本发明涉及一种大米蛋白的制备方法。
背景技术：
：大米蛋白是一种优质的植物蛋白，它含有丰富的必需氨基酸，且氨基酸组成模式与世界卫生组织(worldhealthorganization,who)及联合国粮食及农业组织(foodandagricultureorganizationoftheunitednations,fao)的推荐模式相近，易于被人体消化吸收。另外，大米蛋白具有低过敏性的特点，非常适合作为特殊人群尤其是病人的蛋白补充剂。但由于大米蛋白主要成分谷蛋白结构的特殊性，分子间及分子内存在大量巯基和二硫键，使得大米蛋白在中性条件下难溶于水，影响了其在食品和保健品行业方面的应用，因此，改善大米蛋白的溶解性是解决问题的关键。提高蛋白质溶解性的方法有物理方法、化学方法和生物方法，其中酶法改性具有专一性强、条件温和、无毒副作用等特点而广泛应用于多种植物蛋白溶解性的改性研究。一般选用大豆蛋白、花生蛋白、米糠蛋白等之蛋白酶，期能够将蛋白质分子的肽链水解断裂，改善蛋白的溶解性，达到促进难溶性植物蛋白粉溶解度的效果。中国专利cn1417344c，于2003年公开，揭露了一种从米糟中提取大米蛋白的新工艺，其特征在于味精厂的副产品米糟与复合酶按重量计的配比是1000∶1.5～4.5；其中复合酶由淀粉酶0.05％-0.15％、脂肪酶0.025％-0.075％、纤维素酶0.025％-0.075％和蛋白酶0.05％-0.15％组成；工艺是：把米糟加入容器中，用盐酸调ph至3，温度调至35-40℃，按配比加入纤维素酶，反应30分钟，加入30％naoh，调ph5.0-5.5，加入脂肪酶，反应30分钟，再加naoh调ph至中性7.0，加入淀粉酶、蛋白酶，反应20分钟后升温至60-70℃，反应30分钟，过滤，滤渣中加ph9.5的稀碱液溶解，控制温度在60℃以下，得到蛋白溶液，再用酸将ph调至5.5，蛋白沉淀，即得到含量75％的浓缩大米蛋白。另一中国专利cn1257984c，于2006年公开，揭露例如一种大米蛋白肽的制备方法，其特征在于将大米渣和水按重量比1∶4-6混合，温度55-60℃，保温30分钟，然后，按酶制剂的活力为50,000u/mg计，分别加入大米渣重量0.05％-0.1％的α- 淀粉酶和中性蛋白酶，其中，α-淀粉酶与中性蛋白酶的重量比是1∶1，在ph6.5-7.5和温度50-60℃下，搅拌5-7小时，过滤反应物，所得的液体喷雾干燥，得到白色粉末产品，其中大米蛋白肽的含量约为80％。目前，仍需持续开发较佳的大米蛋白的制备方法，以改善大米蛋白难溶解的问题及提高蛋白收率。技术实现要素：为改善大米蛋白难溶解的问题及提高蛋白收率，本发明提供了一种大米蛋白的制备方法，本发明利用木瓜蛋白酶与中性或碱性蛋白酶组成的复合酶酶解大米蛋白粉，可以显着的改善大米蛋白的溶解性，提高大米蛋白溶解度达60％以上，并得到的大米蛋白产物的蛋白质收率达90％以上。在一方面，本发明提供一种改善大米蛋白粉溶解度以提升蛋白质收率的大米蛋白的制备方法，其特征在于将大米蛋白粉与水以适当比例混合，以一酶组合处理，其中该酶组合为木瓜蛋白酶与中性蛋白酶组成的复合酶，或木瓜蛋白酶与中性蛋白酶组成的复合酶，木瓜蛋白酶与中性或碱蛋白酶的重量比例为1：1-3。在本发明的一具体实施例中，该复合酶中木瓜蛋白酶与中性蛋白酶，或木瓜蛋白酶与碱性蛋白酶的重量比例为1：2。根据本发明，该酶组合进一步包含一风味酶改善苦味。在本发明的一具体实施例中，该风味酶为米曲霉(aspergillusoryzae)与氨肽酶(aminopeptidases)的组合。在本发明的一具体实施例中，本发明方法特征在于包含下列步骤：该大米蛋白粉按适当比例加水搅拌均匀，调节所得溶液ph值至中到碱性，加入该酶组合酶解，持续搅拌一段时间后升温灭酶，经过滤、浓缩、干燥而得。在另一方面，本发明提供一种由本发明所述方法制得的大米蛋白产品，该大米蛋白产品中大米蛋白溶解度大于60％，大米蛋白的蛋白质收率大于90％。具体实施方式除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员一般理解的相同的含义。本文所使用的单数形”一”及”该”包括复数的参照物，除非上下文另有明确说明。因此，举例来说，提及”一样品”包括复数个该样品及其为本领域技术人员熟知的等 同物。本文所使用的"木瓜蛋白酶(papain)"一词，或简称木瓜酶、木瓜酵素，存在于木瓜果实中的一种半胱氨酸蛋白酶。