州生物制品有限公司提供；大肠杆菌dh5α(escherichiacolidh5α)、phsg298载体质粒、pmd-19tsimplevector均购自takara公司；胰蛋白大豆肉汤培养基购自美国bd公司。清洁级balb/c小鼠(雌性)购自北京军科院动物中心。

下述实施例1中主要试剂的配制：

(1)amp储存液(100mg/ml)：取1g氨苄西林溶于5ml去离子水中，定容至10ml，用0.22μm滤膜过滤，分装成每管1ml，保存于－20℃冰箱。

(2)kan储存液(100mg/ml)：取1g硫酸卡那霉素溶于5ml去离子水中，定容至10ml，用0.22μm滤膜过滤，分装成每管1ml，保存于－20℃冰箱。

(3)lb液体培养基：称取胰蛋白胨2g，酵母粉1g，氯化钠2g，加蒸馏水200ml混匀，121℃灭菌20min。

(4)lb固体培养基：lb液体培养基加入1.5％琼脂粉，121℃灭菌20min。

(5)tsb液体培养基：称取tsb粉末6g，加蒸馏水混匀定容至200ml，115℃灭菌15min。

(6)tsa固体培养基：tsb液体培养基中加入1.5％琼脂，115℃灭菌15min。

(7)75％甘油：量取75ml丙三醇，加入25ml蒸馏水，充分混匀，121℃灭菌20min。

cck8细胞增殖检测试剂盒购自美国promega公司；鼠源的ifn-γ、il-2、il-4细胞因子检测试剂盒，小鼠淋巴细胞分离液均购自深圳达科为生物技术有限公司；细胞培养液rpmi1640、胎牛血清购自gibco公司；双抗购自hyclone公司；牛血清白蛋白购自北京索莱宝科技有限公司；hrp标记山羊抗小鼠igg购自美国earthox公司；可溶型单组分tmb底物溶液购自天根生化科技有限公司；抗小鼠cd3evirb2cpcyanine5.5、抗小鼠cd4fitc、抗小鼠cd8ape抗体购自美国ebioscience公司；红细胞裂解液、胰蛋白大豆肉汤培养基购自美国bd公司；常规化学试剂购自军事医学科学院条件处，均为国产分析纯。

下述实施例2主要试剂的配制：

(1)包被液：称量na2co31.59g，nahco32.93g，加入900ml蒸馏水，调节ph值至9.6，加蒸馏水定容至1000ml，4℃保存。

(2)洗涤液：1l的pbs液中加入1mltween～20混匀4℃保存备用。

(3)封闭液：称取5gbsa，加入500ml蒸馏水，制备浓度为1％的bsa溶液。

(4)终止液：量取355.6ml蒸馏水，缓慢滴加44.4ml浓硫酸，并不断搅拌，配成2mol/l硫酸溶液。

(5)细胞培养液：400mlrpmi1640、25ml胎牛血清、10ml双抗，加入rpmi1640定量至500ml，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存。

下述实施例检测所需方法

1、活菌计数

将布鲁氏菌104m菌株，转接到无抗性tsb液体培养基中，180rpm/min，37℃空气摇床震荡培养至细菌开始浑浊，用紫外分光光度计测其od600值，分别收集0.3-0.8对数期间的菌液，并将菌液稀释成10¹-10⁶梯度的菌悬液取0.1ml涂在无抗性tsa固体培养基上，计算出每毫升总活菌数。(每毫升总活菌数＝稀释度菌落数×稀释倍数×10)

2、统计学分析

实验数据采用graphpadprism5和spss17.0软件进行统计分析，数据以平均数±标准差表示，组间差异采用单因素方差分析。p<0.05为差异显著，p<0.01为差异极显著，p>0.05为差异不显著。

实施例1、敲除布鲁氏菌疫苗株104m的virb2基因

在本研究中以克隆载体pmd19-tvector(以下简称t载体)作为载体来构建布鲁氏菌的插入失活突变株。在此基础上构建了带有卡那抗性基因的pmd19-t质粒，采用抗性基因替换的方法来构建布鲁氏菌的缺失突变株，这种方法避免了载体的影响，而且只需要一次抗性筛选即可得到突变株。采用融合pcr的方法，将待缺失基因上下游的同源臂与卡那霉素抗性基因融合起来，构建打靶片段，其中抗性基因位于基因上下游同源臂之间。然后将打靶片段连接到t载体，构建突变载体，进而获得布鲁氏菌的缺失突变株。

