一种用于木薯固氮的柠檬色短小杆菌及其生物菌剂、所述生物菌剂的制备方法和应用与流程

本发明属于微生物技术领域中的固氮菌领域，特别涉及一种用于木薯固氮的柠檬色短小杆菌及其生物菌剂、所述生物菌剂的制备方法和应用。

背景技术：

植物内生固氮菌是指定殖于植物体内，可与宿主植物进行联合固氮的一类微生物。利用内生固氮菌可将大气中游离态的氮元素转变成植物可直接吸收利用的氮素，再进一步转变成植物所需的蛋白质、核酸等大分子物质，供给植物生长所需。从农业上看，利用生物固氮是为作物提供氮肥的重要途径之一。20世纪80年代以来，内生固氮菌由于在禾本科作物上具有固氮活性，又能促进植物生长，成为国内外研究的热点。

联合固氮的机制：自从1972年，巴西的科学家在研究禾本科植物时发现了内生固氮菌，引起广泛关注，并在1974年研究牧草和固氮螺菌(Azospirillum)形成的固氮系统中,认为固氮菌株可以侵入宿主器官的皮层组织或维管内，但并不形成共生组织,它们与寄主细胞处于一种“松散”的共生状态,称为“联合共生固氮作用”(associative symbiotic nitrogen fixation)。联合固氮菌促进植物生长的机理主要有两个方面，其中是通过生物固氮为植物提供氮素或产生植物激素直接促进植物生长，其二是通过诱导植物产生植物激素、改善植物对矿质元素的吸收和利用来间接促进植物生长，促进根系发育。

近年来，国内外的研究者先后从甘蔗、水稻、黑麦草等禾本科植物中分离到多种内生固氮菌，此外，还从棕榈树、果树、咖啡树、黑松等林本中也发现了内生固氮菌。近年来的文献报道的内生固氮菌有：固氮醋杆菌(Gluconacetobacter diazotrophicus)、塞鲁普卡草螺菌(Herbaspirillum seropedicae)及固氮弧菌(Azoarus)、伯克霍尔德氏菌(Burkholderia)、固氮螺菌(Azospirillum)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、芽孢杆菌(Bacillus)、肠杆菌(Enterobacter)、假单胞菌(Pseudomonas)、固氮根瘤菌(Azorhizobium)等属中的一些种。在玉米、水稻、小麦田间接种联合固氮菌的实验结果表明，使用相应的根际联合固氮菌剂可增产10％左右。但到目前为止，在木薯中尚未发现有关内生固氮菌的报道。

氮肥的施用，对现代农业的发展起着不可替代的作用。我国的氮肥生产量和消费量均居世界首位。但是我国农业对氮肥的过量依赖必然造成报酬递减和环境污染的风险，如土壤的酸化、盐渍化、水体富营养化以及全球温室效应等。相比于化学施氮，生物固氮具有经济和环保等优点，不仅降低农业成本，而且避免了化学施氮所带来的种种环境问题。内生固氮菌在浸染木薯后可与木薯联合固氮，促进木薯生长，减少氮肥使用。分离和筛选以木薯为宿主的内生固氮菌，并应用其促进木薯生长是本发明的目的。

技术实现要素：

为解决上述现有技术存在的问题，本发明的第一目的在于提供一种用于木薯固氮的柠檬色短小杆菌，第二目的在于提供以所述菌株作为活性成分的生物菌剂及其制备方法，第三目的在于提供所述菌株及其生物菌剂的应用。

为达到上述目的，本发明的技术方案为：

一种用于木薯固氮的柠檬色短小杆菌其为放线菌门Actinobacteria，短小杆菌属Curtobacterium，柠檬色短小杆菌Curtobacterium citreum，保藏编号为：CGMCC No.12181。

进一步的，所述柠檬色短小杆菌在LB培养基上呈黄色，圆形，表面湿润凸起，边缘整齐，易挑起；革兰氏阳性菌株，其吲哚实验、二乙酰试验、葡萄糖发酵均为阳性，甲基红、淀粉水解实验、明胶液化实验、柠檬酸盐实验、乳糖发酵、蔗糖发酵、麦芽糖发酵均为阴性。

一种用于木薯固氮的柠檬色短小杆菌的制备方法，步骤为：

步骤一、样品选取：对木薯进行采样，选取木薯的根部未膨大的部分，选取一定长度的完整根部，直径为2-3mm；

步骤二、将采集的木薯根部按照根长分类，大致分为4类分别为5cm,10cm,15cm,20cm，用蒸馏水冲洗干净；将分类好的木薯根进行表面杀菌，将表面杀菌完成的木薯根用无菌水冲洗5遍，将最后一遍冲洗的无菌水涂布在LB培养基上，37℃培养36h，将没有菌体长出的材料用于内生菌的筛选；

