(一)技术领域
本发明涉及一种脂肪酶催化在线可控选择性合成5'-o-乙酰-5-氟尿苷的方法
(二)
背景技术：
核苷类药物在病毒性疾病的治疗中占有重要的地位。目前临床上使用的抗病毒药物中，核苷类药物所占比重达60％以上。大多数核苷类化合物为多羟基化合物，存在极性较高、肠道通透性较低，脂溶性差、毒副作用大以及口服生物利用度较低等缺陷。核苷类化合物通过酯化修饰后，可增强其脂溶性，提高药理活性，提高其口服生物利用度。在通常的化学法酯化过程中，多个羟基都有可能参与酯化，产物为单酯及多酯的混合物，因而需经“基团保护---酯化---脱保护基团”三步才能获得单一位置酯化的产物。而酶对底物有良好的专一性和选择性，可以选择性对核苷的某个羟基进行酯化，反应选择性较高，减少了产物后续分离的困难，因此生物催化技术在核苷类化合物的酯化中扮演着越来越重要的角色。
微流控学(microfluidics)是在微米级结构中操控纳升至皮升体积流体的技术与科学，是近十年来迅速崛起的新交叉学科。当前，微流控学的发展已大大超越了原来的主要为分析化学服务的目的，而正在成为整个化学学科、生命科学、仪器科学乃至信息科学新一轮创新研究的重要技术平台。
自1997年harrison课题组发表了首篇在微流控芯片微反应器中合成化合物的文献后，微流控芯片反应器已成功地用于多种有机合成反应，并展示了广泛的应用前景。随着微流控芯片中微混合、微反应技术的发展，在芯片中进行合成反应已经成为微流控芯片领域的研究热点之一。
同常规化学反应器相比，微通道反应器不仅具有使反应物间的扩散距离大大缩短，而且传质速度快；反应物配比、温度、反应时间和流速等反应条件容易控制，副反应较少；需要反应物用量甚微，不但能减少昂贵、有毒、有害反应物的用量，反应过程中产生的环境污染物也极少，是一种环境友好、合成研究新物质的技术。
目前，有较多的国内外学者对有机介质中核苷酰化反应的酶催化合成进行了研究，但是该方法多选用酰化酶进行催化，往往需要较长的反应时间(12-24h)， 且反应的转化率与选择性不高，因此我们研究了微通道反应器中脂肪酶催化在线合成5'-o-乙酰-5-氟尿苷的方法，旨在寻找一种高效环保的5'-o-乙酰-5-氟尿苷的在线可控选择性合成方法。
(三)
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种微流控通道反应器中脂肪酶催化在线合成5'-o-乙酰-5-氟尿苷的新工艺，具有反应时间短、产率高、选择性好的优点。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种脂肪酶催化在线合成5'-o-乙酰-5-氟尿苷的方法，所述方法采用微流控通道反应器，所述的微流控通道反应器包括注射泵、注射器、反应通道和产物收集器，所述注射器安装于注射泵中，通过一个接口与反应通道入口连接，所述产物收集器通过一个接口与反应通道出口连接，所述反应通道内径为0.8～2.4mm，反应通道长为0.5～1.0m；所述方法包括：以体积比为1:8～16的二甲亚砜(dmso)和叔戊醇为反应溶剂，以摩尔比为1:5～13的5-氟尿苷与乙酸乙烯酯为原料，以0.5～1.0g脂肪酶lipozymetlim为催化剂，将原料和反应溶剂置于注射器中，将脂肪酶lipozymetlim均匀填充在反应通道中，在注射泵的推动下使原料和反应溶剂连续通入反应通道中进行酰化反应，使反应体系(原料+反应溶剂)中5-氟尿苷的浓度为0.03～0.07mmol/ml，控制酰化反应温度为15～50℃，酰化反应时间为20～35min，通过产物收集器在线收集反应液，反应液经常规后处理得到5'-o-乙酰-5-氟尿苷。
本发明采用的微流控通道反应器中，所述注射器数目可以是一个或多个，视具体反应需求而定。比如，当使用两个注射器时，可采用t型或y型接口使不同的反应物从两个入口引入，汇流进入公共的反应通道，通过微通道的中反应物分子接触与碰撞几率增大，使两股反应液流在公共的反应通道中混合并进行反应。
所述的微流控通道反应器还包括恒温箱，所述的反应通道置于恒温箱中，以此可以有效控制反应温度。所述的恒温箱可以根据反应温度要求自行选择，比如水浴恒温箱等。
本发明对于反应通道的材质不限，推荐使用绿色、环保的材质，例如硅胶管；对于反应通道的形状最好为曲线形，可以保证反应液匀速稳定的通过。
