一种里氏木霉重组t-PA的分离纯化方法与流程

本发明涉及t-pa的分离纯化领域，具体而言，涉及一种里氏木霉重组t-pa的分离纯化方法。

背景技术：

血栓性疾病是常见病、多发病，现已成为危害人们健康的最严重疾病之一。现代医学的溶栓疗法是血栓性疾病安全而有效的治疗手段。国内外已应用于临床使用的溶栓剂虽药效较好，但均存在不同程度的副作用，而且价格昂贵。

组织型纤溶酶原激活剂(tissue-typeplasminogenactivator,t-pa)是体内各种组织中都含有的一种酶,它能选择地将血栓中的纤溶酶原变成纤溶酶使血栓溶解,并且t-pa引起的血栓溶解一般不伴有全身出血的倾向,因而成为新一代血栓溶栓剂。微生物生长速度快，生命活动周期短，生长条件容易控制，可以通过人工控制发酵条件获取大量的目的产物，从而在产溶栓剂方面展现出广阔的前景。

里氏木霉是一种高产纤维素酶的丝状真菌，它具有极好的合成蛋白和分泌蛋白的能力。实验表明，里氏木霉不仅适于蛋白生产，而且对人没有毒性，在产酶条件下也不产生真菌毒素和抗生素。因此，由里氏木霉生产并分离纯化出的纤溶酶原激活剂具有高度的安全可靠性。

目前，已报道的关于t-pa的分离纯化都是从生物组织中分离，从基因重组动物细胞分离，未见从基因重组微生物里氏木霉细胞中分离t-pa的报道。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种里氏木霉重组t-pa的分离纯化方法，该方法提供了一种简便的里氏木霉生物合成的t-pa分离纯化方法，操作成本低廉同时具备高的活性回收率，操作步骤简单，为使其在临床上得到应用提供了参考。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种里氏木霉重组t-pa的分离纯化方法，包括以下步骤：

将里氏木霉发酵制得的含有t-pa的粗酶液预处理后得到澄清液；

所述澄清液采用d296强阴离子交换树脂柱进行脱色，脱色后用磷酸缓冲液洗脱，得到洗脱液；

所述洗脱液采用硫酸铵进行盐析，得到沉淀；

将所述沉淀用磷酸缓冲液溶解，然后进行透析脱盐；

脱盐后的酶液采用q-sepharosehighperformance强离子交换色谱进行分离纯化，用磷酸缓冲液配置成的0-1mol/l的氯化钠进行梯度洗脱收集得到活性组分液；

所述活性组分液经冷冻抽干即得t-pa成品。

本发明提供的里氏木霉重组t-pa的分离纯化方法，先将得到的含有t-pa的粗酶液预处理后进行脱色，然后再进行盐析得到沉淀，得到的沉淀经溶解后再进行分离纯化，洗脱得到的液体经冷冻抽干得到t-pa成品。整个方法简单易行，得到的t-paa分子质量约为65000，等电点约为4.24，比活力达3200u/mg以上，纯化倍数为51.5以上，回收率为75％以上。

其中，预处理一般是将发酵液低温离心，除去菌体和残渣等固形杂物，得到澄清液。具体为将发酵液在4℃、以8000r/min离心25min,除去菌体和残渣等固形杂物,得到含t-pa的上清液。

