本发明涉及PCDH18基因在制备结直肠癌诊断试剂盒中的应用，以及一种结直肠癌诊断试剂盒。(二)
背景技术：
：结直肠癌(colorectalcancer，CRC)是最常见的消化道恶性肿瘤之一，在世界范围内，发病率居于恶性肿瘤第三位，死亡率居第四位，每年约有120万新发病例，严重威胁人类健康。结直肠癌在全球范围内具有明显的地域分布差异，其中亚洲发病率较高，尤其是中国，主要与年龄、家族史、不健康的饮食及生活习惯等危险因素有关。大部分结直肠癌患者确诊时已处于肿瘤进展期，失去了最佳的治疗时机，导致五年生存率不到20％，预后较差。因此，探索结直肠癌快速诊断的评估方法，提高诊疗水平，提高存活率，是当前研究的热点和难点。目前临床上用于结直肠癌诊断的方法包括：光学检查和形态学检查，常规的检查方法主要有排泄物便潜血检查、排泄物免疫学检查、钡剂双重造影检查、弹性乙状结肠镜检查、结肠镜检查和CT结肠成像。但是，上述检测方法仍存在一定局限性，如便潜血检查分离过程繁琐，易受细菌、食物及肠道粘液等干扰；结肠镜检查对设备和检测人员技术的要求较高，误诊率较大。随着结直肠癌的发病机制的研究越来越广泛，分子生物标记物在其中的重要性越来越明显。这些标记物已成为结直肠癌诊断和治疗的重要靶点。PCDH18基因定位于4q28.3，属于原钙黏蛋白超家族成员之一，原钙粘附蛋白(protocadherin)是钙粘蛋白超家族中一个最大的亚族。钙粘附蛋白家族(cadherinfamily)为钙离子依赖型粘附分子，均为单链跨膜糖蛋白，介导特定组织或器官同型细胞间粘附，对胚胎发育中细胞识别、迁移、通讯和组织分化及中枢神经系统中神经回路的形成具有重要作用。原钙粘附蛋白在神经元发育和突触形成中有重要的作用。原钙粘附蛋白18(protocadherinl8，PCDH18)基因表达主要在小鼠的前脑、后脑脑室管膜区、嗅泡、大脑皮层、丘脑、及小脑中。有关原钙黏蛋白家族与疾病发生的关系是近年来大家关注的热点问题。目前已有多个原钙黏蛋白家族成员被证实在肝癌、宫颈癌、前列腺癌、食管癌等在内的人类多种肿瘤中存在差异性表达并通过激活下游信号通路调控肿瘤发生发展。现有研究表明PCDH18可激活记忆T细胞，但并没有研究揭示其与结直肠癌发生发展的关系。(三)技术实现要素：本发明目的在于提供一种特异性强、灵敏度高的结直肠癌基因诊断分子标志物——PCDH18基因在制备结直肠癌诊断试剂盒中的应用，以及一种结直肠癌诊断试剂盒。本发明采用的技术方案是：PCDH18基因在制备结直肠癌诊断试剂盒中的应用。PCDH18基因包括人PCDH18基因、前体、亚型以及人PCDH18基因的任何功能等同物的多核苷酸。PCDH18基因包括与目前国际公共核酸序列数据库GeneBank中PCDH18基因(NC_000004.12)DNA序列具有70％以上的同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。PCDH18基因的编码序列包括以下任一种DNA分子：(1)序列表中SEQIDNO.1所示的DNA序列；(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白质的DNA序列；(3)与(1)或(2)限定的DNA序列具有70％、优选地，90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。优选的，所述PCDH18基因序列如SEQIDNo.1所示：PCDH18基因表达产物(即PCDH18蛋白)在制备结直肠癌诊断试剂盒中的应用。PCDH18蛋白包括PCDH18蛋白以及PCDH18蛋白的所有功能等同物。所述功能等同物包括PCDH18蛋白保守型变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严禁条件下能与人PCDH18基因的DNA杂交的DNA所编码的蛋白质。PCDH18蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白质：(1)由序列表中SEQIDNO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(2)将SEQIDNO.2所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基替换和/或缺失和/或添加且与SEQIDNO.2所示的氨基酸序列具有相同功能的有SEQIDNO.2所示的氨基酸序列衍生的蛋白质。