用于分离获得肺脏干细胞的试剂盒及方法与流程

本发明涉及肺脏干细胞分离和移植技术领域，具体涉及用于分离获得肺脏干细胞的试剂盒及方法。

背景技术：

随着空气污染的增加及病毒感染等其他一些因素，肺部的一些疾病如肺纤维化，慢性阻塞性肺病等越来越多的影响了人类的健康，甚至生存。对于这些疾病的治疗，目前最有效的治疗方法是肺脏移植。但是由于可用的供体有限，异体之间的免疫排斥等现实原因，能够接受肺脏移植治疗的病人数量非常稀少。除去肺脏移植，目前还没有有效的治疗手段。

肺脏干细胞属于成体干细胞，在机体内分布广泛，其在细胞移植治疗中具有器官的靶向性，再生能力强，无成瘤性，可用于自体干细胞移植治疗，免疫排斥的风险小，具有很强的可操作性。并且，目前已有研究发现，将远端气管中的肺脏干细胞分离出来，然后在体外大量扩增后移植到免疫缺陷的肺部损伤的小鼠中，移植的肺脏干细胞能够整合到小鼠肺脏中并在损伤部位形成肺泡样的结构。因而，干细胞移植在治疗肺部损伤疾病方面具有非常广阔的前景。但是，长期以来由于技术的限制，很难从成体的组织和器官中分离获得可以大量扩增的肺脏干细胞。

因而，目前的肺脏干细胞分离获得方法仍有待改进。

技术实现要素：

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够有效从成体的组织和器官中分离获得可以大量扩增的肺脏干细胞的手段。

在本发明的第一方面，本发明提供了一种肺脏干细胞分离试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包含：组织消化液；经过辐照处理的胚胎成纤维细胞；以及肺脏干细胞分离培养液，

其中，所述组织消化液包含：

99体积％的pbs；

0.1-2u/mldna酶；

0.1-0.2mg/mli型胶原酶；

0.1-0.2mg/mliv型胶原酶；

0.04-0.1mg/ml分散酶；

0.1-0.5mg/ml蛋白酶xiv；

0.1-3mg/ml链丝菌蛋白酶e；以及

0.2-0.5mg/ml胰酶，

所述肺脏干细胞分离培养液包含：

90体积％的rpmi1640培养基；

10体积％的胎牛血清；

1-3mmol/ll-谷氨酰胺；

0.05-0.15mmol/lβ-巯基乙醇；

100-1000u/ml白血病抑制因子；以及

2-5ng/mlegf生长因子。

发明人惊奇地发现，本发明的试剂盒能够有效用于肺脏干细胞分离，具体地，利用其组织消化液能够有效对包含肺脏干细胞的生物样本进行消化处理，获得单细胞；利用肺脏干细胞分离培养液与单细胞混合，并置于经过辐照处理的胚胎成纤维细胞上进行孵育培养，能够有效获得可以大量扩增的肺脏干细胞，且获得的肺脏干细胞活性好、纯度高、无细菌和支原体污染。此外，本发明的试剂盒成本低，使用方便，易于大量生产利用，并且尤其适用于从微量生物样本中分离获得肺脏干细胞。

根据本发明的实施例，通过下列任意一种方法制备获得所述经过增殖抑制处理的胚胎成纤维细胞：

(1)将胚胎成纤维细胞进行辐照量为30-80gy的辐照处理1-5小时；

(2)将所述胚胎成纤维细胞进行1-30ug/ml丝裂霉素c处理1-5小时。由此，经过增殖抑制处理的胚胎成纤维细胞失去细胞生长活性，有利于对肺脏干细胞进行孵育培养。