步骤三，将步骤二处理后消毒并冲洗干净的根放入研钵中研磨，加入10mL的无菌水后静置5min，取0.1mL的研磨液涂布在无氮固体培养基上，28℃培养5-7d；观察无氮固体培养基上的细菌生长状况，选取能够生长的并能够挑起的单个菌落进行划线培养；在无氮固体培养基上进行划线培养，传代三次后选取能够传代培养，并且可以划线分离的细菌进行后续试验；

步骤四、对所得内生固氮菌株进行总DNA提取，并以总DNA为模板，扩增16S rRNA基因序列，扩增产物测序后，结果在NCBI上进行比对。

进一步的，所述步骤一中，采样选取苗期木薯。

进一步的，所述步骤一中，选取木薯根部的长度在5cm以上。

进一步的，所述步骤三中，无氮固体培养基的组成为：蔗糖10g，K2HPO4·H2O 0.1g，MgSO4·H2O 0.2g，CaCl2·H2O 0.02g，Na2MoO4·H2O0.002g，Malic acid 5.0g，KH2PO4·H2O 0.4g，NaCl 0.1g，FeCl30.01g，蒸馏水1000mL，pH7.0。

由上述的柠檬色短小杆菌制得的木薯固氮生物菌剂，该生物菌剂由所述柠檬色短小杆菌经管种培养或液体发酵培养后制得；生物菌剂中的细菌浓度为：每mL活菌数≧10⁸。

进一步的，所述的生物菌剂的制备方法，分别为：A、管种培养：将菌株接种到试管斜面培养基上，在温度28-32℃下恒温培养2-3天，即可得到；

B：液体发酵：将试管种接种到液体培养基上，28-32℃摇床培养1-2天，即可得到目标菌种为活性成分的生物菌剂。

进一步的，A管种培养中所述的试管斜面培养基的成分为：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，蒸馏水1000mL，琼脂15-20g，pH7.0-7.2；

B液体发酵中所述的液体培养基成分为：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，蒸馏水1000mL，pH7.0-7.2。

用于木薯固氮的柠檬色短小杆菌及其生物菌剂在提高木薯苗期氮素积累中的应用。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：本发明所得到的菌株及其研制的生物菌剂可以有效的提高盆栽木薯苗期氮素的积累。固氮酶活性为95.81nmol·mL^-1·h^-1。

附图说明

图1为本发明菌株在无氮培养基上生长图。

图2为本发明菌株革兰氏染色图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明技术方案做进一步详细描述：

试验例1：

从木薯中分离到的1株内生固氮菌，A02菌株属于放线菌门(Actinobacteria；),短小杆菌属(Curtobacterium)，柠檬色短小杆菌(Curtobacterium citreum)。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日：2016年03月07日，保藏编号：12181；

所述从木薯中分离到的内生固氮菌的制备方法包括如下步骤：

A.分离培养基：

Dobereiner无氮培养基：蔗糖10g，K2HPO4·H2O 0.1g，MgSO4·H2O0.2g，CaCl2·H2O 0.02g，Na2MoO4·H2O 0.002g，Malic acid 5.0g，KH2PO4·H2O 0.4g，NaCl 0.1g，FeCl30.01g，蒸馏水1000mL，pH7.0。

B.培养方法：

(1)样品选取：在木薯的苗期进行采样，选取木薯的根部未膨大的部分，尽量选取完整的根部，长度在5cm以上，直径为2-3mm左右。

(2)具体步骤：将采集的木薯根部按照根长分类，大致分为4类分别为5cm，10cm，15cm和20cm，用蒸馏水冲洗干净。将分类好的木薯根进行表面杀菌，具体杀菌时间处理及结果见表1。将表面杀菌完成的木薯根用无菌水冲洗5遍，将最后一遍冲洗的无菌水涂布在LB培养基上，37℃培养36h，观察是否有菌生长，如果有菌体长出表示表面杀菌不完全，材料不能用于内生菌的筛选；如果没有菌体长出表示表面杀菌完全，材料可用于内生菌的筛选。将消毒并冲洗干净的根放入研钵中研磨，加入10mL的无菌水后静置5min，取0.1mL的研磨液涂布在无氮固体培养基上，28℃培养5-7d。观察无氮固体培养基上的细菌生长状况，选取能够生长的并能够挑起的单个菌落进行划线培养。在无氮固体培养基上进行划线培养，传代三次后选取能够传代培养，并且可以划线分离的细菌进行后续试验。

