本发明属于生物材料分离纯化技术领域，涉及一种利用膜层析技术纯化α1-抗胰蛋白酶的方法。
背景技术：
α1-抗胰蛋白酶(α1-antitripsin，AAT)是血浆中主要的蛋白酶抑制剂，占血浆总蛋白酶抑制能力的90％以上。它能抑制多种丝氨酸内切肽酶，如中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)、胰蛋白酶、血浆素、凝血酶等，其主要作用是保护机体正常细胞和器官不受蛋白酶的损伤，抑制感染和炎症，维持机体内环境的平衡。血浆中的α1-AAT主要由肝脏产生，其它如肠、肾、脾等也能产生少量的α1-AAT，这些肝外合成的α1-AT在局部组织损伤的调节中起重要作用。
AAT的制备主要是从血浆沉淀CohnIV出发，加入大量缓冲液以充分溶解蛋白，并降低其中的乙醇浓度以稳定目标蛋白，最后经PEG沉淀除去脂蛋白，所得蛋白料液中AAT浓度约为0.1mg/mL，含有一定量的杂蛋白，需要进一步的纯化。CN1900107A采用阴离子交换柱层析的方法进行纯化，CN102993298A采用阴离子交换层析和阳离子交换层析两步柱层析的方法进行纯化，CN102180966A采用两步阴离子交换柱层析方法进行纯化，CN101747432A和CN101275956A采用阴离子交换柱层析和分子筛层析两步层析的方法进行纯化。可见在α1-抗胰蛋白酶的纯化过程中，层析是一种主要的纯化手段，但是目前的层析过程均采用的是柱层析，存在着流速低，压降大，扩散传质阻力大，缓冲液消耗量大，蛋白容易失活等缺点。
因此，在本领域亟需一种更加高效的纯化α1-抗胰蛋白酶的方法。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种利用膜层析技术纯化α1-抗胰蛋白酶的方法，该方法减少了聚集体，降低乙醇对目标蛋白活性的影响，并且缩短了单元操作时间，减少了缓冲液用量，是一种高效经济的蛋白纯化手段。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供一种α1-抗胰蛋白酶的纯化方法，所述纯化方法包括以下步骤：
(1)将Cohn法组份Ⅳ沉淀溶解；
(2)向步骤(1)所得溶解液中加入PEG进行沉淀，取上清液；
(3)将步骤(2)得到的上清液进行微滤；
(4)将步骤(3)所得滤液经过阴离子交换膜层析吸附α1-抗胰蛋白酶，而后利用洗脱液进行洗脱，收集含有α1-抗胰蛋白酶的洗脱液；
(5)利用疏水层析膜色谱对步骤(4)所得含有α1-抗胰蛋白酶的洗脱液进行进一步纯化；
(6)对步骤(5)所得流穿液进行超滤、除菌、冻干得到所述α1-抗胰蛋白酶。
在α1-抗胰蛋白酶的纯化过程中，为减少聚集体和降低乙醇对目标蛋白活性的影响，从体积较大的蛋白料液中快速捕获并分离α1-抗胰蛋白酶对保持其稳定性尤为关键。现有技术中柱层析是蛋白分离纯化的主流工艺，其以扩散为主的传质方式并不适用于处理本料液体系，特别是高流速带来的高反压不利于整个纯化流程。而本发明利用的膜色谱技术融合了柱层析高选择性和膜过滤高通量的特点，以对流为主的传质方式使得膜色谱可以直接、快速捕获微量目标蛋白，能较好地满足当前的纯化需求。并且本发明结合使用阴离子交换膜层析与疏水层析膜色谱，可以提高对α1-抗胰蛋白酶的纯化效率，提高其纯度，并且可以保障α1-抗胰蛋白酶的活性，获得高活性α1-抗胰蛋白酶。
在本发明所述纯化方法中，步骤(1)使用缓冲液将Cohn法组份Ⅳ沉淀溶解。
优选地，所述缓冲液为磷酸缓冲液、Tris缓冲液或醋酸缓冲液中的任意一种，优选为磷酸缓冲液。
优选地，所述缓冲液的pH值为6.5-8.5，例如6.5、6.7、6.9、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4或8.5，优选7.0。
