一种红斑丹毒丝菌抗原蛋白及应用的制作方法

本发明涉及家畜基因工程疫苗领域，具体涉及一种红斑丹毒丝菌抗原蛋白及应用。

技术背景

猪丹毒是上世纪90年代猪三大传染病之一，随着弱毒和商业化疫苗的使用逐渐得到了有效的控制。但2010年以来，猪丹毒在我国部分省市发生流行。2012年猪丹毒病例已逐渐增多，至2013年，在我国湖南、湖北、江西、广西、四川、广东、浙江等多个省份均出现了猪丹毒的大范围流行，给猪场造成了巨大的经济损失。

以往青霉素是可以作为特效药来治疗猪丹毒的，世界上也没发现一株耐青霉素的红斑丹毒丝菌。然而，湖南动物疾病中心何世成等人在这次猪丹毒爆发中分离到了进行3株耐青霉素红斑丹毒丝菌。本实验室对湖北地区的临床分离红斑丹毒丝菌的耐药性分析表明，对常用的卡那霉素、链霉素、阿米卡星、多粘菌素B、万古霉素、庆大霉素6种抗生素耐药率为100％。

目前已有足够的流行病学资料证实，红斑丹毒丝菌已经对我国的养殖业和人民健康构成了严重的威胁。

红斑丹毒丝菌商业化疫苗主要有灭活疫苗C43-5、弱毒疫苗G4T10和GC42。使用灭活疫苗对同源的红斑丹毒丝菌具有较好的免疫保护，但由于不同菌株的毒力基因表型存在较大差异，对于异源菌株的保护力不佳，免疫持续期可达6个月。猪丹毒弱毒苗用于3月龄以上的猪，免疫后7d产生免疫力，可持续6个月。弱毒疫苗可使猪得到保护，但不能清除定居在扁桃体或关节里的红斑丹毒丝菌,也不能清除隐性感染猪扁桃体内的细菌。另外，母源抗体和药物很容易干扰疫苗的效力，如果弱毒活菌株返毒，其对易感猪群存在很大的风险。

鉴于此，本发明着手于红斑丹毒丝菌保护性抗原的研究，寻找能提供高效免疫力、生物安全好的抗原成分，保护猪抵抗流行毒株的侵袭。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供了一种红斑丹毒丝菌抗原蛋白，其序列为SEQ ID NO.2所示。其对应的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

本发明最后一个目的在于提供了一种红斑丹毒丝菌抗原蛋白在制备猪丹毒疫苗中的应用，该蛋白无菌处理后与佐剂按比例混合，肌肉免疫仔猪，发现其可有效提供攻毒后仔猪存活率，加快仔猪恢复速度。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种红斑丹毒丝菌抗原蛋白，其序列为SEQ ID NO.2所示。可利用常规方案，例如合成，原核表达等方式获得该蛋白。

SEQ ID NO.2所示氨基酸序列对应的核苷酸序列也为本发明的保护范围，优选的所述的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

一种红斑丹毒丝菌抗原蛋白在制备猪丹毒疫苗中的应用，包括利用该蛋白无菌处理后与佐剂按比例混合，制备为猪丹毒疫苗；或是该疫苗与其他已知疫苗组合制备为多联疫苗。

与现有疫苗相比，本发明具有以下优点：

弱毒苗存在毒力返强的危险，会对易感猪群造成巨大的威胁，而且毒力减弱的机理不是很清楚。灭活苗可以为同源红斑丹毒丝菌提供较好的保护效果，但不同菌株的毒力基因存在差异，其对异源菌株的保护效果很弱。本发明提供的亚单位疫苗具有好的保护效果，生物安全性高。

附图说明

图1为实施例1中制备的PotA蛋白检测示意图。

图1A重组抗原纯化SDS-PAGE电泳；图1B Western-blot分析示意图。

图2重组抗原PotA蛋白免疫小鼠后的抗体水平。

图3重组抗原PotA蛋白诱导小鼠抗体IgG亚类测定。

图4抗原PotA蛋白免疫小鼠后2LD100攻毒保护力效果试验。

图5 PotA免疫仔猪后体温变化。

图6 PotA免疫仔猪后血清特异性抗体水平变化规律。

图7 PotA免疫仔猪后3LD100攻毒保护力试验

具体实施方式

本发明所述试剂如未特别说明，均购自商业渠道或为本领域的常规配制试剂。所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案。