本发明在实施过程中，先用dmso溶解5-氟尿苷，再继续加叔戊醇至一定 体积，装于注射器中备用；然后用叔戊醇溶解乙酸乙烯酯至一定体积，装于另一注射器中备用；最后在注射泵(例如pd1200注射泵)推动下使原料和反应溶剂通入反应通道中进行反应。
本发明中，所述的脂肪酶lipozymetlim使用诺维信(novozymes)公司生产的商品，其是一种由微生物制备的、1,3位置专用、食品级脂肪酶(ec3.1.1.3)在颗粒硅胶上的制剂。它是从thermomyceslanuginosus得到的、用一种基因改性米曲霉(aspergillusoryzae)微生物经过深层发酵生产的。
进一步，所述反应溶剂中二甲亚砜和叔戊醇的体积比优选为1:12～1:16，优选为1:14。
进一步，所述5-氟尿苷与乙酸乙烯酯的摩尔比优选为1:9～11，最优选为1:9。
进一步，反应体系中5-氟尿苷的浓度优选为0.04～0.06mmol/ml，最优选为0.05mmol/ml。
进一步，所述酰化反应温度优选为20～40℃，最优选为30℃。
进一步，所述酰化反应时间优选为25～35min，最优选为30min。
本发明的反应产物可以在线收集，所得反应液可以通过常规后处理方法即可获得5'-o-乙酰-5-氟尿苷。所述常规后处理方法可以是：所得反应液减压蒸馏除去溶剂，用200-300目硅胶湿法装柱，洗脱试剂为乙酸乙酯:甲醇＝20:1，样品用少量洗脱试剂溶解后湿法上柱，收集洗脱液，同时tlc跟踪洗脱进程，将得到的含有单一产物的洗脱液合并蒸干，可以得到白色固体，即为5'-o-乙酰-5-氟尿苷。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明在微流控通道反应器中利用脂肪酶催化在线合成5'-o-乙酰-5-氟尿苷，该法不仅大大地缩短了反应时间，而且具有高的转化率和选择性；同时首次利用经济的脂肪酶lipozymetlim催化核苷酯化反应，降低了反应成本，具有经济高效的优势。
(四)附图说明
图1为本发明实施例采用的微流控通道反应器的结构示意图。
(五)具体实施方式
下面以具体实施例对本发明的保护范围作进一步说明，但本发明的保护范围 不限于此：
本发明实施例使用的微流控通道反应器的结构参考图1，包括一个注射泵(未显示)、两个注射器1和2、反应通道3、水浴恒温箱(5，仅显示其平面示意图)和产物收集器4；两个注射器1和2安装于注射泵中，通过一个y型接口与反应通道3入口连接，所述反应通道3置于水浴恒温箱5中，通过水浴恒温箱5控制反应温度，所述的反应通道3的内径2.0mm，管长1m，所述反应通道3出口通过一接口与产物收集器4连接。
实施例1：5'-o-乙酰-5-氟尿苷的合成
装置参考图1：将5-氟尿苷(1.0mmol)溶解在1.33mldmso和8.67ml叔戊醇的中，乙酸乙烯酯(9.0mmol)溶解在10ml叔戊醇中，然后分别装于10ml注射器中备用。0.87g脂肪酶lipozymetlim均匀填充在反应通道中，在pd1200注射泵推动下，两路反应液分别以10.4μl·min-1的流速通过“y”接头进入反应通道中进行反应，通过水浴恒温箱控制反应器温度在30℃，反应液在反应通道内连续流动反应30min，反应结果通过薄层色谱tlc跟踪检测。
通过产物收集器在线收集反应液，减压蒸馏除去溶剂，用200-300目硅胶湿法装柱，洗脱试剂为乙酸乙酯:甲醇＝20:1，柱高35cm，柱直径4.5cm，样品用少量洗脱试剂溶解后湿法上柱，洗脱液收集流速2ml·min-1，同时tlc跟踪洗脱进程，将得到的含有单一产物的洗脱液合并蒸干，得到白色固体，获得5'-o-乙酰-5-氟尿苷，hplc检测5-氟尿苷转化率82％，选择性98％。
核磁表征结果如下：
1h-nmr(dmso-d6,δ,ppm)：11.90(s,h3),7.97(d,j＝7hz,h6),7.62(d,j＝9hz,h6),5.72(d,1h,j＝4.5hz,h1'),5.67(d,1h,j＝9hz,h5),5.49(d,1h,j＝5.5hz,3'-oh),5.28(d,1h,j＝5.5hz,2'-oh),4.24(m,2h,h2'+h3'),4.10(m,1h,h4'),3.98(m,2h,h5'),2.06(s,3h,h2”).
13cnmr(dmso-d6,ppm)：170.14(c1”),156.93(c4),149.25(c2),139.18(c6), 125.05(c5),89.11(c1'),81.10(c4'),72.68(c3'),69.46(c2'),63.51(c5'),20.58(c2”).