优选地，使用缓冲液将Cohn法组份Ⅳ沉淀溶解后，在0-10℃(0℃、2℃、4℃、6℃、8℃或10℃)下搅拌1-8小时(例如1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时或8小时)，而后离心去除沉淀，得到溶解液。
优选地，所述离心转速为3000-8000转/分钟，例如3000转/分钟、3500转/分钟、4000转/分钟、4500转/分钟、5000转/分钟、5500转/分钟、6000转/分钟、6500转/分钟、7000转/分钟、7500转/分钟或8000转/分钟，优选5000转/分钟。
优选地，所述离心时间为20-60分钟，例如20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟或60分钟，优选30分钟。
优选地，步骤(2)所述PEG的分子量为2000-6000，例如2000、3000、4000、5000或6000，优选4000。
优选地，步骤(2)所述加入PEG的浓度为1-100％，例如1％、3％、5％、8％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，优选20％。
优选地，步骤(2)所述向步骤(1)所得溶解液中加入PEG进行沉淀的方法为：加入PEG，调节pH值至5.0-5.6(例如5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5或5.6)，在0-10℃(0℃、2℃、4℃、6℃、8℃或10℃)下搅拌1-4小时(1小时、1.5小时、2小时、2.5小时、3小时、3.5小时或4小时)后，离心去除沉淀。
优选地，所述离心转速为3000-10000转/分钟，例如3000转/分钟、3500转/分钟、4000转/分钟、4500转/分钟、5000转/分钟、5500转/分钟、6000转/分钟、6500转/分钟、7000转/分钟、7500转/分钟、8000转/分钟、9000转/分钟或10000转/分钟，优选为8000转/分钟。
优选地，所述离心时间为20-60分钟，例如20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟或60分钟，优选30分钟。
优选地，步骤(3)所述微滤所用的微滤膜的孔径为0.08-0.8μm，例如0.08μm、0.1μm、0.12μm、0.15μm、0.2μm、0.22μm、0.3μm、0.35μm、0.4μm、0.45μm、0.5μm、0.55μm、0.6μm、0.65μm、0.7μm或0.8μm，优选0.45μm。
优选地，步骤(4)所述阴离子交换层析膜为具有阴离子交换性能的分离膜。
优选地，所述阴离子交换层析膜的材质为聚砜、聚醚砜、聚偏氟乙烯、聚丙烯腈、醋酸纤维素中的任意一种或至少两种的组合，优选聚醚砜。
优选地，所述阴离子交换层析膜表面有效基团为伯胺基、仲胺基、叔胺基或季铵型基团中的任意一种或至少两种的组合，优选季铵型基团。
优选地，步骤(4)所述阴离子交换层析的上样条件为：样品pH值5.5-7.5(例如5.5、5.8、6.0、6.2、6.4、6.8、7.0、7.2、7.4或7.5)，样品体积流速为4-20MV/分钟(例如4MV/分钟、6MV/分钟、8MV/分钟、10MV/分钟、12MV/分钟、14MV/分钟、16MV/分钟、18MV/分钟或20MV/分钟)，样品缓冲液浓度为20-80mM(例如20mM、25mM、28mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM、75mM或80mM)。
优选地，步骤(4)所述利用洗脱液进行洗脱的条件为：洗脱液pH值6.5-7.5(例如6.5、6.7、7.0、7.2、7.4或7.5)，洗脱液体积流速为4-20MV/分钟(例如4MV/分钟、6MV/分钟、8MV/分钟、10MV/分钟、12MV/分钟、14MV/分钟、16MV/分钟、18MV/分钟或20MV/分钟)，洗脱液盐浓度25mM-1M(例如25mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、200mM、300mM、400mM、500mM、600mM、700mM、800mM、900mM或1M)。