根据本发明的实施例，所述胚胎成纤维细胞来源于小鼠，优选e13.5小鼠，

根据本发明的实施例，所述辐照处理是利用细胞辐照仪进行的。由此，辐照效果好，经过辐照处理的胚胎成纤维细胞失去细胞生长活性，但仍能用于对肺脏干细胞进行孵育培养。

根据本发明的实施例，所述组织消化液包含：

99体积％的pbs；

1u/mldna酶；

0.15mg/mli型胶原酶；

0.15mg/mliv型胶原酶；

0.07mg/ml分散酶；

0.3mg/ml蛋白酶xiv；

2mg/ml链丝菌蛋白酶e；以及

0.35mg/ml胰酶，

所述肺脏干细胞分离培养液包含：

90体积％的rpmi1640培养基；

10体积％的胎牛血清；

2mmol/ll-谷氨酰胺；

0.1mmol/lβ-巯基乙醇；

500u/ml白血病抑制因子；以及

3.5ng/mlegf生长因子。

由此，利用该组织消化液对包含肺脏干细胞的生物样本进行消化处理时效果好，能够有效获得单细胞，且对其细胞活性无损伤；而该肺脏干细胞分离培养液能够有效用于肺脏干细胞的孵育培养，从而能够有效获得可以大量扩增的肺脏干细胞，且获得的肺脏干细胞纯度高、无细菌和支原体污染。

在本发明的第二方面，本发明还提供了一种分离获得肺脏干细胞的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：

利用组织消化液将包含肺脏干细胞的生物样本进行消化处理，以便获得单细胞；以及

将所述单细胞与肺脏干细胞分离培养液混合，并置于经过辐照处理的胚胎成纤维细胞上进行孵育培养，以便获得肺脏干细胞，

其中，所述组织消化液包含：

99体积％的pbs；

0.1-2u/mldna酶；

0.1-0.2mg/mli型胶原酶；

0.1-0.2mg/mliv型胶原酶；

0.04-0.1mg/ml分散酶；

0.1-0.5mg/ml蛋白酶xiv；

0.1-3mg/ml链丝菌蛋白酶e；以及

0.2-0.5mg/ml胰酶，

所述肺脏干细胞分离培养液包含：

90体积％的rpmi1640培养基；

10体积％的胎牛血清；

1-3mmol/ll-谷氨酰胺；

0.05-0.15mmol/lβ-巯基乙醇；

100-1000u/ml白血病抑制因子；以及

2-5ng/mlegf生长因子。

发明人惊奇地发现，利用本发明的方法能够有效获得可以大量扩增的肺脏干细胞，且获得的肺脏干细胞活性好、纯度高、无细菌和支原体污染，尤其适用于从微量生物样本中分离获得肺脏干细胞，并且，该方法操作简单、实施成本低，易于推广。

根据本发明的实施例，所述组织消化液包含：

99体积％的pbs；

1u/mldna酶；

0.15mg/mli型胶原酶；

0.15mg/mliv型胶原酶；

0.07mg/ml分散酶；

0.3mg/ml蛋白酶xiv；

2mg/ml链丝菌蛋白酶e；以及

0.35mg/ml胰酶。由此，对包含肺脏干细胞的生物样本进行消化处理的效果好，能够有效获得单细胞，且对其细胞活性无损伤。

根据本发明的实施例，所述肺脏干细胞分离培养液包含：

90体积％的rpmi1640培养基；

10体积％的胎牛血清；

2mmol/ll-谷氨酰胺；

0.1mmol/lβ-巯基乙醇；

500u/ml白血病抑制因子；以及

3.5ng/mlegf生长因子。

由此，该肺脏干细胞分离培养液能够有效用于肺脏干细胞的孵育培养，从而能够有效获得可以大量扩增的肺脏干细胞，且获得的肺脏干细胞活性好、纯度高、无细菌和支原体污染。

根据本发明的实施例，通过下列任意一种方法制备获得所述经过增殖抑制处理的胚胎成纤维细胞：

(1)将胚胎成纤维细胞进行辐照量为30-80gy的辐照处理1-5小时；

(2)将所述胚胎成纤维细胞进行1-30ug/ml丝裂霉素c处理1-5小时。

由此，经过增殖抑制处理的胚胎成纤维细胞失去细胞生长活性，有利于对肺脏干细胞进行孵育培养。

根据本发明的实施例，所述胚胎成纤维细胞来源于小鼠，优选e13.5小鼠。

根据本发明的实施例，所述辐照处理是利用细胞辐照仪进行的。由此，所述经过辐照处理的胚胎成纤维细胞失去细胞生长活性，有利于对肺脏干细胞进行孵育培养。

根据本发明的实施例，于36-38摄氏度，优选37摄氏度的条件下进行所述消化处理1-5小时。由此，消化处理效果好，能够有效获得单细胞，且对其细胞活性无损伤。

根据本发明的实施例，在进行所述消化处理时，针对少于0.1mg的包含肺脏干细胞的生物样本，每个生物样本加入1ml组织消化液；针对不少于0.1mg的包含肺脏干细胞的生物样本，每立方厘米的生物样本加入2.5ml组织消化液。由此，消化处理的效果好，获得的单细胞细胞活性无损伤。