为了达到较佳的脱色效果，进一步地，所述d296强阴离子交换树脂柱的直径为1.5±0.2cm，长度为30±1cm。

进一步地，脱色时，所述澄清液在d296强阴离子交换树脂柱中的线速度小于0.5cm/min。

经试验验证，兼顾沉淀得率与酶活性，优选地，盐析时，硫酸铵的添加量为：用硫酸铵调节所述洗脱液至饱和度为40％-50％，优选为45％。

为了不影响最终得到的酶的活性，进一步地，所述盐析的温度为2-6℃，时间为7-9h；

盐析后，在2-6℃，以7000-8000r/min离心20-30min，得到所述沉淀。

为了达到更好的分离纯化效果，优选地，在将所述沉淀用磷酸缓冲液溶解步骤中，所述沉淀与所述磷酸缓冲液的质量比为1:4-6。

进一步地，所述透析脱盐采用透析袋进行，所述透析袋截留分子量为10000da。

为了达到更好的透析效果，进一步地，所述透析袋在使用前，先在0.9-1.1mol/ledta溶液中煮沸8-15min，再在质量浓度为1.9％-2.1％的nahco3溶液中煮沸8-12min，最后在蒸馏水中煮沸8-15min。

为了达到更好的分离纯化效果，优选地，所述q-sepharosehighperformance强离子交换色谱中的柱子的直径为2.6±0.2cm，长度为7±1cm；流速为1.8-2.2ml/min。

进一步地，步骤中使用的磷酸盐缓冲液的浓度均为0.018-0.022mol/l，ph均为7.3-7.5。

本发明中，合成里氏木霉重组t-pa的菌株可通过常规方法将t-pa基因转入里氏木霉中，得到分泌型t-pa的菌株，如按文献基因工程菌株里氏木霉合成t-pa发酵条件及r-pa基因在甲醇毕赤酵母中表达的研究介绍的内容制备；也可通过市售购买。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明提供的里氏木霉重组t-pa的分离纯化方法，操作成本低廉，操作步骤简单，得到的t-pa分子质量约为65000，等电点约为4.24，比活力达3200u/mg以上，纯化倍数为51.5以上，回收率为75％以上。

(2)本发明还限定了各步骤的具体参数，以提升得到的t-pa的比活力、纯化倍数以及回收率。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明实施例1中里氏木霉重组t-pa的澄清液脱色效果曲线图；

图2为本发明实施例1中里氏木霉重组t-pa的硫酸铵盐析曲线图；

图3为本发明实施例1中强阴离子交换剂q-sepharosehighperformance对里氏木霉重组t-pa进行分离结果曲线图；

图4为本发明实施例1中aktaprime蛋白质纯化系统对活性组分液检测图；

图5为本发明实施例1中里氏木霉重组t-pa的变性电泳图；

图6为本发明实施例1中里氏木霉重组t-pa的活性电泳图；

图7为本发明实施例1中用sds-page纤维蛋白自显影法测定里氏木霉重组t-pa的电泳图；

图8为本发明实施例1中测定里氏木霉重组t-pa的等电点的电泳图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

1.材料：

基因工程菌里氏木霉(trichodermareesei)306,购自天津科技大学应用微生物研究室。琼脂糖购自sino-americanbiotec公司；血纤维蛋白原、十二烷基硫酸钠(sds)、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺均购自sigma公司；凝血酶购自中国医学科学院血研所；低相对分子质量标准蛋白质(marker，14400～97400)、测等电点蛋白质标准物(pi3.5～9.3)购自上海西巴斯生物技术开发有限公司；q-sepharosehighperformance、superdex75prepgrade均购自pharmaciabiotech公司；其余试剂均为进口或国产色谱纯或分析纯试剂。aktaprime蛋白质纯化系统购自美国ge公司。

2.方法

2.1酶液制备：

500ml三角瓶，菌株接种量为10％,于28℃,150r/min下培养48h；

然后将发酵液4℃、8000r/min离心25min,除去菌体和残渣等固形杂物,取含t-pa的上清液备用；

2.2酶液脱色：

将离心去除菌体和固形物的澄清酶液通过d296强阴离子交换树脂柱(φ1.5×30cm)，控制线速度小于0.5cm/min，当树脂对色素吸附接近饱和，停止加酶液，然后用0.02mol/l磷酸缓冲液洗脱，得到洗脱液，同时对树脂再生，以重复利用。