优选地，步骤(4)所述洗脱液为氯化钠水溶液或PBS缓冲液。
在本发明中，MV表示层析膜体积。
优选地，步骤(5)所述疏水层析膜为具有疏水性能的分离膜。
优选地，所述疏水层析膜的材质为聚砜、聚醚砜、聚偏氟乙烯、聚丙烯腈、再生纤维素中的任意一种或至少两种的组合，优选再生纤维素。
优选地，所述疏水层析膜表面有效基团为辛基、丁基、苯基中的任意一种或至少两种的组合，优选为苯基。
优选地，步骤(5)所述疏水层析膜色谱的上样条件为：样品pH值为5.5-6.5(例如5.5、5.7、5.9、6.0、6.2、6.4或6.5)，样品体积流速为4-20MV/分钟(例如4MV/分钟、6MV/分钟、8MV/分钟、10MV/分钟、12MV/分钟、14MV/分钟、16MV/分钟、18MV/分钟或20MV/分钟)，样品缓冲液浓度为20-80mM(例如20mM、25mM、28mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM、75mM或80mM)。
优选地，步骤(5)所述疏水层析膜色谱的洗脱条件为：洗脱液pH值6.5-7.5(例如6.5、6.7、7.0、7.2、7.4或7.5)，洗脱液体积流速为4-20MV/分钟(例如4MV/分钟、6MV/分钟、8MV/分钟、10MV/分钟、12MV/分钟、14MV/分钟、16MV/分钟、18MV/分钟或20MV/分钟)，洗脱液盐浓度25mM-1M(例如25mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、200mM、300mM、400mM、500mM、600mM、700mM、800mM、900mM或1M)。
作为本发明的优选技术方案，所述α1-抗胰蛋白酶的纯化方法具体包括以下步骤：
(1)利用pH值为6.5-8.5的缓冲液Cohn法组份Ⅳ沉淀溶解，在0-10℃下搅拌1-8小时，而后在3000-8000转/分钟的转速下离心20-60分钟去除沉淀，得到溶解液；
(2)向步骤(1)所得溶解液中加入PEG，调节pH值至5.0-5.6，在0-10℃下搅拌1-4小时，3000-10000转/分钟的转速下离心20-60分钟，去除沉淀，取上清液；
(3)利用孔径为0.08-0.8μm的微滤膜将步骤(2)得到的上清液进行微滤；
(4)将步骤(3)所得滤液经过阴离子交换膜层析吸附α1-抗胰蛋白酶，而后利用洗脱液进行洗脱，收集含有α1-抗胰蛋白酶的洗脱液；
所述阴离子交换层析的上样条件为：样品pH值5.5-7.5，样品体积流速为4-20MV/分钟，样品缓冲液浓度为20-80mM；洗脱条件为：洗脱液pH值6.5-7.5，洗脱液体积流速为4-20MV/分钟，洗脱液盐浓度25mM-1M；
(5)利用疏水层析膜色谱对步骤(4)所得含有α1-抗胰蛋白酶的洗脱液进行进一步纯化；
所述疏水层析膜色谱的上样条件为：样品pH值为5.5-6.5，样品体积流速为4-20MV/分钟，样品缓冲液浓度为20-80mM；洗脱条件为：洗脱液pH值6.5-7.5，洗脱液体积流速为4-20MV/分钟，洗脱液缓冲液浓度25mM-1M；
(6)对步骤(5)所得流穿液进行超滤、除菌、冻干得到所述α1-抗胰蛋白酶。
现对于现有技术，本发明至少具有以下有益效果：
本发明采用阴离子交换膜层析与疏水层析膜色谱相结合的膜层析技术进行α-1-抗胰蛋白酶的纯化，相对于柱层析过程，可以提高处理速度，降低处理时间，减少缓冲液的消耗量，也可以减少装置的占地面积，进而提高经济效益。本发明的纯化方法可以使得α1-抗胰蛋白酶的纯度可达95％，总回收率可达83.3％，满足相应的产品纯度要求，并且该发明的纯化方法能够保障α1-抗胰蛋白酶的活性，活性回收率高达91.4％，具有良好的工业化应用前景。