表1木薯根部表面杀菌处理及结果

注：“-”表示此培养基中有菌落长出，“+”表示此培养基中没有菌落长出。

(3)在木薯的块根形成期，块根膨大期，块根成熟期对木薯的根部采样进行分离筛选内生固氮菌的实验均未成功。

将上述步骤所分离到的细菌通过乙炔还原法测定细菌固氮酶活性，以此鉴定细菌是否具有生物固氮的能力。具体方法如下：

将分离出的内生菌接种于装有20mL底氮Dobereiner液体培养基的100mL三角瓶中，盖上棉塞。30℃、150r/min培养。当菌液的OD600达到0.6时将棉塞换成橡胶塞，用注射器抽出瓶内气体5mL，注入高纯乙炔5mL，继续培养24h。用气相色谱仪测定乙烯的生成量，按下式计算固氮酶活性。

C＝(hx×c×V)/(24.9×hs×t)

其中，hx为样品峰面积值；

hs为标准C2H4峰面积值；

c为标准C2H4浓度(nmol/mL)；

V为培养容器体积(mL)；

t为样品培养时间(h)；

C为产生的C2H4浓度(nmol·mL^-1·h^-1)。

菌株分离筛选结果：

通过对木薯根部内生固氮菌的筛选和鉴定得到1株具有较高固氮酶活性的菌株，为A02菌株。它的固氮酶活性分别为95.81nmol·mL^-1·h^-1。将这两株菌株接种到木薯中，在盆栽实验结果中可以提高木薯苗期地上部和地下部的氮含量。

菌株鉴定方法：

菌株的培养特征和生理生化鉴定参照《常见细菌系统鉴定手册》和《韦伯式鉴定手册》。菌株的总DNA提取使用试剂盒，并以总DNA为模板，扩增16S rRNA基因序列，扩增产物送至南宁国拓生物公司进行测序，结果在NCBI上进行比对。

鉴定结果：

本发明的第一目的，所得菌株：A02菌株是从木薯苗期根部分离筛选出来的，经生理生化实验和16S rRNA序列鉴定，确定A02菌株属于放线菌门(Actinobacteria；),短小杆菌属(Curtobacterium)，柠檬色短小杆菌(Curtobacterium citreum)。

菌株主要特征为：

如图1、2所示，A02菌落在LB培养基上呈黄色，圆形，表面湿润凸起，边缘整齐，易挑起。革兰氏阳性菌株，其吲哚实验、V.P(二乙酰试验)、葡萄糖发酵均为阳性，甲基红、淀粉水解实验、明胶液化实验、柠檬酸盐实验、乳糖发酵、蔗糖发酵、麦芽糖发酵均为阴性。

本发明的第二目的是这样实现的：是以上述菌株经过管种培养和液体发酵后制成的生物菌剂。

上述生物菌剂的制备方法具体为包括管种培养和液体发酵实验方法。具体包括：

A：管种培养：将A02接种到试管斜面培养基上，在温度28-32℃下恒温培养2-3天，即可得到。

B：液体发酵：将试管种接种到液体培养基上，28-32℃摇床培养1-2天，即可得到目标菌种为活性成分的生物菌剂。

本发明的第三个目的是这样实现的，本发明研制出的生物菌剂可显著提高盆栽木薯苗期氮素积累量。

本发明从木薯根部筛选出具有较高固氮酶活性的菌株，并研制出有效的生物菌剂，所述生物菌剂可有效提高盆栽木薯苗期氮素积累。

实验例2

本发明为所述的内生固氮菌A02菌株属于放线菌门(Actinobacteria；),短小杆菌属(Curtobacterium)，柠檬色短小杆菌(Curtobacterium citreum)。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日：2016年03月07日，保藏编号：12181。

本发明所述的柠檬色短小杆菌为活性成分的生物菌剂，是以上述菌株经过管种培养和液体发酵后制成的生物菌剂。

本发明所述的生物菌剂的制备方法，包括管种培养和液体发酵实验方法。具体包括：

A：管种培养：将A02菌株接种到试管斜面培养基上，在温度28-32℃下恒温培养2-3天，即可得到。

B：液体发酵：将试管种接种到液体培养基上，28-32℃摇床培养1-2天，即可得到目标菌种为活性成分的生物菌剂。

A步骤所用试管培养基成分为：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，蒸馏水1000mL，琼脂15-20g，pH7.0-7.2。

B步骤所用液体发酵培养基成分为：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，蒸馏水1000mL，pH7.0-7.2。

