重组阿达木单抗Fab片段在昆虫细胞表达系统中的制备方法与流程

本发明涉及全人源adalimumabfab片段在昆虫细胞/杆状病毒表达系统中的制备方法，属于生物技术领域。

背景技术：

adalimumab即阿达木单抗，商品名humira(修美乐)是近年来全球最畅销的生物药，是首个获fda批准的全人源单克隆抗体药物。adalimumab由雅培制药公司开发(us6090382)，现属于艾伯维公司，是igg分子的抗原结合片段(antigen-bindingfragments,fab片段)。adalimumabfab片段是人单克隆d2e7重链和轻链经二硫键结合的二聚物，能特异性地与tnf-α结合从而阻断其与p55、p75细胞表面的tnf-α受体的相互作用，用于治疗类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis，ra)，银屑病关节炎(psoriaticarthritis,pa)，强直性脊柱炎(ankylosingspondylitis，as)，和克罗恩病(crohn'sdisease,cd)等疾病，并能缓解抗风湿性药物(dmard)治疗无效的中至重度ra患者的体征和症状。

fab是igg分子的抗原结合片段，是由fd片段与轻链通过二硫键结合形成的异二聚合体，因其相对分子质量小、有高度确定的完整性结构和免疫原性低等优点成为igg类抗体生产和改造的首选。由于fab片段没有fc段，不需要进行复杂的糖基化和翻译后修饰，所以不需要通过哺乳动物细胞系统来生产。而bac-to-bac昆虫细胞表达系统与其他真核表达系统相比有许多优势：能高水平表达外源基因；大多数表达的重组蛋白可溶；能进行翻译后的加工修饰：包括糖基化、磷酸化、酰基化、信号肽切除等；较容易分离纯化；昆虫细胞悬浮生长易放大培养，有利于大规模表达重组蛋白。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种在昆虫细胞/杆状病毒表达系统中分泌共表达获得重组adalimumabfab片段的制备方法。本发明人经研究发现，通过利用昆虫细胞作为宿主进行表达，可获得具有生物活性的重组adalimumabfab蛋白。

在此，本发明提供一种全人源单克隆抗体adalimumabfab片段的制备方法，包括：

(a)将n端分别带有信号肽的fab片段的重链(heavychain，hc)与轻链(lightchain，lc)的氨基酸序列的基因克隆于带有双启动子的杆状病毒表达载体(优选为pfastbact1)内构建重组表达载体；

(b)将所得的重组表达载体转座至感受态细胞中，筛选重组菌斑，提取重组质粒，并将其转染至昆虫细胞中，得到重组杆状病毒后进一步扩增病毒，并使用病毒感染放大培养的昆虫 细胞以表达fab蛋白，离心收集含fab蛋白的上清产物；

(c)将所得昆虫细胞表达上清首先使用膜包进行超滤浓缩和置换缓冲溶液，然后色谱柱纯化，即可得到全人源单克隆抗体adalimumabfab片段。

本发明运用基因工程等技术手段，将带有信号肽(例如acnpvgp64)的fab片段的重链与轻链分别克隆至杆状病毒载体(例如pfastbact1)中，获得重组质粒，将重组质粒转座到感受态细胞(例如dh10bac)中获得重组bacmiddna，转染昆虫细胞(例如sf9)获得重组杆状病毒，利用病毒感染昆虫细胞，分泌共表达目的蛋白，离心收集含目的蛋白的上清产物。再进行色谱柱纯化，得到有生物活性的adalimumabfab蛋白。经本发明方法获得的全人源单克隆抗体adalimumabfab片段经分析显示纯度较高，且能特异性结合tnf-α，其抑制效果与标准品humira相似，说明本发明方法fab片段保留了标准品humira具备的抗原结合性和特异性；而该fab片段分子量低易靶向作用于病灶，另外昆虫细胞悬浮生长易放大培养，该fab片段可以在昆虫细胞中大规模表达生产，易于分离纯化。

本发明中，选用昆虫细胞杆状病毒表达载体pfastbact1共分泌表达，能容纳大分子的插入片段，表达多种外源基因并可以高效并大量表达外源基因。通过添加外分泌信号肽可以分泌共表达fab蛋白于昆虫细胞上清中，利用胞外的氧化环境，能够指导fab重链和轻链间二硫键的形成。

较佳地，在步骤(a)中，所述重组表达载体为pfastbact1，包括：两个启动子、复制子、多克隆酶切位点、和两个终止子。

较佳地，在步骤(a)中，fab片段的lc与hc的n端的信号肽为外分泌信号肽acnpvgp64。较佳地，fab片段的重链和轻链的启动子皆为多角体基因启动子(polyhedrin(ph)promoter)。

