一种促进哈茨木霉根表定殖的蛋白及其应用的制造方法与工艺

本发明涉及一种促进哈茨木霉根表定殖的蛋白及其应用，属于应用微生物技术领域。技术背景HFB蛋白是丝状真菌特有的疏水性小蛋白。在有关曲霉、木霉的报道中，提及该蛋白家族成员与真菌孢子表面疏水结构的形成、菌丝的延伸和疏水材料表面的粘附作用等有关，但未见其参与调控木霉定殖植物根表的报道。随着微生物技术的发展，经人工筛选和驯化改良的外源微生物及其制剂在农业生产、环境污染修复等领域中广泛应用。但由于土壤和作物种类的差异，土壤温度、湿度的变化以及土著微生物的存在显著影响着外源微生物的定殖与扩增，从而使得外源微生物的作用效果不明显，严重制约了功能微生物的进一步应用。哈茨木霉(Trichodermaharzianum)SQR-T037是我国科学家分离得到并已实现商品化应用的一株兼具生防和促生功能的植物有益菌。由于在田间环境下存在大量的土著微生物与SQR-T037竞争养分、生存空间等，SQR-T037及其相关产品的田间应用效果并没有像实验室条件下那么明显与稳定。因此，大幅提高木霉SQR-T037菌株在植物根部的定殖量，使其快速成为众多根际微生物中的优势种，是发挥其生防与促生功能的保障，对木霉及其相关产品的意义重大。

技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种新的HFB蛋白及其编码基因。本发明发现了参与调控哈茨木霉定殖作物根部的相关基因(蛋白)。本发明的另一目的在于提供HFB蛋白在促进哈茨木霉根表定殖中的应用。本发明的又一目的在于提供HFB蛋白在制备以功能木霉为主的微生物菌肥中的应用。本发明的目的通过以下技术方案实现：一种HFB蛋白，该HFB蛋白为哈茨木霉HFB蛋白家族成员，包括HFB4蛋白和HFB8蛋白中的至少一种，所述的HFB4蛋白具有如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列，所述的HFB8蛋白具有如SEQIDNO.3所示的氨基酸序列。上述HFB蛋白的编码基因，其在于所述HFB4蛋白的编码基因具有如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列；所述HFB8蛋白的编码基因具有如SEQIDNO.4所示的核苷酸序列。含有上述HFB蛋白编码基因的重组表达质粒、转基因细胞系或转基因工程菌。上述的重组表达质粒，是将如SEQIDNO.2所示的HFB4蛋白编码基因hfb4或如SEQIDNO.4所示的HFB8蛋白编码基因hfb8插入到酵母表达质粒pPICZαA的EcoRI和XbaI酶切位点之间得到的。该重组表达质粒具体是采用以下步骤制备：以哈茨木霉菌株SQR-T037的cDNA为模板分别设计引物进行PCR扩增，将得到的PCR扩增产物和酵母表达质粒pPICZαA分别用EcoRI和XbaI酶切连接后分别得到表达HFB4蛋白和HFB8蛋白的酵母表达质粒pPICZαA::HFB4和pPICZαA::HFB8；克隆hfb4基因的引物如下：上游引物hfb4-F:GGCTGAAGCTGAATTCACTCAGGAGCACCAGTTCGA(SEQIDNO.5)下游引物hfb4-R:GAGTTTTTGTTCTAGAATCTGGGGAAGGGCATCCTG(SEQIDNO.6)克隆hfb8基因的引物如下：上游引物hfb8-F:GGCTGAAGCTGAATTCGCTGTCTGCCCTGATGGTG(SEQIDNO.7)下游引物hfb8-R:GAGTTTTTGTTCTAGAATGTGGGTTCCAGCGGGGTT(SEQIDNO.8)。上述的转基因工程菌，是将上述的重组表达质粒用SacI单酶切线性化后转化入感受态毕赤酵母KM71H细胞中得到的可分别表达HFB4蛋白和HFB8蛋白的酵母工程菌。上述的HFB蛋白在促进功能木霉根表定殖中的应用。本领域技术人员研究发现了HFB蛋白参与调控功能木霉在植物根表定殖方面的应用。具体是HFB蛋白的正调控功能的应用；所述正调控功能是将HFB蛋白在酵母中表达后外源添加入作物种植体系中，快速增加功能木霉菌的定殖量。所述的作物是番茄或黄瓜；所述的功能木霉为哈茨木霉。