替换、缺失或添加的氨基酸个数至少大于1个。(3)与SEQIDNO.2所示的氨基酸序列具有至少80％同源性，优选地，与SEQIDNO.2所示的氨基酸序列具有至少90％的同源性的氨基酸构成的多肽。优选的，所述PCDH18基因表达产物氨基酸序列如SEQIDNo.2所示：MHQMNAKMHFRFVFALLIVSFNHDVLGKNLKYRIYEEQRVGSVIARLSEDVADVLLKLPNPSTVRFRAMQRGNSPLLVVNEDNGEISIGATIDREQLCQKNLNCSIEFDVITLPTEHLQLFHIEVEVLDINDNSPQFSRSLIPIEISESAAVGTRIPLDSAFDPDVGENSLHTYSLSANDFFNIEVRTRTDGAKYAELIVVRELDRELKSSYELQLTASDMGVPQRSGSSILKISISDSNDNSPAFEQQSYIIQLLENSPVGTLLLDLNATDPDEGANGKIVYSFSSHVSPKIMETFKIDSERGHLTLFKQVDYEITKSYEIDVQAQDLGPNSIPAHCKIIIKVVDVNDNKPEININLMSPGKEEISYIFEGDPIDTFVALVRVQDKDSGLNGEIVCKLHGHGHFKLQKTYENNYLILTNATLDREKRSEYSLTVIAEDRGTPSLSTVKHFTVQINDINDNPPHFQRSRYEFVISENNSPGAYITTVTATDPDLGENGQVTYTILESFILGSSITTYVTIDPSNGAIYALRIFDHEEVSQITFVVEARDGGSPKQLVSNTTVVLTIIDENDNVPVVIGPALRNNTAEITIPKGAESGFHVTRIRAIDRDSGVNAELSCAIVAGNEENIFIIDPRSCDIHTNVSMDSVPYTEWELSVIIQDKGNPQLHTKVLLKCMIFEYAESVTSTAMTSVSQASLDVSMIIIISLGAICAVLLVIMVLFATRCNREKKDTRSYNCRVAESTYQHHPKRPSRQIHKGDITLVPTINGTLPIRSHHRSSPSSSPTLERGQMGSRQSHNSHQSLNSLVTISSNHVPENFSLELTHATPAVEVSQLLSMLHQGQYQPRPSFRGNKYSRSYRYALQDMDKFSLKDSGRGDSEAGDSDYDLGRDSPIDRLLGEGFSDLFLTDGRIPAAMRLCTEECRVLGHSDQCWMPPLPSPSSDYRSNMFIPGEEFPTQPQQQHPHQSLEDDAQPADSGEKKKSFSTFGKDSPNDEDTGDTSTSSLLSEMSSVFQRLLPPSLDTYSECSEVDRSNSLERRKGPLPAKTVGYPQGVAAWAASTHFQNPTTNCGPPLGTHSSVQPSSKWLPAMEEIPENYEEDDFDNVLNHLNDGKHELMDASELVAEINKLLQDVRQS本发明的PCDH18蛋白也包括对SEQIDNO.2所示氨基酸序列的非保守修饰，只要修饰后的蛋白质仍具有PCDH18蛋白的生物学活性即可。氨基酸序列的修饰可源于自发突变或遗传后修饰，也可人工诱导产生。通常，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域专业人员会认可改变包括替换、缺失或添加，单个氨基酸或小百分比的氨基酸是保守修饰，产生的蛋白质具有相似功能。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。本发明还涉及一种结直肠癌诊断试剂盒，所述试剂盒通过检测PCDH18基因及其表达产物的表达水平进行诊断，所述试剂盒主要包括：扩增PCDH18基因的特异性引物(RT-PCR诊断试剂盒或荧光定量PCR诊断试剂盒)，或者与PCDH18蛋白特异性结合的抗体(免疫检测诊断试剂盒)，或者与PCDH18基因的核酸序列杂交的探针(原位杂交诊断试剂盒)，以及检测用试剂(相应PCR反应或免疫检测、原位杂交以及表达水平检测所需要的试剂)。所述结直肠癌诊断包含判断受试者是否已患结直肠癌，也包含判断受试者是否存在患有结直肠癌的风险。