1、引物的设计与合成

根据布鲁氏菌疫苗株104m全基因组测序结果，设计扩增virb2基因的上、下游同源臂序列。用primer5.0软件遵循gc含量约占50％原则，长度均约为40个碱基。同时引用鉴别布鲁氏菌种属特异性引物，分析并设计特异性引物(见表1)。引物由北京赛百盛生物科技公司合成。

表1为目的基因上、下游同源臂基因及鉴定引物序列

2、敲除载体的构建

以带有kan^r抗性的phsg298质粒为模板，用引物k1、k2扩增得到950bp卡那霉素抗性基因kan(图1)；

以布鲁氏菌104m菌液为模板，使用引物v1、v2扩增得到694bpvirb2基因上游同源臂virb2-u，用引物v4、v5扩增726bpvirb2基因下游同源臂virb2-d(图2，m：dl2000dnamarker；1：virb2基因上游同源臂pcr产物；2：virb2基因下游同源臂pcr产物)；

将virb2-u、virb2-d和kan3个片段化产物(50ng/μl)按1：1：1浓度等量混合作为融合扩增模板进行如下融合pcr反应：融合pcr反应体系为：模板3μl，dntp1μl，q5high-fidelitydnapolymerase0.3μl，5×q5reactionbuffer4μl，ddh2o加至终体积20μl。反应条件：95℃3min，95℃1min，65℃1min，72℃1min，10个循环。得到的pcr反应液命名为pcr-a。将pcr-a反应液稀释10倍作为模板，进行pcr扩增。反应体系：模板3μl，dntp1μl，v1(20μmol/l)1μl，v5(20μmol/l)1μl，lataqdnapolymerase0.5μl，10×buffer2.5μl，ddh2o加至终体积25μl。反应条件：95℃5min，95℃30s，55℃1min，72℃3min，35个循环后72℃10min延伸4℃保存。得到2370bppcr产物(图3)。

将pcr产物进行dna琼脂糖凝胶电泳并切胶纯化，所得到的打靶片段命名为：virb2::kan。

经过测序，打靶片段virb2::kan的核苷酸序列为序列1，其中序列1第1-694位为virb2基因上游同源臂virb2-u、序列1第695-1644位为卡那霉素抗性基因kan、序列1第1645-2370位为virb2基因下游同源臂virb2-u。

将打靶片段virb2::kan直接与pmd19t载体连接，得到重组质粒pmd19t-virb2::kan，转入大肠杆菌中，用v1和v5进行菌落pcr鉴定，鉴定大小为2370bp(如图4)。

经过测序，重组质粒pmd19t-virb2::kan为将序列表中序列1所示的打靶片段与pmd19t载体进行ta连接，得到的质粒。

3、重组菌的获得

将3μl重组质粒pmd19t-virb2::kan(200ng/pl)和48μl104m菌株的感受态细胞，混匀后加入预冷的0.1ml电击杯中，使用bio－radgenepulser电转仪，按1.8kv、25μf、200ohms条件电穿孔转化。电击后立即加入1ml无抗性tsb液体培养液。37℃震动培养6h涂布于kan抗性tsa固体平板，生长的为阳性克隆。

将阳性克隆提取基因组dna，用目的基因virb2鉴定引物279进行pcr验证，以野生型104m菌株作为阴性对照；

结果如图5所示，m：dl250dnamarker；1～5：筛选的重组菌落克隆；6：野生型菌落对照；得到1180bp的阳性克隆为重组菌，其扩增出的片段比野生株扩增出片段(279bp)大，则说明重组菌构建正确，命名为104m△virb2(以下简称△virb2，又称为104m突变株)。