根据本发明的实施例，所述单细胞与所述肺脏干细胞分离培养液的混合比例为300000细胞/2ml分离培养液，其中单细胞数量不足300000时按照300000计算。由此，利用肺脏干细胞的生长扩增，孵育培养的效果好，获得的肺脏干细胞细胞活性好。

根据本发明的实施例，于36-38摄氏度，4％-6.5％co2的条件下进行所述孵育培养2-5天。由此，孵育培养的效果好，获得的肺脏干细胞细胞活性好。

根据本发明的实施例，进一步包括：对所述肺脏干细胞进行细胞鉴定和污染检测。由此，能够进一步确定获得的肺脏干细胞的纯度和质量。

根据本发明的实施例，所述污染检测包括细菌污染检测和支原体污染检测。

根据本发明的实施例，利用免疫荧光染色法检测所述肺脏干细胞的krt5和p63标志物的表达，以便实现所述细胞鉴定。由此，能够进一步确定获得的肺脏干细胞的纯度。

根据本发明的一些具体示例，本发明的分离获得肺脏干细胞的方法可以包括以下步骤：

在无菌实验室中，用组织消化液在37摄氏度下消化活检组织1-5小时，收集消化后的细胞，并添加肺脏干细胞分离培养液后培养在regend-feeder上2-5天；然后通过免疫荧光染色法对培养获得的细胞进行标志物krt5和p63的表达检测，以便进行细胞鉴定，确定获得的细胞为肺脏干细胞，以及分离得到的肺脏干细胞的纯度；对分离得到的肺脏干细胞进行细菌污染和支原体污染的质量检测。

其中，需要说明的是，当使用本发明的试剂盒或方法进行肺脏干细胞分离时，所述的“包含肺脏干细胞的生物样本”的来源不受特别限制，一般动物的包含肺脏干细胞的肺部组织均适用。并且，本发明尤其适用于从微量生物样本中分离获得肺脏干细胞。

需要注意的是，当本发明应用于临床的肺脏干细胞分离培养和移植时，因包含肺脏干细胞的生物样本来源于人，则采样时需要避免对人体的伤害。针对肺严重裂伤无法进行修补者，无远距离转移的肺部恶性肿瘤患者，部分肺结核患者，支气管扩张症患者，肺脓肿患者，间质性肺病患者等，可以在临床治疗对肺部行切除术的同时，选取远离病灶的正常组织作为本发明的“包含肺脏干细胞的生物样本”用于肺部干细胞的分离。但该种方法对于病人的损伤较大，手术的危险性高，难度大，风险高。不适用于正常的健康人群或大多数慢性肺部疾病患者。因而，针对有肺部干细胞存储需求的病人或健康人，可以将其送至支气管镜检查室进行支气管镜检查，同时在支气管镜的活检孔插入一次性细胞刷，在支气管镜监测的情况下将细胞刷送至远端支气管，在清楚地观察了细胞刷周围的气管腔情况后，选择远离病灶的位置，将毛刷在气管壁上轻轻刷一至五次，然后将支气管镜和细胞刷一起从体内取出，将带有少量活检组织的细胞刷头部用无菌剪剪下来，以便获得“包含肺脏干细胞的生物样本”。上述的刷检获取少量活检组织的方法风险较小，对人体的伤害也非常小，具有非常强的可操作性。同时，该方法的适用人群非常广泛，对病人和正常人群都适用。