上述的HFB蛋白在制备以功能木霉为主的微生物菌肥中的应用。本发明人通过对哈茨木霉菌株SQR-T037(是一株商业化应用且有专利保护的菌株，保藏号为CGMCCNO.3308)的基因组分析与注释，找到HFB蛋白家族，其中包含HFB4和HFB8两位ClassII成员，其在SQR-T037与番茄苗共培养时表达量出现显著波动。我们通过基因克隆和异源表达的方法使得HFB4和HFB8在毕赤酵母(Pichiapastoris)中高量表达；并通过融合蛋白技术分别用UV型绿色荧光蛋白(GFPuv)和粉色荧光蛋白(mRFP)标记HFB4和HFB8，获得了可追踪的HFB融合蛋白。结果发现，带荧光标记的HFB可以迅速地附着到植物根系表面，自组装地形成特殊的蛋白包膜，改变植物根系表面的亲水性。本发明对所得到的不带荧光标记的HFB蛋白采用TALONmetalAffinity树脂纯化，并进行了定殖测试，证明通过外源添加HFB蛋白可促进哈茨木霉快速高效地定殖于植物根表。本发明所用的毕赤酵母菌株为KM71H，质粒为pPICZαA，其包含一个甲醇诱导型启动子AOX1、一个α-Factor信号肽、一个博来霉素筛选标记和一个6×His标签。我们将质粒用EcoRI和XbaI双酶切，然后用Infusion同源重组酶将克隆得到的木霉SQR-T037的HFB4和HFB8基因(不含内含子)分别插入到质粒pPICZαA内，并通过电击转化方式整合到酵母KM71H基因组中，获得高效表达HFB4和HFB8的酵母工程菌，分别命名为KM71H-HFB4和KM71H-HFB8。所述的HFB蛋白生产方式如下：1)将工程菌KM71H-HFB4和KM71H-HFB8少量菌体分别接种到含100μg·ml-1博来霉素的BMG液体培养基中(200ml)，黑暗条件下28℃、250rpm培养24小时，8000rpm离心5分钟去除培养基，获得大量菌体；BMG液体培养基配方如下：100mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34％酵母氮源(YNB，w/v，g/ml，即每100ml培养基中含1.34g酵母氮源)，4×10–5％Biotin(w/v，g/ml)，1％甘油(w/v，g/ml)。2)将获得的菌体重新接种至含0.5％(v/v)甲醇的BMM液体培养基中，起始OD600＝30，黑暗条件下28℃、250rpm培养，每24小时添加一次甲醇(按照培养基体积的0.5％的量添加)，72小时后8000rpm离心5分钟去除菌体，获得HFB4和HFB8蛋白发酵液；BMM培养基配方如下：100mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34％酵母氮源(YNB，w/v)，4×10–5％Biotin(w/v)，0.5％(v/v)甲醇。3)取少量蛋白溶液用于SDS-PAGE蛋白电泳和WesternBlot验证，确认无误后采用TALONmetalAffinity树脂纯化，最后用Vivaspin蛋白浓缩超滤离心管置换溶剂，将纯化后的蛋白溶解于100mM的磷酸钾溶液中(pH6.6)，BCA方法测定蛋白含量在0.1-0.4mg·ml-1，-20℃保存待用。本发明的有益效果：本发明首次发现了HFB小蛋白家族中的HFB4蛋白和HFB8蛋白及其参与调控哈茨木霉在植物根表定殖的功能，研究表明，该家族蛋白的存在对哈茨木霉在根表的定殖具有显著的正调控作用。通过酵母异源表达、融合蛋白等技术使得该类蛋白在毕赤酵母中表达并分泌。蛋白经纯化富集后，外源添加入水培种植体系中，可在根表形成特殊的蛋白包膜，改变根表的亲/疏水性，促进植物生防促生菌哈茨木霉的快速定殖，较不添加蛋白的对照组48小时内定殖量增加110％-180％。本发明可有效解决以木霉为主的微生物制剂及相关生物肥料应用中功能菌定殖效果不佳、田间应用效果不稳定的问题。附图说明图1酵母工程菌表达的HFB蛋白电泳图(左)和WesternBlot印迹(右)图2多通道ChemiDocImager下被荧光标记HFB蛋白附着的番茄根系其中，CK为添加不带荧光标记的HFB4对照；HFB4::GFPuv为添加HFB4::GFPuv荧光蛋白的处理；mRFP::HFB...