实施例1：

红斑丹毒丝菌抗原蛋白(本发明或称PotA蛋白)的制备：

本发明实施例以原核表达为例，对该蛋白的的获得进行说明：

大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/pET-28a-PotA的构建，表达并纯化目的蛋白

1)构建表达载体利用BamHI+HindⅢ购自宝生物(大连)有限公司产品)同时酶切PCR扩增的PotA基因片段(SEQ ID NO.1所示)和pET-28a(+),回收PCR片断以及表达载体质粒，将酶切后PotA基因片段与酶切后pET-28a(+)连接，构建出pET-28a-PotA。转化到DH5a感受态，利用BamHI+HindⅢ酶切提取的质粒pET-28a-PotA,酶切后应出现预期大小的外源片段和载体片断即为正确的重组质粒。重组质粒pET-28a-PotA的双酶切鉴定结果见图2，双酶切的条带符合PotA的大小。将重组质粒pET-28a-PotA转化至感受态细胞BL-21(DE3)，采用菌落PCR的方法，挑选阳性克隆扩大培养，提取质粒双酶切鉴定同时将质粒送上海生工生物公司测序，比对正确，即为PotA的表达菌株。

2)表达、纯化目的蛋白将大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/pET-28a-PotA接种于含有25μg/ml Kan的3mL LB液体培养基，于37℃摇床培养。从培养好的菌液中取100μL接种于10mL含有25μg/ml Kan的新鲜LB液体培养基中，于37℃振荡培养约3h，至OD600达到0.8时，加IPTG至终浓度为0.2mmol/L，继续培养3h后收集菌体。

将诱导后的重组大肠杆菌8000r/min离心15min。沉淀用1/10体积的50mM Tris-HCl(pH8.0)重悬，并加入溶菌酶至终浓度1mg/ml，冰浴30min。冰浴条件下进行超声碎破，直至菌液不再粘稠，12000r/min，离心30min。将沉淀用2M尿素洗俩次，用8M尿素重悬沉淀，放入透析袋中，进行梯度透析，直至透析袋中的缓冲液完全替换成50mM Tris-HCl(pH8.0)，重组抗原蛋白PotA(包括SEQ ID NO.2所示序列)进行SDS-PAGE电泳分析及纯化结果见图1A，条带符合PotA蛋白的大小40KD。用Western-blot方法(见上述《分子克隆手册》)分析重组抗原蛋白PotA的免疫原性，结果如图1B所示PotA蛋白可以和PotA免疫鼠阳性血清发生特异性反应，是一个十分重要的保护性抗原，用于以下实施例。

实施例3：亚单位疫苗成分及常规检验

1)疫苗成分：PotA蛋白溶液、佐剂(武汉科前生物有限责任公司)疫苗乳化：PotA蛋白与佐剂按1：1体积混合乳化。使抗原蛋白的终浓度为1mg/ml，用于以下实施例。

2)常规检验：

疫苗性状检测：乳化后疫苗滴入清水中，第一滴散开，第二滴油珠状，晃动液面油珠不破乳。

无菌检测：取少许疫苗涂布TSA平皿，37℃温箱培养18小时无菌落长出。

稳定性检验：3000rpm/min离心15分钟，根据分离情况判定乳化是否稳定，离心后乳化疫苗未分层；

实施例4：重组抗原蛋白小鼠免疫保护力试验

1)实验方案

实验动物：4周龄雌性BALB/c小白鼠，购自湖北省疾病预防控制中心。

攻毒菌株：红斑丹毒丝菌SE38株(以下简称SE38，李敬涛，湖北部分地区红斑丹毒丝菌分离株耐药性分析，养殖与饲料[J].2015.2，11-14)。

免疫方法：将本发明制备的疫苗按100μl/只剂量皮下免疫试验小鼠；2周后用相同方法制备的疫苗加强免疫1次(免疫剂量为100μl/只)。

实验分组：取4周龄，体重18±2g雌性BALB/c小白鼠20只，随机分为2组:疫苗I组(PotA)、佐剂和Tris-HCl混合对照组，每组10只。期间每周断尾取血，用于血清特异性抗体的监测。