通过本发明的试剂盒或分离培养肺脏干细胞的方法，可以从非常少量的活检组织中获得可大量扩增的细胞，为肺脏干细胞的移植治疗提供可能。对于患者来说，无需再花大量的时间和财力物力去获得一个异常稀少的配型成功的肺脏进行器官移植便具有恢复健康，延长寿命的机会。因此，相比于器官移植，更多的病人拥有治疗的机会。对正常人来说，可以在身体健康时便可存储下自己的健康干细胞以备不时之需，同时在无法预料的疾病发生时具有更加好的修复作用和疗效，为自己未来的身体健康投下了一份非常有利的保险。也即，本发明的试剂盒和方法可以有效用于对有肺部干细胞存储需求的正常的健康人群或大多数慢性肺部疾病患者，以及有肺脏干细胞移植治疗需求的严重肺部疾病患者进行肺脏干细胞分离培养。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明一个实施例，分离获得的肺脏干细胞的形态观察结果——呈克隆状生长(10倍物镜，10倍目镜)；

图2显示了根据本发明一个实施例，分离获得的肺脏干细胞的p63和krt5标记物免疫荧光染色检测结果；以及

图3-图5显示了根据本发明一个实施例，人肺脏干细胞移植到免疫缺陷小鼠体内后的免疫荧光染色检测结果(图3用0.8倍物镜，10倍目镜观测；图4和图5用40倍物镜，10倍目镜观测)。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

从包含肺脏干细胞的生物样本分离获得肺脏干细胞，具体如下：

1、样本：样本来源于一患有肺纤维化的病人，已需要签署知情同意书。

样本采集过程：将该病人安排进入内窥镜检查室进行远端气管检查，通过内窥镜对其远端支气管(大致位置可为3-8级)进行清楚的观察后，在支气管镜的活检孔插入一次性细胞刷，选择正常部位，尽量远离病灶，将保护毛刷伸出支气管镜末端，再推出内套管，顶掉毛刷末端的保护塞，内套管伸出外套管末端后再推出毛刷，在气管壁上轻轻刷一至五次后将细胞刷抽回保护管中，再将支气管镜和细胞刷一起从体内取出，用无菌剪刀将毛刷前面部分剪掉，伸出毛刷，再将带有少量活检组织的细胞刷头部3-6cm用无菌剪刀剪下来，放置到标本收集管中，以便获得包含肺脏干细胞的生物样本。

2、试剂：

组织消化液，包含：

99体积％的pbs；

0.1-2u/mldna酶；

0.1-0.2mg/mli型胶原酶；

0.1-0.2mg/mliv型胶原酶；

0.04-0.1mg/ml分散酶；

0.1-0.5mg/ml蛋白酶xiv；

0.1-3mg/ml链丝菌蛋白酶e；以及

0.2-0.5mg/ml胰酶，

肺脏干细胞分离培养液，包含：

90体积％的rpmi1640培养基；

10体积％的胎牛血清；

1-3mmol/ll-谷氨酰胺；

0.05-0.15mmol/lβ-巯基乙醇；

100-1000u/ml白血病抑制因子；以及

2-5ng/mlegf生长因子。

经过辐照处理的胚胎成纤维细胞：通过利用细胞辐照仪将e13.5小鼠胚胎成纤维细胞mef进行辐照量为30-80gy的辐照处理1-5小时获得的。

3、方法：

按照以下步骤，从上述获得的包含肺脏干细胞的生物样本(即带有少量活检组织的细胞刷头部)分离获得肺脏干细胞：

在24小时内，将标本收集管于低温环境中运输至无菌实验室。在无菌实验室中，从标本收集管中小心取出带有少量刷检组织的毛刷头(即包含肺脏干细胞的生物样本，其少于0.1mg)，并加入组织消化液1ml，在37摄氏度的环境中放置1-5小时进行消化处理，再加入终止液(其中，1l终止液包含：900mlrpmi1640培养基；以及100ml胎牛血清)终止消化后，在1200rpm的转速下离心5分钟后，去掉上清以去除消化液，再用含有双抗(50u/ml青霉素和50ug/ml链霉素)的磷酸盐缓冲液重悬细胞洗两遍后，在1200rpm的转速下离心5分钟，去掉上清，用肺脏干细胞分离培养液(300000细胞/2ml分离培养液，其中单细胞数量不足300000时按照300000计算混合)重悬细胞，并将细胞铺到经过辐照处理的人胚胎成纤维细胞上，于二氧化碳细胞培养箱(36-38摄氏度，4％-6.5％co2)进行孵育培养，待2-5天后，倒置显微镜下便可以观察到由肺脏干细胞组成的克隆(见图1)。