附图说明
图1是本发明纯化α1-抗胰蛋白酶的工艺流程图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
在本实施例中，通过以下方法对α1-抗胰蛋白酶进行纯化，具体包括以下步骤(其工艺流程如图1所示)：
(1)将人血浆低温乙醇沉淀得到的Ⅳ组分沉淀溶解在磷酸盐缓冲溶液中，控制pH值为7.0，在4℃下搅拌6个小时，离心去除沉淀后，离心转速5000转/分钟，离心时间20分钟；
(2)在上清液中加入11％的PEG4000，搅拌1小时后用1M的醋酸调节pH值至5.2，继续在4℃下搅拌30分钟，9000转/分钟转速下离心去除沉淀，离心时间30分钟。
(3)上清液用1M的氢氧化钠调节到pH值为6.5后，用0.22μm的微滤进一步净化；
(4)将步骤(3)所得滤上样至MustangQ阴离子交换膜色谱(16层阴离子交换膜)，阴离子交换膜色谱的上样条件为样品pH值6.5，样品体积流速4MV/min，样品缓冲液浓度为20mM的磷酸盐缓冲液。吸附的蛋白使用浓度1M，pH值7.5的洗脱液洗脱，洗脱液体积流速为12MV/min，洗脱得到含有α1-抗胰蛋白酶的洗脱液，其中α1-抗胰蛋白酶的纯度可以达到58％，α1-抗胰蛋白酶的回收率达到87％；
(5)使步骤(4)得到的含有α1-抗胰蛋白酶的洗脱液继续进入MustangQXT5疏水层析膜色谱，疏水层析膜色谱的上样条件为：样品pH值6.5，样品体积流速为15MV/min，样品缓冲液浓度为20mM(样品的磷酸盐缓冲液)，缓冲液中加入一定量的硫酸铵，硫酸铵的浓度为0.8M。疏水层析膜色谱的洗脱条件为：洗脱液pH值6.5，洗脱液体积流速为20MV/min，洗脱液缓冲液浓度25mM。疏水层析膜色谱洗脱得到的α1-抗胰蛋白酶的纯度可以达到94％，α1-抗胰蛋白酶的回收率达到96.1％。
(6)对步骤(5)所得流穿液进行超滤、除菌过滤，冻干，分装得到α1-抗胰蛋白酶，其纯度可达95％，总回收率可达83.3％，活性回收率为91.4％。
实施例2
在本实施例中，通过以下方法对α1-抗胰蛋白酶进行纯化，具体包括以下步骤(其工艺流程如图1所示)：
(1)将人血浆低温乙醇沉淀得到的Ⅳ组分沉淀溶解在磷酸盐缓冲溶液中，控制pH值为7.0，在0℃下搅拌8个小时，离心去除沉淀后，离心转速8000转/分钟，离心时间30分钟；
(2)在上清液中加入20％的PEG4000，搅拌1小时后用1M的醋酸调节pH值至5.4，继续在10℃下搅拌20分钟，8000转/分钟转速下离心去除沉淀，离心时间30分钟。
(3)上清液用1M的氢氧化钠调节到pH值为5.5后，用0.45μm的微滤进一步净化；
(4)将步骤(3)所得滤液上样至MustangQ阴离子交换膜色谱(16层阴离子交换膜)，阴离子交换膜色谱的上样条件为：样品pH值6.0，样品体积流速10MV/min，样品缓冲液浓度为50mM的磷酸盐缓冲液。吸附的蛋白使用浓度300mM，pH值6.5的洗脱液洗脱，洗脱液体积流速为4MV/min，洗脱得到含有α1-抗胰蛋白酶的洗脱液，其中α1-抗胰蛋白酶的纯度可以达到55％，α1-抗胰蛋白酶的回收率达到86％；
(5)使步骤(4)得到的含有α1-抗胰蛋白酶的洗脱液继续进入MustangQXT5疏水层析膜色谱，疏水层析膜色谱的上样条件为：样品pH值5.8，样品体积流速为20MV/min，样品缓冲液浓度为80mM(样品的磷酸盐缓冲液)，缓冲液中加入一定量的硫酸铵，硫酸铵的浓度为0.8M。疏水层析膜色谱的洗脱条件为：洗脱液pH值7.5，洗脱液体积流速为10MV/min，洗脱液缓冲液浓度200mM。疏水层析膜色谱洗脱得到的α1-抗胰蛋白酶的纯度可以达到93％，α1-抗胰蛋白酶的回收率达到95.4％。