2)血清特异性抗体的检测

使用纯化的重组抗原PotA100ng/孔于4℃过夜包被酶联板，用间接ELISA的方法检测分离血清的抗体水平，见图2。免疫后对小鼠的抗体水平进行监测发现：首次免疫后第一周就可以诱导小鼠产生较高的抗体水平，有2⁸。在二免14天时小鼠体内抗体水平达到一个较高的水平，阳性血清的平均抗体效价可以达到2¹⁵。

3)重组抗原诱导小鼠抗体IgG亚类测定

将免疫2周后的小鼠采血分离血清，倍比稀释后取100μl加入酶联板，37℃反应60min。洗板3次后每个稀释度的血清分别加入体积比1:5,000稀释的羊抗鼠IgG1–HRP、IgG2a–HRP，37℃反应30min。洗板5次后加入100μl底物液，避光显色10min后加入0.25％HF终止反应，于630nm读数，见图3。可见PotA在小鼠体内诱导产生的抗体主要是lgG1，IgG2a明显低于lgG1。

4)免疫鼠攻毒后保护情况

二免14天后的小鼠进行攻毒试验，攻毒剂量为2LD100的SE38。连续观察一周，记录小鼠的临床特征及死亡情况。

结果如下：

SE38株的绝对致死菌量LD100为5CFU，免疫小鼠攻毒结果见图4，表明PotA抗原可以保护小鼠有效抵抗毒株SE38的感染，小鼠存活率是60％，存活的6只小鼠无临床症状；而佐剂和Tris-HCl混合对照组小鼠全部死亡，存活率是0，由抗体水平和免疫组小鼠存活率可以看出PotA蛋白加佐剂制成的疫苗对小鼠有一定的保护力。

实施例5：重组亚单位疫苗仔猪免疫保护力试验

1)实验方案

实验动物：4周龄红斑丹毒丝菌检测阴性断奶仔猪，购自武汉市黄陂区青草湖天种猪场。

攻毒菌株：同实施例4使用的攻毒菌株

实验分组：4周龄断奶仔猪分为5组，疫苗组(G4T10)、免疫1组(PotA)、免疫2组(PotA)、佐剂和Tris-HCl混合对照组，每组6头，疫苗组、免疫1组、佐剂和Tris-HCl混合对照组用于攻毒，免疫2组用于检测抗体水平，连续检测8个月。颈部和臀部多点注射，每2周免疫1次，共2次，免疫剂量为2ml/头，疫苗组、免疫1组、佐剂和Tris-HCl混合对照组每周耳静脉取血，用于血清特异性抗体的检测；免疫2组每个月采血一次，用于血清特异性抗体的检测。

2)血清特异性抗体的检测

使用纯化的重组蛋白PotA100ng/孔包被酶联板，4℃过夜。用间接ELISA检测仔猪体内的抗体水平。

3)免疫后仔猪临床症状

首次免疫后每天监测体温，连续检测7天，观察免疫后仔猪的采食及精神情况。

4)免疫猪攻毒后保护情况

二免14天后进行攻毒试验，攻毒剂量为9×10⁸cfu/头剂量的SE38株菌，是致死剂量LD100的3倍。连续观察14天，记录临床特征及死亡情况。

5)免疫效果评估

免疫后仔猪没有临床发病症状，免疫1组、佐剂和Tris-HCl混合组免疫后第二天体温会上升，第三天体温基本恢复正常，期间仔猪采食量未见减少，体温的短暂上升对仔猪的生长影响较小，体温变化见图5；