重组菌104m△virb2为将kan基因替换104m基因组中virb2基因得到的重组菌。

4、重组菌的检测

1)遗传稳定性试验

将重组菌104m△virb2在无抗性tsb液体培养基中连续传代，记录并保存每一代菌液，存放到－80℃。

对104m菌株、△virb2菌株第1-20代进行pcr验证(引物名称279)，结果表明布鲁氏菌virb2突变株连续传20代后仍可继续培养，且每代经pcr扩增鉴定均符合预期条带，这说明插入的外源布鲁氏菌基因组上可稳定复制，并且virb2基因在此过程中没有发生回复突变现象，表明该菌株具有良好的遗传稳定性；野生型阴性条带片段大小为：279bp；突变株条带片段大小为：1180bp。(图6，m：dl2000dnamarker；1：野生型菌落对照；2-24：△virb2第1～13代菌株)。

与此同时，对布鲁氏菌virb2基因突变株△virb2第1代、△virb2第10代菌株、△virb2第20代菌株进行测序验证，利用dnaman软件将104m株与virb2基因序列比对，virb2基因与亲本株同源性为100％；kan基因序列与△virb2第1代、第10代菌株△virb2第20代菌株测序结果比对，同源性为100％。

可以看出，抗性基因成功替换了目的基因，并且连续传至第10代也稳定存在。

2)菌株的pcr鉴定

将△virb2菌株连续传代的培养物采用布鲁氏菌鉴定引物进行菌种鉴定(引物名称1101、626)。

结果如图7所示，图7a为引物1101的扩增产物，大小为1101bp，图7b为引物626的扩增产物，大小为626bp；m：dl2000dnamarker；1：野生型菌落对照；2-24：△virb2第1-23连续稳定传代菌株；重组菌△virb2突变株与104m有同样的特征条带，分别为1101bp，626bp。说明筛选到的突变菌株来自出发菌株，而非其他污染。

3)培养特性的鉴定

将布鲁氏菌104m菌株、△virb2菌株第1代、△virb2菌株第10代、△virb2菌株第20代保存菌种接种于无抗性tsb液体培养基中，37℃，180rpm/min空气摇床震荡培养2d，收集菌体，制成2.5×10⁹cfu/ml的菌悬液分别取100μl涂在含有1:1000的品红和硫堇的无抗性tsa固体培养基上。在37℃恒温箱中培养2～3d，观察细菌生长情况。

结果如表2所示，品红平板有细菌生长，硫堇培养基没有细菌生长。

表2菌株培养特性鉴定结果

“+”：有细菌生长；“－”：没有细菌生长

4)菌株的变异检查

用生理盐水将新鲜培养物104m菌株、△virb2菌株第1代、△virb2菌株第10代、△virb2菌株第20代保存的菌液接种于无抗性tsb液体培养基中，制成含菌2.5×10⁹-3.0×10⁹/ml的菌悬液，置90℃水浴30min，观察凝集现象；同时取相同浓度的菌悬液与1:1000三胜黄素水溶液等量混合，于37℃放置24h，观察凝集现象。

结果如表3所示，亲本株104m与△virb2菌株第1代、△virb2菌株第10代及△virb2菌株第20代均没有产生凝集现象。

表3菌株培养特性检查结果

“+”：凝集；“－”：不凝集

实施例2、virb2基因缺失株△virb2对细菌毒力及免疫原性的影响

一、免疫方案

1、免疫剂量的确定

为选取一个合适的感染剂量，将1×10⁵-1×10⁸cfu/ml的104m菌液通过腹腔接种方式感染小鼠，在感染后不同时间点(4-8天)处死小鼠，分离脾脏，涂板计算平均脾脏重量及平均克脾含菌数(脾指数＝脾重(mg)/小鼠体重(g)；克脾菌数＝小鼠脾总含菌数/脾重)。

小鼠免疫104m菌株感染后4-8天观察并处死小鼠，分离脾脏，涂板计数(见图8)。阴性对照组的小鼠脾脏中一直没有分离到细菌。10⁸组在感染后第4天脾脏菌量达高峰，然后开始下降；10⁷组在感染后第6天脾脏菌量达高峰，然后开始下降。10⁸组的小鼠虽没有死亡，但出现明显的精神萎靡，被毛逆立。布鲁氏菌对动物的毒力主要表现为其在体内的生存能力，评价指标主要是比较细菌在体内的定植和复制能力，因此过高或过低的感染剂量均不能正确反映细菌对小鼠的毒力。因此，选取了10⁷cfu/ml的感染菌量。