较佳地，在步骤(b)中，所述感受态为dh10bac。较佳地，转座菌斑筛选方法为蓝白斑筛选法。

较佳地，在步骤(b)中，所述昆虫细胞为sf9细胞。较佳地，转染试剂可为脂质体cellfection，另外，转染步骤中所用培养基可为sf-900^tmiisfm培养基。

较佳地，在步骤(b)中，所述重组杆状病毒p0扩增病毒p1，即将200μl重组杆状病毒p0加入100ml细胞密度为2×10⁶cells/ml的sf9昆虫细胞中，37℃摇床培养96h后离心获得病毒p1。

较佳地，在步骤(b)中放大培养细胞并表达所用的培养基为esfaf培养基。

较佳地，在步骤(c)中，所述纯化依次包括：使用膜包进行超滤浓缩和置换缓冲溶 液；以及亲和层析和分子筛介质层析。

较佳地，在步骤(c)中，所述亲和柱层析的亲和层析介质为proteinl。

较佳地，在步骤(c)中，所述分子筛介质层析的分子筛层析介质为superdex75。

获得纯化的fab蛋白后，可将其使用elisa、和tnf-α的细胞中和活性方法验证分析。较佳地，纯化fab对tnf-α的细胞中和活性分析可使用小鼠成纤维细胞l929细胞和cellcountingkit-8(cck-8)。经分析可知，本发明获得的fab蛋白能与抗原tnf-α特异性结合且抑制其效果，与标准品humira相比无明显差异，说明其具备与标准品humira相同的抗体性质和特异性。由本发明的制备方法所制备的全人源单克隆抗体adalimumabfab片段可用于治疗由tnf-α升高引起的相关疾病主要包括类风湿性关节炎和癌症。

附图说明

图1为adalimumabfab抗体片段重组表达载体图谱；

图2为proteinl亲和纯化后的fabsds-page电泳图；其中的图a为在非还原条件下电泳所得结果，图b为还原条件下电泳所得结果；fab为igg1抗原结合区hc和lc二聚体，还原条件下为23kd两条电泳条带，非还原条件下在47kd处有单一电泳条带；

图3为分子筛层析纯化后的fabsds-page电泳图，其中的图a为在非还原条件下电泳所得结果，图b为还原条件下电泳所得结果；

图4为分子筛层析纯化并浓缩后的fabsds-page电泳图，表明获得的fab抗体片段具有较高纯度；

图5为westernblot检测分子筛层析纯化并浓缩后的图；

图6为elisa测定纯化的adalimumabfab抗体片段与抗原tnf-α特异性结合能力及抗体活性的图；

图7为本发明表达纯化fab蛋白与humira对tnf-α的细胞中和活性实验的ic50曲线。

具体实施方式

以下结合附图和下述实施方式进一步说明本发明，应理解，附图及下述实施方式仅用于说明本发明，而非限制本发明。

本发明运用基因工程等手段，利用杆状病毒作为表达载体，利用昆虫细胞作为宿主，表达adalimumabfab片段。在一个示例中，本发明的制备方法包括：将分别带有acnpvgp64信号肽的fab片段的重链和轻链克隆至杆状病毒载体pfastbact1中，构建重组表达载体，将重组质粒转座到感受态细胞dh10bac中获得重组bacmiddna并转染至sf9昆虫细胞中获得重组杆状病毒，利用病毒感染sf9昆虫细胞，分泌共表达fab目的蛋白，离心 获得含目的蛋白的上清产物；对所得的蛋白进行色谱柱纯化，得到adalimumabfab蛋白。以下，示例性地说明本发明的制备方法。

(1)重组表达载体的构建

分别合成带有信号肽的fab片段的重链与轻链的基因，克隆于带有双启动子的pfastbact1载体内，构建adalimumabfab抗体片段重组表达载体(fabinpfastbact1)。

优选地，在hc和lc的n端各加上一个外分泌信号肽acnpvgp64。

在一个示例中，lc之前添加信号肽acnpvgp64形成acnpvgp64+lcinpfastbact1。优选地，利用5'bamhi和3'ecori插入于第一个启动子之后。

在另一个示例中，在hc之前添加信号肽acnpvgp64形成acnpvgp64+hcinpfastbact1。优选地，利用5'xhoi和3'hindiii插入于第二个启动子之后。

所构建的adalimumabfab抗体片段重组表达载体图谱如图1所示。由图1可知，该重组表达载体包括：两个昆虫细胞启动子、复制子、多克隆酶切位点和两个终止子。

(2)fab片段在昆虫细胞中的表达

重组质粒的制备：将所构建的adalimumabfab抗体片段重组表达载体转座至感受态细胞(例如dh10bac)中，筛选重组菌斑，提取重组质粒。其中，转座菌斑筛选方法可为蓝白斑筛选法。