所述PCDH18蛋白的特异性抗体包括单克隆和多克隆抗体。所述PCDH18蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段、变异体或修饰。只要所述片段能够保留与JAM3蛋白的结合能力即可。用于检测蛋白质水平的抗体制备是公知的，且本发明可使用任何方法来制备所述抗体。所述与PCDH18基因的核酸序列杂交的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其他衍生物。所述探针长度没有限制，能够完成特异性杂交且与目的核苷酸序列特异性结合均可。所述探针长度范围大于10个碱基。优选的，所述试剂盒为基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒。所述试剂盒为基因检测试剂盒时，所述基因检测试剂盒主要包括扩增PCDH18基因的特异性引物以及PCR反应试剂；所述扩增PCDH18基因的特异性引物序列如下：上游引物：5’-AAGAATTCCCAACGCAACCC-3’；下游引物：5’-AATAGGTGTCCAGGGAAGGC-3’。所述试剂盒还可包括扩增内源对照基因GAPDH的特异性引物：上游引物：5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’；下游引物：5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。所述试剂盒还可包括PCDH18基因标准品，所述PCDH18基因标准品序列如SEQIDNo.1所示。以PCDH18基因标准品作为对照，可对待测样本中PCDH18基因表达量进行定量检测。所述基因检测试剂盒PCR反应试剂为常规PCR反应所需试剂，包括dNTP、Mg2+、Taq酶(热启动酶)、PCR缓冲液、SYBRGreenII等。本发明首次发现了PCDH18基因表达与结直肠癌密切相关，通过检测受试者结直肠组织中PCDH18的表达，可以判断受试者是否已患有结直肠癌或是否存在患有结直肠癌的风险，从而给临床医师提供预防或治疗方案。本发明的有益效果主要体现在：本发明发现了一种结直肠癌新的分子标志物——PCDH18基因，提供了其在制备结直肠癌诊断试剂盒中的应用，以及一种结直肠癌诊断试剂盒，与传统的检测手段相比，分子标志物的诊断更及时、更特异，从而提高结直肠癌患者的5年生存率，降低死亡率，应用前景广阔。(四)附图说明图1为PCDH18基因的扩增曲线和增产物溶解峰的代表图；A为在25对结直肠癌组织和对应的远处正常肠组织中，利用荧光定量PCR检测PCDH18基因的扩增曲线；B为扩增产物溶解峰的代表图。图2为PCDH18基因mRNA在25对结直肠癌组织和对应的远处正常肠组织中的表达情况(2-△Ct值比较，**P<0.01)。图3为PCDH18基因mRNA在正常肠上皮细胞系NCM460和结直肠癌细胞系(SW480、SW620、HCT116、HT29)的表达情况(2-△Ct值比较，***P<0.001)。(五)具体实施方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：实施例1：荧光定量PCR法检测PCDH18基因在结直肠癌组织和对应的远处正常肠组织的差异表达1、收集25对结直肠癌组织和对应的远处正常肠组织样本，所有结直肠癌组织标本均由厦门大学附属第一医院标本库提供，每例患者标本均有明确的诊断记录，并通过伦理委员会的同意，收集标本后冻存于液氮。2、RNA样品的制备(1)样品的前处理：从液氮罐中取出样本，将样本放入2ml的无菌EP管中，加入1mlTrizolRNA提取液，用0.1％DEPC水浸泡过夜并用消毒的剪刀剪碎后放入组织匀浆器中充分研磨。(2)抽提：加入500μL的氯仿，剧烈颠倒混匀15～30s，放入4℃低温离心机中离心，12000rpm离心4min。样品将分为三层：上层为无机水相含有RNA，中间层和下层为含有蛋白或其他杂质的有机相。(3)沉淀：小心取出上层水相，加入含有750μL异丙醇和150μL5％LiCl的无菌EP管中，剧烈颠倒混匀15～30s，放入4℃低温离心机中离心，12000rpm离5min。(4)洗涤：弃上清液，加入1mL75％乙醇(DEPC水配制)，放入4℃低温离心机中离心，12000rpm离1min，弃上清后重复该步骤。