将布鲁氏菌104m、△virb2菌株涂布于无抗性tsa固体培养基上，置于37℃培养4d后，挑取单菌落接种于无抗性tsb液体培养基中，培养至对数期(od600：0.435)将 菌液5000r/min离心2min后，弃上清，用pbs液洗涤重悬菌体3次，最终将菌体重悬于pbs中，分装1ml在1.5ml离心管中，用pbs稀释含菌为5×10⁷cfu/ml，即为布鲁氏菌104m免疫用疫苗和△virb2菌株免疫用疫苗。

2、动物的免疫及分组

(1)分组方案：6-8周龄balb/c雌性小鼠，各实验(包括安全性实验、体液免疫实验、细胞免疫实验)随机分3组，每组5只。

(2)免疫方案：

104m组：布鲁氏菌104m免疫用疫苗，免疫剂量1×10⁷cfu/只；

△virb2组：△virb2菌株免疫用疫苗，免疫剂量1×10⁷cfu/只；

空白对照组：pbs免疫200μl/只。

(3)免疫方式：小鼠腹腔注射。

二、毒性检测

1、皮毛、体重、体温检测

将104m组、△virb2组和pbs组分别免疫小鼠，观察小鼠皮毛体态、体温并记录2周平均体重、体温。

结果如图9所示，a为免疫后小鼠体重；b为免疫后小鼠体温；结果显示104m组、△virb2组和pbs组小鼠表现正常，无明显异常。△virb2组小鼠与104m组小鼠体重无明显差异，均显著低于空白对照pbs组。而各组体温之间无明显变化。检测各组小鼠平均体重(见图9a)，各组小鼠平均体温变化情况(见图9b)。

2、脾指数和克脾菌数计算

从第1-10周分别取各组小鼠断颈处死，在75％酒精中浸泡5min，无菌取脾称重，计算平均脾指数，脾指数＝脾重(mg)/小鼠体重(g)。

104m组平均脾重相比于空白对照组显著差异(p<0.01)。小鼠脾重和脾脏指数呈正相关，突变株与亲本株组小鼠感染后1周内小鼠脾重变化较大，均在第2周达到最高值，5周后呈下降趋势。第6周后突变株感染的小鼠脾脏重量于空白对照组相比无显著差异(p>0.05)，与亲本株104m相比差异极显著(p<0.01)(见图10a)。进而结合脾指数结果看，△virb2突变株脾指数与亲本株相比显著降低(p<0.01)(见图10b)。

感染后分别于1-10周分别取小鼠，断颈、消毒、取脾、研磨，用pbs液适当稀释脾脏研磨组织梯度涂无抗性tsa固体培养基，培养4～6d，计算长出单菌落。最后计算平均克脾菌数，克脾菌数＝小鼠脾总含菌数/脾重。

通过计数发现，感染10周后，突变株与亲本对照组差异显著(p<0.01)(图11)。pbs空白对照组无细菌生长。在感染后前3周亲本株104m的菌落数与△virb2突变株显著降低，第4周后，亲本株无下降趋势而突变株感染的脾菌数菌呈下降趋势，至 第十周亲本菌株104m和△virb2突变株的平均脾菌数差异显著(p<0.015)，说明突变株△virb2的毒力较亲本104m显著下降。