重组bacmid转染sf9昆虫细胞，转染试剂可为脂质体cellfection，培养基可为sf-900^tmiisfm培养基，得到fab-p0代病毒。转染得到的p0代病毒进一步扩增病毒得到p2。在一个示例中，扩增方法为：将200μl重组杆状病毒p0加入100ml细胞密度为2×10⁶cells/ml的sf9昆虫细胞中，37℃摇床培养96h后离心获得病毒p1。使用p2感染昆虫细胞表达fab蛋白。

(3)fab的纯化

fab蛋白的表达为可溶性外分泌表达，表达所用的培养基可为esfaf培养基，病毒扩增感染细胞培养至细胞有感染迹象且细胞百分数80％左右时收集细胞悬液，离心机3000g4℃下离心10min，收集上清溶液，使用vivaflow200切向流超滤膜包将上清进行浓缩并置换缓冲液，方便后续的分离与纯化。然后进行色谱柱纯化，获得高纯度的fab片段。优选地，依次通过亲和柱层析和分子筛介质层析进行纯化。在一个示例中，亲和柱层析的亲和层析介质为proteinl。在另一个示例中，分子筛介质层析的分子筛层析介质为superdex75。在纯化过中，可以使用sds-page电泳分析蛋白纯度。可以使用30kdmilipore超滤管浓缩蛋白。

(分析与检测)

可以使用sds-page电泳分析目的蛋白fab片段。图2、3分别示出经亲和柱层析、分子筛介质层析所获得的蛋白的sds-page电泳图，用以表征蛋白的纯度。该两幅图中的图a均为非还原条件，图b均为还原条件。由图2可知，fab为igg1抗原结合区hc和lc的二聚体，还原条件下在23kd处有两条电泳条带，从上至下分别为hc和lc，非还原条件下在47kd处有单一电泳条带为fab片段。图4示出分子筛层析纯化并浓缩后的fab蛋白的sds-page电泳图，其中泳道1样品为非还原条件下处理，泳道2为还原条件下处理，由图4可知缩后的fab抗体片段的纯度大于98％。图5示出westernblot检测分子筛层析纯化并浓缩后的fab片段，检测中使用hrp标记的羊抗人lgk特异性抗轻链抗体，其中泳道1中样品为还原条件下处理，泳道2中样品为非还原条件下处理。

可以使用elisa测定纯化的adalimumabfab片段与抗原tnf-α特异性结合能力及抗体活性。图6示出该测试结果。由图6可知，adalimumabfab抗体片段能与抗原tnf-α特异性结合，说明该fab片段保留了标准品humira具备的抗体性质和特异性。因此，根据本发明的制备方法所制备的fab片段可应用于制备治疗与tnf-α水平升高有关的疾病(例如类风湿性关节炎、癌症等)的药物。

本发明与现有技术相比具有的优点：

(1)本发明所制备的fab片段分子量小，因此在到达肿瘤靶部位的过程中穿透力大；

(2)本发明所制备的fab片段保留了全抗体对tnf-α的高特异性和高亲和力，并且其半衰期较同类药物长，可以减少药物的使用次数；

(3)昆虫细胞系统表达的重组蛋白具有完整的生物学功能，能正确折叠并形成fab分子间重要的二硫键，表达产物在结构及功能上接近天然蛋白；

(4)能进行翻译后的加工修饰：包括糖基化、磷酸化、酰基化、信号肽切除等；

(5)与其他真核表达系统相比，杆状病毒表达系统可以高效表达外源基因，表达量高；

(6)能容纳大分子的插入片段：杆状病毒毒粒可以扩大，能包装大的基因片段并可以在昆虫细胞中表达多种外源基因；

(7)纯化过程中，使用亲和层析-分子筛层析法纯化获得纯度大于98％的抗体蛋白，是一种操作简单方便，低成本，高产出的抗体片段纯化制备方法；

(8)本发明提供了一种adalimumabfab抗体片段的制备方法，为获得高质量的单克隆抗体fab片段奠定了基础。

下面进一步例举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的 上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

(1)重组质粒的构建

首先扩增基因lc，添加信号肽acnpvgp64将基因acnpvgp64+lc克隆至载体pfastbact1，构建质粒acnpvgp64+lcinpfastbact1。然后从模板质粒fabinpetduet1中扩增基因hc，添加信号肽acnpvgp64，3’终止密码子taa，将基因acnpvgp64+hc克隆至载体pfastbact1，构建质粒acnpvgp64+hcinpfastbact1。最终从模板质粒acnpvgp64+hcinpfastbact1中扩增基因phpromoter+acnpvgp64+hc，使用重组的方法将基因phpromoter+acnpvgp64+hc克隆至载体acnpvgp64+lcinpfastbact1，构建质粒acnpvgp64+lcandacnpvgp64+hcinpfastbact1。