木瓜蛋白酶对于嫩化肉类起着重要作用，为一种内切蛋白酶，具有蛋白酶和酯酶的活性。本文所使用的"中性蛋白酶(neutralprotease)"一词，是一类最适作用ph位于6.0-7.5之间，分子量为35000-40000，等电点为8-9。其作用条件温和，是经选育的枯草芽孢杆菌深层发酵培养，后经先进的提取工艺精制而成的一种内切蛋白酶，能将大分子蛋白质分解为多肽及氨基酸等产物，形成独特的水解风味。中性蛋白酶是最早发现并广泛应用于工业化生产的蛋白酶制剂，可用于焙烤食品工业中、阿斯巴甜的合成、蛋白水解物苦昧的去除等。本文所使用的"碱性蛋白酶(alkalineprotease)"一词，是一种经细菌原生质体诱变方法培育的一种枯草杆菌品种通过深层发酵、提取及精制而成的一种蛋白水解酶，属丝氨酸脆外高碱性蛋白酶，它能在碱性条件下水解蛋白质分子肽链生成多肽或氨基酸。本文所使用的"米曲霉(aspergillusoryzae)"一词，是一种风味酶，包含了内切蛋白酶与外切肽酶两种活性，可以用来去除低水解度产物的苦肽链，将其彻底降解为氨基酸。本文所使用的"氨肽酶(aminopeptidases)"一词，是一种从蛋白质或肽链的氨端选择性切割氨基酸残基的外肽酶，可使氨基酸从多肽链的n-末端顺序逐个地游离出来。由于大米蛋白主要成分谷蛋白在分子间及分子内存在大量巯基和二硫键，使得大米蛋白在中性条件下难溶于水。根据本发明，其特征在于使用一酶组合，包含木瓜蛋白酶与中性蛋白酶组成的复合酶，或木瓜蛋白酶与中性蛋白酶组成的复合酶，改善大米蛋白难溶解的问题及提高蛋白收率。本发明提供一种使用特殊酶组合以改善大米蛋白如解度及提升蛋白质收率的大米蛋白的制备方法。本发明方法包含将大米蛋白粉与水以适当比例混合，以一酶组合处理，其中该酶组合为木瓜蛋白酶与中性蛋白酶组成的复合酶，或木瓜蛋白酶与碱性蛋白酶组成的复合酶。但经酶解处理后往往会有苦味，因此加入风味酶改善苦味。本发明中使用木瓜蛋白酶与中性或碱性蛋白酶的比例，较佳重量比例为1：1-3，优选为1：2。风味酶则可视需要加入以改善苦味。根据本发明，如下实施例中表2与表3的比较，显示本发明利用木瓜蛋白酶与中性蛋白酶组成的复合酶，或木瓜蛋白酶与中性蛋白酶组成的复合酶，其蛋白质收率高达90％以上，远较单独使用其一者为高，其中单独使用木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、米曲霉或氨肽酶的蛋白质收率均不及75％。而米曲霉有改善苦味的效果，不可预期地发现，米曲霉与氨肽酶组合改善苦味效果最佳。本发明方法可按任何习知的方法步骤取得大米蛋白粉，包括但不限于物理或化学方法。例如，可以从大米经粉粹、提纯、干燥等一般提取蛋白质的加工步骤得粉末状得，从而进行本发明方法的酶解。根据本发明的一实施例，是将大米碾碎初步处理取得大米蛋白粉，按适当比例加水搅拌均匀，例如料水重量比为1：3-10，较佳为1:4，调节所得溶液至中性或微碱性，例如约ph8.0。酶解一般是于较高温下酶解一段时间，例如约50-60℃，优选为55℃，持续搅拌后升温至约一高温灭酶，例如约85℃，经过滤、浓缩、干燥制得大米蛋白产品。所得产物可通过常规方法过滤、浓缩、干燥，并进一步进行纯化。提供以下的实施例来说明本发明，而且以下的实施例不会被以任何方式解读为限制本发明的范围。实施例实施例1将大米碾碎初步处理取得大米蛋白粉，按适当比例加水搅拌均匀，例如料水重量比为1：3-10，调节所得溶液ph值至微碱性，例如约ph8.0，加入如下表1的各种酶组合，于较高温下酶解一段时间，例如约50-60℃，持续搅拌后升温至约85℃灭酶，经过滤、浓缩、干燥制得大米蛋白产品，进行检验。表1各实验组的酶组合组别酶组合内容实验组1复合蛋白酶a(木瓜蛋白酶+碱性蛋白酶)+风味酶a(米曲霉)实验组2复合蛋白酶a(木瓜蛋白酶+碱性蛋白酶)+风味酶b(米曲霉+氨肽酶)实验组3复合蛋白酶b(木瓜蛋白酶+中性蛋白酶)+风味酶a(米曲霉)实验组4复合蛋白酶b(木瓜蛋白酶+中性蛋白酶)+风味酶b(米曲霉+氨肽酶)实验组5空白实施例2将实施例1所得的大米蛋白产品，按下列试验方法进行检验。1.溶解度试验方法将一定原料量x按照试验工艺进行水解试验，水解完成后离心分离，收集上清液，并进行干燥，得到干燥后的重量y，则溶解度为2、氨基氮测定实验方法利用氨基酸的两性作用，加入甲醛以固定氨基酸的碱性，使羧基显示出酸性，以氢氧化钠标准溶液滴定后定量。