3、特异性毒性检测

根据《皮上划痕人用布氏菌活疫苗规程－中华人民共和国药典2010年版三部》对新布鲁氏菌疫苗株的鉴定中的特异性毒性试验规定。

104m组：小鼠皮下注射0.5ml1.0×10⁹/ml布鲁氏菌104m免疫用疫苗；

△virb2组：小鼠皮下注射0.5ml1.0×10⁹/ml△virb2菌株免疫用疫苗；

空白对照组：小鼠皮下注射0.5mlpbs。

每组用体重18～20g小鼠6只。

pbs组小鼠全部存活，体重精神状态情况良好。104m组和△virb2组免疫第二天小鼠体重均严重下降，被毛直立，精神状态萎靡，眼睛紧闭。104m组小鼠在第2天、第4天均有死亡情况，第7天时仅有1只小鼠存活。而△virb2组6只小鼠第7天全部存活并体重呈上升趋势，精神状态也逐渐恢复。通过对两组存活率分析结果显示，亲本株和突变株差异显著(p>0.05)(见图12)，说明突变株△virb2的毒力较亲本104m显著下降。

三、免疫原性检测

1、体液免疫检测

在免疫后第1周至第10周断尾采集104m组、△virb2组和pbs组小鼠血，全血室温放置2h后，4℃，8000r/min离心10min，收集上层血清，用间接elisa法检测小鼠血清特异性igg水平，步骤如下：

(1)抗原处理：将布鲁氏菌104菌株接种于无抗性tsb液体培养基中，37℃培养2d，收集菌体，一部分适当稀释涂板计数，其余用pbs液重悬，于80℃加热灭活处理2h。

(2)包被抗原：将处理的重悬菌8000r/min离心2min，弃上清，用包被液充分重悬并稀释到1×10⁷cfu/ml，再包被于96孔elisa平板，100μl/孔，37℃放置2h后4℃包被过夜(包被的elisa板可于4℃保存1周)。

(3)洗板：弃去包被液，拍干，加入250μl洗涤液(pbst)静置1min，弃去洗涤液，拍干，重复3次。

(4)封闭：加入封闭液，100μl/孔，37℃封闭1h。

(5)洗板：重复步骤(3)。

(6)加一抗：将待测血清按1:200到1:12800倍比稀释，100μl/孔，37℃孵育1h。

(7)洗板：重复步骤(3)。

(8)加二抗：将hrp标记山羊抗小鼠igg抗体用pbs按1:5000稀释，100μl/孔， 37℃孵育1h。

(9)洗板：重复步骤(3)。

(10)显色：加入可溶型单组分tmb底物溶液，100μl/孔，37℃避光显色15min。

(11)终止：加入终止液，100μl/孔，轻轻摇晃1min。

(12)读数：先将酶标仪预热15min，在15min内读取elisa平板数值(波长450)。

(13)分析：结果数据处理。

采用elisa方法检测igg抗体效价，取测波长450nm处效价为纵坐标，取样时间为横坐标，绘制抗体消长曲线(见图13)。亲本株与突变株免疫小鼠2周后，小鼠血清中igg水平逐渐上升，到第10周也未见抗体水平明显下降。从变化趋势上看，免疫第8周时，亲本104m和突变株△virb2免疫小鼠的抗体效价与突变株无明显差异(p<0.05)。

2、细胞免疫检测

1)、小鼠脾淋巴细胞的制备

(1)取104m组、△virb2组和pbs组免疫第4周小鼠眼球取血后，断颈处死，用75％酒精浸泡5min，无菌取脾。

(2)无菌条件下在35mm培养皿中加入4ml小鼠淋巴细胞分离液，盖一层200目尼龙筛网，将脾脏放于筛网上，用注射器活塞小心研磨脾脏，直至充分溶解于液体。

(3)吸取脾细胞悬液转移至15ml离心管，并缓缓加入500μlrpmi1640培养液(含10％血清)，室温1200r/min离心10min。

(4)从液面顶部轻轻吸取800μl液体，转移至另一15ml离心管，加入10mlrpmi1640培养液，1000r/min离心5min，弃上清。

(5)加入4ml红细胞裂解液，轻轻混匀，室温静置15min，使红细胞破碎裂解，1000r/min离心5min，弃上清。

(6)加入10mlrpmi1640培养液冲洗，1000r/min离心5min，弃上清，重复2次。

(7)最后将细胞重悬于2mlrpmi1640培养液中，用细胞计数器稀释进行计数，并调整细胞浓度至5×10⁷cfu/ml，备用，为104m组脾淋巴细胞、△virb2组脾淋巴细胞和pbs组脾淋巴细胞。