(6)对步骤(5)所得流穿液进行超滤、除菌过滤，冻干，分装得到α1-抗胰蛋白酶，其纯度可达94％，总回收率可达82％，活性回收率为90.6％。
实施例3
在本实施例中，通过以下方法对α1-抗胰蛋白酶进行纯化，具体包括以下步骤(其工艺流程如图1所示)：
(1)将人血浆低温乙醇沉淀得到的Ⅳ组分沉淀溶解在磷酸盐缓冲溶液中，控制pH值为8.5，在10℃下搅拌1个小时，离心去除沉淀后，离心转速3000转/分钟，离心时间60分钟；
(2)在上清液中加入1％的PEG2000，搅拌1小时后用1M的醋酸调节pH值至5.6，继续在0℃下搅拌60分钟，3000转/分钟转速下离心去除沉淀，离心时间60分钟。
(3)上清液用1M的氢氧化钠调节到pH值为6.5后，用0.22μm的微滤进一步净化；
(4)将步骤(3)所得滤上样至MustangQ阴离子交换膜色谱(16层阴离子交换膜)，阴离子交换膜色谱的上样条件为样品pH值7.5，样品体积流速10MV/min，样品缓冲液浓度为40mM的磷酸盐缓冲液。吸附的蛋白使用浓度25mM，pH值7.0的洗脱液洗脱，洗脱液体积流速为20MV/min，洗脱得到含有α1-抗胰蛋白酶的洗脱液，其中α1-抗胰蛋白酶的纯度可以达到50％，α1-抗胰蛋白酶的回收率达到85％；
(5)使步骤(4)得到的含有α1-抗胰蛋白酶的洗脱液继续进入MustangQXT5疏水层析膜色谱，疏水层析膜色谱的上样条件为：样品pH值5.5，样品体积流速为4MV/min，样品缓冲液浓度为20mM(样品的磷酸盐缓冲液)，缓冲液中加入一定量的硫酸铵，硫酸铵的浓度为0.8M。疏水层析膜色谱的洗脱条件为：洗脱液pH值6.5，洗脱液体积流速为4MV/min，洗脱液缓冲液浓度1M。疏水层析膜色谱洗脱得到的α1-抗胰蛋白酶的纯度可以达到92％，α1-抗胰蛋白酶的回收率达到95.1％。
(6)对步骤(5)所得流穿液进行超滤、除菌过滤，冻干，分装得到α1-抗胰蛋白酶，其纯度可达94％，总回收率可达80.8％，活性回收率为90.1％。
实施例4
在本实施例中，通过以下方法对α1-抗胰蛋白酶进行纯化，具体包括以下步骤(其工艺流程如图1所示)：
(1)将人血浆低温乙醇沉淀得到的Ⅳ组分沉淀溶解在磷酸盐缓冲溶液中，控制pH值为7.0，在4℃下搅拌3个小时，离心去除沉淀后，离心转速5000转/分钟，离心时间30分钟；
(2)在上清液中加入50％的PEG6000，搅拌1小时后用1M的醋酸调节pH值至5.0，继续在4℃下搅拌30分钟，8000转/分钟转速下离心去除沉淀，离心时间30分钟。
(3)上清液用1M的氢氧化钠调节到pH值为6.5后，用0.22μm的微滤进一步净化；
(4)将步骤(3)所得滤上样至MustangQ阴离子交换膜色谱(16层阴离子交换膜)，阴离子交换膜色谱的上样条件为样品pH值7.0，样品体积流速4MV/min，样品缓冲液浓度为20mM的磷酸盐缓冲液。吸附的蛋白使用浓度100mM，pH值7.0的洗脱液洗脱，洗脱液体积流速为15MV/min，洗脱得到含有α1-抗胰蛋白酶的洗脱液，其中α1-抗胰蛋白酶的纯度可以达到56％，α1-抗胰蛋白酶的回收率达到85.2％；
(5)使步骤(4)得到的含有α1-抗胰蛋白酶的洗脱液继续进入MustangQXT5疏水层析膜色谱，疏水层析膜色谱的上样条件为：样品pH值6.0，样品体积流速为10MV/min，样品缓冲液浓度为30mM(样品的磷酸盐缓冲液)，缓冲液中加入一定量的硫酸铵，硫酸铵的浓度为0.8M。疏水层析膜色谱的洗脱条件为：洗脱液pH值6.5，洗脱液体积流速为10MV/min，洗脱液缓冲液浓度100mM。疏水层析膜色谱洗脱得到的α1-抗胰蛋白酶的纯度可以达到92％，α1-抗胰蛋白酶的回收率达到95.8％。
(6)对步骤(5)所得流穿液进行超滤、除菌过滤，冻干，分装得到α1-抗胰蛋白酶，其纯度可达93％，总回收率可达81.6％，活性回收率为90.8％。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。