技术领域本发明属于生物技术领域，涉及一种质粒载体的构建方法，具体是一种外源基因DNA片段克隆到质粒载体相邻或重叠的限制性内切酶酶切位点的方法
背景技术：
当前外源基因DNA片段克隆到质粒载体的常规方法为质粒载体和外源基因DNA片段分别用能切开相匹配末端的限制性内切酶进行酶切，然后两者混合，用DNA连接酶进行连接，转化，再从筛选平板中挑单菌落进行筛选验证。但无法进行双酶切的相邻或重叠的限制性内切酶酶切位点不能作为克隆外源基因DNA片段的选择。另外，质粒载体上酶切位点的顺序决定了外源基因DNA片段克隆到载体的方向，同样制约了使用。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种外源DNA片段克隆到质粒载体相邻或重叠的限制性内切酶酶切位点的方法。本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种外源基因DNA片段克隆到质粒载体相邻或重叠的限制性内切酶酶切位点的方法，该方法的步骤为：将质粒载体分别用限制性内切酶A\\B及A\\C进行双酶切，胶回收后获得AB、BA及AC、CA四个DNA片段。外源基因DNA片段用限制性内切酶B、C分步或双酶切，得到BC片段。AB、BC、CA与AC、BC、BA这三个DNA片段分别进行连接、转化，涂布在筛选平板上培养，再挑取单菌落进行筛选，可以得到外源基因连入质粒载体正反两个方向的重组质粒。上述质粒载体上的限制性内切酶B、C为相邻或重叠的酶切位点。本发明的优点是：使用本发明构建的质粒载体，无法进行双酶切的相邻或重叠的限制性内切酶酶切位点也可作为克隆外源基因DNA片段的选择；另外，外源基因DNA片段连入载体的两个方向也可实现。附图说明图1是本发明的构建流程图。具体实施方式下面结合具体的实施例，进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。实施例1外源基因DNA片段正向连接到质粒载体pUC19相邻酶切位点BamHⅠ、XbaⅠ质粒载体pUC19用ScaⅠ\\BamHⅠ双酶切后可形成约1.7kb、0.9kb大小两片段，分别胶回收，小片段命名为ScaⅠ-BamHⅠ，大片段命名为BamHⅠ-ScaⅠ(大片段BamHⅠ-ScaⅠ在实施例2中备用)；pUC19用ScaⅠ\\XbaⅠ双酶切后可形成约1.7kb、0.9kb大小两片段，分别胶回收，小片段命名为ScaⅠ-XbaⅠ(小片段ScaⅠ-XbaⅠ在实施例2中备用)，大片段命名为XbaⅠ-ScaⅠ。本实验的外源基因DNA片段为保存于本实验室的，从枯草芽孢杆菌基因组DNA扩增的蔗糖酶基因suc。设计引物：SU980:5'GAGGGATCCATGACAGCACATGACCAGGA3'，SU981:5'GAATCTAGAAGATGGCTCAGATTTCACAT3'(下划线分别为BamHⅠ及XbaⅠ酶切位点)，以枯草芽孢杆菌基因组DNA为模板，PCR扩增得到约1.5kb的DNA片段，进行BamHⅠ\\XbaⅠ双酶切、纯化，命名为BamHⅠ-XbaⅠ片段。若假定外源基因DNA片段连入载体的一个方向为正向，则另一个方向为反向。正向连接反应为ScaⅠ-BamHⅠ、BamHⅠ-XbaⅠ、XbaⅠ-ScaⅠ三个片段进行连接、转化，涂布在Amp平板上过夜培养，再挑取单菌落培养，提质粒酶切验证，从而挑选出蔗糖酶基因克隆到pUC19BamHⅠ、XbaⅠ酶切位点的重组质粒，命名为pUC19-sucP。(构建流程见图1)实施例2外源基因DNA片段反向连接到质粒载体pUC19相邻酶切位点BamHⅠ、XbaⅠ质粒载体pUC19及外源基因的酶切处理同上，反向连接反应为ScaⅠ-XbaⅠ、BamHⅠ-XbaⅠ、BamHⅠ-XbaⅠ三个片段进行连接、转化，涂布在Amp平板上过夜培养，再挑取单菌落培养，提质粒酶切验证，从而挑选出蔗糖酶基因克隆到pUC19BamHⅠ、XbaⅠ酶切位点的重组质粒，命名为pUC19-sucN。(构建流程见图1)。