(5)干燥：吸干管中的乙醇，室温下干燥RNA沉淀2～3min。(6)溶解：加入20μLDEPC水溶解RNA沉淀。(7)测定浓度：用Nanodrop2000紫外分光光度计检测RNA样品的浓度，测定的25对样品的浓度如下所示：3、RNA反转录得到cDNA采用Takara公司反转录试剂盒(货号RR047A)进行cDNA反转录，实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：(1)在200μLPCR管中配制去除DNA的反应液，总体系10μL，包含gDNAEraser1μL，5XgDNAEraserBuffer2μL，RNAxμL，RNaseFreedH2O7-xμL，RNA的体积由浓度决定，x＝1μg/RNA浓度。(2)将装有配制好的去DNA反应液的PCR管放入PCR仪(Bio-rad，T100TM)中，42℃孵育2min。(3)在新的200μLPCR管中配制反转录反应液，体系为10μL，包含5×PrimeSriptBuffer4μL，PrimeSriptRTEnzymeMixI1μL，RTPrimerMix1μL，RNaseFreedH2O4μL。(4)将前两步得到的10μL溶液混合得到20μL体系，PCR仪(Bio-rad，T100TM)37℃孵育5min，85℃孵育5s，得到反转录的cDNA，RNaseFreedH2O稀释成200μL。4、荧光定量PCR检测：(1)在八连管中，每管配制荧光定量PCR反应液，总体积20μL，SYBRPremixExTaqII10μL，PCDH18上游引物0.8μL，PCDH18下游引物0.8μL，ROXDyeII0.4μL，cDNA模板2μL，RNaseFreedH2O6μL。(2)封盖后放入PCR检测仪(ABIViiA7)中，程序设定为：50℃2min，95℃10min，接着45个循环：95℃15s，61℃60s。5、数据分析：实验均按照重复3次完成，采用相对定量2-△Ct(△Ct＝样品PCDH18Ct值-样品GAPDHCt值)的方法进行统计分析，GAPDH作为内参基因，数据利用GraphPad5.0软件进行分析，所有统计结果均以P<0.05认为存在显著差异。6、结果：荧光定量PCR扩增曲线代表图显示扩增曲线拐点清楚，整体平行性较好，表明各反应管的扩增效率相近(图1A)；样本扩增产物溶解曲线代表图显示溶解曲线基本都是单峰，说明扩增产物只有一条，为特异性扩增(图1B)；与对应的远处正常肠组织相比，PCDH18基因在结直肠癌癌组织中表达显著下调(P<0.01)(图2)。实施例2：荧光定量PCR法检测PCDH18基因在结直肠癌细胞系和正常肠上皮细胞系差异表达1.培养人结直肠癌细胞系(SW480、SW620、HCT116和HT29)和人正常肠上皮细胞系NCM460，具体培养方法如下：人正常肠道细胞系NCM460用含10％胎生牛血清和青霉素、链霉素各100U/mL的DMEM培养基，在37℃及5％CO2的孵育箱中培养，每2～3天更换培养液并传代。人肠癌SW480采用L15培养基(含10％胎牛血清)，人肠癌HCT116、SW620和HT29细胞系采用DMEM培养基(含10％胎牛血清)，在37℃及5％CO2的孵育箱中培养。2.待细胞在60mm培养皿中的融合度达到80％时，弃去培养液，加入1mL无菌PBS清洗，弃去PBS后重复1次，加入1mLTrizolRNA提取液，左右轻轻晃动培养皿，使TrizolRNA提取液全部没过培养皿底部，采用1mL移液枪轻轻吹打贴壁的细胞，使得细胞完全悬浮于TrizolRNA提取液中，将含有细胞的TrizolRNA提取液收集至1.5mL无菌的EP管中。3.RNA提取、反转录、荧光定量PCR和数据分析步骤同实施例1。4.结果：与正常肠上皮细胞系NCM460相比，结直肠癌细胞系(SW480、SW620、HCT116和HT29)PCDH18基因mRNA的表达量均显著下降(P<0.001)(图3)。上述实施例的介绍仅用来理解本发明的方法及其核心内容。特别需要指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行改进和修饰，但这些改进和修饰也将属于本发明权利要求的保护范围。当前第1页1 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