(2)fab在sf9昆虫细胞中的表达

sf9昆虫细胞在27℃，90rpm的条件下摇瓶培养。当sf9昆虫细胞浓度达到2.0×10⁶cells/ml时，以感染复数(moi)为1pfu/cell的比例加入p2代病毒(即每升细胞加入20ml的p2病毒)，于27℃培养箱内进行病毒感染。fab蛋白的表达为可溶性外分泌表达，病毒扩增感染细胞培养至细胞有感染迹象且细胞百分数80％左右时收集细胞悬液，离心机3000g4℃离心10min，收集细胞上清。

(3)fab表达上清的浓缩与缓冲液置换

fab蛋白的表达为可溶性外分泌表达，离心收集的上清溶液，使用vivaflow200切向流超滤膜包进行浓缩并置换缓冲液，方便后续的分离与纯化。

(4)色谱柱纯化

第一步proteinl亲和层析

1)色谱柱：亲和层析介质：proteinl亲和填料；

2)proteinl亲和柱的制备

3)样品处理：将完成浓缩和置换缓冲溶液的上清溶液离心取上清；

4)缓冲液配置：缓冲液a：50mmol/ltris-hclph7.2，150mmol/lnacl，10％glycerol，缓冲液b：0.1mol/lglycine,ph2.5；

5)纯化过程：用缓冲液a预先平衡填料，样品上样后以缓冲液a平衡柱子，再用缓冲液b洗脱，ep管收集并中和洗脱下的fab蛋白至ph7.0左右；

6)结果：收集目标蛋白峰，测蛋白浓度计算回收率，sds-page分析蛋白纯度(图2)。结果表明该蛋白纯度为大于90％。

第二步分子筛层析

1)色谱柱：hiload16/60superdex75prepgrade，美国ge公司；

2)样品处理：通过proteinl亲和层析洗脱的目标蛋白利用截留分子量为30kd的超滤浓缩管浓缩至2-4ml；

3)缓冲液配置：缓冲液为50mmol/ltris-hclph7.0，150mmol/lnacl，10％glycerol；

4)纯化过程：用缓冲液预先平衡分子筛，上样，以1ml/min进行洗脱；

5)结果：收集目标蛋白峰，样品进行sds-page电泳(图3)。结果表明该蛋白纯度大于98％。

最后，对纯化产物使用millipore超滤系统超滤浓缩，截留分子量为30kd的再生纤维素膜包对纯化后的蛋白质溶液进行脱盐和浓缩，整个纯化组合合理，操作简单，工艺稳定。sds-page分析蛋白纯度(图4)。westernblot分析提取结果，恒压下进行sds-page，结束后将胶卸下进行转膜，60min结束后将膜从电转槽中取出，浸没于封闭液中缓慢摇荡1h，然后用含hrp标记的羊抗人lgk特异性抗轻链抗体的封闭液室温下轻摇孵育1h，孵育结束后，用pbst漂洗膜后再浸洗3次，每次5～10min，之后使用ecl法显色(图5)。结果表明在昆虫细胞中存在分泌表达的adalimumabfab抗体hc和lc，且轻链与重链形成二硫键结合的异二聚体。

(5)间接elisa法分析adalimumabfab的抗原结合性能

将抗原tnf-α包被在96孔酶标板上，4℃冰箱放置过夜。洗涤后加入1％bsa封闭液，用稀释液将纯化的fab蛋白和hurmia作同样的梯度稀释，每孔100μl，设置副孔以保证实验结果的准确性，加入hrp-羊抗人lgk特异性抗轻链抗体，tmb(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)作为底物显色，使用spectramaxm5酶标仪记录450nm-650nm的读数，数据使用graphpadprism5软件进行处理(图6)。结果表明表达纯化所得的adalimumabfab片段能与抗原tnf-α特异性结合。

tnf-α的细胞中和活性实验

将小鼠成纤维l929细胞以2×10³个细胞每孔100ul铺96孔板，放置于37℃的co2培养箱中培养过夜，梯度稀释纯化的fab样品和hurmia，加入50μl一定浓度的tnf-α和50μl不同浓度的fab样品，标准品为阳性对照组(hurmia+培养基)和tnf-α对照组(tnf-α+培养基)，37℃co2培养箱中孵育2d后加入cck-8染色1-4h，酶标仪测定波长450nm-650nm处吸收 值(图7)，数据使用graphpadprism5软件进行处理，结果显示，本发明获得的fab蛋白能与抗原tnf-α特异性结合且抑制其效果，且与标准品humira相比无明显差异。

以上结果显示，制备得到纯度较高的adalimumabfab抗体片段，且能与抗原tnf-α特异性结合，说明该fab片段保留了hurmia具备的抗体性质和特异性。