首先，精密吸取1ml样品待测液，加入79ml蒸馏水，开动磁力搅拌器，用浓度为0.05mol/l的氢氧化钠标准溶液滴定到ph8.2，精密加入甲醛10ml，混匀，再用浓度为0.05mol/l的氢氧化钠标准溶液继续滴定至ph9.2，记录加入甲醛后消耗氢氧化钠标准液的体积。接着，取蒸馏水80ml，精密加入甲醛10ml，用浓度为0.05mol/l的氢氧化钠标准溶液滴定至ph9.2，记录消耗氢氧化钠标准溶液的体积，作为实验空白。依下列公式计算：v1：测定样品待测液加入甲醛后消耗氢氧化钠标准溶液的体积(ml)v2：实际空白加入甲醛后消耗氢氧化钠标准溶液的体积(ml)c：氢氧化钠标准溶液的浓度(mol/l)w：称取样品的量0.0141：与1ml氢氧化钠标准溶液相当的以克表示氨基氮的质量3、蛋白质定量试验(凯氏定氮法)样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白水解，其中碳和氢被氧化成二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵，然后加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收后再用标准盐酸溶液滴定，根据盐酸消耗体积计算出蛋白质的含量。首先，准确称取样品0.2-2克(液体1-2ml)，小心移入干燥洁净的消化瓶中，然后加入硫酸铜0.5克，硫酸钾9.5克和浓硫酸20ml，轻摇匀后置于电炉上小火加热。待瓶中内容物全部碳化，泡沫停止产生后，加大火力，保持瓶内液体微沸，至液体变蓝绿色透明后，再继续加热微沸1-2小时(时间长短由蛋白含量决定)。然后，将溶液冷却后，加入200ml纯水，移入蒸馏瓶中，加入40％naoh溶液150ml，瓶口塞紧，冷凝管下端插入吸收瓶液面下，吸收瓶内盛有4％硼酸溶液50ml及混合指示剂2-3滴，加热蒸馏，至氨全部蒸出(蒸馏液越250ml即可)。以0.1mol/lhcl标准液滴定至灰色为终点，同时做空白。依下列公式计算：v1:样品消耗盐酸标准液的体积(ml)v2:实际空白盐酸标准液的体积(ml)w：称取样品的量0.014：与1ml盐酸标准液相当的以克表示氨基氮的质量c：盐酸标准液的浓度(mol/l)f：氮换算成蛋白质的因数，f＝6.25检验结果整理如表2，各实验组的蛋白质收率均高达90％以上，溶解度明显改善，高达60％以上。其中尤以实验组4(复合蛋白酶b+风味酶b)为优选，蛋白质水解度高达98％以上，溶解度70％以上，且无苦味。表2各实验组的检验结果实验组an％(g/100mg)蛋白质收率％溶解度风味实验组10.339796.5％68.9％清淡米香味，苦味明显实验组20.373997.5％72.0％清淡米香味，有苦味实验组30.365496.2％63.8％清淡米香味，少量苦味实验组40.383998.6％73.5％清淡米香味，略带甜味实验组50.00930.4％6.1％无味以相同方法步骤，使用单一酶制剂进行酶解，经检验得结果如表3，各组的蛋白质收率为40％～75％以上，显然，本发明酶组合明显提高了大米蛋白粉的溶解度，改善大米蛋白溶解度，高达60％以上。其中尤以实验组4(复合蛋白酶b+风味酶b)为优选，蛋白质水解度高达98％以上，溶解度70％以上，且无苦味。表3各单一酶制剂组的检验结果组号使用酶制剂an％(g/100mg)蛋白质收率％风味1木瓜蛋白酶0.245069.7％清淡米香味，有苦味2碱性酶蛋白酶0.273373.5％清淡米香味，苦味重3中性蛋白酶0.206163.2％清淡米香味，少量苦味4米曲霉0.146843.5％清淡米香味，无苦味综上，以木瓜蛋白酶与中性或碱性蛋白酶组合的复合酶，可改善大米蛋白的溶 解度，明显提升大米蛋白的蛋白质收率(均高达90％以上)。其中尤以木瓜蛋白酶与中性蛋白酶，与风味酶b)为优选，蛋白质水解度高达98％以上，溶解度70％以上，且无苦味。以相同方法步骤，使用单一酶制剂进行酶解，经检验得结果如表3，各组的蛋白质收率为40％～75％以上，显然本发明酶组合可明显提高大米蛋白粉的溶解度，改善大米蛋白溶解度，高达60％以上。其中尤以实验组4(复合蛋白酶b+风味酶b)为优选，蛋白质水解度高达98％以上，溶解度70％以上，且无苦味。以上这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。当前第1页12