B步骤所用摇床转速为150-180rmp。

本发明生物菌剂的制备具体操作如下：

A：管种培养使用的培养基为：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，蒸馏水1000mL，琼脂15-20g，pH7.0-7.2。

将A02接种到试管斜面培养基上，在温度28-32℃下恒温培养2-3天，即可得到。

B：液体发酵所用液体发酵培养基成分为：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，蒸馏水1000mL，pH7.0-7.2。

将试管种接种到500mL三角瓶中，每瓶装有200mL液体培养基，于28-32℃恒温条件下，150-180rmp摇床培养1-2天，用OD600检测菌悬液的浓度，当OD600在0.4-0.8之间时，细菌处于对数生长期，活菌数约10⁸-10¹⁰，即为所获得的有效生物菌剂。

生物菌剂的制备结果：

通过液体发酵得到的生物菌剂的浓度为：每mL活菌数≧10⁸。

生物菌剂的应用：

本发明生物菌剂对木薯苗期氮素积累的影响实验

(1)制备生物菌剂：按照上述A02菌株的生物菌剂的制备方法准备好生物菌剂，以不接菌的发酵液为对照。

(2)木薯育苗：将木薯种茎截取为2-3cm大小，在珍珠岩中进行育苗，当木薯苗长至2-3叶时进行移栽。

(3)盆栽准备：将珍珠岩和沙质土壤分别高温高压灭菌，以珍珠岩和土壤比例为3:1混匀后装入盆中，所用盆的规格为内径21-23cm,高30cm的不透光花盆。每盆中装入混匀的土4kg。

(4)营养液准备：所用营养液为完全霍格兰营养液和无氮霍格兰营养液。

(5)生物菌剂对木薯苗的处理方法：将在珍珠岩中育至2-3叶的木薯苗小心取出，不得伤其根部。用无菌水冲洗干净后将木薯苗的根部浸泡在生物菌剂中30min后移栽入盆中。对照浸泡在没有接种的发酵液中。

实验分3组：接种A02生物菌剂，不接种CK1，不接种CK2。每组5个平行。

(6)盆栽木薯生长期间处理：移栽后每隔2天向花盆中施入营养液100mL。直至30天后实验结束。

施入情况分别为：A02处理组与CK1施入无氮霍格兰营养液。CK2施入完全霍格兰营养液。

(7)内生菌浸染木薯后对木薯的根部和叶片的固氮酶活性检测方法

实验处理30天后进行收样，采集木薯正3片叶和根部，无菌水冲洗干净，用0.1％的升汞浸泡10min后用无菌水冲洗5遍，分别将根茎叶剪碎装入50mL的玻璃瓶中，每瓶装有10mL的无氮培养基，橡胶塞封口，用注射器抽出1mL空气后注入1mL高纯乙炔，培养2h后抽取1mL气体进行气相色谱检测乙烯的生成量，用以下公式进行计算固氮酶活性。

C＝(hx×c×V)/(24.9×hs×t)

其中，hx为样品峰面积值；

hs为标准C2H4峰面积值；

c为标准C2H4浓度(nmol/mL)；

V为培养容器体积(mL)；

t为样品培养时间(h)；

C为产生的C2H4浓度(nmol·mL^-1·h^-1)。

(8)木薯根、叶的固氮酶活性检测结果

通过对浸染生物菌剂的木薯的根、叶的固氮酶活性检测结果表2可知，在根部和叶片均检测到固氮酶活性，表明生物菌剂可以浸染木薯，并在根部和叶片发挥固氮作用。

表2木薯根、叶的固氮酶活性(nmol·mL^-1·h^-1)

(9)内生菌浸染木薯后木薯苗期氮素含量的分析方法

实验处理30天后进行收样，将木薯的根、茎、叶分别采下用去离子水冲洗干净后分别装入信封中在烘箱中烘干，粉碎后测定其中氮含量。含氮量的测定采用硫酸消煮-纳氏比色法。

(10)生物菌剂的应用效果

本发明得到的两种生物菌剂都可以通过木薯根部浸染并在根部和叶子上发挥固氮作用，从而达到对木薯生长苗期氮素增加的效果。从表3可以知道，使用生物菌剂对木薯的根、茎、叶的含氮量有显著提高。使用A02生物菌剂的木薯的叶片、茎部和根部含氮量均与不施氮、不加生物菌剂的CK1相比有显著的提高。与正常施氮、不加生物菌剂的CK2相比，A02生物菌剂的木薯的叶片、茎部和根部含氮量可达到CK2的83.44％，65.43％和71.64％，说明采用A02生物菌剂，可替代木薯苗期的部分施氮量。

表3木薯的根、茎、叶的含氮量

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。