将洗脱液进行检测，结果如图1所示。从图1可以看出，洗脱液中酶的蛋白峰和酶的活性峰基本重合，只有一个蛋白洗脱峰，没有拖尾现象；纯化倍数为1.34，酶的活力回收率为92.79％。

2.3盐析：

将脱色后的粗酶液用不同饱和度的硫酸铵进行实验,结果如图2所示。当硫酸铵饱和度为25％时就有t-pa形成沉淀。在25％～45％范围内，随硫酸铵饱和度的增加酶的活力增加，当硫酸铵饱和度为45％时达最大，然后逐渐下降，在饱和度为75％时又达到最大，可能是因为硫酸铵达到一定的饱和度而使酶沉淀时,有些抑制酶活力的小分子发生了共沉,所以当饱和度超过45％后,随饱和度的增加酶的活力下降；下降到65％后抑制酶活力小分子基本沉淀完全，粗酶活力又有所提升，当硫酸铵饱和度达到100％时，纤溶酶基本没有活性。因此，确定硫酸铵盐析饱和度为45％。通过盐析，里氏木霉重组t-pa活力回收率是20.38％，酶的活力损失大，盐析时间太长,因此，在确定了其最适饱和度后,接下来又确定它的酶的活力损失少的作用时间为7-9h，以8h效果更优。

即将脱色后的洗脱液用硫酸铵调饱和度至45％，然后置冰箱(4℃)冷藏8h，在4℃、8000r/min离心25min，将上清液与沉淀分离，收集沉淀后用ph7.4的0.02mol/l磷酸缓冲液溶解，以用于下一步透析脱盐。

2.4透析脱盐：

先将适当大小的透析袋(截留分子量10000)放在1mol/ledta溶液中煮沸10min，再在2％nahco3溶液中煮沸10min，最后在蒸馏水中煮沸10min。然后将硫酸铵盐析后的溶解液放入透析袋中，扎紧上口，将其放入盛有蒸馏水烧杯中，进行透析。每隔一段时间(5-10min)，用氯化钡滴入蒸馏水中，观察是否有沉淀现象，至无沉淀产生。透析结果如表1所示。

表1透析前后的差别

由表1可以看出，透析不但除去了盐类，还除去了一部分抑制纤溶酶活性的杂质，总蛋白含量降低，比活性大幅度提高，纯化倍数达到了35.42，活力回收率很高，透析效果比较好。

2.5分离纯化：

用q-sepharosehighperformance强阴离子交换色谱对脱盐后的粗酶液进一步分离纯化。柱型φ2.6×7cm，上样量为23ml，洗脱液为0.02mol/l磷酸缓冲液(pbs，ph＝7.4)配置成的0-1mol/l的氯化钠进行梯度洗脱，流速为2ml/min，每管收集4ml，梯度洗脱的体积300ml：300ml，检测纤溶酶酶活和280nm吸光值od，测定的吸光度值为0.001后，再接20管，得到的所有的洗脱液即为收集的活性组分液，活性组分冷冻抽干即得成品。

对里氏木霉重组t-pa进行分离的结果如图3所示。由图3可知，从层析曲线来看，里氏木霉重组t-pa完全被q-sepharosehighperformance吸附，洗脱时酶活性峰主要集中在0.2～0.8mol/lnacl处，目标酶的活性峰和280nm蛋白质吸收峰完全重合，而且只有这一个蛋白洗脱峰。说明经过q-sepharosehighperformance的酶的纯度已很高。收集活性组分，采用凝胶过滤层析进行纯度鉴定。

通过上述各步骤对里氏木霉重组t-pa发酵液的处理，使里氏木霉重组t-pa逐步得到纯化，发酵液的活力回收率和纯化倍数如表2所示。

表2各步骤得到的t-pa的相关参数

3.检测：

3.1采用aktaprime蛋白质纯化系统对活性组分液检测，柱子填料为superdex75prepgrade凝胶，柱型：φ1.0×60cm，上样2ml,流速1.0ml/min,洗脱液为0.2mol/l的pbs(ph＝7.4、0.02mol/l磷酸缓冲液)的naci溶液，蛋白浓度是0.0018g/ml。结果如图4所示。