对仔猪免疫PotA后的抗体水平检测表明：首次免疫后第一周诱导的抗体水平较弱，平均有2⁴，随后几周诱导的抗体水平逐渐升高，在第四周可高达2²⁰，即可为仔猪提供保护力，见图6；免疫后，PotA免疫仔猪全部健康，无发病症状，注射部位没有红色斑块；攻毒后，免疫1组有3头仔猪在7天内死亡，存活3头，见图7。将健康存活仔猪处以安乐死进行剖检分菌，肾、脾、肝、心都没有分离到SE38菌株。佐剂和Tris-HCl混合组仔猪全部发病，精神萎靡，行动迟缓，皮肤的疹块呈“打火印”状，陆续有仔猪死亡，最后全部死完。本体动物的实验结果进一步说明本发明制备的PotA亚单位疫苗可以为仔猪提供较好的保护效果。

对免疫2组进行8个月的抗体水平检测，在首次免疫后第28～90天为抗体高峰，抗体效价平均值在2²⁰左右，以后逐渐下降，至180天，抗体水平仍然较高，抗体效价平均值大于2⁹，210天虽能检测到抗体，但抗体水平较低，抗体效价平均值只有2⁶，说明抗体水平至少可维持6个月。

实施例6：安全性检验

为了保证试验数据的准确性和检验疫苗制品质量问题，采用3批次疫苗制品对35日龄仔猪和妊娠70日龄母猪进行安全性检验。01批次是保存1一个月的疫苗制品，02批次是保存2个月的疫苗制品，03批次是新鲜制备的疫苗。

1.实验方案：

1)将3批本发明的亚单位疫苗分别通过臀部肌肉接种35日龄健康断奶仔猪，每批疫苗注射5头，每头接种2ml，观察14日，并测定体温。

2)将3批本发明的亚单位疫苗分别通过臀部肌肉接种妊娠70日的健康母猪，每批疫苗注射5头，每头以1次单剂量2ml接种，观察其临床表现和产仔情况。

2.试验结果

2.1本发明的亚单位疫苗对断奶仔猪1次单剂量接种的安全性

将3批本发明的亚单位疫苗以2ml分别接种35日龄健康断奶仔猪后，每批疫苗注射5头，仔猪体温、呼吸情况、精神状况、食欲等均正常，未见异常变化。说明该疫苗制品对断奶仔猪安全性很好且保存期内的疫苗未变质(表1)。

表1 本发明的3批亚单位疫苗接种35日龄断奶仔猪后的平均体温

2.1本发明的亚单位疫苗对怀孕动物(妊娠母猪)接种的安全性(产子情况)

结果3批本发明的亚单位疫苗接种的健康妊娠70日母猪在整个观察期间体温、呼吸、食欲、精神状态都正常(表2)，产仔正常，没有出现流产、死胎等情况(表3)。

表2 3批本发明的亚单位疫苗一次单剂量接种健康妊娠母猪后的平均体温变化

表3 健康妊娠母猪一次单剂量接种本发明的亚单位疫苗后的产仔情况

本亚单位疫苗对我国流行血清型的红斑丹毒丝菌能提供50％的保护率，且对扁桃体菌株也有较高的防控能力，具有抵抗其它型红斑丹毒丝菌的潜力，经过添加其他蛋白有望获得更好的效果，可以用于我国猪丹毒的防制。

SEQUENCE LISTING

<110> 一种红斑丹毒丝菌抗原蛋白及应用

<120> 华中农业大学

<130> 华中农业大学

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1044

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggaagcat taattcaatt tacaaatatt gtgaagagct ttgaagatca acttgtctta 60

