一种用于度量鸡性成熟启动时机的血清miRNA标志物及含有标志物的血清制备方法与流程

本发明涉及一种用于度量鸡性成熟启动时机的血清miRNA标志物及含有标志物的血清制备方法，属于分子生物学技术领域。

背景技术：

性早熟在人类上表现为病理状态，而在动物生产上则是一个具有重要经济价值的性状。性成熟启动（青春期/初情期，puberty onset）是动物包括人类生命周期中里程碑式的发育事件，机体由此获得生殖能力。性成熟启动时机（timing of puberty onset）调控研究备受关注。

在鸡性成熟启动调控机制研究和性早熟鸡新品系（品种）选育中，缺乏一致的、可精准度量性成熟启动时机的生物标志物。鸡冠、肉髯和体重等变化指标与性发育并不完全同步；生殖激素水平在不同发育时期和个体间易波动，限制了其在性成熟启动度量中的应用。

我国地方鸡品种资源的早熟特性十分明显，开展鸡性成熟启动调节机制研究，对于高产蛋鸡和优质肉鸡育种具有重要意义。同时，鸡作为重要的模式生物，其早熟性相关研究也可为人类性早熟临床诊断、治疗提供科学依据。开展鸡性成熟调控机制研究中，一个重要的前提条件是能够准确地度量性成熟启动时机及其进程。然而，在研究过程中发现若采用常规度量方法（ 鸡冠肉髯等第二性征表型观察：与性发育并不完全同步；LH/FSH等生殖激素浓度测定：激素水平在不同发育阶段及同一发育阶段不同个体间均存在重叠和较大变异）难以精确度量性成熟启动时机，已成为鸡性成熟启动相关研究的瓶颈。另外，在生产中培育性早熟鸡新品系（品种），针对具有性早熟遗传特性的个体难以开展早期（上笼前）精准选种，按常规以开产日龄（母禽性成熟的标志）作为选育指标严重滞后，缺乏一种可辅助用于早期精准选种的生物标志物。

研究发现微小RNA（miRNA）是机体重要发育事件时机转变的一类精细调控者，外泌体所装载的miRNA在血清中能稳定存在（称之为循环miRNA），其拷贝数变化能精确反映机体生理状态的改变，在人类及动物疾病早期监测、诊断和预后观察中具有较好的应用前景，是一种潜在新型生物标志物。寻找和发现有价值的生物标志物用于鸡性成熟启动时机度量，已经成为目前研究的一个重要热点。

技术实现要素：

本发明针对上述缺陷，目的在于提供一种能够精准度量鸡性成熟启动时机的miRNA标志物及含有标志物的血清制备方法。

为此本发明采用的技术方案是：所述的标志物为gga-miR-29c-3p、gga-miR-217-5p、gga-miR-375、gga-miR-215-5p、gga-miR-19b-3p、gga-miR-133a-3p、gga-let-7a-5p中的一种或者几种组合。

所述标记物gga-miR-29c-3p用到的引物如下：

逆转录引物：

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAACCGA；

上游引物：CCGCCGTAGCACCATTTG；

下游引物：CGCAGGGTCCGAGGTATTC。

所述标记物gga-miR-217-5p用到的引物如下：

逆转录引物：

GCGTGGTCCACACCACCTGAGCCGCCACGACCACGCTCCAATCA；

上游引物：CCACCATACTGCATCAGGAACT；

下游引物：CCACACCACCTGAGCCG。

所述标记物gga-miR-375用到的引物如下：

逆转录引物：

CTCAGCGGCTGTCGTGGACTGCGCGCTGCCGCTGAGAACGCGAG；

上游引物：GCCGGATTTGTTCGTTCG；

下游引物：GGCTGTCGTGGACTGCG。

所述标记物gga-miR-215-5p用到的引物如下：

逆转录引物：

GCGTGGTCCACACCACCTGAGCCGCCACGACCACGCAGTCTGTC；

上游引物：GCCGCCATGACCTATGAAT；

下游引物：TCCACACCACCTGAGCCG。

所述标记物gga-miR-19b-3p用到的引物如下：

逆转录引物：

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCAGTT；

上游引物：GGCGGTGTGCAAATCCAT；

下游引物：CAGTGCAGGGTCCGAGGTAT。

所述标记物gga-miR-133a-3p用到的引物如下：

逆转录引物：

CTATACCATAAGCGAGCAGTAGCGCGATGGTATAGACAGCTGG；

上游引物：AACCCGTTGGTCCCCTTCA；

下游引物：GCCATAAGCGAGCAGTAGCG。

所述标记物gga-let-7a-5p用到的引物如下：

逆转录引物：

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAACTAT；

上游引物：GGCGGTGAGGTAGTAGGTTGT；

下游引物：CAGTGCAGGGTCCGAGGTAT。

一种含有标志物的血清制备方法，其特征在于，按照以下步骤进行：

1）集新鲜血液后，迅速置于4℃冷冻离心机中，转速为800~900rpm/min，离心时间为4~6min，去除血细胞及其它内容物，用无酶吸头缓慢吸取上清液，置于另一新无酶管中，严格避免血细胞进入吸取的上清液中；