从图4可以看出，酶的峰型对称，呈单一的峰，我们所要分离的目的蛋白酶达到了色谱纯。

3.2电泳

采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(sds-page)和聚丙烯酰胺凝胶电泳法(page)(12％分离胶，5％浓缩胶，交联度为2.6％，灌注垂直板凝胶)测定里氏木霉重组t-pa的相对分子质量和纯度。蛋白质标准物分子量(14400-97400)。结果如图5和图6所示。

由图5、6可以看出，里氏木霉重组t-pa变性电泳、活性电泳都是单一条带，达到了电泳纯。

3.3纤维蛋白自显影

运用sds-page纤维蛋白自显影法进行测定。结果如图7所示。

从图7中可以看出，样品的泳带上出现了溶斑，说明它们泳带中的蛋白具有溶解血纤维蛋白的能力，其中溶斑分子量大约在65000,说明此带具有溶解血纤维蛋白的物质存在，分子量大约在65000。通过sds-page纤维蛋白自显影证明了基因工程菌里氏木霉的发酵液中具有溶解血纤维蛋白的产物，分子量大约是65000。通过sds-page纤维蛋白自显影证明了sds-page和page电泳结论的正确性，证明了65000分子的片段就是我们要的目标酶。

3.4等电点测定

采用等电聚焦电泳法(ief)(凝胶浓度t＝7.5％,交联度c＝3％)测定里氏木霉重组t-pa的等电点。蛋白质标准物pi3.5～9.3。

测定结果如图8所示，里氏木霉重组t-pa的等电点为：4.24。天然t-pa的等电点在7.8～8.6，最大组分等电点在8.2。测定的里氏木霉重组t-pa的等电点是4.24，与之相比下降了4.80。由于分离得到的里氏木霉重组t-pa主要是分子量约为60kda的产物，它是天然t-pa从275arg-276ile处肽键裂解而得到的有活性的蛋白酶区。根据t-pa序列计算t-pa这部分碱性氨基酸残基数和酸性氨基酸残基数的比值是1.16，因此其等电点下降为4.24。

本实施例提供了适合纯化里氏木霉重组t-pa的分离方法.发酵液经过离心除杂后，用d296强离子交换树脂对粗酶液脱色，除去色素和部分杂蛋白；得到的样品采用45％饱和度硫酸铵盐析；盐析后的粗酶液用透析袋脱盐，比活性提高了4倍，纯化倍数为35.42，回收率达到了290.3％；透析后的酶液进行q-sepharosehighperformance强阴离子交换层析，比活性提高了1.46倍，纯化倍数为52.44，回收率为75.56％；将离子交换层析后的样品冷冻抽干后用用aktaprime蛋白质纯化系统检测其纯度，其呈单一峰，达到了色谱纯；sds-page、page电泳都呈单一条带，证明其达到了电泳纯；用sds-page电泳测得其分子量约为66200，纤维蛋白自显影测定其分析量约为65000，通过等电聚焦电泳测得其等电点为4.24。

实施例2

一种里氏木霉重组t-pa的分离纯化方法，包括以下步骤：

1、制备粗酶液，制备方法同实施例1；

2、粗酶液脱色：将离心去除菌体和固形物的澄清酶液通过d296强阴离子交换树脂柱(φ1.5±0.2×30±1cm)，控制线速度小于0.5cm/min，当树脂对色素吸附接近饱和，停止加酶液，用0.018mol/l磷酸缓冲液洗脱，洗脱后的柱子的树脂进行再生操作以重复利用；

3、硫酸铵盐析：将脱色后的发酵液用硫酸铵调饱和度至40％后置冰箱(2-6℃)冷藏9h，在2℃、7000r/min离心30min，将上清液与沉淀分离，收集沉淀后用ph7.3、0.018mol/l磷酸缓冲液溶解备用；