2)、抗原特异性淋巴细胞增殖试验(cck8法)

分别将5×10⁶个/ml104m组脾淋巴细胞、△virb2组脾淋巴细胞和pbs组脾淋巴细胞稀释液100μl加入到96孔培养板中，加入100μl5×10⁷cfu/ml的灭活抗原(灭活104m)，阴性对照为rpmi1640培养基，空白为不含细胞和抗原的rpmi1640培养基。37℃，5％co2培养箱培养24h。加入20μl的cck8试剂，继续培养2h后，测波长450nm值。

is＝(od－od1640)/(odpbs－od1640)

结果如图16所示，用灭活抗原去刺激104m组脾淋巴细胞、△virb2组脾淋巴细胞和pbs组脾淋巴细胞，经cck8法检测后，计算si；经分析发现，突变株和亲本对照组均能刺激小鼠淋巴细胞增殖，且△virb2突变株刺激小鼠淋巴细胞增殖的能力高于亲本104m。

上述结果表明，△virb2的免疫原性高于亲本株104m。

3)、virb2基因缺失对菌株诱导淋巴细胞转化的影响

(1)将104m组脾淋巴细胞、△virb2组脾淋巴细胞和pbs组脾淋巴细胞分别用rpmi1640培养液稀释至5×10⁶个/ml。

(2)取1ml脾细胞悬液，1200r/min离心10min，吸出900μl上清，剩余液用枪头轻轻混匀。

(3)加入抗小鼠cd3evirb2cpcyanine5.50.25μl、抗小鼠cd4fitc0.5μl、抗小鼠cd8ape0.5μl抗体，4℃避光孵育1h(其中阴性对照组分别加入3种荧光抗体，用于流式细胞仪的校对)。

(4)加入1mlpbs洗涤，1200r/min离心10min，弃上清。

(5)加入1mlpbs洗涤，1200r/min离心10min，弃上清。用300μlpbs重悬。

(6)用流式细胞仪(型号：facscalibur，美国bd公司)进行检测。

104m组脾淋巴细胞、△virb2组脾淋巴细胞和pbs组脾淋巴细胞采用cd3、cd4、cd8荧光标记抗体进行标记，将标记后的细胞采用流式细胞仪进行计数，测定cd3+、cd4+、cd8+的免疫细胞数，并计算cd4+/cd8+的值。结果分析发现，突变株和亲本对照组免疫后小鼠淋巴细胞分化均发生变化，均能引起cd3+、cd4+、cd8+细胞增加(如图15，a为pbs引起的cd4+细胞，b为pbs引起的cd8+细胞，c为104m引起的cd4+细胞，d为104m引起的cd8+细胞，e为△virb2引起的cd4+细胞，f为△virb2引起的cd8+细胞)。从cd4+/cd8+的结果看来(图14)，△virb2突变株显著高于104m亲本株。

上述结果表明，△virb2的免疫原性高于亲本株104m。

4)、细胞因子检测

(1)将104m组脾淋巴细胞、△virb2组脾淋巴细胞和pbs组脾淋巴细胞用rpmi1640培养液(5％血清)稀释至5×10⁶个/ml。

(2)取1.9ml细胞悬液加入24孔细胞培养皿中，加入100μl相应抗原刺激(为5×10⁷cfu/ml，使其每孔抗原终浓度达到与免疫剂量等同)，同时设空白对照组。

(3)将细胞培养皿置于37℃，5％co2培养箱，培养48h。

(4)根据小鼠细胞因子elisa检测试剂盒说明书步骤操作。

(5)统计数据并绘制相关图表。

免疫小鼠后，取脾淋巴细胞培养，体外检测了部分重要的免疫相关细胞因子ifn-γ，il-2，il-4。通过elisa分析inf-γ，il-2和il-4含量。结果表明亲本株104m诱导的细胞因子il-2显著低于δvirb2突变株(图17a)；与亲本株104m相比δvirb2突变株诱导的il-4显著降低(图17b)；亲本株104m诱导的细胞因子inf-γ高于δvirb2突变株(图17c)。