实施例2-6
改变微流控通道反应器中有机溶剂体积比，控制温度为50℃，其他同实施例1，反应结果如表1所示：
表1:有机溶剂体积比对反应的影响
表1的结果表明，当流速为10.4μl·min-1，反应时间均为30min，反应温度均为50℃，反应物5-氟尿苷与乙酸乙烯酯摩尔比均为1:9，反应体系中5-氟尿苷的浓度均为0.05mmol/ml时，转化率随反应器中叔戊醇含量增大而增加，当体积比达到1:14时达到最佳，再继续增大叔戊醇含量将会导致反应物溶解不完全而降低转化率。所以本发明中微流控微通道反应器中最佳dmso:叔戊醇体积比为1:14。
实施例7-11
改变微流控微通道反应器中5-氟尿苷与乙酸乙烯酯的底物摩尔比，控制温度50℃，其他同实施例1，结果如表2所示：
表2:5-氟尿苷与乙酸乙烯酯底物摩尔比对反应的影响
表2的结果表明，当流速为10.4μl·min-1，反应时间均为30min，反应温度均为50℃，dmso:叔戊醇体积比为1:14，反应体系中5-氟尿苷的浓度均为0.05mmol/ml时，随着反应物乙酸乙烯酯的增加，反应的转化率也随着增加，当5-氟尿苷与乙酸乙烯酯底物摩尔比为1:9时，反应的转化率最优，所以本发明中微流控微通道反应器中最佳底物摩尔比为1:9。
实施例12-15
改变微流控通道反应器的温度，其他同实施例1，反应结果如表3所示：
表3：温度对反应的影响
表3的结果表明，当流速为10.4μl·min-1，反应时间均为30min，反应器中dmso:叔戊醇体积比均为1:14，反应物5-氟尿苷与乙酸乙烯酯摩尔比均为1:9，反应体系中5-氟尿苷的浓度均为0.05mmol/ml时，当反应温度处于30℃时，反应的转化率最佳，温度或太高或太低都将影响酶的活性。所以本发明中微流控微通道反应器中最佳温度为30℃。
实施例16-18
改变微流控通道反应器的反应时间，其他同实施例1，反应结果如表4所示：
表4：反应时间对反应的影响
表4的结果表明，当反应器中有机溶剂dmso:叔戊醇体积比均为1:14，反应物5-氟尿苷与乙酸乙烯酯摩尔比均为1:9，反应温度均为30℃，反应体系中5-氟尿苷的浓度均为0.05mmol/ml时，当反应时间为30min的时候，反应转化率达到82％。所以本发明中微流控微通道反应器中最佳反应时间为30min。
实施例19-22
改变微流控通道反应物的浓度，其他同实施例1，反应结果如表5所示：
表5：反应物浓度对反应的影响
表5的结果表明，当反应器中有机溶剂dmso:叔戊醇体积比均为1:14，反应物5-氟尿苷与乙酸乙烯酯摩尔比均为1:9，反应温度均为30℃，反应时间均为30min，反应体系中5-氟尿苷浓度为0.05mmol/ml的时候，反应转化率高达82％，所以本发明中微流控微通道反应器中最佳反应物5-氟尿苷浓度为0.05mmol/ml。
对比例1-3
改变微流控微通道反应器中的催化剂，分别改为脂肪酶lipozymermim(对比例1)、脂肪酶novozym435(对比例2)、枯草杆菌碱性蛋白酶(对比例3)，其他同实施例1，结果如表6所示。
表6：不同酶对反应转化率及选择性的影响
表6的结果表明，对于微流控通道反应器中酶促5-氟尿苷的区域选择性酯化反应而言，不同的酶对反应有着十分明显的影响。利用脂肪酶lipozymermim催化反应，5'-o-乙酰-5-氟尿苷的转化率为40％。而利用枯草杆菌碱性蛋白酶催化该反应，5'-o-乙酰-5-氟尿苷的转化率仅为5％。从表6的结果看，对于微流控通道反应器中酶促5-氟尿苷的区域选择性酯化反应而言，最有效的催化剂为脂肪酶lipozymetlim，5-氟尿苷的转化率为82％，选择性为98％。
对比例4-5
改变微流控微通道反应器中不同种类的尿苷化合物，将实施例1的5-氟尿苷1mmol分别改为鸟苷1mmol(对比例4)、3'-脱氧尿苷1mmol(对比例5)、其他同实施例1，结果如表7所示。
表7：不同核苷类化合物对反应的影响
表7的结果表明，对于微流控通道反应器中酶促核苷类化合物的区域选择性酯化反应而言，不同的核苷类化合物都有不同的反应结果。3'-脱氧尿苷在同样的反应条件下，转化率仅为17％，反应比较困难。鸟苷的反应结果也不理想，转化率仅为23％。从表7的结果看，对于微流控通道反应器中酶促核苷类化合物的区域选择性酯化反应而言，5-氟尿苷可以取得比较理想的反应结果，反应的转化率可以达到82％，选择性为98％。