aaaggcatca acttggatat ctttgagaat gagtttgtga cactacttgg cccttcaggc 120

tgtggaaaaa caacactttt aagaatctta ggtggatttt tagagcagag ttctggtgaa 180

gtatatttcg aaggtattga gatttcgaaa ttagcccctt ataaacgtga gattaataca 240

gtttttcaac ggtatgcact ttttccacat atggatgttt atgacaacat tgcatttggt 300

cttcgtatca agaaaaccaa tgaagatatt atcaaacaaa aagttgagaa gatgttgaat 360

attgttggct taaacggttt tgaacaccgt cctgtcacac tcttatctgg tggtcaacaa 420

caacgtgttg cgattgctcg agcacttgta aatgaaccga tggtccttct gcttgatgaa 480

cccttaggtg cattggattt aaaaatgcgt aaagaaatgc aacgtgaact taaggaaatc 540

caagaaaatg tggggattac ctttgtctat gttacccatg atcaagaaga agcgttaacc 600

atgtcagata aaattgtcgt gatgaatgaa ggggaaatcc aacaaatcgg aaaaccaatg 660

gatatctata atgaacctga aaatcgtttt gttgcgacct tcatcgggga ttctaatatt 720

attgaaggaa cgatgattga agatcgcctt gtggaatttg atggcgttca atttgaatgc 780

gttgatgcag ggttctcaaa taatgaagtt gtagatattg taatccgacc tgaagacatt 840

gatattgttg atgtggaact tggtaaacta accggtgttg tagagtcaat tctatttaag 900

ggtgttcatt acgagattgt cgttaaaacg gaacatcgtg actttatcat tcatacaacg 960

gataattcag aagaaggaaa agaagccggc atccatttct tccctgaaga catccatgtt 1020

atgtacacaa tggagtcgta ttaa 1044

<210> 2

<211> 347

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Glu Ala Leu Ile Gln Phe Thr Asn Ile Val Lys Ser Phe Glu Asp

1 5 10 15

Gln Leu Val Leu Lys Gly Ile Asn Leu Asp Ile Phe Glu Asn Glu Phe

20 25 30

Val Thr Leu Leu Gly Pro Ser Gly Cys Gly Lys Thr Thr Leu Leu Arg

35 40 45

Ile Leu Gly Gly Phe Leu Glu Gln Ser Ser Gly Glu Val Tyr Phe Glu

50 55 60

Gly Ile Glu Ile Ser Lys Leu Ala Pro Tyr Lys Arg Glu Ile Asn Thr

65 70 75 80

Val Phe Gln Arg Tyr Ala Leu Phe Pro His Met Asp Val Tyr Asp Asn

85 90 95

Ile Ala Phe Gly Leu Arg Ile Lys Lys Thr Asn Glu Asp Ile Ile Lys

100 105 110

Gln Lys Val Glu Lys Met Leu Asn Ile Val Gly Leu Asn Gly Phe Glu

115 120 125

His Arg Pro Val Thr Leu Leu Ser Gly Gly Gln Gln Gln Arg Val Ala

130 135 140

Ile Ala Arg Ala Leu Val Asn Glu Pro Met Val Leu Leu Leu Asp Glu

145 150 155 160

Pro Leu Gly Ala Leu Asp Leu Lys Met Arg Lys Glu Met Gln Arg Glu

165 170 175

Leu Lys Glu Ile Gln Glu Asn Val Gly Ile Thr Phe Val Tyr Val Thr

180 185 190

His Asp Gln Glu Glu Ala Leu Thr Met Ser Asp Lys Ile Val Val Met

195 200 205

Asn Glu Gly Glu Ile Gln Gln Ile Gly Lys Pro Met Asp Ile Tyr Asn

210 215 220

Glu Pro Glu Asn Arg Phe Val Ala Thr Phe Ile Gly Asp Ser Asn Ile

225 230 235 240

Ile Glu Gly Thr Met Ile Glu Asp Arg Leu Val Glu Phe Asp Gly Val

245 250 255

Gln Phe Glu Cys Val Asp Ala Gly Phe Ser Asn Asn Glu Val Val Asp

260 265 270

Ile Val Ile Arg Pro Glu Asp Ile Asp Ile Val Asp Val Glu Leu Gly

275 280 285

Lys Leu Thr Gly Val Val Glu Ser Ile Leu Phe Lys Gly Val His Tyr

290 295 300

Glu Ile Val Val Lys Thr Glu His Arg Asp Phe Ile Ile His Thr Thr

305 310 315 320

Asp Asn Ser Glu Glu Gly Lys Glu Ala Gly Ile His Phe Phe Pro Glu

325 330 335

Asp Ile His Val Met Tyr Thr Met Glu Ser Tyr

340 345