4、透析脱盐：先将适当大小的透析袋(截留分子量10000)放在0.9mol/ledta溶液中煮沸15min，再在1.9％nahco3溶液中煮沸12min，最后在蒸馏水中煮沸15min。然后将硫酸铵盐析后的溶解液放入透析袋中，扎紧上口，将其放入盛有蒸馏水烧杯中，进行透析，每隔一段时间(5-10min)，用氯化钡滴入蒸馏水中，观察是否有沉淀现象，至无沉淀结束透析；

5、分离纯化：用q-sepharosehighperformance强离子交换色谱对脱盐后的粗酶液进行进一步分离纯化；柱型φ2.6±0.2×7±1cm，上样量为23ml，洗脱液为0.018mol/l磷酸缓冲液(pbs，ph＝7.3)配置成的0-1mol/l的氯化钠进行梯度洗脱，流速为2.2ml/min，每管收集4ml，梯度洗脱的体积300ml：300ml，检测纤溶酶酶活和280nm吸光值d(280)，测定的吸光度值为0.001后，再接20管，得到的所有的洗脱液即为收集的活性组分液，活性组分冷冻抽干即得成品。

用aktaprime蛋白质纯化系统、sds-page、page电泳对里氏木霉重组t-pa证明其分别达到了色谱纯和电泳纯。纯化后的里氏木霉重组t-pa的比活力达3201.32u/mg，纯化倍数为51.65，回收率为75.08％；分子质量约为65000，等电点约为4.24。

实施例3

一种里氏木霉重组t-pa的分离纯化方法，包括以下步骤：

1、制备粗酶液，制备方法同实施例1；

2、粗酶液脱色：将离心去除菌体和固形物的澄清酶液通过d296强阴离子交换树脂柱(φ1.5±0.2×30±1cm)，控制线速度小于0.5cm/min，当树脂对色素吸附接近饱和，停止加酶液，用0.022mol/l磷酸缓冲液洗脱，洗脱后的柱子的树脂进行再生操作以重复利用；

3、硫酸铵盐析：将脱色后的发酵液用硫酸铵调饱和度至50％后置冰箱(2-6℃)冷藏7h，在6℃、8000r/min离心20min，将上清液与沉淀分离，收集沉淀后用ph7.5、0.022mol/l磷酸缓冲液溶解备用；

4、透析脱盐：先将适当大小的透析袋(截留分子量10000)放在1.1mol/ledta溶液中煮沸8min，再在2.1％nahco3溶液中煮沸8min，最后在蒸馏水中煮沸8min。然后将硫酸铵盐析后的溶解液放入透析袋中，扎紧上口，将其放入盛有蒸馏水烧杯中，进行透析，每隔一段时间(5-10min)，用氯化钡滴入蒸馏水中，观察是否有沉淀现象，至无沉淀结束透析；

5、分离纯化：用q-sepharosehighperformance强离子交换色谱对脱盐后的粗酶液进行进一步分离纯化；柱型φ2.6±0.2×7±1cm，上样量为23ml，洗脱液为0.022mol/l磷酸缓冲液(pbs，ph＝7.5)配置成的0-1mol/l的氯化钠进行梯度洗脱，流速为1.8ml/min，每管收集4ml，梯度洗脱的体积300ml：300ml，检测纤溶酶酶活和280nm吸光值d(280)，测定的吸光度值为0.001后，再接20管，得到的所有的洗脱液即为收集的活性组分液，活性组分冷冻抽干即得成品。

用aktaprime蛋白质纯化系统、sds-page、page电泳对里氏木霉重组t-pa证明其分别达到了色谱纯和电泳纯。纯化后的里氏木霉重组t-pa的比活力达3200.05u/mg，纯化倍数为51.86，回收率为75.23％；分子质量约为65000，等电点约为4.24。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。