接着，通过免疫荧光染色法对培养获得的细胞进行标志物krt5和p63的表达检测，以便进行细胞鉴定，确定获得的细胞为肺脏干细胞，以及分离得到的肺脏干细胞的纯度。免疫荧光染色结果显示大量的克隆表达相应的肺脏干细胞标记物krt5(见图2a)和p63(见图2b)。图2c为dapi染色，指示细胞核。

然后，对经过细胞鉴定的分离得到的肺脏干细胞取上清进行进行细菌污染和支原体污染的质量检测。

其中，细菌污染的检测方法如下：取500ul肺脏干细胞培养基的上清加入到干细胞分离培养液中在37摄氏度的温度下培养14天，每天观察培养基的情况，如果依然澄清，说明没有细菌生成，如果培养液出现浑浊，便说明有细菌污染。在我们的检测中，每天观察培养基的情况都为澄清状态，说明没有细菌污染。

支原体污染的检测方法如下：取100ul的肺脏干细胞培养上清液，再利用美国lonza公司生产的lonzamycoalertmycoplasmadetectionkit(货号为lt07-118)，按照说明书的操作进行检测。检测结果最后的值小于0.8，说明没有支原体的污染。

实施例2

按照实施例1的方法，从包含肺脏干细胞的生物样本分离获得肺脏干细胞，其中，区别仅在于：

组织消化液包含：

99体积％的pbs；

1u/mldna酶；

0.15mg/mli型胶原酶；

0.15mg/mliv型胶原酶；

0.07mg/ml分散酶；

0.3mg/ml蛋白酶xiv；

2mg/ml链丝菌蛋白酶e；以及

0.35mg/ml胰酶，

肺脏干细胞分离培养液包含：

90体积％的rpmi1640培养基；

10体积％的胎牛血清；

2mmol/ll-谷氨酰胺；

0.1mmol/lβ-巯基乙醇；

500u/ml白血病抑制因子；以及

3.5ng/mlegf生长因子。

结果，成功获得肺脏干细胞，且分离得到的肺脏干细胞的细胞活性好，纯度高，无细菌和支原体污染。

实施例3

将实施例1获得的肺脏干细胞进行持续扩增，再将表达绿色荧光蛋白标记的慢病毒加入到细胞培养中24小时后，用磷酸盐缓冲液洗掉病毒再继续培养细胞，72小时后，可以观察到几乎所有的细胞都表达绿色荧光蛋白，说明已成功地将细胞标记上了绿色荧光蛋白。然后将表达绿色荧光蛋白的肺脏干细胞重悬在30-70ul的磷酸盐缓冲液中，再通过气道输入到肺脏损伤的免疫缺陷小鼠(在移植细胞前8天，通过气道灌注将博莱霉素输入nod-scid小鼠呼吸道中，引起小鼠肺部损伤，获得肺脏损伤的免疫缺陷小鼠，其中，nod-scid小鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司)的肺脏中，半个月后，再将小鼠肺脏取出，用oct包埋后，再用冰冻切片机切片后进行免疫荧光染色，再在荧光显微镜下拍摄荧光的表达情况。

结果见图3-图5。具体地，干细胞移植到小鼠肺内后分化形成的人体肺脏(见图3，图中信号为gfp信号)，移植后的干细胞表达支气管分泌上皮标记物cc10(见图4，其中a图为cc10，b图为相同区域的gfp信号)，移植后的干细胞表达支肺泡上皮标记物ager(见图5，其中a图为ager信号，b图为相同区域的gfp信号)。

由图3-图5可知，肺脏干细胞移植后，能够在免疫缺陷小鼠的肺脏中分化出人的支气管 和肺泡等组织结构，从而证明了其干细胞特性。由此表明，利用本发明的方法获取的干细胞可用于临床干细胞移植治疗之用。其中，具体的临床治疗方案设计和伦理论证应严格按照卫计委相关规定执行。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。