2）取1）获取的上清液，迅速置于4℃冷冻离心机中，转速为1800~2000rpm/min，离心时间为8~12min，去除残留的血细胞。用无酶吸头缓慢吸取上清液，置于另一新无酶管中；

3）取2）获取的上清液，迅速置于液氮保存。

本发明的优点是：本发明通过提取鸡血清小RNA，利用qRT-PCR技术检测miRNA标记在性成熟进程中的表达规律，鉴定出了7个能精准度量鸡性成熟启动时机的特异性循环miRNA标志物，为开展鸡性成熟启动机制研究和性早熟鸡新品系（品种）培育提供了更精准的度量标准。

附图说明

图1 为性成熟启动前后7个miRNA标志物表达规律。

图中每周龄中从左至右的标志物依次均为miR-29c(p<0.001)、miR-217(p<0.001)、miR-375(p<0.001)、miR-215(p<0.001)、miR-19b(p<0.001)、miR-133a(p<0.001)、let-7a(p<0.001)。

图2为本发明制备的血清的质检图。

具体实施方式

本发明的目的是鉴定一种用于度量鸡性成熟启动时机的血清miRNA标志物。本发明的技术方案是：提取不同发育阶段鸡血清小RNA，设计引物，利用qRT-PCR技术检测20个候选miRNA标记的表达变化规律，通过分析miRNA表达水平与鸡性腺组织发育变化及血清LH激素水平的关联，发现7个候选miRNA标记（任意一个或组合）能精准度量鸡性成熟启动时机。所采用的技术方法以及所获得的结果如下所示：

1 技术方法

1.1血液采集

无酶管收集鸡翅静脉血样2~2.5ml。

1.2 血清制备

1）集新鲜血液后，迅速置于4℃冷冻离心机中，转速为800~900rpm/min，离心时间为4~6min，去除血细胞及其它内容物，用无酶吸头缓慢吸取上清液，置于另一新无酶管中，严格避免血细胞进入吸取的上清液中；

2）取1）获取的上清液，迅速置于4℃冷冻离心机中，转速为1800~2000rpm/min，离心时间为8~12min，去除残留的血细胞。用无酶吸头缓慢吸取上清液，置于另一新无酶管中；

3）取2）获取的上清液，迅速置于液氮保存。要求1h内完成整个血清制备过程。

1.3 血清小RNA提取

取出液氮保存的血清，按照常规Small RNA提取试剂盒操作说明，提取血清小RNA。

1.4 小RNA质量检测

采用Bioanalyzer 2100分光光度计系统检测样品的RIN值和A260/A280值。

1.5 候选miRNA RT-qPCR检测

（1）引物设计。采用Primer 5.0（ABI）进行引物设计，包括特异性逆转录引物和PCR扩增上、下游引物（见表1）。

表1 miRNA qRT-PCR检测引物信息

。

（2）反转录。按照常规RNA反转录试剂盒说明操作。

（3）相对定量

以snRNA U6作为内参。ABI PRISM® 7900HT型荧光定量PCR仪。Real- time PCR体系（20 ul）：2 X SYBR Green Mix With ROX 10.0 ul，ddH2O 8.2 ul，Primer mix (10 uM) 0.8 ul，RT product 1.0 ul。反应程序为50℃ 2min，95℃ 2min，95℃ 15s，60℃ 30s，40个循环。每个样品3次重复。

（4）数据分析

miRNA相对表达水平的标准化△Cq =Cq miRNA-Cq U6RNA，相对表达水平计算采用2^-△△Cq方法。表达水平的差异显著性p-值和关联分析采用SPSS 20.0 的one-way ANOVA方差分析LSD多重比较。

2 结果

通过RT-qPCR检测，获得了20个miRNA标记在性成熟启动前后鸡血清中的表达变化（见附图1），关联分析结果表明7个候选miRNA标志物在性成熟启动时机的表达水平显著升高与性腺组织快速发育启动及LH脉冲释放增加相一致，且表达水平在个体间差异不显著，结果显示7个循环miRNA标记能精准地度量出鸡性成熟启动时机。基于上述结果，表明应用7个循环miRNA标记（一个或任意组合）能精准地度量出鸡性成熟启动时机，满足特异性生物标志物要求，为开展鸡性成熟启动机制研究和性早熟鸡新品系（品种）培育提供了更精准的度量标准。也为其它动物性成熟启动度量及人类性早熟诊断提供了借鉴。